Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com. Trình duyệt bạn đang sử dụng có hỗ trợ CSS hạn chế. Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt được cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer). Ngoài ra, để đảm bảo hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web mà không có kiểu dáng và JavaScript.
Gần đây, một nền tảng kháng khuẩn không hóa chất dựa trên công nghệ nano sử dụng cấu trúc nano nước nhân tạo (EWNS) đã được phát triển. EWNS có điện tích bề mặt cao và giàu các loại oxy hoạt tính (ROS) có thể tương tác và làm bất hoạt một số vi sinh vật, bao gồm cả các tác nhân gây bệnh trong thực phẩm. Bài viết này chỉ ra rằng các đặc tính của chúng trong quá trình tổng hợp có thể được tinh chỉnh và tối ưu hóa để tăng cường hơn nữa tiềm năng kháng khuẩn. Nền tảng thí nghiệm EWNS được thiết kế để tinh chỉnh các đặc tính của EWNS bằng cách thay đổi các thông số tổng hợp. Việc xác định đặc tính của EWNS (điện tích, kích thước và hàm lượng ROS) được thực hiện bằng các phương pháp phân tích hiện đại. Ngoài ra, các vi sinh vật trong thực phẩm như Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium para fortitum và Saccharomyces cerevisiae đã được cấy lên bề mặt cà chua bi hữu cơ để đánh giá tiềm năng làm bất hoạt vi sinh vật của chúng. Kết quả trình bày ở đây cho thấy các đặc tính của EWNS có thể được tinh chỉnh trong quá trình tổng hợp, dẫn đến sự gia tăng theo cấp số nhân về hiệu quả làm bất hoạt. Đặc biệt, điện tích bề mặt tăng lên gấp bốn lần và hàm lượng ROS cũng tăng lên. Tốc độ loại bỏ vi sinh vật phụ thuộc vào loại vi sinh vật và dao động từ 1,0 đến 3,8 log sau 45 phút tiếp xúc với liều lượng sol khí 40.000 #/cm3 EWNS.
Ô nhiễm vi sinh vật là nguyên nhân chính gây ra bệnh do thực phẩm, xuất phát từ việc ăn phải mầm bệnh hoặc độc tố của chúng. Chỉ riêng tại Hoa Kỳ, mỗi năm có khoảng 76 triệu ca bệnh, 325.000 ca nhập viện và 5.000 ca tử vong do bệnh từ thực phẩm gây ra¹. Ngoài ra, Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ (USDA) ước tính rằng việc tăng cường tiêu thụ rau quả tươi là nguyên nhân gây ra 48% tổng số ca bệnh do thực phẩm được báo cáo tại Hoa Kỳ². Chi phí cho bệnh tật và tử vong do mầm bệnh từ thực phẩm tại Hoa Kỳ rất cao, theo ước tính của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh (CDC) là hơn 15,6 tỷ đô la Mỹ mỗi năm³.
Hiện nay, các biện pháp can thiệp kháng khuẩn bằng hóa chất4, bức xạ5 và nhiệt6 để đảm bảo an toàn thực phẩm chủ yếu được thực hiện tại các điểm kiểm soát quan trọng (CCP) hạn chế trong chuỗi sản xuất (thường là sau thu hoạch và/hoặc trong quá trình đóng gói) chứ không phải được thực hiện liên tục theo cách khiến sản phẩm tươi sống dễ bị nhiễm chéo 7. Cần có các biện pháp can thiệp kháng khuẩn để kiểm soát tốt hơn bệnh do thực phẩm và hư hỏng thực phẩm, và có tiềm năng được áp dụng trên toàn bộ chuỗi từ trang trại đến bàn ăn. Ít tác động và chi phí hơn.
