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Recientemente, se ha desarrollado una plataforma antimicrobiana sin químicos basada en nanotecnología que utiliza nanoestructuras de agua artificial (EWNS). Las EWNS poseen una alta carga superficial y son ricas en especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden interactuar con diversos microorganismos, incluidos patógenos transmitidos por los alimentos, e inactivarlos. En este trabajo se demuestra que sus propiedades durante la síntesis pueden ajustarse y optimizarse para potenciar aún más su actividad antibacteriana. La plataforma de laboratorio EWNS se diseñó para ajustar con precisión las propiedades de las EWNS modificando los parámetros de síntesis. La caracterización de las propiedades de las EWNS (carga, tamaño y contenido de ROS) se realizó mediante métodos analíticos modernos. Además, se inocularon microorganismos alimentarios como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum y Saccharomyces cerevisiae en la superficie de tomates cherry orgánicos para evaluar su potencial de inactivación microbiana. Los resultados presentados demuestran que las propiedades de las EWNS pueden ajustarse durante la síntesis, lo que resulta en un aumento exponencial de la eficiencia de inactivación. En particular, la carga superficial aumentó cuatro veces y el contenido de especies reactivas de oxígeno (ROS) también aumentó. La tasa de eliminación microbiana dependió de la microbiota y varió de 1,0 a 3,8 log después de 45 minutos de exposición a una dosis de aerosol de 40 000 #/cm³ de EWNS.
La contaminación microbiana es la principal causa de enfermedades transmitidas por los alimentos, provocadas por la ingestión de patógenos o sus toxinas. Estas enfermedades causan aproximadamente 76 millones de casos, 325 000 hospitalizaciones y 5000 muertes cada año solo en Estados Unidos¹. Además, el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) estima que el aumento del consumo de productos frescos es responsable del 48 % de todas las enfermedades transmitidas por los alimentos notificadas en Estados Unidos². El costo de las enfermedades y muertes causadas por patógenos transmitidos por los alimentos en Estados Unidos es muy elevado, estimado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) en más de 15 600 millones de dólares anuales³.
Actualmente, las intervenciones antimicrobianas químicas4, por radiación5 y térmicas6 para garantizar la inocuidad de los alimentos se implementan principalmente en puntos críticos de control (PCC) limitados en la cadena de producción (generalmente después de la cosecha y/o durante el envasado) en lugar de implementarse de forma continua, de manera que los productos frescos estén sujetos a contaminación cruzada7. Se necesitan intervenciones antimicrobianas para controlar mejor las enfermedades transmitidas por los alimentos y el deterioro de los alimentos, y tienen el potencial de aplicarse a lo largo de todo el proceso, desde la granja hasta la mesa. Menor impacto y costo.
Recientemente se ha desarrollado una plataforma antimicrobiana sin químicos basada en nanotecnología para inactivar bacterias en superficies y en el aire utilizando nanoestructuras de agua artificiales (EWNS). Para la síntesis de EVNS, se utilizaron dos procesos paralelos: electrospray e ionización de agua (Fig. 1a). Se ha demostrado previamente que las EWNS tienen un conjunto único de propiedades físicas y biológicas8,9,10. Las EWNS tienen un promedio de 10 electrones por estructura y un tamaño nanométrico promedio de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Además, la resonancia de espín electrónico (ESR) mostró que las EWNS contienen una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS), principalmente radicales hidroxilo (OH•) y superóxido (O2-) (Fig. 1c) 8. Las EWNS permanecieron en el aire durante mucho tiempo y pudieron colisionar con los microbios suspendidos en el aire y presentes en las superficies, liberando su carga útil de ROS y causando la inactivación microbiana (Fig. 1d). Estos estudios previos también demostraron que el EWNS puede interactuar con diversas bacterias gramnegativas y grampositivas de importancia para la salud pública, incluidas las micobacterias, e inactivarlas en superficies y en el aire8,9. La microscopía electrónica de transmisión reveló que la inactivación se debía a la alteración de la membrana celular. Además, estudios de inhalación aguda han demostrado que dosis altas de EWNS no causan daño pulmonar ni inflamación8.
(a) La electrospray se produce cuando se aplica un alto voltaje entre un capilar que contiene líquido y un contraelectrodo. (b) La aplicación de alto voltaje da lugar a dos fenómenos diferentes: (i) la electrospray de agua y (ii) la generación de especies reactivas de oxígeno (iones) atrapadas en las nanopartículas electroquímicas (EWNS). (c) La estructura única de las EWNS. (d) Las EWNS son altamente móviles debido a su naturaleza a nanoescala y pueden interactuar con patógenos transportados por el aire.
