ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com คุณกำลังใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันที่มีการรองรับ CSS จำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจได้ว่าเว็บไซต์จะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจึงแสดงเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
เมื่อเร็วๆ นี้ ได้มีการพัฒนาแพลตฟอร์มต้านจุลชีพแบบปราศจากสารเคมีโดยใช้เทคโนโลยีนาโน โดยใช้โครงสร้างนาโนน้ำเทียม (EWNS) EWNS มีประจุบนพื้นผิวสูงและอุดมไปด้วยสารออกซิเจนที่ว่องไว (ROS) ซึ่งสามารถทำปฏิกิริยาและยับยั้งจุลินทรีย์หลายชนิด รวมถึงเชื้อก่อโรคในอาหาร ในที่นี้แสดงให้เห็นว่าคุณสมบัติของ EWNS ในระหว่างการสังเคราะห์สามารถปรับแต่งและเพิ่มประสิทธิภาพเพื่อเพิ่มศักยภาพในการต้านเชื้อแบคทีเรียให้ดียิ่งขึ้น แพลตฟอร์มห้องปฏิบัติการ EWNS ถูกออกแบบมาเพื่อปรับแต่งคุณสมบัติของ EWNS โดยการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์การสังเคราะห์ การวิเคราะห์คุณสมบัติของ EWNS (ประจุ ขนาด และปริมาณ ROS) ดำเนินการโดยใช้วิธีการวิเคราะห์ที่ทันสมัย ​​นอกจากนี้ ยังได้ทำการเพาะเชื้อจุลินทรีย์ในอาหาร เช่น Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum และ Saccharomyces cerevisiae ลงบนพื้นผิวของมะเขือเทศองุ่นอินทรีย์เพื่อประเมินศักยภาพในการยับยั้งจุลินทรีย์ ผลลัพธ์ที่นำเสนอในที่นี้แสดงให้เห็นว่าคุณสมบัติของ EWNS สามารถปรับแต่งได้อย่างละเอียดในระหว่างการสังเคราะห์ ส่งผลให้ประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อเพิ่มขึ้นอย่างมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ประจุบนพื้นผิวเพิ่มขึ้นถึงสี่เท่า และปริมาณ ROS ก็เพิ่มขึ้น อัตราการกำจัดจุลินทรีย์ขึ้นอยู่กับชนิดของจุลินทรีย์ และมีค่าตั้งแต่ 1.0 ถึง 3.8 log หลังจากสัมผัสกับละออง EWNS ในปริมาณ 40,000 #/cm3 เป็นเวลา 45 นาที
การปนเปื้อนของจุลินทรีย์เป็นสาเหตุหลักของโรคที่เกิดจากอาหาร ซึ่งเกิดจากการรับประทานเชื้อโรคหรือสารพิษของเชื้อโรคเหล่านั้น โรคที่เกิดจากอาหารก่อให้เกิดการเจ็บป่วยประมาณ 76 ล้านราย การเข้ารักษาในโรงพยาบาล 325,000 ราย และการเสียชีวิต 5,000 รายต่อปีในสหรัฐอเมริกาเพียงประเทศเดียว¹ นอกจากนี้ กระทรวงเกษตรของสหรัฐอเมริกา (USDA) ประมาณการว่าการบริโภคผักและผลไม้สดที่เพิ่มขึ้นเป็นสาเหตุของโรคที่เกิดจากอาหารทั้งหมดที่รายงานในสหรัฐอเมริกาถึง 48 เปอร์เซ็นต์² ค่าใช้จ่ายของการเจ็บป่วยและการเสียชีวิตจากเชื้อโรคที่ก่อให้เกิดโรคในอาหารในสหรัฐอเมริกานั้นสูงมาก โดยศูนย์ควบคุมและป้องกันโรค (CDC) ประมาณการไว้ที่มากกว่า 15.6 พันล้านดอลลาร์สหรัฐต่อปี³
ปัจจุบัน การแทรกแซงทางเคมี4 รังสี5 และความร้อน6 เพื่อฆ่าเชื้อจุลินทรีย์เพื่อความปลอดภัยของอาหารส่วนใหญ่ดำเนินการเฉพาะในจุดควบคุมวิกฤต (CCP) ที่จำกัดในห่วงโซ่การผลิต (โดยปกติหลังการเก็บเกี่ยวและ/หรือระหว่างการบรรจุ) มากกว่าที่จะดำเนินการอย่างต่อเนื่องในลักษณะที่ทำให้ผลผลิตสดเสี่ยงต่อการปนเปื้อนข้าม7 การแทรกแซงเพื่อฆ่าเชื้อจุลินทรีย์มีความจำเป็นเพื่อควบคุมโรคที่เกิดจากอาหารและการเน่าเสียของอาหารได้ดียิ่งขึ้น และมีศักยภาพที่จะนำไปใช้ได้ตลอดห่วงโซ่การผลิตตั้งแต่ฟาร์มถึงโต๊ะอาหาร ผลกระทบและต้นทุนน้อยลง