Một nền tảng kháng khuẩn không hóa chất dựa trên công nghệ nano gần đây đã được phát triển để vô hiệu hóa vi khuẩn trên bề mặt và trong không khí bằng cách sử dụng cấu trúc nano nước nhân tạo (EWNS). Để tổng hợp EVNS, hai quy trình song song đã được sử dụng: phun điện và ion hóa nước (Hình 1a). EWNS trước đây đã được chứng minh là có một tập hợp các đặc tính vật lý và sinh học độc đáo8,9,10. EWNS có trung bình 10 electron trên mỗi cấu trúc và kích thước nanomet trung bình là 25 nm (Hình 1b,c)8,9,10. Ngoài ra, cộng hưởng spin electron (ESR) cho thấy EWNS chứa một lượng lớn các loại oxy hoạt tính (ROS), chủ yếu là các gốc hydroxyl (OH•) và superoxide (O2-) (Hình 1c) 8. EWNS tồn tại trong không khí trong thời gian dài và có thể va chạm với các vi sinh vật lơ lửng trong không khí và có mặt trên bề mặt, truyền tải lượng ROS của chúng và gây ra sự vô hiệu hóa vi sinh vật (Hình 1d). Các nghiên cứu trước đây cũng cho thấy EWNS có thể tương tác và làm bất hoạt nhiều loại vi khuẩn gram âm và gram dương có tầm quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng, bao gồm cả vi khuẩn lao, trên bề mặt và trong không khí8,9. Kính hiển vi điện tử truyền qua cho thấy sự bất hoạt này là do sự phá vỡ màng tế bào. Ngoài ra, các nghiên cứu hít phải cấp tính đã chỉ ra rằng liều cao EWNS không gây tổn thương phổi hoặc viêm phổi8.
(a) Hiện tượng phun điện xảy ra khi một điện áp cao được đặt giữa một mao quản chứa chất lỏng và một điện cực đối diện. (b) Việc đặt điện áp cao dẫn đến hai hiện tượng khác nhau: (i) phun điện nước và (ii) tạo ra các loại oxy hoạt tính (ion) bị giữ lại trong EWNS. (c) Cấu trúc độc đáo của EWNS. (d) EWNS có tính di động cao do bản chất kích thước nano của chúng và có thể tương tác với các mầm bệnh trong không khí.
Khả năng của nền tảng kháng khuẩn EWNS trong việc vô hiệu hóa các vi sinh vật gây bệnh trên bề mặt thực phẩm tươi sống cũng đã được chứng minh gần đây. Người ta cũng đã chứng minh rằng điện tích bề mặt của EWNS có thể được sử dụng kết hợp với điện trường để phân phối mục tiêu. Quan trọng hơn, một kết quả ban đầu đầy hứa hẹn cho thấy sự giảm khoảng 1,4 log hoạt tính của cà chua hữu cơ chống lại nhiều vi sinh vật gây bệnh như E. coli và Listeria trong vòng 90 phút tiếp xúc với EWNS ở nồng độ khoảng 50.000#/cm311. Ngoài ra, các thử nghiệm đánh giá cảm quan sơ bộ cho thấy không có tác động nào đến cảm quan so với cà chua đối chứng. Mặc dù những kết quả vô hiệu hóa ban đầu này hứa hẹn sự an toàn thực phẩm ngay cả ở liều lượng EWNS rất thấp là 50.000#/cc, nhưng rõ ràng là tiềm năng vô hiệu hóa cao hơn sẽ có lợi hơn để giảm thiểu hơn nữa nguy cơ nhiễm trùng và hư hỏng.
Tại đây, chúng tôi sẽ tập trung nghiên cứu vào việc phát triển nền tảng tạo EWNS để tinh chỉnh các thông số tổng hợp và tối ưu hóa các tính chất lý hóa của EWNS nhằm tăng cường tiềm năng kháng khuẩn của chúng. Cụ thể, việc tối ưu hóa tập trung vào việc tăng điện tích bề mặt (để cải thiện khả năng phân phối mục tiêu) và hàm lượng ROS (để cải thiện hiệu quả bất hoạt). Việc xác định đặc tính lý hóa tối ưu (kích thước, điện tích và hàm lượng ROS) sẽ được thực hiện bằng các phương pháp phân tích hiện đại và sử dụng các vi sinh vật thực phẩm phổ biến như E. coli, S. enterica, L. innocua, S. cerevisiae và M. parafortuitum.
EVNS được tổng hợp bằng phương pháp phun điện và ion hóa đồng thời nước tinh khiết cao (18 MΩ cm–1). Bộ phun điện 12 thường được sử dụng để phun các chất lỏng và các hạt polyme tổng hợp và gốm 13 cũng như các sợi 14 có kích thước được kiểm soát.
