Дякуємо за відвідування Nature.com. Ви використовуєте версію браузера з обмеженою підтримкою CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Крім того, для забезпечення постійної підтримки ми показуємо сайт без стилів та JavaScript.
Нещодавно було розроблено безхімічну антимікробну платформу на основі нанотехнологій з використанням штучних водних наноструктур (ШВН). ШВН мають високий поверхневий заряд і багаті на активні форми кисню (АФК), які можуть взаємодіяти та інактивувати низку мікроорганізмів, включаючи харчові патогени. Тут показано, що їхні властивості під час синтезу можна точно налаштувати та оптимізувати для подальшого підвищення їхнього антибактеріального потенціалу. Лабораторна платформа ШВН була розроблена для точного налаштування властивостей ШВН шляхом зміни параметрів синтезу. Характеристика властивостей ШВН (заряд, розмір та вміст АФК) була проведена за допомогою сучасних аналітичних методів. Крім того, харчові мікроорганізми, такі як Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum та Saccharomyces cerevisiae, були інокульовані на поверхню органічних виноградних помідорів для оцінки їхнього потенціалу мікробної інактивації. Результати, представлені тут, демонструють, що властивості ШВН можна точно налаштувати під час синтезу, що призводить до експоненціального збільшення ефективності інактивації. Зокрема, поверхневий заряд збільшився в чотири рази, а вміст активних форм кисню (ROS) збільшився. Швидкість видалення мікробів залежала від мікробів і коливалася від 1,0 до 3,8 log після 45 хвилин впливу аерозолю в дозі 40 000 #/см3 EWNS.
Мікробне забруднення є основною причиною харчових отруєнь, спричинених потраплянням патогенів або їх токсинів. Харчові отруєння є причиною близько 76 мільйонів захворювань, 325 000 госпіталізацій та 5000 смертей щороку лише у Сполучених Штатах1. Крім того, Міністерство сільського господарства США (USDA) оцінює, що збільшення споживання свіжих продуктів є причиною 48 відсотків усіх харчових отруєнь, зареєстрованих у Сполучених Штатах2. Вартість захворювань та смертей від харчових патогенів у Сполучених Штатах дуже висока, і, за оцінками Центрів з контролю та профілактики захворювань (CDC), вона становить понад 15,6 мільярда доларів США на рік3.
Наразі хімічні4, радіаційні5 та термічні6 антимікробні втручання для забезпечення безпеки харчових продуктів переважно впроваджуються в обмежених критичних контрольних точках (КТК) у виробничому ланцюжку (зазвичай після збору врожаю та/або під час упаковки), а не впроваджуються безперервно таким чином, щоб свіжі продукти піддавалися перехресному забрудненню7. Антимікробні втручання необхідні для кращого контролю харчових отруєнь та псування харчових продуктів, і мають потенціал для застосування на всьому етапі «від ферми до столу». Менший вплив та витрати.
Нещодавно було розроблено нанотехнологічну безхімічну антимікробну платформу для інактивації бактерій на поверхнях та в повітрі за допомогою штучних водних наноструктур (ШВН). Для синтезу ШВН використовувалися два паралельні процеси: електророзпилення та іонізація води (рис. 1a). Раніше було показано, що ШВН мають унікальний набір фізичних та біологічних властивостей8,9,10. ШВН мають в середньому 10 електронів на структуру та середній нанометровий розмір 25 нм (рис. 1b,c)8,9,10. Крім того, електронний спіновий резонанс (ЕСР) показав, що ШВН містять велику кількість активних форм кисню (АФК), головним чином гідроксильних (OH•) та супероксидних (O2-) радикалів (рис. 1c)8. ШВН залишаються в повітрі протягом тривалого часу та можуть стикатися з мікробами, завислими в повітрі та присутніми на поверхнях, доставляючи своє корисне навантаження АФК та ​​спричиняючи мікробну інактивацію (рис. 1d). Ці попередні дослідження також показали, що EWNS можуть взаємодіяти та інактивувати різні грамнегативні та грампозитивні бактерії, що мають значення для громадського здоров'я, включаючи мікобактерії, на поверхнях та в повітрі8,9. Трансмісійна електронна мікроскопія показала, що інактивація була спричинена порушенням клітинної мембрани. Крім того, дослідження гострої інгаляції показали, що високі дози EWNS не викликають пошкодження легень або запалення8.