เมื่อเร็วๆ นี้ ได้มีการพัฒนาแพลตฟอร์มต้านจุลชีพแบบปราศจากสารเคมีโดยใช้เทคโนโลยีนาโน เพื่อยับยั้งแบคทีเรียบนพื้นผิวและในอากาศโดยใช้โครงสร้างนาโนน้ำเทียม (EWNS) สำหรับการสังเคราะห์ EWNS นั้น ใช้กระบวนการคู่ขนานสองกระบวนการ ได้แก่ การพ่นด้วยไฟฟ้าและการแตกตัวเป็นไอออนของน้ำ (รูปที่ 1a) ก่อนหน้านี้ EWNS ได้แสดงให้เห็นแล้วว่ามีคุณสมบัติทางกายภาพและชีวภาพที่เป็นเอกลักษณ์8,9,10 EWNS มีอิเล็กตรอนเฉลี่ย 10 ตัวต่อโครงสร้าง และมีขนาดนาโนเมตรเฉลี่ย 25 ​​นาโนเมตร (รูปที่ 1b,c)8,9,10 นอกจากนี้ การเรโซแนนซ์สปินอิเล็กตรอน (ESR) แสดงให้เห็นว่า EWNS มีสารออกซิเจนที่ว่องไว (ROS) จำนวนมาก ส่วนใหญ่เป็นอนุมูลไฮดรอกซิล (OH•) และอนุมูลซูเปอร์ออกไซด์ (O2-) (รูปที่ 1c) 8 EWNS คงอยู่ในอากาศเป็นเวลานานและสามารถชนกับจุลินทรีย์ที่แขวนลอยอยู่ในอากาศและบนพื้นผิว ส่งมอบ ROS และทำให้จุลินทรีย์ไม่ทำงาน (รูปที่ 1d) การศึกษาก่อนหน้านี้ยังแสดงให้เห็นว่า EWNS สามารถทำปฏิกิริยาและยับยั้งแบคทีเรียแกรมลบและแกรมบวกต่างๆ ที่มีความสำคัญต่อสุขภาพของประชาชน รวมถึงไมโคแบคทีเรีย บนพื้นผิวและในอากาศได้8,9 การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งเกิดจากการทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ นอกจากนี้ การศึกษาการสูดดมแบบเฉียบพลันยังแสดงให้เห็นว่า EWNS ในปริมาณสูงไม่ก่อให้เกิดความเสียหายหรือการอักเสบในปอด8
(a) การพ่นละอองไฟฟ้าเกิดขึ้นเมื่อมีการใช้แรงดันไฟฟ้าสูงระหว่างหลอดแคปิลลารีที่มีของเหลวกับขั้วไฟฟ้าตรงข้าม (b) การใช้แรงดันไฟฟ้าสูงส่งผลให้เกิดปรากฏการณ์ที่แตกต่างกันสองอย่าง ได้แก่ (i) การพ่นละอองน้ำด้วยไฟฟ้า และ (ii) การสร้างอนุมูลอิสระออกซิเจน (ไอออน) ที่ถูกกักอยู่ใน EWNS (c) โครงสร้างที่เป็นเอกลักษณ์ของ EWNS (d) EWNS มีความคล่องตัวสูงเนื่องจากมีขนาดระดับนาโนและสามารถทำปฏิกิริยากับเชื้อโรคในอากาศได้
ความสามารถของแพลตฟอร์มต้านจุลชีพ EWNS ในการยับยั้งจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคในอาหารบนพื้นผิวของอาหารสดได้รับการพิสูจน์แล้วเมื่อเร็ว ๆ นี้ นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่าประจุบนพื้นผิวของ EWNS สามารถใช้ร่วมกับสนามไฟฟ้าเพื่อการส่งสารไปยังเป้าหมายได้อย่างแม่นยำ ที่สำคัญกว่านั้น ผลลัพธ์เบื้องต้นที่น่าสนใจคือ การลดลงของกิจกรรมของมะเขือเทศอินทรีย์ประมาณ 1.4 ล็อก เมื่อเทียบกับจุลินทรีย์ในอาหารหลายชนิด เช่น E. coli และ Listeria ภายใน 90 นาทีของการสัมผัสกับ EWNS ที่ความเข้มข้นประมาณ 50,000#/cm³¹¹ นอกจากนี้ การทดสอบการประเมินทางประสาทสัมผัสเบื้องต้นแสดงให้เห็นว่าไม่มีผลกระทบต่อประสาทสัมผัสเมื่อเทียบกับมะเขือเทศควบคุม แม้ว่าผลการยับยั้งเบื้องต้นเหล่านี้จะให้คำมั่นสัญญาถึงความปลอดภัยของอาหารแม้ในปริมาณ EWNS ที่ต่ำมากเพียง 50,000#/cc³ แต่ก็เห็นได้ชัดว่าศักยภาพในการยับยั้งที่สูงขึ้นจะเป็นประโยชน์มากกว่าในการลดความเสี่ยงของการติดเชื้อและการเน่าเสียต่อไป