Như đã trình bày chi tiết trong các ấn phẩm trước đây 8, 9, 10, 11, trong một thí nghiệm điển hình, một điện áp cao được đặt giữa một mao quản kim loại và một điện cực đối diện được nối đất. Trong quá trình này, hai hiện tượng khác nhau xảy ra: 1) phun điện và 2) ion hóa nước. Một điện trường mạnh giữa hai điện cực làm cho các điện tích âm tích tụ trên bề mặt của nước ngưng tụ, dẫn đến sự hình thành các hình nón Taylor. Kết quả là, các giọt nước tích điện cao được hình thành, tiếp tục phân tách thành các hạt nhỏ hơn, theo lý thuyết Rayleigh16. Đồng thời, một điện trường mạnh làm cho một số phân tử nước bị phân tách và tước bỏ electron (ion hóa), do đó tạo ra một lượng lớn các loại oxy phản ứng (ROS)17. Các gói ROS18 được tạo ra đồng thời được bao bọc trong EWNS (Hình 1c).
Hình 2a thể hiện hệ thống tạo EWNS được phát triển và sử dụng trong quá trình tổng hợp EWNS trong nghiên cứu này. Nước tinh khiết được chứa trong một chai kín được dẫn qua một ống Teflon (đường kính trong 2 mm) đến một kim thép không gỉ 30G (mao quản kim loại). Như thể hiện trong Hình 2b, lưu lượng nước được điều khiển bởi áp suất không khí bên trong chai. Kim được gắn vào một giá đỡ Teflon có thể điều chỉnh thủ công đến một khoảng cách nhất định so với điện cực đối diện. Điện cực đối diện là một đĩa nhôm được đánh bóng có một lỗ ở giữa để lấy mẫu. Bên dưới điện cực đối diện là một phễu lấy mẫu bằng nhôm, được kết nối với phần còn lại của thiết lập thí nghiệm thông qua một cổng lấy mẫu (Hình 2b). Tất cả các thành phần lấy mẫu đều được nối đất để tránh tích tụ điện tích có thể làm giảm chất lượng lấy mẫu hạt.
(a) Hệ thống tạo cấu trúc nano trong nước (EWNS). (b) Mặt cắt ngang của bộ lấy mẫu và bộ phun điện cho thấy các thông số quan trọng nhất. (c) Thiết lập thí nghiệm để vô hiệu hóa vi khuẩn.
Hệ thống tạo EWNS được mô tả ở trên có khả năng thay đổi các thông số vận hành chính để tinh chỉnh các đặc tính của EWNS. Điều chỉnh điện áp đặt vào (V), khoảng cách giữa kim và điện cực đối diện (L), và lưu lượng nước (φ) qua mao dẫn để tinh chỉnh các đặc tính của EWNS. Các ký hiệu [V (kV), L (cm)] được sử dụng để biểu thị các tổ hợp khác nhau. Điều chỉnh lưu lượng nước để thu được hình nón Taylor ổn định với một tập hợp [V, L] nhất định. Trong nghiên cứu này, đường kính lỗ của điện cực đối diện (D) được đặt ở mức 0,5 inch (1,29 cm).
Do hình dạng hạn chế và tính bất đối xứng, cường độ điện trường không thể được tính toán từ các nguyên lý cơ bản. Thay vào đó, phần mềm QuickField™ (Svendborg, Đan Mạch)19 đã được sử dụng để tính toán điện trường. Điện trường không đồng nhất, vì vậy giá trị điện trường tại đầu mao dẫn được sử dụng làm giá trị tham chiếu cho các cấu hình khác nhau.
Trong quá trình nghiên cứu, một số tổ hợp điện áp và khoảng cách giữa kim và điện cực đối diện đã được đánh giá về khả năng hình thành nón Taylor, độ ổn định của nón Taylor, độ ổn định sản xuất EWNS và khả năng tái tạo. Các tổ hợp khác nhau được trình bày trong Bảng bổ sung S1.