(a) Електророзпилення відбувається, коли висока напруга прикладається між капіляром, що містить рідину, та протиелектродом. (b) Прикладання високої напруги призводить до двох різних явищ: (i) електророзпилення води та (ii) утворення активних форм кисню (іонів), що утримуються в EWNS. (c) Унікальна структура EWNS. (d) EWNS є дуже рухливими завдяки своїй нанорозмірній природі та можуть взаємодіяти з патогенами, що переносяться повітрям.
Нещодавно було продемонстровано здатність антимікробної платформи EWNS інактивувати харчові мікроорганізми на поверхні свіжих продуктів. Також було показано, що поверхневий заряд EWNS можна використовувати в поєднанні з електричним полем для цілеспрямованої доставки. Що ще важливіше, багатообіцяючий початковий результат зниження активності органічних томатів проти різних харчових мікроорганізмів, таких як кишкова паличка та лістерія, приблизно на 1,4 логарифмічного одиниці, спостерігався протягом 90 хвилин після впливу EWNS у концентрації приблизно 50 000#/см³11. Крім того, попередні органолептичні оціночні випробування не показали органолептичного ефекту порівняно з контрольним томатом. Хоча ці початкові результати інактивації обіцяють безпеку харчових продуктів навіть при дуже низьких дозах EWNS 50 000#/см³, очевидно, що вищий потенціал інактивації був би більш корисним для подальшого зниження ризику інфекції та псування.
Тут ми зосередимо наші дослідження на розробці платформи генерації EWNS для точного налаштування параметрів синтезу та оптимізації фізико-хімічних властивостей EWNS для підвищення їхнього антибактеріального потенціалу. Зокрема, оптимізація була зосереджена на збільшенні їх поверхневого заряду (для покращення цільової доставки) та вмісту активних форм кисню (АФК) (для підвищення ефективності інактивації). Характеристика оптимізованих фізико-хімічних властивостей (розмір, заряд та вміст АФК) за допомогою сучасних аналітичних методів та використання поширених харчових мікроорганізмів, таких як E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae та M. parafortuitum.
EVNS було синтезовано шляхом одночасного електророзпилення та іонізації води високої чистоти (18 МОм см–1). Електричний розпилювач 12 зазвичай використовується для розпилення рідин, синтетичних полімерних і керамічних частинок 13 і волокон 14 контрольованого розміру.
Як детально описано в попередніх публікаціях 8, 9, 10, 11, у типовому експерименті висока напруга прикладається між металевим капіляром та заземленим протиелектродом. Під час цього процесу відбуваються два різних явища: 1) електророзпилення та 2) іонізація води. Сильне електричне поле між двома електродами призводить до накопичення негативних зарядів на поверхні конденсованої води, що призводить до утворення конусів Тейлора. В результаті утворюються високо заряджені краплі води, які продовжують розпадатися на дрібніші частинки, згідно з теорією Релея16. Водночас сильне електричне поле призводить до розщеплення деяких молекул води та відривання електронів (іонізація), тим самим генеруючи велику кількість активних форм кисню (ROS)17. Одночасно згенеровані пакети ROS18 були інкапсульовані в EWNS (рис. 1c).
