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Recentemente è stata sviluppata una piattaforma antimicrobica priva di sostanze chimiche basata sulla nanotecnologia e sull'utilizzo di nanostrutture artificiali di acqua (EWNS). Le EWNS presentano un'elevata carica superficiale e sono ricche di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in grado di interagire con numerosi microrganismi, inclusi i patogeni di origine alimentare, e di inattivarli. In questo studio si dimostra che le loro proprietà durante la sintesi possono essere ottimizzate e regolate con precisione per migliorarne ulteriormente il potenziale antibatterico. La piattaforma di laboratorio EWNS è stata progettata per ottimizzare le proprietà delle EWNS modificando i parametri di sintesi. La caratterizzazione delle proprietà delle EWNS (carica, dimensione e contenuto di ROS) è stata effettuata utilizzando metodi analitici moderni. Inoltre, microrganismi alimentari come Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum e Saccharomyces cerevisiae sono stati inoculati sulla superficie di pomodorini biologici per valutarne il potenziale di inattivazione microbica. I risultati qui presentati dimostrano che le proprietà dell'EWNS possono essere ottimizzate durante la sintesi, determinando un aumento esponenziale dell'efficienza di inattivazione. In particolare, la carica superficiale è quadruplicata e il contenuto di ROS è aumentato. Il tasso di rimozione microbica è risultato dipendente dal tipo di microrganismo e ha oscillato tra 1,0 e 3,8 log dopo 45 minuti di esposizione a una dose di aerosol di 40.000 particelle/cm³ di EWNS.
La contaminazione microbica è la principale causa di malattie di origine alimentare, dovute all'ingestione di agenti patogeni o delle loro tossine. Solo negli Stati Uniti, le malattie di origine alimentare causano circa 76 milioni di casi di malattia, 325.000 ricoveri ospedalieri e 5.000 decessi ogni anno¹. Inoltre, il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) stima che l'aumento del consumo di prodotti freschi sia responsabile del 48% di tutte le malattie di origine alimentare segnalate negli Stati Uniti². Il costo delle malattie e dei decessi causati da agenti patogeni di origine alimentare negli Stati Uniti è molto elevato, stimato dai Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie (CDC) in oltre 15,6 miliardi di dollari all'anno³.
Attualmente, gli interventi antimicrobici chimici4, radiativi5 e termici6 per garantire la sicurezza alimentare vengono implementati principalmente in punti critici di controllo (CCP) limitati nella catena di produzione (di solito dopo la raccolta e/o durante il confezionamento) piuttosto che in modo continuo, in modo che i prodotti freschi siano soggetti a contaminazione incrociata7. Gli interventi antimicrobici sono necessari per controllare meglio le malattie di origine alimentare e il deterioramento degli alimenti e hanno il potenziale per essere applicati lungo l'intera filiera, dalla fattoria alla tavola. Minore impatto e costi.
È stata recentemente sviluppata una piattaforma antimicrobica basata sulla nanotecnologia e priva di sostanze chimiche per inattivare i batteri su superfici e nell'aria utilizzando nanostrutture artificiali di acqua (EWNS). Per la sintesi delle EWNS sono stati utilizzati due processi paralleli: elettrospray e ionizzazione dell'acqua (Fig. 1a). È stato precedentemente dimostrato che le EWNS possiedono un insieme unico di proprietà fisiche e biologiche8,9,10. Le EWNS hanno una media di 10 elettroni per struttura e una dimensione media di 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Inoltre, la risonanza di spin elettronico (ESR) ha mostrato che le EWNS contengono una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS), principalmente radicali idrossilici (OH•) e superossido (O2-) (Fig. 1c)8. Le EWNS rimangono nell'aria per lungo tempo e possono collidere con i microbi sospesi nell'aria e presenti sulle superfici, rilasciando il loro carico di ROS e causando l'inattivazione microbica (Fig. 1d). Questi studi precedenti hanno anche dimostrato che l'EWNS può interagire con vari batteri Gram-negativi e Gram-positivi di importanza per la salute pubblica, inclusi i micobatteri, presenti su superfici e nell'aria, e inattivarli8,9. La microscopia elettronica a trasmissione ha mostrato che l'inattivazione era causata dalla rottura della membrana cellulare. Inoltre, studi di inalazione acuta hanno dimostrato che dosi elevate di EWNS non causano danni o infiammazioni polmonari8.
