Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używasz przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS. Aby zapewnić najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Ponadto, aby zapewnić ciągłą obsługę, wyświetlamy witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Niedawno opracowano wolną od chemikaliów platformę antybakteryjną opartą na nanotechnologii wykorzystującej sztuczne nanostruktury wodne (EWNS). EWNS charakteryzują się wysokim ładunkiem powierzchniowym i są bogate w reaktywne formy tlenu (RFT), które mogą oddziaływać z wieloma mikroorganizmami, w tym patogenami przenoszonymi przez żywność, i je inaktywować. W pracy wykazano, że ich właściwości podczas syntezy można precyzyjnie dostroić i zoptymalizować, aby jeszcze bardziej zwiększyć ich potencjał antybakteryjny. Platforma laboratoryjna EWNS została zaprojektowana w celu precyzyjnego dostrojenia właściwości EWNS poprzez zmianę parametrów syntezy. Charakterystykę właściwości EWNS (ładunku, wielkości i zawartości RFT) przeprowadzono przy użyciu nowoczesnych metod analitycznych. Ponadto, na powierzchnię ekologicznych pomidorów winogronowych zaszczepiono mikroorganizmy spożywcze, takie jak Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum i Saccharomyces cerevisiae, w celu oceny ich potencjału inaktywacji mikrobiologicznej. Przedstawione wyniki dowodzą, że właściwości EWNS można precyzyjnie dostroić podczas syntezy, co skutkuje wykładniczym wzrostem wydajności inaktywacji. W szczególności, ładunek powierzchniowy wzrósł czterokrotnie, a zawartość ROS wzrosła. Szybkość usuwania drobnoustrojów była zależna od mikroorganizmów i wahała się od 1,0 do 3,8 log po 45 minutach ekspozycji na dawkę aerozolu 40 000 µg/cm³ EWNS.
Zanieczyszczenie mikrobiologiczne jest główną przyczyną chorób przenoszonych drogą pokarmową, spowodowanych spożyciem patogenów lub ich toksyn. Choroby przenoszone drogą pokarmową odpowiadają za około 76 milionów zachorowań, 325 000 hospitalizacji i 5000 zgonów rocznie w samych Stanach Zjednoczonych1. Ponadto, Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) szacuje, że zwiększone spożycie świeżych produktów odpowiada za 48% wszystkich chorób przenoszonych drogą pokarmową zgłaszanych w Stanach Zjednoczonych2. Koszt chorób i zgonów spowodowanych patogenami przenoszonymi drogą pokarmową w Stanach Zjednoczonych jest bardzo wysoki, szacowany przez Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) na ponad 15,6 miliarda dolarów rocznie3.
Obecnie chemiczne4, radiacyjne5 i termiczne6 interwencje przeciwdrobnoustrojowe w celu zapewnienia bezpieczeństwa żywności są wdrażane głównie w ograniczonych krytycznych punktach kontroli (CCP) w łańcuchu produkcyjnym (zwykle po zbiorach i/lub podczas pakowania), a nie w sposób ciągły, w taki sposób, aby świeże produkty były narażone na zanieczyszczenie krzyżowe7. Interwencje przeciwdrobnoustrojowe są potrzebne do lepszej kontroli chorób przenoszonych drogą pokarmową i psucia się żywności i mają potencjał do stosowania w całym cyklu „od pola do stołu”. Mniejszy wpływ i niższe koszty.