На рис. 2a показано систему генерації EWNS, розроблену та використану в синтезі EWNS у цьому дослідженні. Очищена вода, що зберігалася в закритій пляшці, подавалася через тефлонову трубку (внутрішній діаметр 2 мм) до голки з нержавіючої сталі 30G (металевий капіляр). Як показано на рис. 2b, потік води контролюється тиском повітря всередині пляшки. Голка прикріплена до тефлонової консолі, яку можна вручну відрегулювати на певну відстань від протиелектрода. Протиелектрод являє собою полірований алюмінієвий диск з отвором посередині для відбору проб. Під протиелектродом розташована алюмінієва лійка для відбору проб, яка з'єднана з рештою експериментальної установки через отвір для відбору проб (рис. 2b). Усі компоненти пробовідбірника електрично заземлені, щоб уникнути накопичення заряду, який може погіршити відбір проб частинок.
(a) Система генерації інженерних наноструктур води (EWNS). (b) Поперечний переріз пробовідбірника та електророзпилювального блоку, що показує найважливіші параметри. (c) Експериментальна установка для інактивації бактерій.
Система генерації EWNS, описана вище, здатна змінювати ключові робочі параметри для полегшення точного налаштування властивостей EWNS. Регулюйте прикладену напругу (V), відстань між голкою та протиелектродом (L) та потік води (φ) через капіляр для точного налаштування характеристик EWNS. Символи [V (кВ), L (см)] використовуються для позначення різних комбінацій. Регулюйте потік води, щоб отримати стабільний конус Тейлора певного набору [V, L]. Для цілей цього дослідження апертура протиелектрода (D) була встановлена ​​на рівні 0,5 дюйма (1,29 см).
Через обмежену геометрію та асиметрію, напруженість електричного поля неможливо розрахувати з перших принципів. Натомість для розрахунку електричного поля було використано програмне забезпечення QuickField™ (Свендборг, Данія)19. Електричне поле не є однорідним, тому значення електричного поля на кінчику капіляра використовувалося як опорне значення для різних конфігурацій.
Під час дослідження було оцінено кілька комбінацій напруги та відстані між голкою та протиелектродом з точки зору формування конуса Тейлора, стабільності конуса Тейлора, стабільності виробництва EWNS та відтворюваності. Різні комбінації наведено в Додатковій таблиці S1.
Вихід системи генерації EWNS був безпосередньо підключений до скануючого мобільного вимірювача розміру частинок (SMPS, модель 3936, TSI, Шорвью, Міннесота) для вимірювання концентрації частинок і використовувався разом з аерозольним електрометром Фарадея (TSI, модель 3068B, Шорвью, США). (МН) для вимірювання потоків аерозолів, як описано в нашій попередній публікації9. Як SMPS, так і аерозольний електрометр відбирали проби зі швидкістю потоку 0,5 л/хв (загальний потік проби 1 л/хв). Концентрації частинок та потоки аерозолів вимірювалися протягом 120 с. Вимірювання повторіть 30 разів. Загальний заряд аерозолю розраховується на основі вимірювань струму, а середній заряд EWNS оцінюється на основі загальної кількості відібраних частинок EWNS. Середню вартість EWNS можна розрахувати за допомогою рівняння (1):
де IEl – виміряний струм, NSMPS – концентрація речовини, виміряна за допомогою SMPS, а φEl – швидкість потоку до електрометра.
Оскільки відносна вологість (RH) впливає на поверхневий заряд, температура та (RH) підтримувалися постійними на рівні 21°C та 45% відповідно протягом експерименту.
Для вимірювання розміру та часу життя EWNS використовували атомно-силову мікроскопію (АСМ), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Санта-Барбара, Каліфорнія) та зонд AC260T (Olympus, Токіо, Японія). Частота сканування АСМ становить 1 Гц, а площа сканування — 5 мкм × 5 мкм з 256 лініями сканування. Всі зображення були піддані вирівнюванню зображень першого порядку за допомогою програмного забезпечення Asylum (маска з діапазоном 100 нм та порогом 100 пм).