Recientemente se ha demostrado la capacidad de la plataforma antimicrobiana EWNS para inactivar microorganismos transmitidos por los alimentos en la superficie de alimentos frescos. También se ha demostrado que la carga superficial de EWNS puede utilizarse en combinación con un campo eléctrico para una administración dirigida. Más importante aún, se observó un resultado inicial prometedor de una reducción de aproximadamente 1,4 log en la actividad del tomate orgánico contra diversos microorganismos alimentarios, como E. coli y Listeria, en 90 minutos de exposición a EWNS a una concentración de aproximadamente 50 000#/cm³. Además, las pruebas preliminares de evaluación organoléptica no mostraron ningún efecto organoléptico en comparación con el tomate de control. Si bien estos resultados iniciales de inactivación prometen seguridad alimentaria incluso a dosis muy bajas de EWNS de 50 000#/cm³, es evidente que un mayor potencial de inactivación sería más beneficioso para reducir aún más el riesgo de infección y deterioro.
En este trabajo, centraremos nuestra investigación en el desarrollo de una plataforma de generación de EWNS para ajustar con precisión los parámetros de síntesis y optimizar las propiedades fisicoquímicas de los EWNS con el fin de potenciar su actividad antibacteriana. En particular, la optimización se ha enfocado en aumentar su carga superficial (para mejorar la administración dirigida) y su contenido de ROS (para mejorar la eficacia de inactivación). Se caracterizarán las propiedades fisicoquímicas optimizadas (tamaño, carga y contenido de ROS) mediante métodos analíticos modernos y el uso de microorganismos alimentarios comunes como E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae y M. parafortuitum.
EVNS se sintetizó mediante electrorociado e ionización simultáneos de agua de alta pureza (18 MΩ cm–1). El atomizador eléctrico 12 se utiliza normalmente para atomizar líquidos, polímeros sintéticos, partículas cerámicas 13 y fibras 14 de tamaño controlado.
Como se detalla en publicaciones anteriores 8, 9, 10, 11, en un experimento típico, se aplica un alto voltaje entre un capilar metálico y un contraelectrodo conectado a tierra. Durante este proceso, ocurren dos fenómenos diferentes: 1) electrospray y 2) ionización del agua. Un fuerte campo eléctrico entre los dos electrodos provoca la acumulación de cargas negativas en la superficie del agua condensada, lo que da lugar a la formación de conos de Taylor. Como resultado, se forman gotas de agua altamente cargadas, que continúan fragmentándose en partículas más pequeñas, según la teoría de Rayleigh16. Al mismo tiempo, un fuerte campo eléctrico provoca que algunas de las moléculas de agua se dividan y pierdan electrones (ionización), generando así una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS)17. Los paquetes de ROS18 generados simultáneamente se encapsularon en EWNS (Fig. 1c).
La figura 2a muestra el sistema de generación de EWNS desarrollado y utilizado en la síntesis de EWNS en este estudio. Agua purificada almacenada en una botella cerrada se introdujo a través de un tubo de teflón (2 mm de diámetro interno) hasta una aguja de acero inoxidable de calibre 30 (capilar metálico). Como se muestra en la figura 2b, el flujo de agua se controla mediante la presión de aire dentro de la botella. La aguja está conectada a una consola de teflón que se puede ajustar manualmente a una distancia determinada del contraelectrodo. El contraelectrodo es un disco de aluminio pulido con un orificio en el centro para la toma de muestras. Debajo del contraelectrodo se encuentra un embudo de muestreo de aluminio, conectado al resto del montaje experimental mediante un puerto de muestreo (Fig. 2b). Todos los componentes del muestreador están conectados a tierra para evitar la acumulación de carga que podría degradar la toma de muestras de partículas.
(a) Sistema de generación de nanoestructuras de agua (EWNS). (b) Sección transversal del muestreador y la unidad de electrospray que muestra los parámetros más importantes. (c) Montaje experimental para la inactivación de bacterias.
El sistema de generación EWNS descrito anteriormente permite modificar parámetros operativos clave para optimizar sus propiedades. Ajuste la tensión aplicada (V), la distancia entre la aguja y el contraelectrodo (L) y el caudal de agua (φ) a través del capilar para ajustar las características EWNS. Los símbolos [V (kV), L (cm)] representan diferentes combinaciones. Ajuste el caudal de agua para obtener un cono de Taylor estable con un valor específico de [V, L]. Para este estudio, la apertura del contraelectrodo (D) se fijó en 0,5 pulgadas (1,29 cm).