(a) L'elettrospray si verifica quando viene applicata un'alta tensione tra un capillare contenente liquido e un controelettrodo. (b) L'applicazione di un'alta tensione determina due fenomeni diversi: (i) l'elettrospray dell'acqua e (ii) la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ioni) intrappolate nell'EWNS. (c) La struttura unica dell'EWNS. (d) Le EWNS sono altamente mobili grazie alla loro natura su scala nanometrica e possono interagire con agenti patogeni aerotrasportati.
È stata recentemente dimostrata anche la capacità della piattaforma antimicrobica EWNS di inattivare i microrganismi di origine alimentare presenti sulla superficie degli alimenti freschi. È stato inoltre dimostrato che la carica superficiale EWNS può essere utilizzata in combinazione con un campo elettrico per un rilascio mirato. Ancora più importante, è stato osservato un promettente risultato iniziale di una riduzione di circa 1,4 log dell'attività del pomodoro biologico contro vari microrganismi alimentari come E. coli e Listeria entro 90 minuti dall'esposizione a EWNS a una concentrazione di circa 50.000 #/cm³. Inoltre, i test preliminari di valutazione organolettica non hanno mostrato alcun effetto organolettico rispetto al pomodoro di controllo. Sebbene questi risultati iniziali di inattivazione promettano la sicurezza alimentare anche a dosi molto basse di EWNS (50.000 #/cm³), è chiaro che un potenziale di inattivazione maggiore sarebbe più vantaggioso per ridurre ulteriormente il rischio di infezione e deterioramento.
In questo contesto, la nostra ricerca si concentrerà sullo sviluppo di una piattaforma per la generazione di EWNS al fine di affinare i parametri di sintesi e ottimizzare le proprietà fisico-chimiche delle EWNS per migliorarne il potenziale antibatterico. In particolare, l'ottimizzazione si è concentrata sull'aumento della carica superficiale (per migliorare il rilascio mirato) e del contenuto di ROS (per migliorare l'efficienza di inattivazione). La caratterizzazione delle proprietà fisico-chimiche ottimizzate (dimensioni, carica e contenuto di ROS) verrà effettuata utilizzando metodi analitici moderni e impiegando microrganismi alimentari comuni come E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae e M. parafortuitum.
L'EVNS è stato sintetizzato mediante elettrospray simultaneo e ionizzazione di acqua ad elevata purezza (18 MΩ cm–1). L'atomizzatore elettrico 12 viene tipicamente utilizzato per atomizzare liquidi e particelle polimeriche e ceramiche sintetiche 13 e fibre 14 di dimensioni controllate.
Come dettagliato nelle precedenti pubblicazioni 8, 9, 10, 11, in un esperimento tipico, viene applicata un'alta tensione tra un capillare metallico e un controelettrodo messo a terra. Durante questo processo, si verificano due fenomeni diversi: 1) elettrospray e 2) ionizzazione dell'acqua. Un forte campo elettrico tra i due elettrodi provoca l'accumulo di cariche negative sulla superficie dell'acqua condensata, con conseguente formazione di coni di Taylor. Di conseguenza, si formano goccioline d'acqua altamente cariche, che continuano a frammentarsi in particelle più piccole, secondo la teoria di Rayleigh16. Allo stesso tempo, un forte campo elettrico fa sì che alcune molecole d'acqua si scindano e perdano elettroni (ionizzazione), generando così una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS)17. I pacchetti di ROS18 generati simultaneamente sono stati incapsulati in EWNS (Fig. 1c).