Niedawno opracowano nanotechnologiczną, wolną od chemikaliów platformę przeciwdrobnoustrojową do inaktywacji bakterii na powierzchniach i w powietrzu przy użyciu sztucznych nanostruktur wodnych (EWNS). Do syntezy EVNS zastosowano dwa równoległe procesy: elektrorozpylanie i jonizację wody (rys. 1a). Wykazano wcześniej, że EWNS mają unikalny zestaw właściwości fizycznych i biologicznych8,9,10. EWNS ma średnio 10 elektronów na strukturę i średni rozmiar nanometra 25 nm (rys. 1b,c)8,9,10. Ponadto rezonans spinów elektronowych (ESR) wykazał, że EWNS zawierają dużą ilość reaktywnych form tlenu (ROS), głównie rodników hydroksylowych (OH•) i ponadtlenkowych (O2-) (rys. 1c)8. EWNS pozostawały w powietrzu przez długi czas i mogły zderzać się z mikrobami zawieszonymi w powietrzu i obecnymi na powierzchniach, dostarczając ładunek ROS i powodując inaktywację drobnoustrojów (rys. 1d). Wcześniejsze badania wykazały również, że EWNS może wchodzić w interakcje z różnymi bakteriami Gram-ujemnymi i Gram-dodatnimi, istotnymi dla zdrowia publicznego, w tym z prątkami gruźlicy, oraz inaktywować je na powierzchniach i w powietrzu8,9. Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała, że ​​inaktywacja była spowodowana uszkodzeniem błony komórkowej. Ponadto badania ostrej inhalacji wykazały, że wysokie dawki EWNS nie powodują uszkodzenia płuc ani stanu zapalnego8.
(a) Elektrospray występuje, gdy pomiędzy kapilarą zawierającą ciecz a elektrodą przeciwną przyłożone zostaje wysokie napięcie. (b) Zastosowanie wysokiego napięcia powoduje dwa różne zjawiska: (i) elektrospray wody i (ii) wytwarzanie reaktywnych form tlenu (jonów) uwięzionych w sieciach EWNS. (c) Unikalna struktura sieci EWNS. (d) Sieci EWNS są bardzo mobilne ze względu na swoją nanostrukturę i mogą oddziaływać z patogenami unoszącymi się w powietrzu.
Niedawno wykazano również zdolność platformy antybakteryjnej EWNS do inaktywacji mikroorganizmów przenoszonych przez żywność na powierzchni świeżej żywności. Wykazano również, że ładunek powierzchniowy EWNS może być stosowany w połączeniu z polem elektrycznym do ukierunkowanego dostarczania. Co ważniejsze, obiecujący początkowy wynik, wynoszący około 1,4 logarytmu redukcji aktywności pomidorów ekologicznych wobec różnych mikroorganizmów spożywczych, takich jak E. coli i Listeria, zaobserwowano w ciągu 90 minut od ekspozycji na EWNS w stężeniu około 50 000#/cm311. Ponadto wstępne testy oceny organoleptycznej nie wykazały żadnego efektu organoleptycznego w porównaniu z pomidorem kontrolnym. Chociaż te wstępne wyniki inaktywacji obiecują bezpieczeństwo żywności nawet przy bardzo niskich dawkach EWNS, wynoszących 50 000#/cm3, oczywiste jest, że wyższy potencjał inaktywacji byłby bardziej korzystny dla dalszego zmniejszenia ryzyka infekcji i psucia się żywności.
W niniejszym artykule skupimy się na opracowaniu platformy generacji EWNS, aby precyzyjnie dostroić parametry syntezy i zoptymalizować właściwości fizykochemiczne EWNS w celu zwiększenia ich potencjału antybakteryjnego. W szczególności optymalizacja koncentruje się na zwiększeniu ich ładunku powierzchniowego (w celu poprawy ukierunkowanego dostarczania) oraz zawartości ROS (w celu poprawy wydajności inaktywacji). Charakterystyka zoptymalizowanych właściwości fizykochemicznych (rozmiar, ładunek i zawartość ROS) zostanie przeprowadzona przy użyciu nowoczesnych metod analitycznych oraz z wykorzystaniem popularnych mikroorganizmów spożywczych, takich jak E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae i M. parafortuitum.
