Kiitos, että kävit Nature.com-sivustolla. Käytät selainversiota, jossa on rajoitettu CSS-tuki. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Äskettäin on kehitetty kemikaaliton nanoteknologiaan perustuva antimikrobinen alusta, jossa käytetään keinotekoisia veden nanorakenteita (EWNS). EWNS:illä on korkea pintavaraus ja ne sisältävät runsaasti reaktiivisia happilajeja (ROS), jotka voivat olla vuorovaikutuksessa useiden mikro-organismien, mukaan lukien elintarvikkeista peräisin olevien patogeenien, kanssa ja inaktivoida niitä. Tässä osoitetaan, että niiden ominaisuuksia synteesin aikana voidaan hienosäätää ja optimoida niiden antibakteerisen potentiaalin parantamiseksi entisestään. EWNS-laboratorioalusta suunniteltiin EWNS:ien ominaisuuksien hienosäätämiseksi muuttamalla synteesiparametreja. EWNS:ien ominaisuuksien (varaus, koko ja ROS-pitoisuus) karakterisointi suoritettiin käyttämällä nykyaikaisia ​​analyyttisiä menetelmiä. Lisäksi elintarvikkeiden mikro-organismeja, kuten Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum ja Saccharomyces cerevisiae, inokuloitiin luomurypäletomaattien pinnalle niiden mikrobien inaktivointipotentiaalin arvioimiseksi. Tässä esitetyt tulokset osoittavat, että EWNS:ien ominaisuuksia voidaan hienosäätää synteesin aikana, mikä johtaa inaktivointitehokkuuden eksponentiaaliseen kasvuun. Erityisesti pintavaraus kasvoi nelinkertaiseksi ja ROS-pitoisuus kasvoi. Mikrobien poistonopeus riippui mikrobitasosta ja vaihteli 1,0:stä 3,8 log10:een 45 minuutin altistuksen jälkeen 40 000 #/cm3 EWNS:n aerosoliannokselle.
Mikrobien aiheuttama kontaminaatio on tärkein syy ruokamyrkytykseen, jonka aiheuttavat taudinaiheuttajien tai niiden toksiinien nauttiminen. Ruokamyrkytykseen liittyvät sairaudet aiheuttavat vuosittain noin 76 miljoonaa sairastumista, 325 000 sairaalahoitoa ja 5 000 kuolemantapausta pelkästään Yhdysvalloissa1. Lisäksi Yhdysvaltain maatalousministeriö (USDA) arvioi, että tuoreiden tuotteiden lisääntynyt kulutus on vastuussa 48 prosentista kaikista Yhdysvalloissa raportoiduista ruokamyrkyistä2. Ruokamyrkytykseen liittyvien taudinaiheuttajien aiheuttamien sairauksien ja kuolemien kustannukset Yhdysvalloissa ovat erittäin korkeat, ja tautien torjunta- ja ehkäisykeskukset (CDC) arvioivat niiden olevan yli 15,6 miljardia Yhdysvaltain dollaria vuodessa3.
Tällä hetkellä kemiallisia4, säteily-5 ja termisiä6 antimikrobisia toimenpiteitä elintarviketurvallisuuden varmistamiseksi toteutetaan pääasiassa rajoitetuissa kriittisissä valvontapisteissä (CCP) tuotantoketjussa (yleensä sadonkorjuun jälkeen ja/tai pakkaamisen aikana) sen sijaan, että niitä toteutettaisiin jatkuvasti siten, että tuoreet tuotteet altistuvat ristikontaminaatiolle7. Antimikrobisia toimenpiteitä tarvitaan elintarvikeperäisten sairauksien ja elintarvikkeiden pilaantumisen torjumiseksi paremmin, ja niitä on mahdollista soveltaa koko maatilalta pöytään -jatkumossa. Pienemmät vaikutukset ja kustannukset.