La figura 2a mostra il sistema di generazione EWNS sviluppato e utilizzato nella sintesi EWNS in questo studio. Acqua purificata, conservata in una bottiglia chiusa, è stata fatta passare attraverso un tubo di teflon (diametro interno di 2 mm) fino a un ago in acciaio inossidabile 30G (capillare metallico). Come mostrato in figura 2b, il flusso d'acqua è controllato dalla pressione dell'aria all'interno della bottiglia. L'ago è fissato a una console in teflon che può essere regolata manualmente a una certa distanza dal controelettrodo. Il controelettrodo è un disco di alluminio lucidato con un foro al centro per il campionamento. Al di sotto del controelettrodo si trova un imbuto di campionamento in alluminio, collegato al resto della configurazione sperimentale tramite una porta di campionamento (Fig. 2b). Tutti i componenti del campionatore sono messi a terra elettricamente per evitare l'accumulo di carica che potrebbe compromettere il campionamento delle particelle.
(a) Sistema di generazione di nanostrutture d'acqua ingegnerizzate (EWNS). (b) Sezione trasversale del campionatore e dell'unità di elettrospray che mostra i parametri più importanti. (c) Configurazione sperimentale per l'inattivazione dei batteri.
Il sistema di generazione EWNS descritto sopra è in grado di modificare i parametri operativi chiave per facilitare la messa a punto delle proprietà EWNS. Regolando la tensione applicata (V), la distanza tra l'ago e il controelettrodo (L) e il flusso d'acqua (φ) attraverso il capillare, è possibile ottimizzare le caratteristiche EWNS. I simboli [V (kV), L (cm)] indicano diverse combinazioni. Regolando il flusso d'acqua si ottiene un cono di Taylor stabile di una determinata coppia di valori [V, L]. Ai fini di questo studio, l'apertura del controelettrodo (D) è stata impostata a 0,5 pollici (1,29 cm).
A causa della geometria limitata e dell'asimmetria, l'intensità del campo elettrico non può essere calcolata a partire dai principi fondamentali. Pertanto, è stato utilizzato il software QuickField™ (Svendborg, Danimarca)¹⁹ per calcolare il campo elettrico. Il campo elettrico non è uniforme, quindi il valore del campo elettrico sulla punta del capillare è stato utilizzato come valore di riferimento per le diverse configurazioni.
Durante lo studio, sono state valutate diverse combinazioni di tensione e distanza tra l'ago e il controelettrodo in termini di formazione del cono di Taylor, stabilità del cono di Taylor, stabilità della produzione di EWNS e riproducibilità. Le varie combinazioni sono riportate nella Tabella supplementare S1.
L'uscita del sistema di generazione EWNS è stata collegata direttamente a un analizzatore di mobilità delle particelle (SMPS, modello 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) per misurare la concentrazione numerica delle particelle ed è stata utilizzata con un elettrometro per aerosol di Faraday (TSI, modello 3068B, Shoreview, USA) per misurare i flussi di aerosol, come descritto nella nostra precedente pubblicazione9. Sia l'SMPS che l'elettrometro per aerosol hanno campionato a una velocità di flusso di 0,5 L/min (flusso totale del campione 1 L/min). Le concentrazioni di particelle e i flussi di aerosol sono stati misurati per 120 s. La misurazione è stata ripetuta 30 volte. La carica totale di aerosol è calcolata dalle misurazioni di corrente e la carica media di EWNS è stimata dal numero totale di particelle EWNS campionate. Il costo medio di EWNS può essere calcolato utilizzando l'equazione (1):
dove IEl è la corrente misurata, NSMPS è la concentrazione numerica misurata con l'SMPS e φEl è la portata all'elettrometro.
Poiché l'umidità relativa (UR) influenza la carica superficiale, la temperatura e l'UR sono state mantenute costanti rispettivamente a 21 °C e 45% durante l'esperimento.
Per misurare le dimensioni e la durata degli EWNS sono stati utilizzati un microscopio a forza atomica (AFM), un Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) e una sonda AC260T (Olympus, Tokyo, Giappone). La velocità di scansione dell'AFM è di 1 Hz e l'area di scansione è di 5 µm × 5 µm con 256 linee di scansione. Tutte le immagini sono state sottoposte ad allineamento di primo ordine utilizzando il software Asylum (maschera con un intervallo di 100 nm e una soglia di 100 pm).
