Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Uporabljate različico brskalnika z omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo uporabo posodobljenega brskalnika (ali onemogočanje načina združljivosti v Internet Explorerju). Poleg tega za zagotovitev stalne podpore spletno mesto prikazujemo brez slogov in JavaScripta.
Nedavno je bila razvita platforma brez kemikalij, ki temelji na nanotehnologiji z uporabo umetnih vodnih nanostruktur (EWNS). EWNS imajo visok površinski naboj in so bogate z reaktivnimi kisikovimi spojinami (ROS), ki lahko interagirajo s številnimi mikroorganizmi in jih inaktivirajo, vključno s patogeni, ki se prenašajo s hrano. Tukaj je prikazano, da je mogoče njihove lastnosti med sintezo natančno prilagoditi in optimizirati, da se še poveča njihov antibakterijski potencial. Laboratorijska platforma EWNS je bila zasnovana za natančno prilagoditev lastnosti EWNS s spreminjanjem parametrov sinteze. Karakterizacija lastnosti EWNS (naboj, velikost in vsebnost ROS) je bila izvedena z uporabo sodobnih analitičnih metod. Poleg tega so bili na površino ekoloških paradižnikov inokulirani živilski mikroorganizmi, kot so Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum in Saccharomyces cerevisiae, da bi ocenili njihov potencial za inaktivacijo mikrobov. Rezultati, predstavljeni tukaj, kažejo, da je mogoče lastnosti EWNS med sintezo natančno prilagoditi, kar ima za posledico eksponentno povečanje učinkovitosti inaktivacije. Predvsem se je površinski naboj povečal za faktor štirikrat, vsebnost ROS pa se je povečala. Hitrost odstranjevanja mikrobov je bila odvisna od mikrobov in se je gibala od 1,0 do 3,8 log po 45 minutah izpostavljenosti aerosolnemu odmerku 40.000 #/cm3 EWNS.
Mikrobna kontaminacija je glavni vzrok bolezni, ki se prenašajo s hrano, ki jih povzroča zaužitje patogenov ali njihovih toksinov. Bolezni, ki se prenašajo s hrano, so samo v Združenih državah Amerike vzrok za približno 76 milijonov bolezni, 325.000 hospitalizacij in 5.000 smrti vsako leto1. Poleg tega Ministrstvo za kmetijstvo Združenih držav Amerike (USDA) ocenjuje, da je povečana poraba svežih pridelkov odgovorna za 48 odstotkov vseh bolezni, ki se prenašajo s hrano, o katerih poročajo v Združenih državah2. Stroški bolezni in smrti zaradi patogenov, ki se prenašajo s hrano, so v Združenih državah Amerike zelo visoki, Centri za nadzor in preprečevanje bolezni (CDC) pa jih ocenjujejo na več kot 15,6 milijarde ameriških dolarjev na leto3.
Trenutno se kemični4, sevalni5 in toplotni6 protimikrobni posegi za zagotavljanje varnosti hrane izvajajo predvsem na omejenih kritičnih kontrolnih točkah (KKT) v proizvodni verigi (običajno po žetvi in/ali med pakiranjem), namesto da bi se izvajali neprekinjeno tako, da bi sveži pridelki bili izpostavljeni navzkrižni kontaminaciji7. Protimikrobni posegi so potrebni za boljši nadzor nad boleznimi, ki se prenašajo s hrano, in kvarjenjem hrane, in se lahko uporabljajo v celotnem kontinuumu od kmetije do mize. Manj vpliva in stroškov.