Synteza EVNS została przeprowadzona poprzez jednoczesne elektrorozpylanie i jonizację wody o wysokiej czystości (18 MΩ cm–1). Atomizer elektryczny 12 jest zazwyczaj używany do rozpylania cieczy oraz cząstek polimerów syntetycznych i ceramicznych 13 i włókien 14 o kontrolowanej wielkości.
Jak szczegółowo opisano w poprzednich publikacjach 8, 9, 10, 11, w typowym eksperymencie wysokie napięcie jest przykładane między metalową kapilarę a uziemioną przeciwelektrodę. Podczas tego procesu zachodzą dwa różne zjawiska: 1) elektrorozpylanie i 2) jonizacja wody. Silne pole elektryczne między dwiema elektrodami powoduje gromadzenie się ładunków ujemnych na powierzchni skroplonej wody, co prowadzi do powstania stożków Taylora. W rezultacie powstają silnie naładowane krople wody, które nadal rozpadają się na mniejsze cząsteczki, zgodnie z teorią Rayleigha16. Jednocześnie silne pole elektryczne powoduje rozszczepienie niektórych cząsteczek wody i oderwanie elektronów (jonizacja), generując w ten sposób dużą ilość reaktywnych form tlenu (ROS)17. Jednocześnie wygenerowane pakiety ROS18 zostały zamknięte w EWNS (rys. 1c).
Na rys. 2a przedstawiono system generacji EWNS opracowany i zastosowany w syntezie EWNS w niniejszym badaniu. Oczyszczoną wodę przechowywaną w zamkniętej butelce podawano przez teflonową rurkę (o średnicy wewnętrznej 2 mm) do igły ze stali nierdzewnej 30G (metalowej kapilary). Jak pokazano na rys. 2b, przepływ wody jest kontrolowany przez ciśnienie powietrza wewnątrz buteleczki. Igła jest przymocowana do teflonowej konsoli, którą można ręcznie regulować w określonej odległości od przeciwelektrody. Przeciwelektroda to polerowany aluminiowy dysk z otworem pośrodku do pobierania próbek. Poniżej przeciwelektrody znajduje się aluminiowy lejek do pobierania próbek, który jest połączony z resztą układu eksperymentalnego za pomocą portu do pobierania próbek (rys. 2b). Wszystkie elementy próbnika są uziemione elektrycznie, aby zapobiec gromadzeniu się ładunku, który mógłby pogorszyć jakość pobierania próbek cząstek.
(a) System generowania nanostruktury wody (EWNS). (b) Przekrój próbnika i jednostki elektrosprayu pokazujący najważniejsze parametry. (c) Układ eksperymentalny do inaktywacji bakterii.
Opisany powyżej system generacji EWNS umożliwia zmianę kluczowych parametrów operacyjnych, co ułatwia precyzyjne dostrojenie właściwości EWNS. Aby precyzyjnie dostroić charakterystykę EWNS, należy dostosować przyłożone napięcie (V), odległość między igłą a przeciwelektrodą (L) oraz przepływ wody (φ) przez kapilarę. Symbole [V (kV), L (cm)] służą do oznaczenia różnych kombinacji. Dostosuj przepływ wody, aby uzyskać stabilny stożek Taylora o określonym kącie [V, L]. Na potrzeby niniejszego badania apertura przeciwelektrody (D) została ustawiona na 0,5 cala (1,29 cm).
Ze względu na ograniczoną geometrię i asymetrię, natężenia pola elektrycznego nie można obliczyć metodą teoretyczną. Zamiast tego do obliczenia pola elektrycznego wykorzystano oprogramowanie QuickField™ (Svendborg, Dania)19. Pole elektryczne nie jest jednorodne, dlatego wartość pola elektrycznego na końcu kapilary została wykorzystana jako wartość odniesienia dla różnych konfiguracji.
W trakcie badania oceniono kilka kombinacji napięcia i odległości między igłą a przeciwelektrodą pod kątem formowania stożka Taylora, jego stabilności, stabilności wytwarzania EWNS oraz powtarzalności. Różne kombinacje przedstawiono w tabeli uzupełniającej S1.