Вийміть лійку для відбору проб і розмістіть поверхню слюди на відстані 2,0 см від протиелектрода на середній час 120 с, щоб уникнути коалесценції частинок та утворення нерівних крапель на поверхні слюди. EWNS наносили безпосередньо на свіжорозрізані поверхні слюди (Тед Пелла, Реддінг, Каліфорнія). Відразу після розпилення поверхню слюди візуалізували за допомогою АСМ. Кут контакту поверхні свіжорозрізаної немодифікованої слюди близький до 0°, тому EWNS поширюється по поверхні слюди у формі купола20. Діаметр (a) та висота (h) дифундуючих крапель вимірювали безпосередньо з топографії АСМ та використовували для розрахунку куполоподібного дифузійного об'єму EWNS за допомогою нашого раніше перевіреного методу8. Припускаючи, що вбудований EVNS має такий самий об'єм, еквівалентний діаметр можна розрахувати за рівнянням (2):
Відповідно до нашого раніше розробленого методу, для виявлення наявності короткоживучих радикальних проміжних продуктів в EWNS було використано спінову пастку електронного спінового резонансу (ESR). Аерозолі пропускали через розчин, що містив 235 мМ DEPMPO (5-(дієтоксіфосфорил)-5-метил-1-піролін-N-оксид) (Oxis International Inc., Портленд, Орегон). Всі вимірювання EPR проводилися за допомогою спектрометра Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, США) та плоских комірок. Для збору та аналізу даних використовувалося програмне забезпечення Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, США). Характеристика ROS проводилася лише для набору робочих умов [-6,5 кВ, 4,0 см]. Концентрації EWNS вимірювалися за допомогою SMPS з урахуванням втрат EWNS в імпакторі.
Рівень озону контролювали за допомогою двопроменевого озонового монітора 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Боулдер, Колорадо)8,9,10.
Для всіх властивостей EWNS значення вимірювання є середнім значенням вимірювань, а похибка вимірювання – стандартним відхиленням. Був проведений t-тест для порівняння значення оптимізованого атрибута EWNS з відповідним значенням базового EWNS.
На рисунку 2c показано раніше розроблену та охарактеризовану систему пропускання електростатичних осадів (EPES), яку можна використовувати для націлювання EWNS11 на поверхні. EPES використовує заряд EWNS у поєднанні з сильним електричним полем для безпосереднього «спрямування» на поверхню цілі. Деталі системи EPES представлені в нещодавній публікації Pyrgiotakis et al.11. Таким чином, EPES складається з надрукованої на 3D-принтері ПВХ-камери з конічними кінцями, що містить дві паралельні металеві пластини з нержавіючої сталі (нержавіюча сталь 304, дзеркально полірована) посередині на відстані 15,24 см одна від одної. Плати були підключені до зовнішнього джерела високої напруги (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), нижня плата завжди була позитивною, а верхня плата завжди була заземленою (плаваючою). Стінки камери покриті алюмінієвою фольгою, яка електрично заземлена для запобігання втратам частинок. Камера має герметичні передні дверцята завантаження, що дозволяє розміщувати тестові поверхні на пластикових стійках, піднімаючи їх з нижньої металевої пластини, щоб уникнути перешкод високої напруги.
Ефективність осадження EWNS в EPES була розрахована згідно з раніше розробленим протоколом, детально описаним у Додатковому рисунку S111.
Як контрольна камера, другий потік через циліндричну камеру з'єднаний послідовно з системою EPES за допомогою проміжного HEPA-фільтра для видалення EWNS. Як показано на рис. 2c, аерозоль EWNS прокачувався через дві камери, з'єднані послідовно. Фільтр між диспетчерською та EPES видаляє будь-які залишки EWNS, що призводить до однакової температури (T), відносної вологості (RH) та рівня озону.
Було виявлено, що важливі харчові мікроорганізми забруднюють свіжі продукти, такі як Escherichia coli (ATCC #27325) – фекальний індикатор, Salmonella enterica (ATCC #53647) – харчовий патоген, Listeria innocua (ATCC #33090) – альтернатива патогенній Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) – як альтернатива дріжджам, що викликають псування, та Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) – більш стійкі живі бактерії, придбані у ATCC (Манассас, Вірджинія).