Nanoteknologiaan perustuva kemikaaliton antimikrobinen alusta on äskettäin kehitetty bakteerien inaktivoimiseksi pinnoilla ja ilmassa käyttämällä keinotekoisia veden nanorakenteita (EWNS). EVNS:n synteesissä käytettiin kahta rinnakkaista prosessia: sähkösuihkutusta ja vesiionisaatiota (kuva 1a). EWNS:llä on aiemmin osoitettu olevan ainutlaatuinen joukko fysikaalisia ja biologisia ominaisuuksia8,9,10. EWNS:llä on keskimäärin 10 elektronia rakennetta kohden ja keskimääräinen nanometrikoko on 25 nm (kuva 1b,c)8,9,10. Lisäksi elektronispinresonanssi (ESR) osoitti, että EWNS:t sisältävät suuren määrän reaktiivisia happilajeja (ROS), pääasiassa hydroksyyli- (OH•) ja superoksidiradikaaleja (O2-) (kuva 1c)8. EWNS pysyi ilmassa pitkään ja saattoi törmätä ilmassa ja pinnoilla olevien mikrobien kanssa, jolloin ne toimittivat ROS-hyötykuormansa ja aiheuttivat mikrobien inaktivoinnin (kuva 1d). Nämä aikaisemmat tutkimukset osoittivat myös, että EWNS voi olla vuorovaikutuksessa useiden kansanterveydellisesti tärkeiden gramnegatiivisten ja grampositiivisten bakteerien, mukaan lukien mykobakteerien, kanssa ja inaktivoida niitä pinnoilla ja ilmassa8,9. Läpäisyelektronimikroskopia osoitti, että inaktivoitumisen aiheutti solukalvon vaurioituminen. Lisäksi akuutit inhalaatiotutkimukset ovat osoittaneet, että suuret EWNS-annokset eivät aiheuta keuhkovaurioita tai tulehdusta8.
(a) Sähkösuihkutus tapahtuu, kun korkea jännite kohdistetaan nestettä sisältävän kapillaarin ja vastaelektrodin väliin. (b) Korkean jännitteen kohdistaminen johtaa kahteen eri ilmiöön: (i) veden sähkösuihkutukseen ja (ii) reaktiivisten happilajien (ionien) muodostumiseen, jotka jäävät loukkuun EWNS:ään. (c) EWNS:n ainutlaatuinen rakenne. (d) EWNS:t ovat erittäin liikkuvia nanomittakaavan luonteensa vuoksi ja voivat olla vuorovaikutuksessa ilmassa olevien patogeenien kanssa.
EWNS-antimikrobiaalisen alustan kyky inaktivoida elintarvikkeissa olevia mikro-organismeja tuoreen elintarvikkeen pinnalla on myös äskettäin osoitettu. On myös osoitettu, että EWNS-pintavarausta voidaan käyttää yhdessä sähkökentän kanssa kohdennettuun annosteluun. Vielä tärkeämpää on, että lupaava alustava tulos: noin 1,4 log-yksikön väheneminen orgaanisten tomaattien aktiivisuudessa erilaisia ​​elintarvikkeiden mikro-organismeja, kuten E. colia ja Listeriaa, vastaan ​​havaittiin 90 minuutin kuluessa altistamisesta EWNS:lle noin 50 000#/cm311-pitoisuudella. Lisäksi alustavat aistinvaraiset arviointitestit eivät osoittaneet aistinvaraista vaikutusta verrattuna kontrollitomaattiin. Vaikka nämä alustavat inaktivointitulokset lupaavat elintarviketurvallisuutta jopa hyvin pienillä EWNS-annoksilla, 50 000#/cc, on selvää, että suurempi inaktivointipotentiaali olisi edullisempi infektio- ja pilaantumisriskin vähentämiseksi entisestään.
Tässä tutkimuksessa keskitymme EWNS-synteesialustan kehittämiseen synteesiparametrien hienosäätämiseksi ja EWNS-synteesien fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien optimoimiseksi niiden antibakteerisen potentiaalin parantamiseksi. Optimoinnissa on keskitytty erityisesti niiden pintavarauksen (kohdennetun kulkeutumisen parantamiseksi) ja ROS-pitoisuuden (inaktivointitehokkuuden parantamiseksi) lisäämiseen. Optimoitujen fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien (koko, varaus ja ROS-pitoisuus) karakterisointi nykyaikaisilla analyyttisillä menetelmillä ja yleisten elintarvike-mikro-organismien, kuten E. colin, S. enterican, L. innocuan, S. cerevisiaen ja M. parafortuitumin, avulla.
