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Récemment, une plateforme antimicrobienne sans produits chimiques, basée sur la nanotechnologie et utilisant des nanostructures d'eau artificielles (EWNS), a été développée. Les EWNS présentent une charge de surface élevée et sont riches en espèces réactives de l'oxygène (ROS), capables d'interagir avec de nombreux micro-organismes et de les inactiver, notamment les pathogènes d'origine alimentaire. Cette étude montre que leurs propriétés peuvent être finement ajustées et optimisées lors de leur synthèse afin d'améliorer leur potentiel antibactérien. La plateforme de laboratoire EWNS a été conçue pour ajuster précisément les propriétés des EWNS en modifiant les paramètres de synthèse. La caractérisation des propriétés des EWNS (charge, taille et teneur en ROS) a été réalisée à l'aide de méthodes analytiques modernes. De plus, des micro-organismes alimentaires tels qu'Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum et Saccharomyces cerevisiae ont été inoculés à la surface de tomates cerises biologiques afin d'évaluer leur potentiel d'inactivation microbienne. Les résultats présentés ici démontrent que les propriétés des EWNS peuvent être finement ajustées lors de leur synthèse, ce qui entraîne une augmentation exponentielle de l'efficacité d'inactivation. En particulier, la charge de surface a quadruplé et la concentration en espèces réactives de l'oxygène (ROS) a augmenté. Le taux d'élimination microbienne dépendait du type de micro-organisme et variait de 1,0 à 3,8 log après 45 minutes d'exposition à une dose d'aérosol de 40 000 particules/cm³ d'EWNS.
La contamination microbienne est la principale cause de maladies d'origine alimentaire dues à l'ingestion d'agents pathogènes ou de leurs toxines. Aux États-Unis seulement, ces maladies sont responsables d'environ 76 millions de cas, 325 000 hospitalisations et 5 000 décès chaque année¹. De plus, le Département de l'Agriculture des États-Unis (USDA) estime que la consommation accrue de fruits et légumes frais est responsable de 48 % de toutes les maladies d'origine alimentaire recensées aux États-Unis². Le coût des maladies et des décès liés aux agents pathogènes d'origine alimentaire aux États-Unis est très élevé : les Centres pour le contrôle et la prévention des maladies (CDC) l'estiment à plus de 15,6 milliards de dollars par an³.
Actuellement, les interventions antimicrobiennes chimiques⁴, par irradiation⁵ et thermiques⁶ visant à garantir la sécurité alimentaire sont principalement mises en œuvre à des points critiques de contrôle (PCC) limités de la chaîne de production (généralement après la récolte et/ou lors du conditionnement), plutôt que de manière continue, ce qui expose les produits frais à un risque de contamination croisée⁷. Des interventions antimicrobiennes sont nécessaires pour mieux maîtriser les maladies d'origine alimentaire et l'altération des aliments, et pourraient être appliquées tout au long de la chaîne, de la production à la consommation. Elles permettraient de réduire l'impact et les coûts.
Une plateforme antimicrobienne sans produits chimiques, basée sur les nanotechnologies, a récemment été développée pour inactiver les bactéries présentes sur les surfaces et dans l'air grâce à des nanostructures d'eau artificielles (EWNS). La synthèse des EWNS a été réalisée par deux procédés parallèles : l'électrospray et l'ionisation de l'eau (Fig. 1a). Il a été démontré que les EWNS possèdent des propriétés physiques et biologiques uniques^8,9,10. Chaque structure contient en moyenne 10 électrons et présente une taille moyenne de 25 nm (Fig. 1b,c)^8,9,10. De plus, la résonance paramagnétique électronique (RPE) a révélé que les EWNS contiennent une grande quantité d'espèces réactives de l'oxygène (ERO), principalement des radicaux hydroxyle (OH•) et superoxyde (O_2-^-) (Fig. 1c)⁸. Les EWNS persistent longtemps dans l'air et peuvent entrer en collision avec les micro-organismes en suspension et présents sur les surfaces, libérant ainsi leurs ERO et inactivant les micro-organismes (Fig. 1d). Ces études antérieures ont également montré que l'EWNS peut interagir avec diverses bactéries Gram négatif et Gram positif d'importance pour la santé publique, notamment les mycobactéries, et les inactiver, aussi bien sur les surfaces que dans l'air^8,9. La microscopie électronique à transmission a révélé que cette inactivation était due à la rupture de la membrane cellulaire. De plus, des études d'inhalation aiguë ont démontré que de fortes doses d'EWNS n'entraînent ni lésions pulmonaires ni inflammation⁸.