Випадковим чином купіть коробки органічних виноградних помідорів на місцевому ринку та поставте їх у холодильник при температурі 4°C до використання (до 3 днів). Виберіть помідори для експерименту одного розміру, приблизно 1,25 см у діаметрі.
Протоколи інкубації, інокуляції, експозиції та підрахунку колоній були детально описані в наших попередніх публікаціях та детально пояснені в Додаткових даних 11. Ефективність EWNS оцінювали шляхом впливу на інокульовані помідори концентрацією 40 000 #/см3 протягом 45 хвилин. Коротко кажучи, у момент часу t = 0 хв три помідори були використані для оцінки вижилих мікроорганізмів. Три помідори помістили в EPES та піддали впливу EWNS у концентрації 40 000 #/см³ (помідори, що піддавалися впливу EWNS), а три інші помістили в контрольну камеру (контрольні помідори). Жодна з груп помідорів не піддавалася додатковій обробці. Помідори, що піддавалися впливу EWNS, та контрольні помідори були видалені через 45 хвилин для оцінки ефекту EWNS.
Кожен експеримент проводили у трьох повторностях. Аналіз даних проводили згідно з протоколом, описаним у Додаткових даних.
Зразки бактерій E. coli, Enterobacter та L. innocua, що піддавалися впливу EWNS (45 хв, концентрація аерозолю EWNS 40 000 #/см3) та не піддавалися впливу, були осаджені для оцінки механізмів інактивації. Осад фіксували протягом 2 годин за кімнатної температури в 0,1 М розчині какодилату натрію (pH 7,4) з фіксатором з 2,5% глутаральдегіду, 1,25% параформальдегіду та 0,03% пікринової кислоти. Після промивання їх фіксували 1% чотириокисом осмію (OsO4)/1,5% фероціанідом калію (KFeCN6) протягом 2 годин, промивали 3 рази водою та інкубували в 1% уранілацетаті протягом 1 години, потім двічі промивали водою. Подальше зневоднення тривало 10 хвилин 50%, 70%, 90%, 100% спиртом. Потім зразки поміщали в оксид пропілену на 1 годину та просочували сумішшю оксиду пропілену та TAAP Epon у співвідношенні 1:1 (Marivac Canada Inc. Сен-Лоран, Каліфорнія). Зразки заливали в TAAB Epon та полімеризували при 60°C протягом 48 годин. Затверділу гранульовану смолу розрізали та візуалізували за допомогою ПЕМ за допомогою JEOL 1200EX (JEOL, Токіо, Японія), звичайного просвічуючого електронного мікроскопа, оснащеного камерою AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Вобурн, Массачусетс, США).
Усі експерименти проводили у трьох повторностях. Для кожної часової точки бактеріальні змиви висівали у трьох повторностях, в результаті чого загалом було отримано дев'ять точок даних на точку, середнє значення яких використовувалося як концентрація бактерій для цього конкретного організму. Стандартне відхилення використовувалося як похибка вимірювання. Враховуються всі точки.
Логарифм зменшення концентрації бактерій порівняно з t = 0 хв розраховували за такою формулою:
де C0 – концентрація бактерій у контрольному зразку в момент часу 0 (тобто після висихання поверхні, але до поміщення в камеру), а Cn – концентрація бактерій на поверхні після n хвилин експозиції.
Щоб врахувати природну деградацію бактерій протягом 45-хвилинного періоду експозиції, також було розраховано логарифмічне зниження порівняно з контролем через 45 хвилин наступним чином:
Де Cn – концентрація бактерій у контрольному зразку в момент часу n, а Cn-Control – концентрація контрольних бактерій у момент часу n. Дані представлені у вигляді логарифмічного зменшення порівняно з контролем (без впливу EWNS).