EVNS syntetisoitiin samanaikaisesti sähköruiskutuksella ja ionisaatiolla erittäin puhtaasta vedestä (18 MΩ cm–1). Sähköistä sumutinta 12 käytetään tyypillisesti nesteiden ja kontrolloidun kokoisten synteettisten polymeerien ja keraamisten hiukkasten 13 ja kuitujen 14 sumuttamiseen.
Kuten aiemmissa julkaisuissa 8, 9, 10, 11 on yksityiskohtaisesti kuvattu, tyypillisessä kokeessa metallikapillaarin ja maadoitetun vastaelektrodin väliin syötetään korkea jännite. Tämän prosessin aikana tapahtuu kaksi eri ilmiötä: 1) sähkösuihkutus ja 2) veden ionisaatio. Kahden elektrodin välinen voimakas sähkökenttä aiheuttaa negatiivisten varausten kertymistä kondensoituneen veden pinnalle, mikä johtaa Taylor-kartioiden muodostumiseen. Tämän seurauksena muodostuu voimakkaasti varautuneita vesipisaroita, jotka jatkavat hajoamista pienemmiksi hiukkasiksi Rayleigh'n teorian16 mukaisesti. Samaan aikaan voimakas sähkökenttä aiheuttaa joidenkin vesimolekyylien hajoamisen ja elektronien irrottamisen (ionisaatio), jolloin syntyy suuri määrä reaktiivisia happilajeja (ROS)17. Samanaikaisesti generoidut ROS18-paketit kapseloitiin EWNS:ään (kuva 1c).
Kuvassa 2a on esitetty tässä tutkimuksessa kehitetty ja käytetty EWNS-synteesissä käytetty EWNS-generointijärjestelmä. Suljetussa pullossa säilytettyä puhdistettua vettä syötettiin teflonputken (sisähalkaisija 2 mm) läpi 30G:n ruostumattomasta teräksestä valmistettuun neulaan (metallinen kapillaari). Kuten kuvassa 2b on esitetty, veden virtausta säädetään pullon sisällä olevalla ilmanpaineella. Neula on kiinnitetty teflonkonsoliin, jota voidaan säätää manuaalisesti tietylle etäisyydelle vastaelektrodista. Vastaelektrodi on kiillotettu alumiinilevy, jonka keskellä on reikä näytteenottoa varten. Vastaelektrodin alapuolella on alumiininen näytteenottosuppilo, joka on yhdistetty muuhun kokeelliseen laitteistoon näytteenottoportin kautta (kuva 2b). Kaikki näytteenottimen komponentit on maadoitettu sähköisesti, jotta vältetään varauksen kertyminen, joka voisi heikentää hiukkasnäytteenottoa.
(a) Teknisen veden nanorakenteiden generointijärjestelmä (EWNS). (b) Näytteenottajan ja sähköruiskutusyksikön poikkileikkaus, jossa näkyvät tärkeimmät parametrit. (c) Bakteerien inaktivoinnin kokeellinen järjestely.
Edellä kuvattu EWNS-generointijärjestelmä pystyy muuttamaan keskeisiä toimintaparametreja EWNS-ominaisuuksien hienosäädön helpottamiseksi. Säädä käytettyä jännitettä (V), neulan ja vastaelektrodin välistä etäisyyttä (L) ja veden virtausta (φ) kapillaarin läpi EWNS-ominaisuuksien hienosäätämiseksi. Symboleja [V (kV), L (cm)] käytetään merkitsemään eri yhdistelmiä. Säädä veden virtausta saadaksesi vakaan Taylor-kartion tietyllä joukolla [V, L]. Tässä tutkimuksessa vastaelektrodin (D) aukko asetettiin 0,5 tuumaan (1,29 cm).
Rajoitetun geometrian ja epäsymmetrian vuoksi sähkökentän voimakkuutta ei voida laskea ensisijaisten periaatteiden perusteella. Sen sijaan sähkökentän laskemiseen käytettiin QuickField™-ohjelmistoa (Svendborg, Tanska)19. Sähkökenttä ei ole tasainen, joten kapillaarin kärjessä olevan sähkökentän arvoa käytettiin vertailuarvona eri konfiguraatioissa.
Tutkimuksen aikana arvioitiin useita neulan ja vastaelektrodin välisen jännitteen ja etäisyyden yhdistelmiä Taylor-kartion muodostumisen, Taylor-kartion vakauden, EWNS-tuotannon vakauden ja toistettavuuden kannalta. Erilaisia ​​yhdistelmiä on esitetty lisätaulukossa S1.