(a) L'électropulvérisation se produit lorsqu'une haute tension est appliquée entre un capillaire contenant un liquide et une contre-électrode. (b) L'application d'une haute tension entraîne deux phénomènes distincts : (i) l'électropulvérisation d'eau et (ii) la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ions) piégées dans les nanoparticules d'eau électrolysées (EWNS). (c) La structure unique des EWNS. (d) Les EWNS sont très mobiles en raison de leur taille nanométrique et peuvent interagir avec les agents pathogènes présents dans l'air.
La capacité de la plateforme antimicrobienne EWNS à inactiver les micro-organismes d'origine alimentaire à la surface des aliments frais a été récemment démontrée. Il a également été montré que la charge de surface de l'EWNS peut être utilisée en combinaison avec un champ électrique pour un ciblage précis. Plus important encore, un résultat initial prometteur a été observé : une réduction d'environ 1,4 log de l'activité antimicrobienne de la tomate biologique contre divers micro-organismes alimentaires, tels que *E. coli* et *Listeria*, a été constatée en 90 minutes d'exposition à l'EWNS à une concentration d'environ 50 000 #/cm³. De plus, des tests organoleptiques préliminaires n'ont révélé aucun effet organoleptique par rapport à la tomate témoin. Bien que ces premiers résultats d'inactivation soient prometteurs pour la sécurité alimentaire, même à de très faibles doses d'EWNS (50 000 #/cm³), il est clair qu'un potentiel d'inactivation plus élevé serait plus avantageux pour réduire davantage les risques d'infection et d'altération.
Nos recherches porteront sur le développement d'une plateforme de génération d'EWNS afin d'optimiser les paramètres de synthèse et les propriétés physico-chimiques de ces nanoparticules, et ainsi renforcer leur potentiel antibactérien. L'optimisation s'est notamment concentrée sur l'augmentation de leur charge de surface (pour un ciblage plus précis) et de leur teneur en espèces réactives de l'oxygène (ROS) (pour une meilleure efficacité d'inactivation). La caractérisation des propriétés physico-chimiques optimisées (taille, charge et teneur en ROS) sera réalisée à l'aide de méthodes analytiques modernes et de micro-organismes alimentaires courants tels que *Escherichia coli*, *Salmonella enterica*, *Legionella innocua*, *Saccharomyces cerevisiae* et *Mycobacterium parafortuitum*.
L'EVNS a été synthétisé par électropulvérisation et ionisation simultanées d'eau de haute pureté (18 MΩ cm–1). L'atomiseur électrique 12 est généralement utilisé pour atomiser des liquides et des particules de polymères et de céramiques synthétiques 13 et des fibres 14 de taille contrôlée.
Comme décrit en détail dans les publications précédentes 8, 9, 10, 11, une expérience typique consiste à appliquer une haute tension entre un capillaire métallique et une contre-électrode reliée à la terre. Ce processus met en jeu deux phénomènes distincts : 1) l’électropulvérisation et 2) l’ionisation de l’eau. Le champ électrique intense entre les deux électrodes provoque l’accumulation de charges négatives à la surface de l’eau condensée, entraînant la formation de cônes de Taylor. Il se forme ainsi des gouttelettes d’eau fortement chargées, qui se fragmentent ensuite en particules plus petites, conformément à la théorie de Rayleigh¹⁶. Simultanément, le champ électrique intense provoque la dissociation de certaines molécules d’eau et l’arrachement d’électrons (ionisation), générant ainsi une grande quantité d’espèces réactives de l’oxygène (ERO)¹⁷. Les ERO ainsi générées¹⁸ sont encapsulées dans des nanoparticules d’eau électrolysée (EWNS) (Fig. 1c).