Під час дослідження було оцінено кілька комбінацій напруги та відстані між голкою та протиелектродом з точки зору формування конуса Тейлора, стабільності конуса Тейлора, стабільності утворення EWNS та відтворюваності. Різні комбінації наведено в Додатковій таблиці S1. Для повного дослідження було обрано два випадки, що демонструють стабільні та відтворювані властивості (конус Тейлора, утворення EWNS та стабільність з часом). На рис. 3 показано результати щодо заряду, розміру та вмісту активних форм кисню (ROS) для двох випадків. Результати також узагальнено в Таблиці 1. Для довідки, Рисунок 3 та Таблиця 1 включають властивості раніше синтезованих неоптимізованих EWNS8, 9, 10, 11 (базовий рівень-EWNS). Розрахунки статистичної значущості з використанням двостороннього t-критерію перепубліковані в Додатковій таблиці S2. Крім того, додаткові дані включають дослідження впливу діаметра отвору для відбору проб протиелектрода (D) та відстані між заземлюючим електродом та кінчиком голки (L) (Додаткові рисунки S2 та S3).
(a–c) Розподіл розмірів за допомогою АФМ. (d–f) Характеристика поверхневого заряду. (g) Характеристика активних форм кисню (ROS) та електронів проби (ESR).
Також важливо зазначити, що для всіх вищезазначених умов виміряні струми іонізації були в діапазоні 2-6 мкА, а напруги - в діапазоні від -3,8 до -6,5 кВ, що призвело до споживання енергії цим одновивідним EWNS менше 50 мВт. . модулем генерації. Хоча EWNS синтезували під високим тиском, рівень озону був дуже низьким, ніколи не перевищуючи 60 ppb.
На Додатковому рисунку S4 показано змодельовані електричні поля для сценаріїв [-6,5 кВ, 4,0 см] та [-3,8 кВ, 0,5 см] відповідно. Поля згідно зі сценаріями [-6,5 кВ, 4,0 см] та [-3,8 кВ, 0,5 см] розраховані як 2 × 10⁶ В/м та 4,7 × 10⁶ В/м відповідно. Цього слід було очікувати, оскільки відношення напруги до відстані значно вище у другому випадку.
На рис. 3a,b показано діаметр EWNS, виміряний за допомогою AFM8. Середні діаметри EWNS для сценаріїв [-6,5 кВ, 4,0 см] та [-3,8 кВ, 0,5 см] були розраховані як 27 нм та 19 нм відповідно. Геометричні стандартні відхилення розподілів для випадків [-6,5 кВ, 4,0 см] та [-3,8 кВ, 0,5 см] становлять 1,41 та 1,45 відповідно, що вказує на вузький розподіл розмірів. Як середній розмір, так і геометричне стандартне відхилення дуже близькі до базового рівня EWNS, становлячи 25 нм та 1,41 відповідно. На рис. 3c показано розподіл розмірів базового рівня EWNS, виміряний за допомогою того ж методу за тих самих умов.
На рис. 3d,e показано результати характеристики заряду. Дані є середніми вимірюваннями 30 одночасних вимірювань концентрації (#/см3) та струму (I). Аналіз показує, що середній заряд на EWNS становить 22 ± 6 е- та 44 ± 6 е- для [-6,5 кВ, 4,0 см] та [-3,8 кВ, 0,5 см] відповідно. Порівняно з базовим EWNS (10 ± 2 е-), їхній поверхневий заряд значно вищий, вдвічі більше, ніж у сценарії [-6,5 кВ, 4,0 см], та в чотири рази більше, ніж у сценарії [-3,8 кВ, 0,5 см]. На рис. 3f показано основні дані оплати EWNS.
З карт концентрації кількості частинок EWNS (Додаткові рисунки S5 та S6) видно, що сцена [-6,5 кВ, 4,0 см] має значно більшу кількість частинок, ніж сцена [-3,8 кВ, 0,5 см]. Слід також зазначити, що концентрації кількості частинок EWNS контролювалися протягом 4 годин (Додаткові рисунки S5 та S6), де стабільність генерації EWNS показала однакові рівні концентрації кількості частинок в обох випадках.