Rimuovere l'imbuto di campionamento e posizionare la superficie di mica a una distanza di 2,0 cm dal controelettrodo per un tempo medio di 120 s per evitare la coalescenza delle particelle e la formazione di goccioline irregolari sulla superficie di mica. L'EWNS è stato applicato direttamente su superfici di mica appena tagliate (Ted Pella, Redding, CA). Immediatamente dopo lo sputtering, la superficie di mica è stata visualizzata utilizzando l'AFM. L'angolo di contatto superficiale della mica appena tagliata non modificata è vicino a 0°, quindi l'EWNS si propaga sulla superficie di mica in una forma a cupola20. Il diametro (a) e l'altezza (h) delle goccioline in diffusione sono stati misurati direttamente dalla topografia AFM e utilizzati per calcolare il volume di diffusione a cupola dell'EWNS utilizzando il nostro metodo precedentemente validato8. Supponendo che l'EVNS a bordo abbia lo stesso volume, il diametro equivalente può essere calcolato dall'equazione (2):
In conformità con il metodo da noi precedentemente sviluppato, è stata utilizzata una trappola di spin a risonanza di spin elettronico (ESR) per rilevare la presenza di intermedi radicalici di breve durata in EWNS. Gli aerosol sono stati fatti passare attraverso una soluzione contenente 235 mM di DEPMPO (5-(dietossifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-ossido) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Tutte le misurazioni EPR sono state eseguite utilizzando uno spettrometro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) e array di celle piatte. Il software Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) è stato utilizzato per raccogliere e analizzare i dati. La caratterizzazione delle ROS è stata eseguita solo per una serie di condizioni operative [-6,5 kV, 4,0 cm]. Le concentrazioni di EWNS sono state misurate utilizzando SMPS dopo aver tenuto conto della perdita di EWNS nell'impattore.
I livelli di ozono sono stati monitorati utilizzando un monitor per ozono a doppio raggio 205™ (2B Technologies, Boulder, CO)8,9,10.
Per tutte le proprietà EWNS, il valore misurato è la media delle misurazioni e l'errore di misurazione è la deviazione standard. È stato eseguito un test t per confrontare il valore dell'attributo EWNS ottimizzato con il valore corrispondente dell'EBNS di base.
La Figura 2c mostra un sistema di passaggio per precipitazione elettrostatica (EPES) precedentemente sviluppato e caratterizzato, utilizzabile per indirizzare le particelle EWNS11 verso le superfici. L'EPES utilizza una carica EWNS in combinazione con un forte campo elettrico per "puntare" direttamente sulla superficie del bersaglio. I dettagli del sistema EPES sono presentati in una recente pubblicazione di Pyrgiotakis et al.11. L'EPES è costituito da una camera in PVC stampata in 3D con estremità rastremate, contenente al centro due piastre metalliche parallele in acciaio inossidabile (acciaio inossidabile 304, lucidato a specchio) distanti 15,24 cm l'una dall'altra. Le piastre sono collegate a una sorgente esterna ad alta tensione (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY); la piastra inferiore è sempre positiva e quella superiore è sempre messa a terra (fluttuante). Le pareti della camera sono rivestite con un foglio di alluminio, collegato a terra elettricamente per prevenire la perdita di particelle. La camera è dotata di uno sportello di carico frontale sigillato che consente di posizionare le superfici di prova su supporti in plastica, sollevandole dalla piastra metallica inferiore per evitare interferenze ad alta tensione.
L'efficienza di deposizione di EWNS in EPES è stata calcolata secondo un protocollo precedentemente sviluppato e dettagliato nella Figura supplementare S111.
Come camera di controllo, il secondo flusso attraverso la camera cilindrica è collegato in serie con il sistema EPES utilizzando un filtro HEPA intermedio per rimuovere l'EWNS. Come mostrato in figura 2c, l'aerosol di EWNS è stato pompato attraverso due camere collegate in serie. Il filtro tra la sala di controllo e l'EPES rimuove l'eventuale EWNS residuo, garantendo così la stessa temperatura (T), umidità relativa (RH) e livelli di ozono.