La figure 2a présente le système de génération d'EWNS développé et utilisé pour la synthèse d'EWNS dans cette étude. De l'eau purifiée, stockée dans une bouteille fermée, est acheminée par un tube en téflon (2 mm de diamètre intérieur) jusqu'à une aiguille en acier inoxydable 30G (capillaire métallique). Comme illustré sur la figure 2b, le débit d'eau est contrôlé par la pression d'air à l'intérieur de la bouteille. L'aiguille est fixée à une console en téflon, réglable manuellement à une distance précise de la contre-électrode. Cette dernière est un disque en aluminium poli percé en son centre pour le prélèvement d'échantillons. Sous la contre-électrode se trouve un entonnoir de prélèvement en aluminium, relié au reste du dispositif expérimental par un port de prélèvement (figure 2b). Tous les composants de l'échantillonneur sont mis à la terre afin d'éviter toute accumulation de charges susceptibles de perturber le prélèvement des particules.
(a) Système de génération de nanostructures d'eau artificielles (EWNS). (b) Coupe transversale de l'échantillonneur et de l'unité d'électropulvérisation montrant les paramètres les plus importants. (c) Dispositif expérimental pour l'inactivation des bactéries.
Le système de génération d'EWNS décrit ci-dessus permet de modifier les principaux paramètres de fonctionnement afin d'ajuster précisément les propriétés des EWNS. Il est possible de régler la tension appliquée (V), la distance entre l'aiguille et la contre-électrode (L) et le débit d'eau (φ) dans le capillaire pour optimiser les caractéristiques des EWNS. Les symboles [V (kV), L (cm)] désignent différentes combinaisons. Le débit d'eau doit être ajusté pour obtenir un cône de Taylor stable pour un ensemble [V, L] donné. Dans le cadre de cette étude, l'ouverture de la contre-électrode (D) a été fixée à 0,5 pouce (1,29 cm).
En raison de la géométrie contrainte et de l'asymétrie, l'intensité du champ électrique ne peut être calculée par des méthodes ab initio. Le logiciel QuickField™ (Svendborg, Danemark)¹⁹ a donc été utilisé pour effectuer ce calcul. Le champ électrique n'étant pas uniforme, sa valeur à l'extrémité du capillaire a servi de référence pour les différentes configurations.
Au cours de cette étude, plusieurs combinaisons de tension et de distance entre l'aiguille et la contre-électrode ont été évaluées en termes de formation du cône de Taylor, de stabilité de ce cône, de stabilité de la production d'EWNS et de reproductibilité. Différentes combinaisons sont présentées dans le tableau supplémentaire S1.
La sortie du système de génération d'EWNS était directement connectée à un spectromètre de mobilité de particules (SMPS, modèle 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) pour mesurer la concentration en nombre de particules et était utilisée avec un électromètre d'aérosols Faraday (TSI, modèle 3068B, Shoreview, États-Unis) pour mesurer les flux d'aérosols, comme décrit dans notre publication précédente⁹. Le SMPS et l'électromètre d'aérosols effectuaient tous deux des prélèvements à un débit de 0,5 L/min (débit total de 1 L/min). Les concentrations de particules et les flux d'aérosols étaient mesurés pendant 120 s. La mesure était répétée 30 fois. La charge totale d'aérosols était calculée à partir des mesures de courant, et la charge moyenne d'EWNS était estimée à partir du nombre total de particules d'EWNS échantillonnées. Le coût moyen d'EWNS pouvait être calculé à l'aide de l'équation (1) :
où IEl est le courant mesuré, NSMPS est la concentration numérique mesurée avec le SMPS et φEl est le débit vers l'électromètre.
Étant donné que l'humidité relative (HR) affecte la charge de surface, la température et (HR) ont été maintenues constantes à 21°C et 45%, respectivement, pendant l'expérience.
La taille et la durée de vie des EWNS ont été mesurées par microscopie à force atomique (AFM), à l'aide d'un microscope Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) et d'une sonde AC260T (Olympus, Tokyo, Japon). La fréquence de balayage de l'AFM était de 1 Hz et la zone de balayage de 5 µm × 5 µm, avec 256 lignes de balayage. Toutes les images ont été alignées au premier ordre à l'aide du logiciel Asylum (masque de 100 nm de portée et seuil de 100 pm).