Debido a la geometría limitada y la asimetría, la intensidad del campo eléctrico no se puede calcular a partir de principios fundamentales. En su lugar, se utilizó el software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)¹⁹ para calcularlo. Dado que el campo eléctrico no es uniforme, se utilizó el valor del campo eléctrico en la punta del capilar como valor de referencia para diversas configuraciones.
Durante el estudio, se evaluaron diversas combinaciones de voltaje y distancia entre la aguja y el contraelectrodo en cuanto a la formación del cono de Taylor, su estabilidad, la estabilidad de la producción de EWNS y la reproducibilidad. En la Tabla S1 del material complementario se muestran varias combinaciones.
La salida del sistema de generación EWNS se conectó directamente a un analizador de movilidad de partículas (SMPS, modelo 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) para medir la concentración numérica de partículas y se utilizó con un electrómetro de aerosoles Faraday (TSI, modelo 3068B, Shoreview, EE. UU., MN) para medir los flujos de aerosoles, como se describe en nuestra publicación anterior⁹. Tanto el SMPS como el electrómetro de aerosoles tomaron muestras a un caudal de 0,5 L/min (caudal total de la muestra: 1 L/min). Las concentraciones de partículas y los flujos de aerosoles se midieron durante 120 s. Repita la medición 30 veces. La carga total de aerosoles se calcula a partir de las mediciones actuales, y la carga promedio de EWNS se estima a partir del número total de partículas EWNS muestreadas. El costo promedio de EWNS se puede calcular utilizando la ecuación (1):
donde IEl es la corriente medida, NSMPS es la concentración numérica medida con el SMPS y φEl es el caudal hacia el electrómetro.
Debido a que la humedad relativa (HR) afecta la carga superficial, la temperatura y la humedad relativa (HR) se mantuvieron constantes a 21 °C y 45 %, respectivamente, durante el experimento.
Se utilizó microscopía de fuerza atómica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Bárbara, CA) y sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japón) para medir el tamaño y la vida útil de las EWNS. La velocidad de escaneo del AFM fue de 1 Hz y el área de escaneo de 5 µm × 5 µm con 256 líneas de escaneo. Todas las imágenes se sometieron a una alineación de primer orden utilizando el software Asylum (máscara con un rango de 100 nm y un umbral de 100 pm).
Retire el embudo de muestreo y coloque la superficie de mica a una distancia de 2,0 cm del contraelectrodo durante un tiempo promedio de 120 s para evitar la coalescencia de partículas y la formación de gotas irregulares en la superficie de mica. EWNS se aplicó directamente a superficies de mica recién cortadas (Ted Pella, Redding, CA). Inmediatamente después de la pulverización catódica, la superficie de mica se visualizó mediante AFM. El ángulo de contacto superficial de la mica recién cortada sin modificar es cercano a 0°, por lo que EWNS se propaga sobre la superficie de mica en forma de cúpula20. El diámetro (a) y la altura (h) de las gotas difusoras se midieron directamente a partir de la topografía de AFM y se utilizaron para calcular el volumen de difusión en forma de cúpula de EWNS utilizando nuestro método previamente validado8. Suponiendo que el EVNS integrado tiene el mismo volumen, el diámetro equivalente se puede calcular a partir de la ecuación (2):
De acuerdo con nuestro método previamente desarrollado, se utilizó una trampa de espín de resonancia de espín electrónico (ESR) para detectar la presencia de intermedios radicales de corta duración en EWNS. Los aerosoles se hicieron pasar a través de una solución que contenía 235 mM de DEPMPO (5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Todas las mediciones de EPR se realizaron utilizando un espectrómetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, EE. UU.) y matrices de celdas planas. El software Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, EE. UU.) se utilizó para recopilar y analizar los datos. La caracterización de ROS se realizó solo para un conjunto de condiciones de operación [-6,5 kV, 4,0 cm]. Las concentraciones de EWNS se midieron utilizando SMPS después de tener en cuenta la pérdida de EWNS en el impactador.
Los niveles de ozono se monitorearon utilizando un monitor de ozono de doble haz 205™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Para todas las propiedades de EWNS, el valor de medición es la media de las mediciones y el error de medición es la desviación estándar. Se realizó una prueba t para comparar el valor del atributo EWNS optimizado con el valor correspondiente del EWNS base.