EWNS-generointijärjestelmän lähtö kytkettiin suoraan Scanning Mobility Particle Sizer -laitteeseen (SMPS, malli 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) hiukkasten lukumäärän pitoisuuden mittaamiseksi ja sitä käytettiin Faraday-aerosolielektrometrin (TSI, malli 3068B, Shoreview, USA) kanssa aerosolivirtausten mittaamiseksi, kuten edellisessä julkaisussamme9 on kuvattu. Sekä SMPS että aerosolielektrometri ottivat näytteen virtausnopeudella 0,5 l/min (näytteen kokonaisvirtaus 1 l/min). Hiukkaspitoisuudet ja aerosolivuot mitattiin 120 sekunnin ajan. Toista mittaus 30 kertaa. Aerosolin kokonaisvaraus lasketaan virtausmittauksista ja keskimääräinen EWNS-varaus arvioidaan näytteistettyjen EWNS-hiukkasten kokonaismäärästä. EWNS:n keskimääräiset kustannukset voidaan laskea yhtälöllä (1):
jossa IEl on mitattu virta, NSMPS on SMPS:llä mitattu lukumääräinen konsentraatio ja φEl on virtausnopeus elektrometriin.
Koska suhteellinen kosteus (RH) vaikuttaa pintavaraukseen, lämpötila ja (RH) pidettiin vakioina 21 °C:ssa ja 45 %:ssa kokeen aikana.
Atomivoimamikroskopiaa (AFM), Asylum MFP-3D -laitetta (Asylum Research, Santa Barbara, CA) ja AC260T-anturia (Olympus, Tokio, Japani) käytettiin EWNS:n koon ja eliniän mittaamiseen. AFM-skannaustaajuus on 1 Hz ja skannausalue on 5 µm × 5 µm ja skannausviivaa on 256. Kaikille kuville tehtiin ensimmäisen asteen kuvankohdistus Asylum-ohjelmistolla (maski, jonka alue oli 100 nm ja kynnysarvo 100 pm).
Poista näytteenottosuppilo ja aseta kiillepinta 2,0 cm:n etäisyydelle vastaelektrodista keskimäärin 120 sekunnin ajaksi, jotta vältetään hiukkasten yhteenkasvaminen ja epäsäännöllisten pisaroiden muodostuminen kiillepinnalle. EWNS levitettiin suoraan vastaleikatuille kiillepinnoille (Ted Pella, Redding, CA). Välittömästi sputteroinnin jälkeen kiillepinta visualisoitiin AFM:llä. Vastaleikatun, muokkaamattoman kiilteen pinnan kosketuskulma on lähellä 0°, joten EWNS etenee kiillepinnan yli kupumaisesti20. Difundoituvien pisaroiden halkaisija (a) ja korkeus (h) mitattiin suoraan AFM-topografiasta ja niitä käytettiin kupumaisen diffuusiotilavuuden EWNS laskemiseen aiemmin validoidulla menetelmällämme8. Olettaen, että sisäänrakennetulla EVNS:llä on sama tilavuus, ekvivalenttihalkaisija voidaan laskea yhtälöstä (2):
Aiemmin kehittämämme menetelmän mukaisesti elektronispinresonanssiin (ESR) perustuvaa spinloukkua käytettiin lyhytikäisten radikaalivälituotteiden havaitsemiseen EWNS:ssä. Aerosolit johdettiin liuoksen läpi, joka sisälsi 235 mM DEPMPO:ta (5-(dietoksifosforyyli)-5-metyyli-1-pyrroliini-N-oksidia) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Kaikki EPR-mittaukset tehtiin Bruker EMX -spektrometrillä (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) ja litteillä kennomatriiseilla. Datan keräämiseen ja analysointiin käytettiin Acquisit-ohjelmistoa (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA). ROS-karakterisointi suoritettiin vain tietyille käyttöolosuhteille [-6,5 kV, 4,0 cm]. EWNS-pitoisuudet mitattiin SMPS:llä ottaen huomioon EWNS:n hävikki impaktorissa.