ในงานวิจัยนี้ เราจะมุ่งเน้นไปที่การพัฒนาแพลตฟอร์มการสร้าง EWNS เพื่อปรับแต่งพารามิเตอร์การสังเคราะห์และเพิ่มประสิทธิภาพคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของ EWNS เพื่อเพิ่มศักยภาพในการต้านเชื้อแบคทีเรีย โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การเพิ่มประสิทธิภาพได้มุ่งเน้นไปที่การเพิ่มประจุบนพื้นผิว (เพื่อปรับปรุงการส่งยาไปยังเป้าหมาย) และปริมาณ ROS (เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อ) รวมถึงการวิเคราะห์คุณสมบัติทางกายภาพและเคมีที่ได้รับการปรับปรุงแล้ว (ขนาด ประจุ และปริมาณ ROS) โดยใช้วิธีการวิเคราะห์ที่ทันสมัย ​​และใช้จุลินทรีย์ในอาหารทั่วไป เช่น E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae และ M. parafortuitum
EVNS ถูกสังเคราะห์โดยการพ่นด้วยไฟฟ้าและการแตกตัวเป็นไอออนพร้อมกันของน้ำบริสุทธิ์สูง (18 MΩ cm–1) เครื่องพ่นละอองไฟฟ้า 12 โดยทั่วไปใช้สำหรับพ่นละอองของเหลว โพลิเมอร์สังเคราะห์ อนุภาคเซรามิก 13 และเส้นใย 14 ที่มีขนาดที่ควบคุมได้
ดังรายละเอียดในเอกสารเผยแพร่ก่อนหน้านี้ 8, 9, 10, 11 ในการทดลองทั่วไป จะมีการใช้แรงดันไฟฟ้าสูงระหว่างท่อโลหะและขั้วไฟฟ้าตรงข้ามที่ต่อลงดิน ในระหว่างกระบวนการนี้ จะเกิดปรากฏการณ์ที่แตกต่างกันสองอย่างคือ 1) การพ่นด้วยไฟฟ้า และ 2) การแตกตัวเป็นไอออนของน้ำ สนามไฟฟ้าแรงสูงระหว่างขั้วไฟฟ้าทั้งสองทำให้ประจุลบสะสมบนพื้นผิวของน้ำที่ควบแน่น ส่งผลให้เกิดการก่อตัวของกรวยเทย์เลอร์ ผลที่ตามมาคือ หยดน้ำที่มีประจุสูงจะก่อตัวขึ้น ซึ่งจะแตกตัวต่อไปเป็นอนุภาคขนาดเล็กตามทฤษฎีของเรย์ลีห์16 ในขณะเดียวกัน สนามไฟฟ้าแรงสูงทำให้โมเลกุลของน้ำบางส่วนแตกตัวและดึงอิเล็กตรอนออก (การแตกตัวเป็นไอออน) จึงสร้างอนุมูลอิสระออกซิเจน (ROS) จำนวนมาก17 แพ็กเก็ต ROS18 ที่เกิดขึ้นพร้อมกันจะถูกห่อหุ้มไว้ใน EWNS (รูปที่ 1c)
ภาพที่ 2a แสดงระบบการสร้าง EWNS ที่พัฒนาและใช้ในการสังเคราะห์ EWNS ในการศึกษาครั้งนี้ น้ำบริสุทธิ์ที่เก็บไว้ในขวดปิดสนิทถูกส่งผ่านท่อเทฟลอน (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 2 มม.) ไปยังเข็มสแตนเลสขนาด 30G (ท่อโลหะ) ดังแสดงในภาพที่ 2b การไหลของน้ำถูกควบคุมโดยความดันอากาศภายในขวด เข็มติดอยู่กับแท่นเทฟลอนที่สามารถปรับระยะห่างจากขั้วไฟฟ้าตรงข้ามได้ด้วยตนเอง ขั้วไฟฟ้าตรงข้ามเป็นแผ่นอลูมิเนียมขัดเงาที่มีรูตรงกลางสำหรับเก็บตัวอย่าง ด้านล่างของขั้วไฟฟ้าตรงข้ามเป็นกรวยเก็บตัวอย่างอลูมิเนียม ซึ่งเชื่อมต่อกับส่วนประกอบอื่นๆ ของอุปกรณ์ทดลองผ่านทางช่องเก็บตัวอย่าง (ภาพที่ 2b) ส่วนประกอบทั้งหมดของเครื่องเก็บตัวอย่างต่อลงดินเพื่อหลีกเลี่ยงการสะสมประจุที่อาจทำให้การเก็บตัวอย่างอนุภาคเสื่อมคุณภาพ
(a) ระบบสร้างโครงสร้างนาโนของน้ำที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรม (EWNS) (b) ภาพตัดขวางของอุปกรณ์เก็บตัวอย่างและหน่วยพ่นละอองไฟฟ้าที่แสดงพารามิเตอร์ที่สำคัญที่สุด (c) การจัดเตรียมอุปกรณ์ทดลองสำหรับการยับยั้งแบคทีเรีย
ระบบสร้าง EWNS ที่อธิบายไว้ข้างต้นสามารถเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์การทำงานหลักเพื่ออำนวยความสะดวกในการปรับแต่งคุณสมบัติของ EWNS อย่างละเอียด ปรับแรงดันไฟฟ้าที่ใช้ (V) ระยะห่างระหว่างเข็มและขั้วไฟฟ้าตรงข้าม (L) และการไหลของน้ำ (φ) ผ่านท่อแคปิลลารีเพื่อปรับแต่งลักษณะของ EWNS สัญลักษณ์ [V (kV), L (cm)] ใช้เพื่อแสดงการผสมผสานที่แตกต่างกัน ปรับการไหลของน้ำเพื่อให้ได้กรวยเทย์เลอร์ที่เสถียรของชุด [V, L] ที่กำหนด สำหรับการศึกษาครั้งนี้ ขนาดรูเปิดของขั้วไฟฟ้าตรงข้าม (D) ถูกตั้งไว้ที่ 0.5 นิ้ว (1.29 ซม.)