La figura 2c muestra un sistema de paso por precipitación electrostática (EPES) previamente desarrollado y caracterizado, que puede utilizarse para dirigir EWNS11 a superficies. El EPES utiliza una carga EWNS en combinación con un campo eléctrico intenso para "apuntar" directamente a la superficie del objetivo. Los detalles del sistema EPES se presentan en una publicación reciente de Pyrgiotakis et al.11. Así, el EPES consta de una cámara de PVC impresa en 3D con extremos cónicos que contiene dos placas metálicas paralelas de acero inoxidable (acero inoxidable 304, pulido espejo) en el centro, separadas 15,24 cm. Las placas estaban conectadas a una fuente de alto voltaje externa (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY); la placa inferior siempre era positiva y la superior siempre estaba conectada a tierra (flotante). Las paredes de la cámara están cubiertas con papel de aluminio, que está conectado a tierra eléctricamente para evitar la pérdida de partículas. La cámara tiene una puerta de carga frontal sellada que permite colocar las superficies de prueba en soportes de plástico, separándolas de la placa metálica inferior para evitar interferencias de alto voltaje.
La eficiencia de deposición de EWNS en EPES se calculó de acuerdo con un protocolo desarrollado previamente y detallado en la Figura complementaria S111.
Como cámara de control, el segundo flujo a través de la cámara cilíndrica se conecta en serie con el sistema EPES mediante un filtro HEPA intermedio para eliminar las partículas de EWNS. Como se muestra en la figura 2c, el aerosol de EWNS se bombeó a través de dos cámaras conectadas en serie. El filtro entre la sala de control y el sistema EPES elimina cualquier partícula de EWNS restante, lo que resulta en la misma temperatura (T), humedad relativa (HR) y niveles de ozono.
Se han encontrado microorganismos importantes transmitidos por los alimentos que contaminan los productos frescos, como Escherichia coli (ATCC #27325), un indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), un patógeno transmitido por los alimentos, Listeria innocua (ATCC #33090), una alternativa a la patógena Listeria monocytogenes, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) como alternativa a la levadura de deterioro, y Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) como una bacteria viva más resistente, que se compraron a ATCC (Manassas, Virginia).
Compra cajas de tomates cherry orgánicos al azar en tu mercado local y refrigéralas a 4 °C hasta su uso (hasta 3 días). Selecciona tomates de un solo tamaño, de aproximadamente 1,2 cm de diámetro, para experimentar.
Los protocolos de incubación, inoculación, exposición y recuento de colonias se han detallado en nuestras publicaciones anteriores y se explican en detalle en los Datos Suplementarios 11. El rendimiento de EWNS se evaluó exponiendo tomates inoculados a 40 000 #/cm³ durante 45 minutos. Brevemente, en el tiempo t = 0 min, se utilizaron tres tomates para evaluar los microorganismos supervivientes. Tres tomates se colocaron en EPES y se expusieron a EWNS a 40 000 #/cc (tomates expuestos a EWNS) y otros tres se colocaron en la cámara de control (tomates de control). Ninguno de los grupos de tomates fue sometido a procesamiento adicional. Los tomates expuestos a EWNS y los controles se retiraron después de 45 minutos para evaluar el efecto de EWNS.
Cada experimento se realizó por triplicado. El análisis de datos se llevó a cabo según el protocolo descrito en los Datos Suplementarios.
Se centrifugaron muestras bacterianas de E. coli, Enterobacter y L. innocua expuestas a EWNS (45 min, concentración de aerosol EWNS 40,000 #/cm3) y no expuestas para evaluar los mecanismos de inactivación. El precipitado se fijó durante 2 horas a temperatura ambiente en una solución de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) con un fijador de glutaraldehído al 2,5 %, paraformaldehído al 1,25 % y ácido pícrico al 0,03 %. Después del lavado, se fijaron con tetróxido de osmio (OsO4) al 1 %/ferrocianuro de potasio (KFeCN6) al 1,5 % durante 2 h, se lavaron 3 veces con agua y se incubaron en acetato de uranilo al 1 % durante 1 h, luego se lavaron dos veces con agua. Deshidratación posterior durante 10 minutos con alcohol al 50 %, 70 %, 90 % y 100 %. Las muestras se colocaron en óxido de propileno durante 1 hora y se impregnaron con una mezcla 1:1 de óxido de propileno y TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). Posteriormente, las muestras se embebieron en TAAB Epon y se polimerizaron a 60 °C durante 48 horas. La resina granular curada se cortó y se visualizó mediante TEM utilizando un JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japón), un microscopio electrónico de transmisión convencional equipado con una cámara CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, EE. UU.).
Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Para cada punto temporal, se sembraron muestras de lavado bacteriano por triplicado, obteniendo un total de nueve puntos de datos por punto. El promedio de estos datos se utilizó como concentración bacteriana para ese organismo en particular. La desviación estándar se utilizó como error de medición. Todos los puntos son válidos.
El logaritmo de la disminución de la concentración de bacterias en comparación con t = 0 min se calculó utilizando la siguiente fórmula:
donde C0 es la concentración de bacterias en la muestra de control en el tiempo 0 (es decir, después de que la superficie se haya secado pero antes de ser colocada en la cámara) y Cn es la concentración de bacterias en la superficie después de n minutos de exposición.
Para tener en cuenta la degradación natural de las bacterias durante el período de exposición de 45 minutos, también se calculó la reducción logarítmica en comparación con el control a los 45 minutos de la siguiente manera:
Donde Cn es la concentración de bacterias en la muestra de control en el tiempo n y Cn-Control es la concentración de bacterias de control en el tiempo n. Los datos se presentan como una reducción logarítmica en comparación con el control (sin exposición a EWNS).
Durante el estudio, se evaluaron varias combinaciones de voltaje y distancia entre la aguja y el contraelectrodo en términos de formación del cono de Taylor, estabilidad del cono de Taylor, estabilidad de la producción de EWNS y reproducibilidad. Varias combinaciones se muestran en la Tabla Suplementaria S1. Se seleccionaron dos casos para un estudio completo que mostró propiedades estables y reproducibles (cono de Taylor, producción de EWNS y estabilidad a lo largo del tiempo). La figura 3 muestra los resultados sobre la carga, el tamaño y el contenido de ROS para dos casos. Los resultados también se resumen en la Tabla 1. Como referencia, la Figura 3 y la Tabla 1 incluyen las propiedades de los EWNS8, 9, 10, 11 no optimizados previamente sintetizados (EWNS de referencia). Los cálculos de significancia estadística utilizando una prueba t de dos colas se republican en la Tabla Suplementaria S2. Además, los datos adicionales incluyen estudios sobre el efecto del diámetro del orificio de muestreo del contraelectrodo (D) y la distancia entre el electrodo de tierra y la punta de la aguja (L) (Figuras Suplementarias S2 y S3).
(a–c) Distribución de tamaño por AFM. (d–f) Característica de carga superficial. (g) Caracterización de ROS y ESR.
También es importante señalar que para todas las condiciones anteriores, las corrientes de ionización medidas estuvieron en el rango de 2-6 µA, y los voltajes estuvieron en el rango de -3,8 a -6,5 kV, lo que resultó en un consumo de energía para este módulo de generación EWNS de un solo terminal de menos de 50 mW. Aunque el EWNS se sintetizó a alta presión, los niveles de ozono fueron muy bajos, nunca superaron los 60 ppb.
La Figura S4 complementaria muestra los campos eléctricos simulados para los escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Los campos correspondientes a estos escenarios se calculan en 2 × 10⁵ V/m y 4,7 × 10⁵ V/m, respectivamente. Esto es previsible, ya que la relación entre voltaje y distancia es mucho mayor en el segundo caso.
En la figura 3a,b se muestra el diámetro de EWNS medido con el AFM8. Los diámetros promedio de EWNS para los escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm] se calcularon como 27 nm y 19 nm, respectivamente. Las desviaciones estándar geométricas de las distribuciones para los casos [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm] son ​​1,41 y 1,45, respectivamente, lo que indica una distribución de tamaño estrecha. Tanto el tamaño medio como la desviación estándar geométrica son muy cercanos a los de EWNS de referencia, siendo 25 nm y 1,41, respectivamente. En la figura 3c se muestra la distribución de tamaño de EWNS de referencia medida utilizando el mismo método bajo las mismas condiciones.
En la figura 3d,e se muestran los resultados de la caracterización de carga. Los datos son mediciones promedio de 30 mediciones simultáneas de concentración (#/cm3) y corriente (I). El análisis muestra que la carga promedio en el EWNS es de 22 ± 6 e- y 44 ± 6 e- para [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. En comparación con Baseline-EWNS (10 ± 2 e-), su carga superficial es significativamente mayor, el doble que la del escenario [-6,5 kV, 4,0 cm] y cuatro veces la del escenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. La figura 3f muestra los datos básicos de pago del EWNS.