Otsonitasoja seurattiin käyttämällä 205 Dual Beam Ozone Monitor™ -laitetta (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Kaikkien EWNS-ominaisuuksien osalta mittausarvo on mittausten keskiarvo ja mittausvirhe on keskihajonta. T-testillä verrattiin optimoidun EWNS-attribuutin arvoa vastaavaan EWNS-perusarvoon.
Kuvassa 2c on esitetty aiemmin kehitetty ja karakterisoitu sähköstaattinen saostusjärjestelmä (EPES), jota voidaan käyttää EWNS11:n kohdistamiseen pinnoille. EPES käyttää EWNS-varausta yhdessä voimakkaan sähkökentän kanssa "osoittaakseen" suoraan kohteen pintaan. EPES-järjestelmän yksityiskohdat on esitetty Pyrgiotakis et al.11:n tuoreessa julkaisussa. EPES koostuu siis 3D-tulostetusta PVC-kammiosta, jonka kartiomaiset päät sisältävät kaksi rinnakkaista ruostumattomasta teräksestä (304 ruostumaton teräs, peilikiillotettu) valmistettua metallilevyä keskellä 15,24 cm:n etäisyydellä toisistaan. Levyt oli kytketty ulkoiseen korkeajännitelähteeseen (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), pohjalevy oli aina positiivinen ja ylälevy oli aina maadoitettu (kelluva). Kammion seinät on peitetty alumiinifoliolla, joka on sähköisesti maadoitettu hiukkasten häviämisen estämiseksi. Kammiossa on suljettu etulatausluukku, jonka avulla testipinnat voidaan asettaa muovitelineille ja nostaa ne irti pohjalevystä korkeajännitehäiriöiden välttämiseksi.
EWNS:n laskeutumistehokkuus EPES:ssä laskettiin aiemmin kehitetyn protokollan mukaisesti, joka on yksityiskohtaisesti esitetty lisäkuvassa S111.
Ohjauskammiona toinen virtaus sylinterimäisen kammion läpi on kytketty sarjaan EPES-järjestelmän kanssa käyttämällä välissä olevaa HEPA-suodatinta EWNS:n poistamiseksi. Kuten kuvassa 2c on esitetty, EWNS-aerosolia pumpattiin kahden sarjaan kytketyn kammion läpi. Ohjaushuoneen ja EPES:n välinen suodatin poistaa kaikki jäljellä olevat EWNS:t, jolloin lämpötila (T), suhteellinen kosteus (RH) ja otsonipitoisuudet pysyvät samoina.
Tärkeiden elintarvikeperäisten mikro-organismien on havaittu saastuttavan tuoreita tuotteita. Näitä ovat esimerkiksi Escherichia coli (ATCC #27325), ulosteperäinen indikaattori, Salmonella enterica (ATCC #53647), elintarvikeperäinen patogeeni, ja Listeria innocua (ATCC #33090), vaihtoehto patogeeniselle Listeria monocytogenes -bakteerille. ATCC:ltä (Manassas, Virginia) hankittiin Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) vaihtoehtona pilaantumishiivalle ja Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) vastustuskykyisempinä elävinä bakteereina.
Osta luomurypäletomaatteja laatikoittain paikalliselta torilta ja säilytä niitä jääkaapissa 4 °C:ssa käyttöön asti (enintään 3 päivää). Valitse kokeiltavaksi yhden kokoisia tomaatteja, halkaisijaltaan noin 1,5 cm.
Inkubointi-, inokulaatio-, altistus- ja pesäkelaskentaprotokollat ​​on kuvattu yksityiskohtaisesti aiemmissa julkaisuissamme ja selitetty yksityiskohtaisesti lisätiedoissa 11. EWNS:n suorituskykyä arvioitiin altistamalla inokuloidut tomaatit 40 000 #/cm3:lle 45 minuutin ajan. Lyhyesti sanottuna ajanhetkellä t = 0 min kolmea tomaattia käytettiin eloonjääneiden mikro-organismien arviointiin. Kolme tomaattia laitettiin EPES-astiaan ja altistettiin EWNS:lle 40 000 #/cc:n pitoisuudella (EWNS:lle altistetut tomaatit) ja kolme muuta laitettiin kontrollikammioon (kontrollitomaatit). Yhtäkään tomaattiryhmää ei käsitelty lisäkäsittelyllä. EWNS:lle altistetut tomaatit ja kontrollit poistettiin 45 minuutin kuluttua EWNS:n vaikutuksen arvioimiseksi.