Importanti microrganismi di origine alimentare sono stati trovati a contaminare prodotti freschi come Escherichia coli (ATCC #27325), un indicatore fecale, Salmonella enterica (ATCC #53647), un patogeno di origine alimentare, Listeria innocua (ATCC #33090), un'alternativa alla patogena Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) come alternativa ai lieviti responsabili del deterioramento e Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) come batteri vivi più resistenti sono stati acquistati da ATCC (Manassas, Virginia).
Acquista a caso delle confezioni di pomodorini biologici al mercato locale e conservali in frigorifero a 4°C fino al momento dell'utilizzo (fino a 3 giorni). Scegli pomodorini di una sola dimensione per sperimentare, di circa 1,2 cm di diametro.
I protocolli per l'incubazione, l'inoculazione, l'esposizione e il conteggio delle colonie sono stati descritti in dettaglio nelle nostre precedenti pubblicazioni e spiegati in dettaglio nei Dati supplementari 11. Le prestazioni di EWNS sono state valutate esponendo i pomodori inoculati a 40.000 #/cm³ per 45 minuti. In breve, al tempo t = 0 min, sono stati utilizzati tre pomodori per valutare i microrganismi sopravvissuti. Tre pomodori sono stati posti in EPES ed esposti a EWNS a 40.000 #/cm³ (pomodori esposti a EWNS) e altri tre sono stati posti nella camera di controllo (pomodori di controllo). Nessuno dei gruppi di pomodori è stato sottoposto a ulteriori trattamenti. I pomodori esposti a EWNS e i controlli sono stati rimossi dopo 45 minuti per valutare l'effetto di EWNS.
Ciascun esperimento è stato condotto in triplice copia. L'analisi dei dati è stata effettuata secondo il protocollo descritto nei Dati supplementari.
Campioni batterici di E. coli, Enterobacter e L. innocua esposti a EWNS (45 min, concentrazione di aerosol EWNS 40.000 #/cm3) e non esposti sono stati centrifugati per valutare i meccanismi di inattivazione. Il precipitato è stato fissato per 2 ore a temperatura ambiente in una soluzione di cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,4) con un fissativo di glutaraldeide al 2,5%, paraformaldeide all'1,25% e acido picrico allo 0,03%. Dopo il lavaggio, sono stati fissati con tetrossido di osmio all'1% (OsO4)/ferrocianuro di potassio all'1,5% (KFeCN6) per 2 ore, lavati 3 volte con acqua e incubati in acetato di uranile all'1% per 1 ora, quindi lavati due volte con acqua. Successivamente disidratazione per 10 minuti ciascuno in alcol al 50%, 70%, 90% e 100%. I campioni sono stati quindi immersi in ossido di propilene per 1 ora e impregnati con una miscela 1:1 di ossido di propilene e TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). I ​​campioni sono stati inglobati in TAAB Epon e polimerizzati a 60 °C per 48 ore. La resina granulare polimerizzata è stata tagliata e visualizzata tramite TEM utilizzando un JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Giappone), un microscopio elettronico a trasmissione convenzionale dotato di una telecamera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA).
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplice copia. Per ogni punto temporale, i lavaggi batterici sono stati piastrati in triplice copia, ottenendo un totale di nove punti dati per punto, la cui media è stata utilizzata come concentrazione batterica per quello specifico organismo. La deviazione standard è stata utilizzata come errore di misurazione. Tutti i punti sono validi.
Il logaritmo della diminuzione della concentrazione batterica rispetto a t = 0 min è stato calcolato utilizzando la seguente formula:
dove C0 è la concentrazione di batteri nel campione di controllo al tempo 0 (ovvero dopo che la superficie si è asciugata ma prima di essere inserita nella camera) e Cn è la concentrazione di batteri sulla superficie dopo n minuti di esposizione.
Per tenere conto della naturale degradazione dei batteri durante il periodo di esposizione di 45 minuti, è stata calcolata anche la riduzione logaritmica rispetto al controllo a 45 minuti come segue:
Dove Cn è la concentrazione di batteri nel campione di controllo al tempo n e Cn-Controllo è la concentrazione di batteri di controllo al tempo n. I dati sono presentati come riduzione logaritmica rispetto al controllo (nessuna esposizione a EWNS).