Retirez l'entonnoir d'échantillonnage et placez la surface de mica à 2,0 cm de la contre-électrode pendant 120 s en moyenne afin d'éviter la coalescence des particules et la formation de gouttelettes irrégulières. L'EWNS a été appliqué directement sur des surfaces de mica fraîchement découpées (Ted Pella, Redding, CA). Immédiatement après la pulvérisation, la surface de mica a été visualisée par AFM. L'angle de contact de la surface de mica non modifié fraîchement découpé étant proche de 0°, l'EWNS se propage sur la surface en formant un dôme²⁰. Le diamètre (a) et la hauteur (h) des gouttelettes diffusantes ont été mesurés directement à partir de la topographie AFM et utilisés pour calculer le volume de diffusion en dôme de l'EWNS selon notre méthode validée précédemment⁸. En supposant que l'EVNS embarqué ait le même volume, le diamètre équivalent peut être calculé à partir de l'équation (2).
Conformément à notre méthode précédemment développée, un piège à spin à résonance paramagnétique électronique (RPE) a été utilisé pour détecter la présence d'intermédiaires radicalaires de courte durée dans les EWNS. Les aérosols ont été mis en contact avec une solution contenant 235 mM de DEPMPO (5-(diéthoxyphosphoryl)-5-méthyl-1-pyrroline-N-oxyde) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Toutes les mesures RPE ont été réalisées à l'aide d'un spectromètre Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, États-Unis) et de réseaux de cellules planes. Le logiciel Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, États-Unis) a été utilisé pour l'acquisition et l'analyse des données. La caractérisation des ROS a été effectuée uniquement pour des conditions opératoires spécifiques [-6,5 kV, 4,0 cm]. Les concentrations d'EWNS ont été mesurées par SMPS après correction des pertes d'EWNS dans l'impacteur.
Les niveaux d'ozone ont été surveillés à l'aide d'un moniteur d'ozone à double faisceau 205™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Pour toutes les propriétés EWNS, la valeur mesurée correspond à la moyenne des mesures et l'erreur de mesure à l'écart type. Un test t a été réalisé afin de comparer la valeur de l'attribut EWNS optimisé à la valeur correspondante de l'attribut EWNS de base.
La figure 2c présente un système de précipitation électrostatique (EPES) précédemment développé et caractérisé, permettant de cibler des particules EWNS11 sur des surfaces. L'EPES utilise une charge EWNS combinée à un champ électrique intense pour diriger les particules directement vers la surface cible. Les détails du système EPES sont présentés dans une publication récente de Pyrgiotakis et al.11. L'EPES se compose d'une chambre en PVC imprimée en 3D, à extrémités coniques, contenant deux plaques métalliques parallèles en acier inoxydable (acier inoxydable 304, poli miroir) distantes de 15,24 cm. Ces plaques sont reliées à une source de haute tension externe (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY). La plaque inférieure est toujours positive et la plaque supérieure toujours mise à la terre (flottante). Les parois de la chambre sont recouvertes d'une feuille d'aluminium, elle-même mise à la terre pour éviter toute perte de particules. La chambre est équipée d'une porte de chargement frontale étanche permettant de placer les surfaces à tester sur des supports en plastique, les surélevant ainsi de la plaque métallique inférieure afin d'éviter les interférences de haute tension.
L'efficacité de dépôt de l'EWNS dans l'EPES a été calculée selon un protocole précédemment développé et détaillé dans la figure supplémentaire S111.
Dans la chambre de contrôle, le second flux traversant la chambre cylindrique est connecté en série avec le système EPES via un filtre HEPA intermédiaire afin d'éliminer les particules fines (EWNS). Comme illustré sur la figure 2c, l'aérosol EWNS est pompé à travers deux chambres connectées en série. Le filtre situé entre la chambre de contrôle et le système EPES élimine toute trace d'EWNS, garantissant ainsi des niveaux de température (T), d'humidité relative (HR) et d'ozone identiques.