Nedavno je bila razvita nanotehnološka protimikrobna platforma brez kemikalij za inaktivacijo bakterij na površinah in v zraku z uporabo umetnih vodnih nanostruktur (EWNS). Za sintezo EVNS sta bila uporabljena dva vzporedna procesa: elektrosprej in ionizacija vode (slika 1a). Predhodno je bilo dokazano, da imajo EWNS edinstven nabor fizikalnih in bioloških lastnosti8,9,10. EWNS ima povprečno 10 elektronov na strukturo in povprečno nanometrsko velikost 25 nm (slika 1b,c)8,9,10. Poleg tega je elektronska spinska resonanca (ESR) pokazala, da EWNS vsebujejo veliko količino reaktivnih kisikovih spojin (ROS), predvsem hidroksilne (OH•) in superoksidne (O2-) radikale (slika 1c)8. EWNS so dolgo časa ostale v zraku in so lahko trčile z mikrobi, suspendiranimi v zraku in prisotnimi na površinah, pri čemer so dostavile svoj ROS in povzročile inaktivacijo mikrobov (slika 1d). Te prejšnje študije so tudi pokazale, da lahko EWNS interagirajo z različnimi gramnegativnimi in grampozitivnimi bakterijami, pomembnimi za javno zdravje, vključno z mikobakterijami, na površinah in v zraku ter jih inaktivirajo8,9. Transmisijska elektronska mikroskopija je pokazala, da je inaktivacijo povzročila motnja celične membrane. Poleg tega so študije akutnega vdihavanja pokazale, da visoki odmerki EWNS ne povzročajo poškodb pljuč ali vnetja8.
(a) Elektropršenje nastane, ko se med kapilaro, ki vsebuje tekočino, in protielektrodo uporabi visoka napetost. (b) Uporaba visoke napetosti povzroči dva različna pojava: (i) elektropršenje vode in (ii) nastanek reaktivnih kisikovih zvrsti (ionov), ujetih v EWNS. (c) Edinstvena struktura EWNS. (d) EWNS so zaradi svoje nanoskopske narave zelo mobilne in lahko interagirajo s patogeni, ki se prenašajo po zraku.
Nedavno je bila dokazana tudi sposobnost protimikrobne platforme EWNS za inaktivacijo mikroorganizmov, ki se prenašajo s hrano, na površini sveže hrane. Pokazalo se je tudi, da se površinski naboj EWNS lahko uporablja v kombinaciji z električnim poljem za ciljno dostavo. Še pomembneje je, da je bil v 90 minutah po izpostavljenosti EWNS pri koncentraciji približno 50.000#/cm311 opažen obetaven začetni rezultat približno 1,4 logaritemskega zmanjšanja aktivnosti organskega paradižnika proti različnim mikroorganizmom v hrani, kot sta E. coli in Listeria. Poleg tega predhodni organoleptični testi niso pokazali organoleptičnega učinka v primerjavi s kontrolnim paradižnikom. Čeprav ti začetni rezultati inaktivacije obljubljajo varnost hrane tudi pri zelo nizkih odmerkih EWNS 50.000#/cm3, je jasno, da bi bil višji potencial inaktivacije bolj koristen za nadaljnje zmanjšanje tveganja okužbe in kvarjenja.
Tukaj se bomo osredotočili na razvoj platforme za generiranje EWNS (efektivno napolnjenih nanodelcev encimov), da bi natančno nastavili parametre sinteze in optimizirali fizikalno-kemijske lastnosti EWNS za povečanje njihovega antibakterijskega potenciala. Optimizacija se je osredotočila predvsem na povečanje njihovega površinskega naboja (za izboljšanje ciljne dostave) in vsebnosti ROS (za izboljšanje učinkovitosti inaktivacije). Karakterizacija optimiziranih fizikalno-kemijskih lastnosti (velikost, naboj in vsebnost ROS) z uporabo sodobnih analitičnih metod in uporabe običajnih živilskih mikroorganizmov, kot so E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae in M. parafortuitum.
EVNS je bil sintetiziran s sočasnim elektropršenjem in ionizacijo vode visoke čistosti (18 MΩ cm–1). Električni atomizer 12 se običajno uporablja za atomizacijo tekočin ter sintetičnih polimernih in keramičnih delcev 13 in vlaken 14 nadzorovane velikosti.
Kot je podrobno opisano v prejšnjih publikacijah 8, 9, 10, 11, se v tipičnem poskusu med kovinsko kapilaro in ozemljeno protielektrodo priključi visoka napetost. Med tem postopkom se pojavita dva različna pojava: 1) elektropršenje in 2) ionizacija vode. Močno električno polje med obema elektrodama povzroči kopičenje negativnih nabojev na površini kondenzirane vode, kar povzroči nastanek Taylorjevih stožcev. Posledično nastanejo visoko nabite kapljice vode, ki se v skladu z Rayleighovo teorijo16 še naprej razpadajo na manjše delce. Hkrati močno električno polje povzroči, da se nekatere molekule vode cepijo in odvzamejo elektrone (ionizacija), s čimer nastane velika količina reaktivnih kisikovih spojin (ROS)17. Hkrati generirani paketi ROS18 so bili enkapsulirani v EWNS (slika 1c).