Wyjście systemu generacji EWNS było bezpośrednio podłączone do urządzenia Scanning Mobility Particle Sizer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) w celu pomiaru stężenia cząstek i było używane z elektrometrem aerozolowym Faradaya (TSI, model 3068B, Shoreview, USA). MN) do pomiaru przepływów aerozolu, jak opisano w naszej poprzedniej publikacji9. Zarówno SMPS, jak i elektrometr aerozolowy pobierały próbki z szybkością przepływu 0,5 l/min (całkowity przepływ próbki 1 l/min). Stężenia cząstek i strumienie aerozolu mierzono przez 120 s. Powtórz pomiar 30 razy. Całkowity ładunek aerozolu oblicza się na podstawie bieżących pomiarów, a średni ładunek EWNS szacuje się na podstawie całkowitej liczby pobranych próbek cząstek EWNS. Średni koszt EWNS można obliczyć za pomocą równania (1):
gdzie IEl to zmierzony prąd, NSMPS to stężenie liczbowe zmierzone za pomocą SMPS, a φEl to natężenie przepływu do elektrometru.
Ponieważ wilgotność względna (RH) ma wpływ na ładunek powierzchniowy, podczas całego eksperymentu utrzymywano stałą temperaturę i wilgotność względną (RH) na poziomie odpowiednio 21°C i 45%.
Do pomiaru wielkości i czasu życia EWNS wykorzystano mikroskopię sił atomowych (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornia) oraz sondę AC260T (Olympus, Tokio, Japonia). Częstotliwość skanowania AFM wynosi 1 Hz, a obszar skanowania to 5 µm×5 µm z 256 liniami skanowania. Wszystkie obrazy poddano wyrównaniu obrazu pierwszego rzędu za pomocą oprogramowania Asylum (maska ​​o zakresie 100 nm i progu 100 pm).
Wyjąć lejek do pobierania próbek i umieścić powierzchnię miki w odległości 2,0 cm od elektrody przeciwnej na średni czas 120 s, aby uniknąć koalescencji cząstek i tworzenia się nieregularnych kropel na powierzchni miki. EWNS został nałożony bezpośrednio na świeżo przecięte powierzchnie miki (Ted Pella, Redding, Kalifornia). Natychmiast po rozpyleniu powierzchnia miki została zwizualizowana za pomocą AFM. Kąt kontaktu powierzchni świeżo przeciętej niemodyfikowanej miki jest bliski 0°, więc EWNS rozprzestrzenia się po powierzchni miki w kształcie kopuły20. Średnicę (a) i wysokość (h) dyfuzyjnych kropel zmierzono bezpośrednio z topografii AFM i wykorzystano do obliczenia kopulastej objętości dyfuzyjnej EWNS za pomocą naszej wcześniej zweryfikowanej metody8. Zakładając, że pokładowy EVNS ma tę samą objętość, średnicę równoważną można obliczyć z równania (2):
Zgodnie z naszą wcześniej opracowaną metodą, pułapka spinowa rezonansu spinowego elektronów (ESR) została użyta do wykrycia obecności krótkożyciowych pośrednich rodników w EWNS. Aerozole przepuszczono przez roztwór zawierający 235 mM DEPMPO (5-(dietoksyfosforylo)-5-metylo-1-pirolino-N-tlenek) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Wszystkie pomiary EPR zostały wykonane przy użyciu spektrometru Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) i płaskich matryc komórkowych. Oprogramowanie Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) zostało użyte do zebrania i analizy danych. Charakterystykę ROS przeprowadzono tylko dla zestawu warunków pracy [-6,5 kV, 4,0 cm]. Stężenia EWNS mierzono przy użyciu SMPS po uwzględnieniu utraty EWNS w impaktorze.