Des micro-organismes importants d'origine alimentaire ont été trouvés contaminant les produits frais, tels qu'Escherichia coli (ATCC n° 27325), un indicateur de contamination fécale, Salmonella enterica (ATCC n° 53647), un pathogène d'origine alimentaire, Listeria innocua (ATCC n° 33090), une alternative à la pathogène Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC n° 4098) comme alternative à la levure d'altération, et Mycobacterium parafortuitous (ATCC n° 19686) comme bactérie vivante plus résistante. Ces souches ont été achetées auprès de l'ATCC (Manassas, Virginie).
Achetez au hasard des barquettes de tomates cerises bio sur votre marché local et conservez-les au réfrigérateur à 4 °C jusqu'à utilisation (3 jours maximum). Choisissez des tomates d'un seul calibre, environ 1,25 cm de diamètre, pour vos essais.
Les protocoles d'incubation, d'inoculation, d'exposition et de comptage des colonies ont été détaillés dans nos publications précédentes et expliqués en détail dans les données supplémentaires 11. L'efficacité du traitement EWNS a été évaluée en exposant des tomates inoculées à 40 000 #/cm³ pendant 45 minutes. Brièvement, à t = 0 min, trois tomates ont été utilisées pour évaluer la survie des micro-organismes. Trois tomates ont été placées dans l'EPES et exposées à l'EWNS à 40 000 #/cm³ (tomates exposées à l'EWNS), tandis que trois autres ont été placées dans la chambre témoin (tomates témoins). Aucun traitement supplémentaire n'a été appliqué aux tomates. Les tomates exposées à l'EWNS et les tomates témoins ont été retirées après 45 minutes afin d'évaluer l'effet du traitement EWNS.
Chaque expérience a été réalisée en trois exemplaires. L'analyse des données a été effectuée conformément au protocole décrit dans les données supplémentaires.
Des échantillons bactériens d'E. coli, d'Enterobacter et de L. innocua, exposés à un aérosol de fumées électroniques (EWNS) (45 min, concentration de 40 000 particules/cm³) et non exposés, ont été centrifugés afin d'évaluer les mécanismes d'inactivation. Le précipité a été fixé pendant 2 heures à température ambiante dans une solution de cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,4) contenant 2,5 % de glutaraldéhyde, 1,25 % de paraformaldéhyde et 0,03 % d'acide picrique. Après lavage, les échantillons ont été fixés avec une solution de tétroxyde d'osmium (OsO₄) à 1 % et de ferrocyanure de potassium (KFeCN₆) à 1,5 % pendant 2 heures, puis lavés 3 fois à l'eau et incubés dans une solution d'acétate d'uranyle à 1 % pendant 1 heure, avant d'être lavés deux fois à l'eau. La déshydratation a ensuite été réalisée par bains successifs d'alcool à 50 %, 70 %, 90 % et 100 % pendant 10 minutes chacun. Les échantillons ont ensuite été placés dans de l'oxyde de propylène pendant une heure, puis imprégnés d'un mélange à parts égales d'oxyde de propylène et d'Epon TAAP (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). Ils ont ensuite été enrobés dans de l'Epon TAAB et polymérisés à 60 °C pendant 48 heures. La résine granulaire polymérisée a été coupée et observée par microscopie électronique à transmission (MET) à l'aide d'un microscope JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Japon), un microscope électronique à transmission conventionnel équipé d'une caméra CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, États-Unis).
Toutes les expériences ont été réalisées en trois exemplaires. Pour chaque point de mesure, les lavages bactériens ont été ensemencés en trois exemplaires, ce qui a permis d'obtenir neuf points de données par point. La moyenne de ces neuf points a été utilisée pour déterminer la concentration bactérienne de l'organisme considéré. L'écart type a été utilisé comme indicateur d'erreur de mesure. Tous les points sont pris en compte.
Le logarithme de la diminution de la concentration bactérienne par rapport à t = 0 min a été calculé à l'aide de la formule suivante :
où C0 est la concentration de bactéries dans l'échantillon témoin au temps 0 (c'est-à-dire après que la surface a séché mais avant d'être placée dans la chambre) et Cn est la concentration de bactéries sur la surface après n minutes d'exposition.