Na sliki 2a je prikazan sistem za generiranje EWNS, razvit in uporabljen pri sintezi EWNS v tej študiji. Prečiščena voda, shranjena v zaprti steklenici, je bila dovajana skozi teflonsko cev (notranji premer 2 mm) v iglo iz nerjavečega jekla 30G (kovinska kapilara). Kot je prikazano na sliki 2b, pretok vode nadzira zračni tlak v steklenici. Igla je pritrjena na teflonsko konzolo, ki jo je mogoče ročno nastaviti na določeno razdaljo od protielektrode. Protielektroda je poliran aluminijast disk z luknjo na sredini za vzorčenje. Pod protielektrodo je aluminijast lijak za vzorčenje, ki je prek odprtine za vzorčenje povezan s preostalim delom eksperimentalne postavitve (slika 2b). Vse komponente vzorčevalnika so električno ozemljene, da se prepreči kopičenje naboja, ki bi lahko poslabšalo vzorčenje delcev.
(a) Sistem za generiranje vodnih nanostruktur (EWNS). (b) Prečni prerez vzorčevalnika in elektropršilne enote, ki prikazuje najpomembnejše parametre. (c) Eksperimentalna postavitev za inaktivacijo bakterij.
Zgoraj opisani sistem za generiranje EWNS lahko spreminja ključne obratovalne parametre za lažjo natančno nastavitev lastnosti EWNS. Za natančno nastavitev značilnosti EWNS prilagodite uporabljeno napetost (V), razdaljo med iglo in protielektrodo (L) ter pretok vode (φ) skozi kapilaro. Simboli [V (kV), L (cm)] se uporabljajo za označevanje različnih kombinacij. Prilagodite pretok vode, da dobite stabilen Taylorjev stožec določenega niza [V, L]. Za namene te študije je bila odprtina protielektrode (D) nastavljena na 0,5 palca (1,29 cm).
Zaradi omejene geometrije in asimetrije jakosti električnega polja ni mogoče izračunati iz prvih principov. Namesto tega je bila za izračun električnega polja uporabljena programska oprema QuickField™ (Svendborg, Danska)19. Električno polje ni enakomerno, zato je bila vrednost električnega polja na konici kapilare uporabljena kot referenčna vrednost za različne konfiguracije.
Med študijo je bilo ocenjenih več kombinacij napetosti in razdalje med iglo in protielektrodo glede na nastanek Taylorjevega stožca, stabilnost Taylorjevega stožca, stabilnost proizvodnje EWNS in ponovljivost. Različne kombinacije so prikazane v dodatni tabeli S1.
Izhod sistema za generiranje EWNS je bil neposredno povezan z merilnikom velikosti delcev Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) za merjenje koncentracije števila delcev in je bil uporabljen skupaj z aerosolnim elektrometrom Faraday (TSI, model 3068B, Shoreview, ZDA). MN) za merjenje pretokov aerosolov, kot je opisano v naši prejšnji publikaciji9. Tako SMPS kot aerosolni elektrometer sta vzorčila s pretokom 0,5 l/min (skupni pretok vzorca 1 l/min). Koncentracije delcev in aerosolni tokovi so bili merjeni 120 sekund. Meritev ponovite 30-krat. Skupni naboj aerosola se izračuna iz meritev toka, povprečni naboj EWNS pa se oceni iz skupnega števila vzorčenih delcev EWNS. Povprečne stroške EWNS lahko izračunamo z enačbo (1):
kjer je IEl izmerjeni tok, NSMPS je številčna koncentracija, izmerjena s SMPS, in φEl je pretok do elektrometra.
Ker relativna vlažnost (RH) vpliva na površinski naboj, sta bila temperatura in (RH) med poskusom konstantna pri 21 °C oziroma 45 %.
Za merjenje velikosti in življenjske dobe EWNS so bili uporabljeni mikroskopija atomskih sil (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornija) in sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japonska). Hitrost skeniranja AFM je 1 Hz, površina skeniranja pa je 5 µm × 5 µm z 256 linijami skeniranja. Vse slike so bile podvržene poravnavi slik prvega reda z uporabo programske opreme Asylum (maska ​​z obsegom 100 nm in pragom 100 pm).