เนื่องจากข้อจำกัดทางเรขาคณิตและความไม่สมมาตร จึงไม่สามารถคำนวณความแรงของสนามไฟฟ้าจากหลักการพื้นฐานได้ ดังนั้นจึงใช้ซอฟต์แวร์ QuickField™ (Svendborg, เดนมาร์ก)19 ในการคำนวณสนามไฟฟ้า เนื่องจากสนามไฟฟ้าไม่สม่ำเสมอ จึงใช้ค่าสนามไฟฟ้าที่ปลายหลอดแคปิลลารีเป็นค่าอ้างอิงสำหรับการกำหนดค่าต่างๆ
ในระหว่างการศึกษา ได้มีการประเมินค่าแรงดันไฟฟ้าและระยะห่างระหว่างเข็มกับขั้วไฟฟ้าหลายแบบ ในแง่ของการก่อตัวของกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของการผลิต EWNS และความสามารถในการทำซ้ำได้ โดยค่าต่างๆ แสดงอยู่ในตารางเสริม S1
เอาต์พุตของระบบสร้าง EWNS เชื่อมต่อโดยตรงกับเครื่องสแกนขนาดอนุภาคแบบเคลื่อนที่ (SMPS, รุ่น 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) เพื่อวัดความเข้มข้นของจำนวนอนุภาค และใช้ร่วมกับเครื่องวัดกระแสไฟฟ้าของละอองลอยแบบฟาราเดย์ (TSI, รุ่น 3068B, Shoreview, USA) เพื่อวัดการไหลของละอองลอย ดังที่อธิบายไว้ในเอกสารเผยแพร่ก่อนหน้าของเรา9 ทั้ง SMPS และเครื่องวัดกระแสไฟฟ้าของละอองลอยเก็บตัวอย่างที่อัตราการไหล 0.5 ลิตร/นาที (อัตราการไหลของตัวอย่างทั้งหมด 1 ลิตร/นาที) วัดความเข้มข้นของอนุภาคและฟลักซ์ของละอองลอยเป็นเวลา 120 วินาที ทำการวัดซ้ำ 30 ครั้ง คำนวณประจุของละอองลอยทั้งหมดจากการวัดกระแสไฟฟ้า และประมาณประจุ EWNS เฉลี่ยจากจำนวนอนุภาค EWNS ทั้งหมดที่เก็บตัวอย่าง ต้นทุนเฉลี่ยของ EWNS สามารถคำนวณได้โดยใช้สมการ (1):
โดยที่ IEl คือกระแสไฟฟ้าที่วัดได้, NSMPS คือความเข้มข้นของจำนวนอนุภาคที่วัดได้ด้วย SMPS และ φEl คืออัตราการไหลไปยังอิเล็กโทรมิเตอร์
เนื่องจากความชื้นสัมพัทธ์ (RH) มีผลต่อประจุบนพื้นผิว ดังนั้นอุณหภูมิและความชื้นสัมพัทธ์จึงถูกควบคุมให้คงที่ที่ 21°C และ 45% ตามลำดับ ตลอดการทดลอง
ใช้กล้องจุลทรรศน์แรงอะตอม (AFM) รุ่น Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) และหัววัด AC260T (Olympus, Tokyo, Japan) ในการวัดขนาดและอายุการใช้งานของ EWNS อัตราการสแกนของ AFM คือ 1 Hz และพื้นที่การสแกนคือ 5 µm × 5 µm โดยมีเส้นสแกน 256 เส้น ภาพทั้งหมดได้รับการปรับแนวภาพลำดับแรกโดยใช้ซอฟต์แวร์ Asylum (มาสก์ที่มีช่วง 100 nm และค่าเกณฑ์ 100 pm)
นำกรวยเก็บตัวอย่างออกและวางพื้นผิวไมกาที่ระยะห่าง 2.0 ซม. จากขั้วไฟฟ้าตรงข้ามเป็นเวลาเฉลี่ย 120 วินาที เพื่อหลีกเลี่ยงการรวมตัวของอนุภาคและการก่อตัวของหยดน้ำที่ไม่สม่ำเสมอบนพื้นผิวไมกา EWNS ถูกนำไปใช้โดยตรงกับพื้นผิวไมกาที่ตัดใหม่ (Ted Pella, Redding, CA) ทันทีหลังจากการสปัตเตอร์ พื้นผิวไมกาถูกตรวจสอบโดยใช้ AFM มุมสัมผัสพื้นผิวของไมกาที่ตัดใหม่ที่ไม่ได้ดัดแปลงนั้นใกล้เคียงกับ 0° ดังนั้น EWNS จึงแพร่กระจายไปทั่วพื้นผิวไมกาในรูปทรงโดม20 เส้นผ่านศูนย์กลาง (a) และความสูง (h) ของหยดน้ำที่แพร่กระจายถูกวัดโดยตรงจากภาพภูมิประเทศ AFM และใช้ในการคำนวณปริมาตรการแพร่กระจายแบบโดม EWNS โดยใช้วิธีการที่ได้รับการตรวจสอบแล้วก่อนหน้านี้ของเรา8 สมมติว่า EVNS บนเครื่องมีปริมาตรเท่ากัน เส้นผ่านศูนย์กลางเทียบเท่าสามารถคำนวณได้จากสมการ (2):
ตามวิธีการที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้ของเรา ได้ใช้เครื่องดักจับสปินแบบอิเล็กตรอนสปินเรโซแนนซ์ (ESR) เพื่อตรวจจับการมีอยู่ของสารตัวกลางอนุมูลอิสระที่มีอายุสั้นใน EWNS โดยนำละอองลอยผ่านสารละลายที่มี DEPMPO (5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) ความเข้มข้น 235 mM (Oxis International Inc., Portland, Oregon) การวัด EPR ทั้งหมดดำเนินการโดยใช้เครื่องสเปกโทรเมตร Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) และอาร์เรย์เซลล์แบบแบน ซอฟต์แวร์ Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) ใช้ในการรวบรวมและวิเคราะห์ข้อมูล การหาลักษณะเฉพาะของ ROS ดำเนินการเฉพาะภายใต้เงื่อนไขการทำงานชุดหนึ่ง [-6.5 kV, 4.0 cm] เท่านั้น ความเข้มข้นของ EWNS วัดโดยใช้ SMPS หลังจากคำนึงถึงการสูญเสีย EWNS ในเครื่องดักจับแล้ว