Pour tenir compte de la dégradation naturelle des bactéries pendant la période d'exposition de 45 minutes, la réduction logarithmique a également été calculée par rapport au témoin à 45 minutes comme suit :
Où Cn représente la concentration de bactéries dans l'échantillon témoin au temps n et Cn-Contrôle représente la concentration de bactéries témoins au temps n. Les données sont présentées sous forme de réduction logarithmique par rapport au témoin (absence d'exposition à l'EWNS).
Au cours de cette étude, plusieurs combinaisons de tension et de distance entre l'aiguille et la contre-électrode ont été évaluées en termes de formation et de stabilité du cône de Taylor, de stabilité de la production d'EWNS et de reproductibilité. Différentes combinaisons sont présentées dans le tableau supplémentaire S1. Deux cas ont été sélectionnés pour une étude complète démontrant des propriétés stables et reproductibles (cône de Taylor, production d'EWNS et stabilité dans le temps). La figure 3 présente les résultats relatifs à la charge, la taille et la teneur en ROS pour ces deux cas. Ces résultats sont également résumés dans le tableau 1. À titre de référence, la figure 3 et le tableau 1 incluent les propriétés des EWNS non optimisés précédemment synthétisés^{8, 9, 10, 11} (EWNS de référence). Les calculs de signification statistique, effectués à l'aide d'un test t bilatéral, sont reproduits dans le tableau supplémentaire S2. Des données supplémentaires incluent des études sur l'effet du diamètre (D) de l'orifice d'échantillonnage de la contre-électrode et de la distance (L) entre l'électrode de masse et l'extrémité de l'aiguille (figures supplémentaires S2 et S3).
(a–c) Distribution granulométrique AFM. (d – f) Caractéristique de charge de surface. (g) Caractérisation des ROS et de la RPE.
Il est également important de noter que, dans toutes les conditions décrites ci-dessus, les courants d'ionisation mesurés se situaient entre 2 et 6 µA, et les tensions entre -3,8 et -6,5 kV, ce qui correspond à une consommation électrique inférieure à 50 mW pour ce module de génération d'EWNS à terminal unique. Bien que l'EWNS ait été synthétisé sous haute pression, les niveaux d'ozone sont restés très faibles, n'excédant jamais 60 ppb.
La figure supplémentaire S4 présente les champs électriques simulés pour les scénarios [-6,5 kV, 4,0 cm] et [-3,8 kV, 0,5 cm]. Les champs calculés pour ces scénarios sont respectivement de 2 × 10⁵ V/m et 4,7 × 10⁵ V/m. Ce résultat est conforme aux attentes, le rapport tension/distance étant nettement plus élevé dans le second cas.
Les figures 3a et 3b présentent le diamètre des EWNS mesuré par AFM8. Les diamètres moyens des EWNS pour les scénarios [-6,5 kV, 4,0 cm] et [-3,8 kV, 0,5 cm] ont été calculés à 27 nm et 19 nm, respectivement. Les écarts-types géométriques des distributions pour ces scénarios sont de 1,41 et 1,45, respectivement, ce qui indique une distribution granulométrique étroite. La taille moyenne et l'écart-type géométrique sont très proches de ceux des EWNS de référence (25 nm et 1,41, respectivement). La figure 3c présente la distribution granulométrique des EWNS de référence, mesurée par la même méthode et dans les mêmes conditions.
Les figures 3d et 3e présentent les résultats de la caractérisation de la charge. Les données correspondent à la moyenne de 30 mesures simultanées de la concentration (nombre de porteurs/cm³) et du courant (I). L'analyse montre que la charge moyenne sur l'EWNS est de 22 ± 6 e⁻ et de 44 ± 6 e⁻ pour les configurations [-6,5 kV, 4,0 cm] et [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivement. Comparée à l'EWNS de référence (10 ± 2 e⁻), la charge de surface est nettement supérieure : deux fois plus élevée pour la configuration [-6,5 kV, 4,0 cm] et quatre fois plus élevée pour la configuration [-3,8 kV, 0,5 cm]. La figure 3f présente les données de paiement de base de l'EWNS.
D’après les cartes de concentration des EWNS (figures supplémentaires S5 et S6), la scène [-6,5 kV, 4,0 cm] présente un nombre de particules nettement supérieur à celui de la scène [-3,8 kV, 0,5 cm]. Il convient également de noter que les concentrations d’EWNS ont été suivies pendant une durée allant jusqu’à 4 heures (figures supplémentaires S5 et S6), la stabilité de la génération d’EWNS présentant des concentrations de particules similaires dans les deux cas.