Poziom ozonu monitorowano przy użyciu monitora ozonu Dual Beam Ozone Monitor™ 205 (2B Technologies, Boulder, Kolorado)8,9,10.
Dla wszystkich właściwości EWNS, wartość pomiaru jest średnią pomiarów, a błąd pomiaru jest odchyleniem standardowym. Wykonano test t w celu porównania wartości zoptymalizowanego atrybutu EWNS z odpowiadającą mu wartością bazowego atrybutu EWNS.
Rysunek 2c przedstawia opracowany i scharakteryzowany wcześniej system EPES (Electrostatic Precipitation Pass Through System), który może być użyty do nakierowania EWNS11 na powierzchnie. EPES wykorzystuje ładunek EWNS w połączeniu z silnym polem elektrycznym, aby „skierować” bezpośrednio na powierzchnię celu. Szczegóły systemu EPES przedstawiono w niedawnej publikacji Pyrgiotakisa i in.11. EPES składa się z drukowanej w 3D komory z PVC o stożkowych końcach, zawierającej dwie równoległe płyty ze stali nierdzewnej (stal nierdzewna 304, polerowana na lustro) pośrodku, oddalone od siebie o 15,24 cm. Płyty podłączono do zewnętrznego źródła wysokiego napięcia (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), dolna płyta była zawsze dodatnia, a górna zawsze uziemiona (pływająca). Ściany komory pokryte są folią aluminiową, która jest uziemiona elektrycznie, aby zapobiec utracie cząstek. Komora posiada uszczelnione przednie drzwi załadowcze, które umożliwiają umieszczenie testowanych powierzchni na plastikowych stelażach, podnosząc je z dolnej płyty metalowej, aby uniknąć zakłóceń wysokiego napięcia.
Wydajność depozycji EWNS w EPES została obliczona zgodnie z opracowanym wcześniej protokołem szczegółowo opisanym na rysunku uzupełniającym S111.
Jako komora kontrolna, drugi przepływ przez komorę cylindryczną jest połączony szeregowo z systemem EPES za pomocą pośredniego filtra HEPA w celu usunięcia EWNS. Jak pokazano na rys. 2c, aerozol EWNS był pompowany przez dwie komory połączone szeregowo. Filtr między pomieszczeniem kontrolnym a systemem EPES usuwa wszelkie pozostałości EWNS, co skutkuje utrzymaniem tej samej temperatury (T), wilgotności względnej (RH) i poziomu ozonu.
Stwierdzono, że ważne mikroorganizmy przenoszone przez żywność zanieczyszczają świeże produkty, takie jak Escherichia coli (ATCC #27325), wskaźnik kałowy, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen przenoszony przez żywność, Listeria innocua (ATCC #33090), alternatywa dla patogennej Listeria monocytogenes. Od ATCC (Manassas, Wirginia) zakupiono Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) jako alternatywę dla drożdży powodujących psucie się produktów oraz Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) jako bardziej odporne żywe bakterie.
Kupuj losowo opakowania ekologicznych pomidorków koktajlowych w lokalnym markecie i przechowuj je w lodówce w temperaturze 4°C do momentu spożycia (do 3 dni). Wybierz pomidory i poeksperymentuj z jednym rozmiarem, o średnicy około 1,25 cm.
Protokoły inkubacji, inokulacji, ekspozycji i liczenia kolonii zostały szczegółowo opisane w naszych poprzednich publikacjach i wyjaśnione w Danych uzupełniających 11. Skuteczność EWNS oceniano poprzez ekspozycję zaszczepionych pomidorów na 40 000 #/cm3 przez 45 minut. Krótko mówiąc, w czasie t = 0 min, użyto trzech pomidorów do oceny przeżywających mikroorganizmów. Trzy pomidory umieszczono w komorze EPES i wystawiono na działanie EWNS w stężeniu 40 000 #/cm3 (pomidory wystawione na działanie EWNS), a trzy pozostałe umieszczono w komorze kontrolnej (pomidory kontrolne). Żadnej z grup pomidorów nie poddano dodatkowej obróbce. Pomidory wystawione na działanie EWNS oraz kontrolne usunięto po 45 minutach w celu oceny skuteczności EWNS.