Odstranite lij za vzorčenje in površino sljude postavite na razdaljo 2,0 cm od protielektrode za povprečni čas 120 sekund, da preprečite koalescenco delcev in nastanek nepravilnih kapljic na površini sljude. EWNS smo nanesli neposredno na sveže rezane površine sljude (Ted Pella, Redding, CA). Takoj po razprševanju smo površino sljude vizualizirali z AFM. Površinski kontaktni kot sveže rezane nemodificirane sljude je blizu 0°, zato se EWNS širi po površini sljude v kupolasti obliki20. Premer (a) in višina (h) difuznih kapljic smo izmerili neposredno iz topografije AFM in uporabili za izračun kupolastega difuzijskega volumna EWNS z uporabo naše predhodno validirane metode8. Ob predpostavki, da ima vgrajeni EVNS enak volumen, lahko ekvivalentni premer izračunamo iz enačbe (2):
V skladu z našo predhodno razvito metodo smo za zaznavanje prisotnosti kratkoživih radikalnih intermediatov v EWNS uporabili spinsko past z elektronsko spinsko resonanco (ESR). Aerosoli so bili prepuščeni skozi raztopino, ki je vsebovala 235 mM DEPMPO (5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksid) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Vse EPR meritve so bile izvedene z uporabo spektrometra Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ZDA) in ploščatih celičnih nizov. Za zbiranje in analizo podatkov je bila uporabljena programska oprema Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ZDA). Karakterizacija ROS je bila izvedena le za niz obratovalnih pogojev [-6,5 kV, 4,0 cm]. Koncentracije EWNS so bile izmerjene z uporabo SMPS ob upoštevanju izgube EWNS v udarnem elementu.
Ravni ozona so bile spremljane z uporabo 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Za vse lastnosti EWNS je izmerjena vrednost povprečje meritev, merilna napaka pa standardni odklon. Za primerjavo vrednosti optimiziranega atributa EWNS z ustrezno vrednostjo osnovnega EWNS je bil izveden t-test.
Slika 2c prikazuje predhodno razvit in karakteriziran sistem za prehod elektrostatičnih padavin (EPES), ki ga je mogoče uporabiti za usmerjanje EWNS11 na površine. EPES uporablja naboj EWNS v kombinaciji z močnim električnim poljem, da ga »usmeri« neposredno na površino tarče. Podrobnosti sistema EPES so predstavljene v nedavni publikaciji Pyrgiotakisa in sodelavcev.11. EPES je torej sestavljen iz 3D-natisnjene PVC komore s stožčastimi konci, ki vsebuje dve vzporedni kovinski plošči iz nerjavečega jekla (nerjaveče jeklo 304, zrcalno polirano) na sredini, oddaljeni 15,24 cm. Plošče so bile priključene na zunanji vir visoke napetosti (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), spodnja plošča je bila vedno pozitivna, zgornja pa vedno ozemljena (plavajoča). Stene komore so prekrite z aluminijasto folijo, ki je električno ozemljena, da se prepreči izguba delcev. Komora ima zaprta sprednja nakladalna vrata, ki omogočajo postavitev testnih površin na plastične stojala, pri čemer se dvignejo s spodnje kovinske plošče, da se preprečijo motnje visoke napetosti.
Učinkovitost nanašanja EWNS v EPES je bila izračunana v skladu s predhodno razvitim protokolom, podrobno opisanim v Dodatni sliki S111.
Kot kontrolna komora je drugi tok skozi valjasto komoro zaporedno povezan s sistemom EPES z uporabo vmesnega HEPA filtra za odstranjevanje EWNS. Kot je prikazano na sliki 2c, je bil aerosol EWNS črpan skozi dve zaporedno povezani komori. Filter med kontrolno sobo in EPES odstrani vse preostale EWNS, kar ima za posledico enako temperaturo (T), relativno vlažnost (RH) in raven ozona.