La figure 3g présente le spectre RPE après soustraction du signal de fond pour les EWNS optimisés à [-6,5 kV, 4,0 cm]. Le spectre des ROS est également comparé à celui des EWNS de référence d'une publication antérieure. Le nombre calculé d'EWNS réagissant avec le piège à spin est de 7,5 × 10⁴ EWNS/s, une valeur similaire à celle des EWNS de référence (Baseline-EWNS8) publiées précédemment. Les spectres RPE indiquent clairement la présence de deux types de ROS : O₂⁻ est prédominant, tandis que OH• est présent en plus faible quantité. De plus, une comparaison directe des intensités des pics montre que les EWNS optimisés présentent une teneur en ROS significativement plus élevée que les EWNS de référence.
La figure 4 illustre l'efficacité de dépôt des EWNS dans l'EPES. Ces données sont également résumées dans le tableau I et comparées aux données initiales des EWNS. Dans les deux cas d'EWNS, le dépôt était proche de 100 %, même à une faible tension de 3,0 kV. Généralement, 3,0 kV suffisent pour atteindre un dépôt de 100 %, indépendamment de la variation de charge de surface. Dans les mêmes conditions, l'efficacité de dépôt des EWNS de référence n'était que de 56 %, en raison de leur charge plus faible (en moyenne 10 électrons par EWNS).
La figure 5 et le tableau 2 résument le degré d'inactivation des micro-organismes inoculés à la surface des tomates après exposition à environ 40 000 #/cm³ de faisceaux d'électrons non ionisés (EWNS) pendant 45 minutes dans les conditions optimales [-6,5 kV, 4,0 cm]. Les souches d'E. coli et de L. innocua inoculées ont présenté une réduction significative de 3,8 log après 45 minutes d'exposition. Dans les mêmes conditions, S. enterica a présenté une réduction logarithmique plus faible de 2,2 log, tandis que S. cerevisiae et M. parafortuitum ont présenté une réduction de 1,0 log.
Les micrographies électroniques (figure 6) illustrent les modifications physiques induites par le courant d'eau ionique (EWNS) dans les cellules d'E. coli, de Salmonella enterica et de L. innocua, conduisant à leur inactivation. Les bactéries témoins présentaient des membranes cellulaires intactes, tandis que les bactéries exposées avaient des membranes externes endommagées.
L'imagerie au microscope électronique des bactéries témoins et exposées a révélé des dommages membranaires.
Les données relatives aux propriétés physico-chimiques des EWNS optimisées montrent collectivement que leurs propriétés (charge de surface et teneur en ROS) ont été significativement améliorées par rapport aux données de référence publiées précédemment^8,9,10,11. Par ailleurs, leur taille est restée de l'ordre du nanomètre, ce qui est très proche des résultats publiés antérieurement et leur permet de persister longtemps dans l'air. La polydispersité observée peut s'expliquer par des variations de la charge de surface, qui déterminent l'amplitude de l'effet Rayleigh, le caractère aléatoire et le risque de fusion des EWNS. Cependant, comme l'ont détaillé Nielsen et al.²², une charge de surface élevée réduit l'évaporation en augmentant l'énergie/tension superficielle de la goutte d'eau. Cette théorie a été confirmée expérimentalement pour les microgouttelettes²² et les EWNS dans notre publication précédente⁸. La perte de matière au fil du temps peut également affecter la taille et contribuer à la distribution granulométrique observée.
De plus, la charge par structure est d'environ 22 à 44 e⁻, selon les circonstances, ce qui est nettement supérieur à celle de l'EWNS de base, dont la charge moyenne est de 10 ± 2 électrons par structure. Il convient toutefois de préciser qu'il s'agit de la charge moyenne de l'EWNS. Seto et al. ont montré que la charge n'est pas uniforme et suit une distribution log-normale²¹. Par rapport à nos travaux précédents, le doublement de la charge de surface double l'efficacité de dépôt dans le système EPES, qui atteint presque 100 %¹¹.