ระดับโอโซนได้รับการตรวจสอบโดยใช้เครื่องตรวจวัดโอโซนแบบลำแสงคู่ 205™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10
สำหรับคุณสมบัติ EWNS ทั้งหมด ค่าที่วัดได้คือค่าเฉลี่ยของการวัด และข้อผิดพลาดในการวัดคือค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน มีการทำการทดสอบ t เพื่อเปรียบเทียบค่าของคุณลักษณะ EWNS ที่ปรับให้เหมาะสมแล้วกับค่า EWNS พื้นฐานที่สอดคล้องกัน
รูปที่ 2c แสดงระบบการตกตะกอนด้วยไฟฟ้าสถิตแบบส่งผ่าน (EPES) ที่พัฒนาและกำหนดลักษณะไว้ก่อนหน้านี้ ซึ่งสามารถใช้เพื่อกำหนดเป้าหมาย EWNS11 ไปยังพื้นผิวได้ EPES ใช้ประจุ EWNS ร่วมกับสนามไฟฟ้าแรงสูงเพื่อ "ชี้" ไปที่พื้นผิวเป้าหมายโดยตรง รายละเอียดของระบบ EPES ได้ถูกนำเสนอในสิ่งพิมพ์ล่าสุดโดย Pyrgiotakis et al.11 ดังนั้น EPES ประกอบด้วยห้อง PVC ที่พิมพ์ด้วยเครื่องพิมพ์ 3 มิติที่มีปลายเรียว โดยมีแผ่นโลหะสแตนเลส (สแตนเลส 304 ขัดเงา) สองแผ่นขนานกันอยู่ตรงกลางห่างกัน 15.24 ซม. แผ่นโลหะเชื่อมต่อกับแหล่งจ่ายไฟแรงสูงภายนอก (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) แผ่นด้านล่างเป็นบวกเสมอ และแผ่นด้านบนต่อลงดินเสมอ (ลอยตัว) ผนังห้องถูกหุ้มด้วยฟอยล์อลูมิเนียม ซึ่งต่อลงดินเพื่อป้องกันการสูญเสียอนุภาค ห้องมีประตูโหลดด้านหน้าที่ปิดสนิท ซึ่งช่วยให้สามารถวางพื้นผิวทดสอบบนชั้นวางพลาสติก ยกขึ้นจากแผ่นโลหะด้านล่างเพื่อหลีกเลี่ยงการรบกวนจากแรงดันไฟฟ้าสูง
ประสิทธิภาพการตกตะกอนของ EWNS ใน EPES ถูกคำนวณตามโปรโตคอลที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้ ซึ่งมีรายละเอียดอยู่ในภาพประกอบเพิ่มเติม S111
ในฐานะห้องควบคุม กระแสลมที่สองที่ไหลผ่านห้องทรงกระบอกจะเชื่อมต่อแบบอนุกรมกับระบบ EPES โดยใช้ตัวกรอง HEPA ระหว่างกลางเพื่อกำจัด EWNS ดังแสดงในรูปที่ 2c ละออง EWNS ถูกสูบผ่านห้องสองห้องที่เชื่อมต่อแบบอนุกรม ตัวกรองระหว่างห้องควบคุมและ EPES จะกำจัด EWNS ที่เหลืออยู่ ทำให้ได้อุณหภูมิ (T) ความชื้นสัมพัทธ์ (RH) และระดับโอโซนที่เท่ากัน
จุลินทรีย์สำคัญที่ก่อให้เกิดโรคจากอาหารได้ถูกพบว่าปนเปื้อนในผลิตผลสด เช่น Escherichia coli (ATCC #27325) ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้อุจจาระ, Salmonella enterica (ATCC #53647) ซึ่งเป็นเชื้อก่อโรคในอาหาร, Listeria innocua (ATCC #33090) ซึ่งเป็นทางเลือกแทน Listeria monocytogenes ที่ก่อโรค, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) ซึ่งเป็นทางเลือกแทนยีสต์ที่ทำให้เกิดการเน่าเสีย และ Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) ซึ่งเป็นแบคทีเรียที่มีชีวิตที่ทนทานกว่า ได้ซื้อมาจาก ATCC (Manassas, Virginia)
ซื้อกล่องมะเขือเทศเชอร์รี่ออร์แกนิกจากตลาดท้องถิ่นแบบสุ่ม แล้วแช่เย็นที่อุณหภูมิ 4°C จนกว่าจะนำมาใช้ (นานถึง 3 วัน) เลือกมะเขือเทศที่มีขนาดเดียว ประมาณ 1/2 นิ้ว เพื่อนำมาทดลอง
ขั้นตอนการบ่ม การปลูกเชื้อ การสัมผัส และการนับจำนวนโคโลนีได้อธิบายไว้โดยละเอียดในเอกสารเผยแพร่ก่อนหน้านี้ของเรา และอธิบายอย่างละเอียดในข้อมูลเสริม 11 ประสิทธิภาพของ EWNS ได้รับการประเมินโดยการนำมะเขือเทศที่ปลูกเชื้อแล้วไปสัมผัสกับ EWNS ที่ความเข้มข้น 40,000 #/cm³ เป็นเวลา 45 นาที โดยสรุปคือ ณ เวลา t = 0 นาที ใช้มะเขือเทศสามลูกเพื่อประเมินจุลินทรีย์ที่รอดชีวิต มะเขือเทศสามลูกถูกวางใน EPES และสัมผัสกับ EWNS ที่ความเข้มข้น 40,000 #/cc (มะเขือเทศที่สัมผัสกับ EWNS) และอีกสามลูกถูกวางไว้ในห้องควบคุม (มะเขือเทศควบคุม) ไม่มีกลุ่มมะเขือเทศใดได้รับการแปรรูปเพิ่มเติม มะเขือเทศที่สัมผัสกับ EWNS และกลุ่มควบคุมถูกนำออกหลังจาก 45 นาทีเพื่อประเมินผลของ EWNS