Ugotovljeno je bilo, da pomembni mikroorganizmi, ki se prenašajo s hrano, kontaminirajo sveže pridelke, kot so Escherichia coli (ATCC #27325), fekalni indikator, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen, ki se prenaša s hrano, Listeria innocua (ATCC #33090), alternativa patogeni Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) kot alternativa kvasovkam, ki povzročajo kvarjenje, in Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) kot bolj odporne žive bakterije, kupljene pri ATCC (Manassas, Virginia).
Na lokalni tržnici naključno kupite škatle ekoloških grozdnih paradižnikov in jih do uporabe (do 3 dni) shranite v hladilniku pri 4 °C. Za eksperimentiranje izberite paradižnike ene velikosti, premera približno 1,2 cm.
Protokoli za inkubacijo, inokulacijo, izpostavljenost in štetje kolonij so bili podrobno opisani v naših prejšnjih publikacijah in podrobno pojasnjeni v Dodatnih podatkih 11. Učinkovitost EWNS je bila ocenjena tako, da so bili inokulirani paradižniki izpostavljeni 40.000 #/cm3 45 minut. Na kratko, v času t = 0 min so bili za oceno preživelih mikroorganizmov uporabljeni trije paradižniki. Trije paradižniki so bili postavljeni v EPES in izpostavljeni EWNS pri 40.000 #/cm3 (paradižniki, izpostavljeni EWNS), trije drugi pa so bili postavljeni v kontrolno komoro (kontrolni paradižniki). Nobena od skupin paradižnikov ni bila podvržena dodatni obdelavi. Paradižniki, izpostavljeni EWNS, in kontrolni paradižniki so bili po 45 minutah odstranjeni, da bi ocenili učinek EWNS.
Vsak poskus je bil izveden v treh ponovitvah. Analiza podatkov je bila izvedena v skladu s protokolom, opisanim v dodatnih podatkih.
Vzorci bakterij E. coli, Enterobacter in L. innocua, izpostavljeni EWNS (45 min, koncentracija aerosola EWNS 40.000 #/cm3) in neizpostavljeni, so bili zbrani v peletih za oceno mehanizmov inaktivacije. Oborina je bila 2 uri pri sobni temperaturi fiksirana v 0,1 M raztopini natrijevega kakodilata (pH 7,4) s fiksativom 2,5 % glutaraldehida, 1,25 % paraformaldehida in 0,03 % pikrinske kisline. Po izpiranju so bili 2 uri fiksirani z 1 % osmijevim tetroksidom (OsO4)/1,5 % kalijevim ferocianidom (KFeCN6), 3-krat sprani z vodo in inkubirani v 1 % uranil acetatu 1 uro, nato pa dvakrat sprani z vodo. Nadaljnja dehidracija je bila 10 minut s 50 %, 70 %, 90 % in 100 % alkoholom. Vzorce smo nato za 1 uro namestili v propilen oksid in impregnirali z mešanico propilen oksida in TAAP Epona v razmerju 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Kalifornija). Vzorce smo vgradili v TAAB Epon in polimerizirali pri 60 °C 48 ur. Strjena granulirana smola je bila razrezana in vizualizirana s TEM z uporabo JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japonska), običajnega transmisijskega elektronskega mikroskopa, opremljenega s kamero AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, ZDA).
Vsi poskusi so bili izvedeni v treh ponovitvah. Za vsako časovno točko so bili bakterijski izpirki naneseni v treh ponovitvah, kar je dalo skupno devet podatkovnih točk na točko, katerih povprečje je bilo uporabljeno kot bakterijska koncentracija za ta določen organizem. Standardni odklon je bil uporabljen kot merilna napaka. Vse točke štejejo.
Logaritem zmanjšanja koncentracije bakterij v primerjavi s t = 0 min smo izračunali po naslednji formuli:
kjer je C0 koncentracija bakterij v kontrolnem vzorcu v času 0 (tj. po tem, ko se je površina posušila, vendar preden je bila postavljena v komoro), Cn pa koncentracija bakterij na površini po n minutah izpostavljenosti.
Da bi upoštevali naravno razgradnjo bakterij med 45-minutnim obdobjem izpostavljenosti, je bila izračunana tudi logaritemska redukcija v primerjavi s kontrolno skupino pri 45 minutah, kot sledi:
Kjer je Cn koncentracija bakterij v kontrolnem vzorcu v času n, Cn-Control pa koncentracija kontrolnih bakterij v času n. Podatki so predstavljeni kot logaritemsko zmanjšanje v primerjavi s kontrolo (brez izpostavljenosti EWNS).