Każdy eksperyment przeprowadzono trzykrotnie. Analizę danych przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym w Danych uzupełniających.
Próbki bakterii E. coli, Enterobacter i L. innocua wystawione na działanie EWNS (45 min, stężenie aerozolu EWNS 40 000 µg/cm3) i nienaświetlone zostały zgranulowane w celu oceny mechanizmów inaktywacji. Osad utrwalano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w 0,1 M roztworze kakodylanu sodu (pH 7,4) z utrwalaczem 2,5% glutaraldehydu, 1,25% paraformaldehydu i 0,03% kwasu pikrynowego. Po przemyciu utrwalano je 1% tetratlenkiem osmu (OsO4)/1,5% żelazocyjankiem potasu (KFeCN6) przez 2 godziny, przemywano 3 razy wodą i inkubowano w 1% octanie uranylu przez 1 godzinę, a następnie przemywano dwukrotnie wodą. Następnie odwadniano przez 10 minut w 50%, 70%, 90% i 100% alkoholu. Następnie próbki umieszczono w tlenku propylenu na 1 godzinę i zaimpregnowano mieszaniną tlenku propylenu i żywicy TAAP Epon w stosunku 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Kalifornia). Próbki zatopiono w żywicy TAAB Epon i polimeryzowano w temperaturze 60°C przez 48 godzin. Utwardzoną żywicę granulowaną pocięto i uwidoczniono za pomocą mikroskopii elektronowej (TEM) przy użyciu JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japonia), konwencjonalnego transmisyjnego mikroskopu elektronowego wyposażonego w kamerę AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono trzykrotnie. Dla każdego punktu czasowego płukanki bakteryjne posiewano trzykrotnie, co dało łącznie dziewięć punktów danych na punkt, z których średnia została użyta jako stężenie bakterii dla danego organizmu. Odchylenie standardowe zostało użyte jako błąd pomiaru. Wszystkie punkty są brane pod uwagę.
Logarytm spadku stężenia bakterii w porównaniu do t = 0 min obliczono według następującego wzoru:
gdzie C0 oznacza stężenie bakterii w próbce kontrolnej w czasie 0 (czyli po wyschnięciu powierzchni, ale przed umieszczeniem jej w komorze), a Cn oznacza stężenie bakterii na powierzchni po n minutach ekspozycji.
Aby uwzględnić naturalną degradację bakterii podczas 45-minutowego okresu ekspozycji, obliczono także logarytmiczną redukcję w porównaniu do kontroli po 45 minutach w następujący sposób:
Gdzie Cn oznacza stężenie bakterii w próbce kontrolnej w czasie n, a Cn-Kontrola oznacza stężenie bakterii kontrolnych w czasie n. Dane przedstawiono jako redukcję logarytmiczną w porównaniu z próbką kontrolną (bez narażenia na EWNS).
W trakcie badania oceniono kilka kombinacji napięcia i odległości między igłą a przeciwelektrodą pod kątem formowania stożka Taylora, jego stabilności, stabilności wytwarzania EWNS oraz powtarzalności. Różne kombinacje przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej S1. Do pełnego badania wybrano dwa przypadki wykazujące stabilne i powtarzalne właściwości (stożek Taylora, wytwarzanie EWNS i stabilność w czasie). Na rys. 3 przedstawiono wyniki dotyczące ładunku, rozmiaru i zawartości ROS dla dwóch przypadków. Wyniki podsumowano również w Tabeli 1. Dla porównania, na Rysunku 3 i w Tabeli 1 przedstawiono właściwości wcześniej zsyntetyzowanych, niezoptymalizowanych EWNS8, 9, 10, 11 (wartość bazowa – EWNS). Obliczenia istotności statystycznej z wykorzystaniem dwustronnego testu t opublikowano ponownie w Tabeli Uzupełniającej S2. Ponadto dodatkowe dane obejmują badania dotyczące wpływu średnicy otworu próbkującego elektrody przeciwnej (D) i odległości między elektrodą uziemiającą a końcówką igły (L) (rysunki uzupełniające S2 i S3).