การทดลองแต่ละครั้งดำเนินการซ้ำ 3 ครั้ง การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการตามระเบียบวิธีที่อธิบายไว้ในข้อมูลเพิ่มเติม
ตัวอย่างแบคทีเรีย E. coli, Enterobacter และ L. innocua ที่สัมผัสกับ EWNS (45 นาที ความเข้มข้นของละออง EWNS 40,000 #/cm3) และตัวอย่างที่ไม่สัมผัส ถูกนำมาตกตะกอนเพื่อประเมินกลไกการยับยั้ง ตะกอนถูกตรึงเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องในสารละลายโซเดียมคาโคไดเลต 0.1 M (pH 7.4) โดยใช้สารตรึงประกอบด้วยกลูตารัลดีไฮด์ 2.5%, พาราฟอร์มาลดีไฮด์ 1.25% และกรดพิคริก 0.03% หลังจากล้างแล้ว ตัวอย่างถูกตรึงด้วยออสเมียมเตตระออกไซด์ (OsO4) 1%/โพแทสเซียมเฟอร์โรไซยาไนด์ (KFeCN6) 1.5% เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้างด้วยน้ำ 3 ครั้ง และบ่มในยูรานิลอะซิเตต 1% เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นล้างด้วยน้ำ 2 ครั้ง จากนั้นทำการกำจัดน้ำออกจากตัวอย่างโดยแช่ในแอลกอฮอล์ความเข้มข้น 50%, 70%, 90% และ 100% เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นนำตัวอย่างไปแช่ในโพรพิลีนออกไซด์เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และทำการชุบด้วยส่วนผสมของโพรพิลีนออกไซด์และ TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) ในอัตราส่วน 1:1 ตัวอย่างถูกฝังใน TAAB Epon และทำการพอลิเมอไรซ์ที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เรซินที่เป็นเม็ดที่แข็งตัวแล้วถูกตัดและนำไปตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) รุ่น JEOL 1200EX (JEOL, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ซึ่งเป็นกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านทั่วไปที่ติดตั้งกล้อง CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, USA)
การทดลองทั้งหมดดำเนินการซ้ำ 3 ครั้ง สำหรับแต่ละช่วงเวลา นำตัวอย่างล้างแบคทีเรียไปเพาะเลี้ยงซ้ำ 3 ครั้ง ทำให้ได้ข้อมูลทั้งหมด 9 จุดต่อช่วงเวลา จากนั้นจึงนำค่าเฉลี่ยมาใช้เป็นความเข้มข้นของแบคทีเรียสำหรับจุลินทรีย์ชนิดนั้น และใช้ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานเป็นค่าความคลาดเคลื่อนในการวัด นับทุกจุดข้อมูล
คำนวณค่าลอการิทึมของการลดลงของความเข้มข้นของแบคทีเรียเมื่อเทียบกับเวลา t = 0 นาที โดยใช้สูตรต่อไปนี้:
โดยที่ C0 คือความเข้มข้นของแบคทีเรียในตัวอย่างควบคุม ณ เวลา 0 (กล่าวคือ หลังจากพื้นผิวแห้งแล้ว แต่ก่อนที่จะนำไปวางในห้องทดลอง) และ Cn คือความเข้มข้นของแบคทีเรียบนพื้นผิวหลังจากสัมผัสเป็นเวลา n นาที
เพื่อชดเชยการเสื่อมสภาพตามธรรมชาติของแบคทีเรียในช่วงเวลาสัมผัส 45 นาที จึงได้คำนวณค่า Log-Reduction เปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่เวลา 45 นาที ดังนี้:
โดยที่ Cn คือความเข้มข้นของแบคทีเรียในตัวอย่างควบคุม ณ เวลา n และ Cn-Control คือความเข้มข้นของแบคทีเรียในกลุ่มควบคุม ณ เวลา n ข้อมูลแสดงในรูปของค่าลอการิทึมของการลดลงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (ไม่มีการสัมผัสกับ EWNS)
ในระหว่างการศึกษา ได้มีการประเมินค่าแรงดันไฟฟ้าและระยะห่างระหว่างเข็มกับขั้วไฟฟ้าตรงข้ามหลายแบบ ในแง่ของการก่อตัวของกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของการผลิต EWNS และความสามารถในการทำซ้ำได้ ค่าต่างๆ แสดงอยู่ในตารางเสริม S1 ได้เลือกสองกรณีสำหรับการศึกษาอย่างครบถ้วน ซึ่งแสดงให้เห็นถึงคุณสมบัติที่เสถียรและทำซ้ำได้ (กรวยเทย์เลอร์ การผลิต EWNS และความเสถียรเมื่อเวลาผ่านไป) รูปที่ 3 แสดงผลลัพธ์เกี่ยวกับประจุ ขนาด และปริมาณของ ROS สำหรับสองกรณี ผลลัพธ์ยังสรุปไว้ในตารางที่ 1 ด้วย สำหรับการอ้างอิง รูปที่ 3 และตารางที่ 1 รวมถึงคุณสมบัติของ EWNS8, 9, 10, 11 ที่สังเคราะห์ไว้ก่อนหน้านี้โดยไม่ได้ปรับให้เหมาะสม (EWNS พื้นฐาน) การคำนวณความสำคัญทางสถิติโดยใช้การทดสอบ t แบบสองด้านได้ถูกตีพิมพ์ซ้ำในตารางเสริม S2 นอกจากนี้ ข้อมูลเพิ่มเติมยังรวมถึงการศึกษาเกี่ยวกับผลกระทบของเส้นผ่านศูนย์กลางของรูเก็บตัวอย่างของขั้วไฟฟ้าตรงข้าม (D) และระยะห่างระหว่างขั้วไฟฟ้ากราวด์กับปลายเข็ม (L) (รูปเสริม S2 และ S3)