Med študijo je bilo ocenjenih več kombinacij napetosti in razdalje med iglo in protielektrodo glede na nastanek Taylorjevega stožca, stabilnost Taylorjevega stožca, stabilnost proizvodnje EWNS in ponovljivost. Različne kombinacije so prikazane v dodatni tabeli S1. Za celovito študijo sta bila izbrana dva primera, ki kažeta stabilne in ponovljive lastnosti (Taylorjev stožec, proizvodnja EWNS in stabilnost skozi čas). Na sliki 3 so prikazani rezultati o naboju, velikosti in vsebnosti ROS za dva primera. Rezultati so povzeti tudi v tabeli 1. Za referenco slika 3 in tabela 1 vključujeta lastnosti predhodno sintetiziranih neoptimiziranih EWNS8, 9, 10, 11 (osnovni EWNS). Izračuni statistične pomembnosti z uporabo dvostranskega t-testa so ponovno objavljeni v dodatni tabeli S2. Poleg tega dodatni podatki vključujejo študije o vplivu premera vzorčne odprtine protielektrode (D) in razdalje med ozemljitveno elektrodo in konico igle (L) (dodatni sliki S2 in S3).
(a–c) Porazdelitev velikosti AFM. (d–f) Karakteristika površinskega naboja. (g) Karakterizacija ROS in ESR.
Pomembno je tudi omeniti, da so bili pri vseh zgoraj navedenih pogojih izmerjeni ionizacijski tokovi v območju 2–6 µA, napetosti pa v območju od –3,8 do –6,5 kV, kar je povzročilo porabo energije za ta enojni priključkovni EWNS manj kot 50 mW. Čeprav je bil EWNS sintetiziran pod visokim tlakom, so bile ravni ozona zelo nizke in nikoli niso presegle 60 ppb.
Dodatna slika S4 prikazuje simulirana električna polja za scenarija [-6,5 kV, 4,0 cm] oziroma [-3,8 kV, 0,5 cm]. Polja v skladu s scenarijema [-6,5 kV, 4,0 cm] in [-3,8 kV, 0,5 cm] so izračunana kot 2 × 10⁶ V/m oziroma 4,7 × 10⁶ V/m. To je pričakovano, saj je razmerje med napetostjo in razdaljo v drugem primeru veliko večje.
Na sliki 3a,b je prikazan premer EWNS, izmerjen z AFM8. Povprečna premera EWNS za scenarija [-6,5 kV, 4,0 cm] in [-3,8 kV, 0,5 cm] sta bila izračunana kot 27 nm oziroma 19 nm. Geometrijska standardna odstopanja porazdelitev za primera [-6,5 kV, 4,0 cm] in [-3,8 kV, 0,5 cm] sta 1,41 oziroma 1,45, kar kaže na ozko porazdelitev velikosti. Tako povprečna velikost kot geometrijski standardni odklon sta zelo blizu osnovni vrednosti EWNS, in sicer 25 nm oziroma 1,41. Na sliki 3c je prikazana porazdelitev velikosti osnovne vrednosti EWNS, izmerjena z isto metodo pod enakimi pogoji.
Na sliki 3d,e so prikazani rezultati karakterizacije naboja. Podatki so povprečne meritve 30 sočasnih meritev koncentracije (#/cm3) in toka (I). Analiza kaže, da je povprečni naboj na EWNS 22 ± 6 e- in 44 ± 6 e- za [-6,5 kV, 4,0 cm] oziroma [-3,8 kV, 0,5 cm]. V primerjavi z osnovnim EWNS (10 ± 2 e-) je njihov površinski naboj bistveno višji, dvakrat večji kot pri scenariju [-6,5 kV, 4,0 cm] in štirikrat večji kot pri scenariju [-3,8 kV, 0,5 cm]. Slika 3f prikazuje osnovne podatke o plačilu EWNS.
Iz zemljevidov koncentracij števila delcev EWNS (dodatni sliki S5 in S6) je razvidno, da ima prizor [-6,5 kV, 4,0 cm] bistveno večje število delcev kot prizor [-3,8 kV, 0,5 cm]. Prav tako je treba opozoriti, da so bile koncentracije števila delcev EWNS spremljane do 4 ure (dodatni sliki S5 in S6), kjer je stabilnost generacije EWNS v obeh primerih pokazala enake ravni koncentracij števila delcev.