(a–c) Rozkład wielkości AFM. (d – f) Charakterystyka ładunku powierzchniowego. (g) Charakterystyka ROS i ESR.
Należy również zauważyć, że we wszystkich powyższych warunkach zmierzone prądy jonizacji mieściły się w zakresie 2–6 µA, a napięcia w zakresie od -3,8 do -6,5 kV, co skutkowało poborem mocy przez ten jednozaciskowy moduł generacyjny EWNS mniejszym niż 50 mW. Chociaż EWNS był syntetyzowany pod wysokim ciśnieniem, poziom ozonu był bardzo niski i nigdy nie przekraczał 60 ppb.
Rysunek uzupełniający S4 przedstawia symulowane pola elektryczne odpowiednio dla scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Pola dla scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] obliczono odpowiednio jako 2 × 105 V/m i 4,7 × 105 V/m. Jest to zrozumiałe, ponieważ stosunek napięcia do odległości jest znacznie wyższy w drugim przypadku.
Na rys. 3a i b przedstawiono średnicę EWNS zmierzoną za pomocą AFM8. Średnie średnice EWNS dla scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] obliczono odpowiednio na 27 nm i 19 nm. Geometryczne odchylenia standardowe rozkładów dla przypadków [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] wynoszą odpowiednio 1,41 i 1,45, co wskazuje na wąski rozkład wielkości. Zarówno średni rozmiar, jak i geometryczne odchylenie standardowe są bardzo zbliżone do wartości bazowej EWNS, wynosząc odpowiednio 25 nm i 1,41. Na rys. 3c przedstawiono rozkład wielkości bazowej EWNS zmierzonej tą samą metodą w tych samych warunkach.
Na rys. 3d i e przedstawiono wyniki charakterystyki ładunku. Dane stanowią średnie pomiary 30 jednoczesnych pomiarów stężenia (#/cm3) i natężenia (I). Analiza pokazuje, że średni ładunek na EWNS wynosi odpowiednio 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- dla [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. W porównaniu ze scenariuszem Baseline-EWNS (10 ± 2 e-), ich ładunek powierzchniowy jest znacznie wyższy, dwukrotnie wyższy niż w scenariuszu [-6,5 kV, 4,0 cm] i czterokrotnie wyższy niż w scenariuszu [-3,8 kV, 0,5 cm]. Rys. 3f przedstawia podstawowe dane dotyczące płatności EWNS.
Z map koncentracji liczby cząstek EWNS (rysunki uzupełniające S5 i S6) wynika, że ​​scena [-6,5 kV, 4,0 cm] charakteryzuje się znacznie większą liczbą cząstek niż scena [-3,8 kV, 0,5 cm]. Należy również zauważyć, że stężenia liczby cząstek EWNS monitorowano przez okres do 4 godzin (rysunki uzupełniające S5 i S6), gdzie stabilność generacji EWNS wykazała ten sam poziom koncentracji liczby cząstek w obu przypadkach.
Rysunek 3g przedstawia widmo EPR po odjęciu sygnału kontrolnego (tło) dla zoptymalizowanego EWNS przy [-6,5 kV, 4,0 cm]. Widmo ROS porównano również z bazą EWNS w opublikowanej wcześniej pracy. Obliczona liczba EWNS reagujących z pułapką spinową wynosi 7,5 × 104 EWNS/s, co jest wartością zbliżoną do wcześniej opublikowanej bazy EWNS8. Widma EPR wyraźnie wskazywały na obecność dwóch rodzajów ROS, w których dominował O2-, a OH• występował w mniejszej ilości. Ponadto bezpośrednie porównanie intensywności pików wykazało, że zoptymalizowany EWNS miał istotnie wyższą zawartość ROS w porównaniu z bazą EWNS.