(a–c) การกระจายขนาดของ AFM (d – f) ลักษณะประจุบนพื้นผิว (g) การวิเคราะห์ลักษณะเฉพาะของ ROS และ ESR
สิ่งสำคัญที่ควรทราบอีกประการหนึ่งคือ ภายใต้เงื่อนไขทั้งหมดข้างต้น กระแสไอออนไนเซชันที่วัดได้อยู่ในช่วง 2-6 µA และแรงดันไฟฟ้าอยู่ในช่วง -3.8 ถึง -6.5 kV ส่งผลให้การใช้พลังงานสำหรับโมดูลสร้าง EWNS แบบขั้วเดียวนี้ต่ำกว่า 50 mW แม้ว่า EWNS จะถูกสังเคราะห์ภายใต้ความดันสูง แต่ระดับโอโซนก็ต่ำมาก ไม่เคยเกิน 60 ppb
ภาพประกอบเพิ่มเติม S4 แสดงสนามไฟฟ้าจำลองสำหรับสถานการณ์ [-6.5 kV, 4.0 cm] และ [-3.8 kV, 0.5 cm] ตามลำดับ สนามไฟฟ้าตามสถานการณ์ [-6.5 kV, 4.0 cm] และ [-3.8 kV, 0.5 cm] คำนวณได้เป็น 2 × 10⁵ V/m และ 4.7 × 10⁵ V/m ตามลำดับ ซึ่งเป็นไปตามที่คาดไว้ เนื่องจากอัตราส่วนของแรงดันไฟฟ้าต่อระยะทางในกรณีที่สองนั้นสูงกว่ามาก
ภาพที่ 3a และ 3b แสดงเส้นผ่านศูนย์กลางของ EWNS ที่วัดด้วย AFM8 เส้นผ่านศูนย์กลางเฉลี่ยของ EWNS สำหรับสถานการณ์ [-6.5 kV, 4.0 cm] และ [-3.8 kV, 0.5 cm] คำนวณได้เป็น 27 นาโนเมตร และ 19 นาโนเมตร ตามลำดับ ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานทางเรขาคณิตของการกระจายตัวสำหรับกรณี [-6.5 kV, 4.0 cm] และ [-3.8 kV, 0.5 cm] คือ 1.41 และ 1.45 ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าการกระจายขนาดแคบ ทั้งขนาดเฉลี่ยและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานทางเรขาคณิตใกล้เคียงกับ EWNS พื้นฐานมาก โดยมีค่า 25 นาโนเมตร และ 1.41 ตามลำดับ ภาพที่ 3c แสดงการกระจายขนาดของ EWNS พื้นฐานที่วัดโดยใช้วิธีเดียวกันภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน
รูปที่ 3d และ 3e แสดงผลการวิเคราะห์ลักษณะประจุ ข้อมูลเป็นค่าเฉลี่ยของการวัดความเข้มข้น (#/cm3) และกระแสไฟฟ้า (I) พร้อมกัน 30 ครั้ง การวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่าประจุเฉลี่ยบน EWNS คือ 22 ± 6 e- และ 44 ± 6 e- สำหรับ [-6.5 kV, 4.0 cm] และ [-3.8 kV, 0.5 cm] ตามลำดับ เมื่อเปรียบเทียบกับ Baseline-EWNS (10 ± 2 e-) ประจุบนพื้นผิวของ EWNS สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ คือ สองเท่าของสถานการณ์ [-6.5 kV, 4.0 cm] และสี่เท่าของสถานการณ์ [-3.8 kV, 0.5 cm] รูปที่ 3f แสดงข้อมูลการชำระเงินพื้นฐานของ EWNS
จากแผนที่แสดงความเข้มข้นของจำนวนอนุภาค EWNS (ภาพประกอบเพิ่มเติม S5 และ S6) จะเห็นได้ว่าฉาก [-6.5 kV, 4.0 cm] มีจำนวนอนุภาคสูงกว่าฉาก [-3.8 kV, 0.5 cm] อย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ควรสังเกตว่ามีการตรวจสอบความเข้มข้นของจำนวนอนุภาค EWNS นานถึง 4 ชั่วโมง (ภาพประกอบเพิ่มเติม S5 และ S6) ซึ่งความเสถียรของการเกิด EWNS แสดงให้เห็นระดับความเข้มข้นของจำนวนอนุภาคที่เท่ากันในทั้งสองกรณี
รูปที่ 3g แสดงสเปกตรัม EPR หลังจากการลบค่าควบคุม (พื้นหลัง) สำหรับ EWNS ที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมที่ [-6.5 kV, 4.0 cm] สเปกตรัม ROS ยังถูกเปรียบเทียบกับค่าพื้นฐานของ EWNS ในเอกสารที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ จำนวน EWNS ที่ทำปฏิกิริยากับตัวดักจับสปินที่คำนวณได้คือ 7.5 × 10⁴ EWNS/s ซึ่งคล้ายกับค่าพื้นฐานของ EWNS⁸ ที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ สเปกตรัม EPR แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงการมีอยู่ของ ROS สองประเภท โดย O²⁻ มีปริมาณมาก ในขณะที่ OH• มีปริมาณน้อยกว่า นอกจากนี้ การเปรียบเทียบความเข้มของยอดโดยตรงแสดงให้เห็นว่า EWNS ที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมมีปริมาณ ROS สูงกว่า EWNS พื้นฐานอย่างมีนัยสำคัญ