Jokainen koe suoritettiin kolmena kappaleena. Data-analyysi suoritettiin lisätiedoissa kuvatun protokollan mukaisesti.
EWNS:lle (45 min, EWNS-aerosolipitoisuus 40 000 #/cm3) altistetut ja altistamattomat E. coli-, Enterobacter- ja L. innocua -bakteerinäytteet pelletoitiin inaktivaatiomekanismien arvioimiseksi. Sakkaa fiksoitiin 2 tuntia huoneenlämmössä 0,1 M natriumkakodylaattiliuoksessa (pH 7,4) fiksatiivilla, joka sisälsi 2,5 % glutaraldehydiä, 1,25 % paraformaldehydiä ja 0,03 % pikriinihappoa. Pesun jälkeen ne fiksoitiin 1 % osmiumtetroksidilla (OsO4) / 1,5 % kaliumferrosyanidilla (KFeCN6) 2 tunnin ajan, pestiin kolme kertaa vedellä ja inkuboitiin 1 % uranyyliasetaatissa 1 tunnin ajan, minkä jälkeen ne pestiin kahdesti vedellä. Tämän jälkeen näytteet dehydroitiin 10 minuuttia kutakin liuosta käyttäen 50 %, 70 %, 90 % ja 100 % alkoholia. Näytteet asetettiin sitten propyleenioksidiin yhdeksi tunniksi ja kyllästettiin propyleenioksidin ja TAAP Eponin 1:1-seoksella (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Näytteet upotettiin TAAB Eponiin ja polymeroitiin 60 °C:ssa 48 tuntia. Kovettunut rakeinen hartsi leikattiin ja visualisoitiin TEM:llä käyttäen JEOL 1200EX -laitetta (JEOL, Tokio, Japani), joka on tavanomainen läpäisyelektronimikroskooppi, joka on varustettu AMT 2k CCD-kameralla (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA).
Kaikki kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisnäytteenä. Jokaista aikapistettä kohden bakteeripesut maljattiin kolmena rinnakkaisnäytteenä, jolloin saatiin yhteensä yhdeksän datapistettä pistettä kohden, joiden keskiarvoa käytettiin kyseisen organismin bakteeripitoisuutena. Keskihajontaa käytettiin mittausvirheenä. Kaikki pisteet lasketaan.
Bakteeripitoisuuden laskun logaritmi verrattuna aikaan t = 0 min laskettiin seuraavalla kaavalla:
jossa C0 on bakteerien pitoisuus kontrollinäytteessä ajanhetkellä 0 (eli pinnan kuivuttua, mutta ennen kammioon asettamista) ja Cn on bakteerien pitoisuus pinnalla n minuutin altistuksen jälkeen.
Bakteerien luonnollisen hajoamisen huomioon ottamiseksi 45 minuutin altistusjakson aikana laskettiin myös log-vähennys verrattuna kontrolliin 45 minuutin kohdalla seuraavasti:
Jossa Cn on bakteerien pitoisuus kontrollinäytteessä ajanhetkellä n ja Cn-kontrolli on kontrollibakteerien pitoisuus ajanhetkellä n. Tiedot esitetään logaritmisena vähennyksenä verrattuna kontrolliin (ei EWNS-altistusta).
Tutkimuksen aikana arvioitiin useita neulan ja vastaelektrodin välisen jännitteen ja etäisyyden yhdistelmiä Taylor-kartion muodostumisen, Taylor-kartion stabiilisuuden, EWNS-tuotannon stabiilisuuden ja toistettavuuden kannalta. Erilaisia ​​yhdistelmiä on esitetty lisätaulukossa S1. Täydelliseen tutkimukseen valittiin kaksi tapausta, jotka osoittavat stabiilit ja toistettavissa olevat ominaisuudet (Taylor-kartio, EWNS-tuotanto ja stabiilius ajan kuluessa). Kuvassa 3 on esitetty kahden tapauksen tulokset ROS-varauksesta, koosta ja pitoisuudesta. Tulokset on myös esitetty yhteenvetona taulukossa 1. Vertailun vuoksi kuvassa 3 ja taulukossa 1 on esitetty aiemmin syntetisoitujen, optimoimattomien EWNS-yhdisteiden 8, 9, 10, 11 (lähtötaso-EWNS) ominaisuudet. Tilastollisen merkitsevyyden laskelmat, joissa käytettiin kaksisuuntaista t-testiä, on julkaistu uudelleen lisätaulukossa S2. Lisäksi lisätietoihin sisältyy tutkimuksia vastaelektrodin näytteenottoreiän halkaisijan (D) ja maadoituselektrodin ja neulan kärjen välisen etäisyyden (L) vaikutuksesta (lisäkuvat S2 ja S3).