Slika 3g prikazuje EPR spekter po odštevanju kontrolne vrednosti (ozadje) za optimiziran EWNS pri [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spekter je primerjan tudi z osnovnim EWNS v predhodno objavljenem članku. Izračunano število EWNS, ki reagirajo s spinsko pastjo, je 7,5 × 104 EWNS/s, kar je podobno predhodno objavljenemu osnovnemu EWNS8. EPR spektri so jasno pokazali prisotnost dveh vrst ROS, kjer je prevladoval O2-, medtem ko je bil OH• prisoten v manjši količini. Poleg tega je neposredna primerjava intenzivnosti vrhov pokazala, da je imel optimiziran EWNS bistveno višjo vsebnost ROS v primerjavi z osnovnim EWNS.
Na sliki 4 je prikazana učinkovitost nanašanja EWNS v EPES. Podatki so povzeti tudi v tabeli I in primerjani z originalnimi podatki EWNS. V obeh primerih EUNS je bilo nanašanje blizu 100 % tudi pri nizki napetosti 3,0 kV. Običajno je 3,0 kV dovolj za doseganje 100 % nanašanja ne glede na spremembo površinskega naboja. Pod enakimi pogoji je bila učinkovitost nanašanja Baseline-EWNS le 56 % zaradi nižjega naboja (povprečno 10 elektronov na EWNS).
Slika 5 in tabela 2 povzemata stopnjo inaktivacije mikroorganizmov, inokuliranih na površini paradižnika po izpostavljenosti približno 40.000 #/cm3 EWNS 45 minut v optimalnem scenariju [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulirani E. coli in L. innocua sta pokazali znatno zmanjšanje za 3,8 log po 45 minutah izpostavljenosti. V enakih pogojih je S. enterica pokazala nižje zmanjšanje logaritma za 2,2 log, medtem ko sta S. cerevisiae in M. parafortuitum pokazala zmanjšanje za 1,0 log.
Elektronske mikrografije (slika 6), ki prikazujejo fizikalne spremembe, ki jih je povzročila EWNS v celicah E. coli, Salmonella enterica in L. innocua, kar je vodilo do inaktivacije. Kontrolne bakterije so imele nepoškodovane celične membrane, izpostavljene bakterije pa so imele poškodovane zunanje membrane.
Elektronsko mikroskopsko slikanje kontrolnih in izpostavljenih bakterij je pokazalo poškodbe membrane.
Podatki o fizikalno-kemijskih lastnostih optimiziranih EWNS skupaj kažejo, da so se lastnosti EWNS (površinski naboj in vsebnost ROS) bistveno izboljšale v primerjavi s prej objavljenimi osnovnimi podatki EWNS8,9,10,11. Po drugi strani pa je njihova velikost ostala v nanometrskem območju, kar je zelo podobno prej objavljenim rezultatom, kar jim omogoča, da ostanejo v zraku dlje časa. Opaženo polidisperznost je mogoče pojasniti s spremembami površinskega naboja, ki določajo velikost Rayleighovega učinka, naključnostjo in potencialnim združevanjem EWNS. Vendar pa, kot so podrobno opisali Nielsen in sod.22, visok površinski naboj zmanjša izhlapevanje z učinkovitim povečanjem površinske energije/napetosti vodne kapljice. Ta teorija je bila eksperimentalno potrjena za mikrokapljice22 in EWNS v naši prejšnji publikaciji8. Izguba časa lahko vpliva tudi na velikost in prispeva k opaženi porazdelitvi velikosti.
Poleg tega je naboj na strukturo približno 22–44 e-, odvisno od okoliščin, kar je bistveno več v primerjavi z osnovnim EWNS, ki ima povprečni naboj 10 ± 2 elektronov na strukturo. Vendar je treba opozoriti, da je to povprečni naboj EWNS. Seto in sod. Pokazalo se je, da naboj ni enakomeren in sledi logaritemsko normalni porazdelitvi21. V primerjavi z našim prejšnjim delom podvojitev površinskega naboja podvoji učinkovitost nanašanja v sistemu EPES na skoraj 100 %11.