Durante lo studio, sono state valutate diverse combinazioni di tensione e distanza tra l'ago e il controelettrodo in termini di formazione del cono di Taylor, stabilità del cono di Taylor, stabilità della produzione di EWNS e riproducibilità. Le varie combinazioni sono riportate nella Tabella supplementare S1. Sono stati selezionati due casi per uno studio completo che mostrasse proprietà stabili e riproducibili (cono di Taylor, produzione di EWNS e stabilità nel tempo). La Figura 3 mostra i risultati relativi alla carica, alle dimensioni e al contenuto di ROS per i due casi. I risultati sono riassunti anche nella Tabella 1. Per riferimento, la Figura 3 e la Tabella 1 includono le proprietà degli EWNS non ottimizzati precedentemente sintetizzati8, 9, 10, 11 (EWNS di riferimento). I calcoli della significatività statistica mediante un test t a due code sono ripubblicati nella Tabella supplementare S2. Inoltre, ulteriori dati includono studi sull'effetto del diametro del foro di campionamento del controelettrodo (D) e della distanza tra l'elettrodo di terra e la punta dell'ago (L) (Figure supplementari S2 e S3).
(a–c) Distribuzione dimensionale AFM. (d–f) Caratteristica della carica superficiale. (g) Caratterizzazione di ROS e ESR.
È inoltre importante notare che, per tutte le condizioni sopra descritte, le correnti di ionizzazione misurate erano comprese tra 2 e 6 µA e le tensioni tra -3,8 e -6,5 kV, con un consumo energetico per questo modulo di generazione EWNS a terminale singolo inferiore a 50 mW. Sebbene l'EWNS sia stato sintetizzato ad alta pressione, i livelli di ozono erano molto bassi, non superando mai i 60 ppb.
La Figura supplementare S4 mostra i campi elettrici simulati per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], rispettivamente. I campi calcolati per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] sono pari rispettivamente a 2 × 10⁵ V/m e 4,7 × 10⁵ V/m. Questo risultato è prevedibile, poiché il rapporto tra tensione e distanza è molto più elevato nel secondo caso.
La figura 3a,b mostra il diametro EWNS misurato con l'AFM8. I diametri medi EWNS per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] sono stati calcolati rispettivamente pari a 27 nm e 19 nm. Le deviazioni standard geometriche delle distribuzioni per i casi [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm] sono rispettivamente 1,41 e 1,45, indicando una distribuzione dimensionale ristretta. Sia la dimensione media che la deviazione standard geometrica sono molto vicine a quelle dell'EWNS di riferimento, essendo rispettivamente di 25 nm e 1,41. La figura 3c mostra la distribuzione dimensionale dell'EWNS di riferimento misurata utilizzando lo stesso metodo nelle stesse condizioni.
La figura 3d,e mostra i risultati della caratterizzazione della carica. I dati sono misurazioni medie di 30 misurazioni simultanee di concentrazione (#/cm³) e corrente (I). L'analisi mostra che la carica media sull'EWNS è di 22 ± 6 e- e 44 ± 6 e- rispettivamente per [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm]. Rispetto all'EWNS di riferimento (10 ± 2 e-), la loro carica superficiale è significativamente più alta, il doppio di quella dello scenario [-6,5 kV, 4,0 cm] e quattro volte quella di [-3,8 kV, 0,5 cm]. La figura 3f mostra i dati di pagamento di base dell'EWNS.
Dalle mappe di concentrazione numerica EWNS (Figure supplementari S5 e S6), si può notare che la scena [-6,5 kV, 4,0 cm] presenta un numero di particelle significativamente più elevato rispetto alla scena [-3,8 kV, 0,5 cm]. Va inoltre sottolineato che le concentrazioni numeriche EWNS sono state monitorate fino a 4 ore (Figure supplementari S5 e S6), periodo durante il quale la stabilità della generazione EWNS ha mostrato gli stessi livelli di concentrazione numerica delle particelle in entrambi i casi.