На рисунку 3g показано спектр ЕПР після віднімання контрольного (фонового) рівня для оптимізованого EWNS при [-6,5 кВ, 4,0 см]. Спектр активних форм кисню (ROS) також порівнюється з базовим рівнем EWNS, опублікованим у раніше опублікованій статті. Розрахована кількість EWNS, що реагують зі спіновою пасткою, становить 7,5 × 10⁴ EWNS/с, що подібно до раніше опублікованого Baseline-EWNS8. Спектри ЕПР чітко вказували на наявність двох типів ROS, де переважав O2-, тоді як OH• був присутній у меншій кількості. Крім того, пряме порівняння інтенсивності піків показало, що оптимізований EWNS мав значно вищий вміст ROS порівняно з базовим рівнем EWNS.
На рис. 4 показано ефективність осадження EWNS в EPES. Дані також зведені в Таблиці I та порівняні з вихідними даними EWNS. Для обох випадків EUNS осадження було близьким до 100% навіть при низькій напрузі 3,0 кВ. Зазвичай 3,0 кВ достатньо для досягнення 100% осадження незалежно від зміни поверхневого заряду. За тих самих умов ефективність осадження Baseline-EWNS становила лише 56% через нижчий заряд (в середньому 10 електронів на EWNS).
На рисунку 5 та в таблиці 2 підсумовано ступінь інактивації мікроорганізмів, інокульованих на поверхні томатів після впливу приблизно 40 000 #/см3 EWNS протягом 45 хвилин за оптимального сценарію [-6,5 кВ, 4,0 см]. Інокульовані E. coli та L. innocua показали значне зниження на 3,8 log після 45 хвилин впливу. За тих самих умов S. enterica показала менше зниження log на 2,2 log, тоді як S. cerevisiae та M. parafortuitum показали зниження на 1,0 log.
Електронні мікрофотографії (Рисунок 6), що зображують фізичні зміни, викликані EWNS у клітинах E. coli, Salmonella enterica та L. innocua, що призвели до інактивації. Контрольні бактерії мали неушкоджені клітинні мембрани, тоді як бактерії, що зазнали впливу, мали пошкоджені зовнішні мембрани.
Електронно-мікроскопічна візуалізація контрольних та експонованих бактерій виявила пошкодження мембран.
Дані про фізико-хімічні властивості оптимізованих EWNS у сукупності показують, що властивості EWNS (поверхневий заряд та вміст активних форм кисню) були значно покращені порівняно з раніше опублікованими базовими даними EWNS8,9,10,11. З іншого боку, їхній розмір залишався в нанометровому діапазоні, що дуже схоже на раніше опубліковані результати, що дозволяє їм залишатися в повітрі протягом тривалого періоду часу. Спостережувану полідисперсність можна пояснити змінами поверхневого заряду, які визначають величину ефекту Релея, випадковість та потенційне злиття EWNS. Однак, як детально описано Нільсеном та ін.22, високий поверхневий заряд зменшує випаровування, ефективно збільшуючи поверхневу енергію/натяг краплі води. Ця теорія була експериментально підтверджена для мікрокрапель22 та EWNS у нашій попередній публікації8. Втрата часу також може впливати на розмір та сприяти спостережуваному розподілу розмірів.
Крім того, заряд на структуру становить приблизно 22–44 е-, залежно від обставин, що значно вище порівняно з базовим EWNS, який має середній заряд 10 ± 2 електронів на структуру. Однак слід зазначити, що це середній заряд EWNS. Сето та ін. Було показано, що заряд не є однорідним і відповідає логарифмічно-нормальному розподілу21. Порівняно з нашою попередньою роботою, подвоєння поверхневого заряду подвоює ефективність осадження в системі EPES майже до 100%11.