A partir de los mapas de concentración numérica de EWNS (Figuras complementarias S5 y S6), se observa que la escena [-6,5 kV, 4,0 cm] presenta una cantidad de partículas significativamente mayor que la escena [-3,8 kV, 0,5 cm]. Cabe destacar también que las concentraciones numéricas de EWNS se monitorizaron durante un máximo de 4 horas (Figuras complementarias S5 y S6), periodo durante el cual la estabilidad de la generación de EWNS mostró los mismos niveles de concentración numérica de partículas en ambos casos.
La figura 3g muestra el espectro EPR después de la sustracción del control (fondo) para EWNS optimizado a [-6,5 kV, 4,0 cm]. El espectro ROS también se compara con la línea base EWNS en un artículo publicado anteriormente. El número calculado de EWNS que reaccionan con la trampa de espín es 7,5 × 10⁴ EWNS/s, que es similar al Baseline-EWNS8 publicado anteriormente. Los espectros EPR indicaron claramente la presencia de dos tipos de ROS, donde predominó O₂⁻, mientras que OH• estuvo presente en menor cantidad. Además, una comparación directa de las intensidades de los picos mostró que el EWNS optimizado tenía un contenido de ROS significativamente mayor en comparación con el EWNS de línea base.
La figura 4 muestra la eficiencia de deposición de EWNS en EPES. Los datos también se resumen en la Tabla I y se comparan con los datos originales de EWNS. En ambos casos de EUNS, la deposición fue cercana al 100% incluso a un voltaje bajo de 3,0 kV. Normalmente, 3,0 kV es suficiente para lograr una deposición del 100% independientemente del cambio de carga superficial. En las mismas condiciones, la eficiencia de deposición de Baseline-EWNS fue de solo el 56% debido a la menor carga (un promedio de 10 electrones por EWNS).
La Figura 5 y la Tabla 2 resumen el grado de inactivación de microorganismos inoculados en la superficie de tomates tras la exposición a aproximadamente 40 000 #/cm³ de EWNS durante 45 minutos en el escenario óptimo [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli y L. innocua inoculadas mostraron una reducción significativa de 3,8 log tras 45 minutos de exposición. En las mismas condiciones, S. enterica mostró una reducción menor de 2,2 log, mientras que S. cerevisiae y M. parafortuitum mostraron una reducción de 1,0 log.
Las micrografías electrónicas (Figura 6) muestran los cambios físicos inducidos por EWNS en células de E. coli, Salmonella enterica y L. innocua, que conducen a su inactivación. Las bacterias de control presentaban membranas celulares intactas, mientras que las bacterias expuestas tenían membranas externas dañadas.
Las imágenes obtenidas mediante microscopía electrónica de las bacterias de control y las expuestas revelaron daños en la membrana.
Los datos sobre las propiedades fisicoquímicas de las EWNS optimizadas muestran colectivamente que las propiedades de las EWNS (carga superficial y contenido de ROS) mejoraron significativamente en comparación con los datos de referencia de EWNS publicados anteriormente8,9,10,11. Por otro lado, su tamaño se mantuvo en el rango nanométrico, lo que es muy similar a los resultados publicados anteriormente, lo que les permite permanecer en el aire durante un período prolongado. La polidispersidad observada puede explicarse por cambios en la carga superficial, que determinan la magnitud del efecto Rayleigh, la aleatoriedad y la posible fusión de las EWNS. Sin embargo, como detallan Nielsen et al.22, una alta carga superficial reduce la evaporación al aumentar efectivamente la energía/tensión superficial de la gota de agua. Esta teoría fue confirmada experimentalmente para microgotas22 y EWNS en nuestra publicación anterior8. La pérdida con el tiempo también puede afectar el tamaño y contribuir a la distribución de tamaño observada.
Además, la carga por estructura es de aproximadamente 22–44 e-, dependiendo de las circunstancias, lo cual es significativamente mayor en comparación con el EWNS básico, que tiene una carga promedio de 10 ± 2 electrones por estructura. Sin embargo, cabe señalar que esta es la carga promedio del EWNS. Seto et al. han demostrado que la carga no es uniforme y sigue una distribución log-normal21. En comparación con nuestro trabajo anterior, duplicar la carga superficial duplica la eficiencia de deposición en el sistema EPES a casi el 100%11.