La Figura 3g mostra lo spettro EPR dopo la sottrazione del controllo (sfondo) per EWNS ottimizzato a [-6,5 kV, 4,0 cm]. Lo spettro ROS è anche confrontato con la linea di base EWNS in un articolo pubblicato in precedenza. Il numero calcolato di EWNS che reagiscono con la trappola di spin è 7,5 × 104 EWNS/s, che è simile alla linea di base EWNS8 pubblicata in precedenza. Gli spettri EPR hanno chiaramente indicato la presenza di due tipi di ROS, dove O2- predominava, mentre OH• era presente in quantità minore. Inoltre, un confronto diretto delle intensità dei picchi ha mostrato che l'EWNS ottimizzato aveva un contenuto di ROS significativamente più elevato rispetto all'EWNS di base.
La figura 4 mostra l'efficienza di deposizione di EWNS in EPES. I dati sono riassunti anche nella Tabella I e confrontati con i dati EWNS originali. Per entrambi i casi EUNS, la deposizione è risultata prossima al 100% anche a una bassa tensione di 3,0 kV. Tipicamente, 3,0 kV sono sufficienti per ottenere una deposizione del 100% indipendentemente dalla variazione della carica superficiale. Nelle stesse condizioni, l'efficienza di deposizione del Baseline-EWNS è stata solo del 56% a causa della carica inferiore (in media 10 elettroni per EWNS).
La Figura 5 e la Tabella 2 riassumono il grado di inattivazione dei microrganismi inoculati sulla superficie dei pomodori dopo l'esposizione a circa 40.000 #/cm3 EWNS per 45 minuti nello scenario ottimale [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli e L. innocua inoculati hanno mostrato una riduzione significativa di 3,8 log dopo 45 minuti di esposizione. Nelle stesse condizioni, S. enterica ha mostrato una riduzione logaritmica inferiore di 2,2 log, mentre S. cerevisiae e M. parafortuitum hanno mostrato una riduzione di 1,0 log.
Micrografie elettroniche (Figura 6) che illustrano le modifiche fisiche indotte da EWNS nelle cellule di E. coli, Salmonella enterica e L. innocua, che portano alla loro inattivazione. I batteri di controllo mostravano membrane cellulari intatte, mentre i batteri esposti presentavano membrane esterne danneggiate.
L'analisi al microscopio elettronico di batteri di controllo e di batteri esposti ha rivelato danni alla membrana cellulare.
I dati sulle proprietà fisico-chimiche degli EWNS ottimizzati mostrano collettivamente che le proprietà degli EWNS (carica superficiale e contenuto di ROS) sono state significativamente migliorate rispetto ai dati di riferimento degli EWNS pubblicati in precedenza8,9,10,11. D'altra parte, le loro dimensioni sono rimaste nell'intervallo nanometrico, il che è molto simile ai risultati pubblicati in precedenza, consentendo loro di rimanere nell'aria per un lungo periodo di tempo. La polidispersità osservata può essere spiegata dalle variazioni della carica superficiale, che determinano l'entità dell'effetto Rayleigh, la casualità e la potenziale fusione degli EWNS. Tuttavia, come dettagliato da Nielsen et al.22, un'elevata carica superficiale riduce l'evaporazione aumentando efficacemente l'energia/tensione superficiale della goccia d'acqua. Questa teoria è stata confermata sperimentalmente per le microgocce22 e gli EWNS nella nostra precedente pubblicazione8. La perdita nel tempo può anche influenzare le dimensioni e contribuire alla distribuzione dimensionale osservata.
Inoltre, la carica per struttura è di circa 22–44 e-, a seconda delle circostanze, che è significativamente più alta rispetto all'EWNS di base, che ha una carica media di 10 ± 2 elettroni per struttura. Tuttavia, va notato che questa è la carica media dell'EWNS. Seto et al. hanno dimostrato che la carica non è uniforme e segue una distribuzione log-normale21. Rispetto al nostro lavoro precedente, il raddoppio della carica superficiale raddoppia l'efficienza di deposizione nel sistema EPES fino a quasi il 100%11.