ภาพที่ 4 แสดงประสิทธิภาพการตกตะกอนของ EWNS ใน EPES ข้อมูลสรุปไว้ในตารางที่ 1 และเปรียบเทียบกับข้อมูล EWNS ดั้งเดิม สำหรับกรณี EUNS ทั้งสองกรณี การตกตะกอนใกล้เคียง 100% แม้ที่แรงดันต่ำ 3.0 kV โดยทั่วไป 3.0 kV ก็เพียงพอที่จะทำให้เกิดการตกตะกอน 100% โดยไม่คำนึงถึงการเปลี่ยนแปลงประจุบนพื้นผิว ภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน ประสิทธิภาพการตกตะกอนของ Baseline-EWNS อยู่ที่เพียง 56% เนื่องจากประจุที่ต่ำกว่า (เฉลี่ย 10 อิเล็กตรอนต่อ EWNS)
รูปที่ 5 และตารางที่ 2 สรุประดับการยับยั้งจุลินทรีย์ที่เพาะเลี้ยงบนผิวมะเขือเทศหลังจากสัมผัสกับ EWNS ประมาณ 40,000 #/cm3 เป็นเวลา 45 นาที ภายใต้สภาวะที่เหมาะสมที่สุด [-6.5 kV, 4.0 cm] E. coli และ L. innocua ที่เพาะเลี้ยงแสดงให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญถึง 3.8 log หลังจากสัมผัสเป็นเวลา 45 นาที ภายใต้สภาวะเดียวกัน S. enterica แสดงการลดลงในระดับที่ต่ำกว่าคือ 2.2 log ในขณะที่ S. cerevisiae และ M. parafortuitum แสดงการลดลง 1.0 log
ภาพถ่ายอิเล็กตรอนไมโครสโคป (รูปที่ 6) แสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงทางกายภาพที่เกิดจาก EWNS ในเซลล์ E. coli, Salmonella enterica และ L. innocua ซึ่งนำไปสู่การไม่ทำงานของแบคทีเรีย แบคทีเรียกลุ่มควบคุมมีเยื่อหุ้มเซลล์ที่สมบูรณ์ ในขณะที่แบคทีเรียที่ได้รับสารมีเยื่อหุ้มเซลล์ชั้นนอกที่เสียหาย
การถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนของแบคทีเรียกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่ได้รับสาร เผยให้เห็นความเสียหายของเยื่อหุ้มเซลล์
ข้อมูลเกี่ยวกับคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของ EWNS ที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมโดยรวมแสดงให้เห็นว่าคุณสมบัติของ EWNS (ประจุบนพื้นผิวและปริมาณ ROS) ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับข้อมูลพื้นฐานของ EWNS ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้8,9,10,11 ในทางกลับกัน ขนาดของ EWNS ยังคงอยู่ในช่วงนาโนเมตร ซึ่งคล้ายคลึงกับผลลัพธ์ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้มาก ทำให้สามารถลอยอยู่ในอากาศได้เป็นเวลานาน ความหลากหลายของขนาดที่สังเกตได้นั้นสามารถอธิบายได้ด้วยการเปลี่ยนแปลงของประจุบนพื้นผิว ซึ่งเป็นตัวกำหนดขนาดของปรากฏการณ์เรย์ลี ความสุ่ม และการรวมตัวกันของ EWNS ที่อาจเกิดขึ้น อย่างไรก็ตาม ดังที่ Nielsen et al.22 ได้อธิบายไว้ ประจุบนพื้นผิวสูงจะช่วยลดการระเหยโดยการเพิ่มพลังงาน/แรงตึงผิวของหยดน้ำอย่างมีประสิทธิภาพ ทฤษฎีนี้ได้รับการยืนยันจากการทดลองสำหรับไมโครดรอปเล็ต22 และ EWNS ในสิ่งพิมพ์ก่อนหน้าของเรา8 การสูญเสียเมื่อเวลาผ่านไปอาจส่งผลต่อขนาดและมีส่วนทำให้เกิดการกระจายขนาดที่สังเกตได้
นอกจากนี้ ประจุต่อโครงสร้างอยู่ที่ประมาณ 22–44 อิเล็กตรอน ขึ้นอยู่กับสถานการณ์ ซึ่งสูงกว่า EWNS พื้นฐานอย่างมีนัยสำคัญ โดย EWNS พื้นฐานมีประจุเฉลี่ย 10 ± 2 อิเล็กตรอนต่อโครงสร้าง อย่างไรก็ตาม ควรสังเกตว่านี่คือประจุเฉลี่ยของ EWNS Seto และคณะได้แสดงให้เห็นว่าประจุไม่สม่ำเสมอและเป็นไปตามการกระจายแบบลอการิทมิกปกติ²¹ เมื่อเปรียบเทียบกับงานก่อนหน้าของเรา การเพิ่มประจุบนพื้นผิวเป็นสองเท่าจะทำให้ประสิทธิภาพการตกตะกอนในระบบ EPES เพิ่มขึ้นเป็นสองเท่าเกือบ 100%¹¹