(a–c) AFM:n kokojakauma. (d–f) Pintavarauksen ominaisuudet. (g) ROS:n ja ESR:n karakterisointi.
On myös tärkeää huomata, että kaikissa edellä mainituissa olosuhteissa mitatut ionisaatiovirrat olivat välillä 2–6 µA ja jännitteet välillä -3,8–6,5 kV, mikä johti tämän yksiterminaalisen EWNS-generaattorimoduulin tehonkulutukseen alle 50 mW. Vaikka EWNS syntetisoitiin korkeassa paineessa, otsonipitoisuudet olivat hyvin alhaiset, eivätkä koskaan ylittäneet 60 ppb:tä.
Lisäkuva S4 esittää simuloidut sähkökentät skenaarioissa [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm]. Skenaarioiden [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] mukaiset kentät on laskettu arvoiksi 2 × 105 V/m ja 4,7 × 105 V/m. Tämä on odotettavissa, koska jännitteen suhde etäisyyteen on paljon suurempi jälkimmäisessä tapauksessa.
Kuvassa 3a, b on esitetty AFM8:lla mitattu EWNS:n halkaisija. Skenaarioissa [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] keskimääräisiksi EWNS:n halkaisijaksi laskettiin vastaavasti 27 nm ja 19 nm. Tapauksissa [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm] jakaumien geometriset keskihajonnat ovat vastaavasti 1,41 ja 1,45, mikä osoittaa kapeaa kokojakaumaa. Sekä keskimääräinen koko että geometrinen keskihajonta ovat hyvin lähellä perustason EWNS:ää, ollen vastaavasti 25 nm ja 1,41. Kuvassa 3c on esitetty samalla menetelmällä ja samoissa olosuhteissa mitatun perustason EWNS:n kokojakauma.
Kuvassa 3d,e on esitetty varauksen karakterisoinnin tulokset. Tiedot ovat 30 samanaikaisen pitoisuus- (#/cm3) ja virta- (I) -mittauksen keskiarvoja. Analyysi osoittaa, että EWNS:n keskimääräinen varaus on 22 ± 6 e- ja 44 ± 6 e- vastaavasti skenaarioilla [-6,5 kV, 4,0 cm] ja [-3,8 kV, 0,5 cm]. Verrattuna perus-EWNS:ään (10 ± 2 e-), niiden pintavaraus on merkittävästi suurempi, kaksinkertainen [-6,5 kV, 4,0 cm] -skenaarioon verrattuna ja neljä kertaa suurempi [-3,8 kV, 0,5 cm] -skenaarioon verrattuna. Kuva 3f esittää EWNS:n perusmaksutiedot.
EWNS-hiukkasten lukumääräpitoisuuskartoista (lisäkuvat S5 ja S6) voidaan nähdä, että kohdassa [-6,5 kV, 4,0 cm] on huomattavasti enemmän hiukkasia kuin kohdassa [-3,8 kV, 0,5 cm]. On myös huomattava, että EWNS-hiukkasten lukumääräpitoisuuksia seurattiin jopa 4 tunnin ajan (lisäkuvat S5 ja S6), ja EWNS-hiukkasten muodostumisen stabiilius osoitti molemmissa tapauksissa samoja hiukkasten lukumääräpitoisuuksia.
Kuva 3g esittää EPR-spektrin kontrollin (taustan) vähentämisen jälkeen optimoidulle EWNS:lle jännitteellä [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS-spektriä on myös verrattu aiemmin julkaistun artikkelin EWNS:n perusviivaan. Laskettu spinloukun kanssa reagoivien EWNS:ien määrä on 7,5 × 104 EWNS/s, mikä on samankaltainen kuin aiemmin julkaistussa Baseline-EWNS8:ssa. EPR-spektrit osoittivat selvästi kahdenlaisten ROS-yhdisteiden läsnäolon, joissa O2- oli vallitseva, kun taas OH•:ta oli läsnä pienemmässä määrin. Lisäksi piikkien intensiteettien suora vertailu osoitti, että optimoidulla EWNS:llä oli merkittävästi korkeampi ROS-pitoisuus verrattuna EWNS:n perusviivaan.