Na rys. 4 przedstawiono wydajność osadzania EWNS w EPES. Dane podsumowano również w Tabeli I i porównano z oryginalnymi danymi EWNS. W obu przypadkach EUNS, osadzanie było bliskie 100%, nawet przy niskim napięciu 3,0 kV. Zazwyczaj 3,0 kV wystarcza do osiągnięcia 100% osadzania, niezależnie od zmiany ładunku powierzchniowego. W tych samych warunkach, wydajność osadzania Baseline-EWNS wyniosła zaledwie 56% ze względu na niższy ładunek (średnio 10 elektronów na EWNS).
Rysunek 5 i Tabela 2 podsumowują stopień inaktywacji mikroorganizmów zaszczepionych na powierzchni pomidorów po ekspozycji na około 40 000 #/cm3 EWNS przez 45 minut w optymalnym scenariuszu [-6,5 kV, 4,0 cm]. Zaszczepione bakterie E. coli i L. innocua wykazały istotną redukcję o 3,8 log po 45 minutach ekspozycji. W tych samych warunkach S. enterica wykazała niższą redukcję o 2,2 log, podczas gdy S. cerevisiae i M. parafortuitum wykazały redukcję o 1,0 log.
Zdjęcia mikroskopowe elektronowe (ryc. 6) przedstawiające zmiany fizyczne indukowane przez EWNS w komórkach E. coli, Salmonella enterica i L. innocua prowadzące do ich inaktywacji. Bakterie kontrolne wykazywały nienaruszone błony komórkowe, podczas gdy bakterie wystawione na działanie EWNS miały uszkodzone błony zewnętrzne.
Obrazowanie mikroskopowe pod mikroskopem elektronowym bakterii kontrolnych i wystawionych na działanie czynników zewnętrznych ujawniło uszkodzenie błony komórkowej.
Dane dotyczące właściwości fizykochemicznych zoptymalizowanego EWNS łącznie pokazują, że właściwości EWNS (ładunek powierzchniowy i zawartość ROS) uległy znacznej poprawie w porównaniu z wcześniej opublikowanymi danymi bazowymi EWNS8,9,10,11. Z drugiej strony, ich rozmiar pozostał w zakresie nanometrów, co jest bardzo podobne do wcześniej opublikowanych wyników, co pozwala im pozostać w powietrzu przez długi czas. Obserwowaną polidyspersyjność można wyjaśnić zmianami ładunku powierzchniowego, które determinują wielkość efektu Rayleigha, losowość i potencjalne łączenie się EWNS. Jednakże, jak szczegółowo opisali Nielsen i in.22, wysoki ładunek powierzchniowy zmniejsza parowanie poprzez efektywne zwiększenie energii/napięcia powierzchniowego kropli wody. Teoria ta została eksperymentalnie potwierdzona dla mikrokropli22 i EWNS w naszej poprzedniej publikacji8. Utrata nadgodzin może również wpływać na rozmiar i przyczyniać się do obserwowanego rozkładu wielkości.
Ponadto ładunek na strukturę wynosi około 22–44 e-, w zależności od okoliczności, co jest wartością znacznie wyższą w porównaniu z podstawowym EWNS, który ma średni ładunek 10 ± 2 elektronów na strukturę. Należy jednak zauważyć, że jest to średni ładunek EWNS. Seto i in. Wykazano, że ładunek nie jest jednorodny i ma rozkład logarytmiczno-normalny21. W porównaniu z naszą poprzednią pracą, podwojenie ładunku powierzchniowego podwaja wydajność osadzania w układzie EPES do prawie 100%11.