Kuvassa 4 on esitetty EWNS:n laskeutumistehokkuus EPES:ssä. Tiedot on myös esitetty yhteenvetona taulukossa I ja niitä on verrattu alkuperäisiin EWNS-tietoihin. Molemmissa EUNS-tapauksissa laskeuma oli lähes 100 % jopa alhaisella 3,0 kV:n jännitteellä. Tyypillisesti 3,0 kV riittää 100 %:n laskeuman saavuttamiseen pintavarauksen muutoksesta riippumatta. Samoissa olosuhteissa Baseline-EWNS:n laskeutumistehokkuus oli vain 56 % alhaisemman varauksen vuoksi (keskimäärin 10 elektronia EWNS:ää kohden).
Kuvio 5 ja taulukko 2 esittävät yhteenvedon tomaattien pinnalle inokuloitujen mikro-organismien inaktivoitumisasteesta noin 40 000 #/cm3 EWNS-altistuksen jälkeen 45 minuutin ajan optimaalisessa skenaariossa [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokuloidut E. coli- ja L. innocua -bakteerit osoittivat merkittävää 3,8 logaritmin vähenemistä 45 minuutin altistuksen jälkeen. Samoissa olosuhteissa S. enterica osoitti pienempää 2,2 logaritmin vähenemistä, kun taas S. cerevisiae ja M. parafortuitum osoittivat 1,0 logaritmin vähenemistä.
Elektronimikroskooppikuvat (kuva 6), jotka kuvaavat EWNS:n aiheuttamia fyysisiä muutoksia E. coli-, Salmonella enterica- ja L. innocua -soluissa, jotka johtavat inaktivoitumiseen. Kontrollibakteereilla oli ehjät solukalvot, kun taas altistuneilla bakteereilla oli vaurioituneet ulkokalvot.
Kontrollin ja altistuneiden bakteerien elektronimikroskooppinen kuvantaminen paljasti kalvovaurioita.
Optimoitujen EWNS-vesisuihkujen fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien tiedot osoittavat yhdessä, että EWNS-vesisuihkujen ominaisuudet (pintavaraus ja ROS-pitoisuus) paranivat merkittävästi aiemmin julkaistuihin EWNS-lähtötietoihin verrattuna8,9,10,11. Toisaalta niiden koko pysyi nanometrialueella, mikä on hyvin samanlaista kuin aiemmin julkaistut tulokset, minkä ansiosta ne voivat pysyä ilmassa pitkään. Havaittu polydispersiteetti voidaan selittää pintavarauksen muutoksilla, jotka määräävät Rayleigh-ilmiön suuruuden, satunnaisuuden ja EWNS-vesisuihkujen mahdollisen yhdistymisen. Kuten Nielsen et al.22 ovat yksityiskohtaisesti esittäneet, suuri pintavaraus vähentää haihtumista lisäämällä tehokkaasti vesipisaran pintaenergiaa/jännitystä. Tämä teoria vahvistettiin kokeellisesti mikropisaroille22 ja EWNS-vesisuihkuille edellisessä julkaisussamme8. Ajan menetys voi myös vaikuttaa kokoon ja vaikuttaa havaittuun kokojakaumaan.
Lisäksi varaus rakennetta kohden on noin 22–44 e- olosuhteista riippuen, mikä on huomattavasti korkeampi verrattuna perus-EWNS:ään, jonka keskimääräinen varaus on 10 ± 2 elektronia rakennetta kohden. On kuitenkin huomattava, että tämä on EWNS:n keskimääräinen varaus. Seto ym. On osoitettu, että varaus ei ole tasainen ja noudattaa log-normaalijakaumaa21. Aiempaan työhömme verrattuna pintavarauksen kaksinkertaistaminen kaksinkertaistaa EPES-järjestelmän laskeutumistehokkuuden lähes 100 prosenttiin11.