Đầu ra của hệ thống tạo EWNS được kết nối trực tiếp với Máy đo kích thước hạt di động quét (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, Minnesota) để đo nồng độ số hạt và được sử dụng với máy đo điện tích khí dung Faraday (TSI, model 3068B, Shoreview, Hoa Kỳ, MN) để đo lưu lượng khí dung, như đã mô tả trong ấn phẩm trước đây của chúng tôi9. Cả SMPS và máy đo điện tích khí dung đều lấy mẫu ở tốc độ dòng chảy 0,5 L/phút (tổng lưu lượng mẫu 1 L/phút). Nồng độ hạt và thông lượng khí dung được đo trong 120 giây. Lặp lại phép đo 30 lần. Tổng điện tích khí dung được tính toán từ các phép đo hiện tại, và điện tích EWNS trung bình được ước tính từ tổng số hạt EWNS được lấy mẫu. Chi phí trung bình của EWNS có thể được tính bằng Phương trình (1):
trong đó IEl là dòng điện đo được, NSMPS là nồng độ số lượng đo được bằng SMPS, và φEl là tốc độ dòng chảy đến điện kế.
Vì độ ẩm tương đối (RH) ảnh hưởng đến điện tích bề mặt, nên nhiệt độ và độ ẩm tương đối được giữ không đổi ở mức 21°C và 45% tương ứng trong suốt thí nghiệm.
Kính hiển vi lực nguyên tử (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) và đầu dò AC260T (Olympus, Tokyo, Nhật Bản) được sử dụng để đo kích thước và thời gian tồn tại của EWNS. Tốc độ quét AFM là 1 Hz và diện tích quét là 5 µm × 5 µm với 256 đường quét. Tất cả các hình ảnh đều được căn chỉnh hình ảnh bậc nhất bằng phần mềm Asylum (mặt nạ với phạm vi 100 nm và ngưỡng 100 pm).
Tháo phễu lấy mẫu và đặt bề mặt mica ở khoảng cách 2,0 cm so với điện cực đối diện trong thời gian trung bình 120 giây để tránh sự kết tụ của các hạt và sự hình thành các giọt không đều trên bề mặt mica. EWNS được áp dụng trực tiếp lên bề mặt mica mới cắt (Ted Pella, Redding, CA). Ngay sau khi phun, bề mặt mica được quan sát bằng AFM. Góc tiếp xúc bề mặt của mica mới cắt chưa được xử lý gần bằng 0°, do đó EWNS lan truyền trên bề mặt mica theo hình vòm20. Đường kính (a) và chiều cao (h) của các giọt khuếch tán được đo trực tiếp từ hình ảnh AFM và được sử dụng để tính toán thể tích khuếch tán hình vòm EWNS bằng phương pháp đã được xác thực trước đó của chúng tôi8. Giả sử rằng EVNS trên bo mạch có cùng thể tích, đường kính tương đương có thể được tính từ phương trình (2):
Theo phương pháp đã được phát triển trước đây của chúng tôi, bẫy spin cộng hưởng spin điện tử (ESR) được sử dụng để phát hiện sự hiện diện của các chất trung gian gốc tự do tồn tại trong thời gian ngắn trong EWNS. Các sol khí được cho đi qua dung dịch chứa 235 mM DEPMPO (5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Tất cả các phép đo EPR được thực hiện bằng máy quang phổ Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) và mảng tế bào phẳng. Phần mềm Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) được sử dụng để thu thập và phân tích dữ liệu. Việc đặc trưng hóa ROS chỉ được thực hiện cho một tập hợp các điều kiện hoạt động [-6,5 kV, 4,0 cm]. Nồng độ EWNS được đo bằng SMPS sau khi tính đến sự mất mát EWNS trong bộ phận va đập.
Nồng độ ôzôn được theo dõi bằng máy đo ôzôn chùm kép 205™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Đối với tất cả các thuộc tính của EWNS, giá trị đo được là giá trị trung bình của các phép đo, và sai số đo là độ lệch chuẩn. Một phép kiểm định t đã được thực hiện để so sánh giá trị của thuộc tính EWNS được tối ưu hóa với giá trị tương ứng của EWNS cơ sở.
Hình 2c cho thấy một Hệ thống Truyền qua Kết tủa Tĩnh điện (EPES) đã được phát triển và mô tả trước đó, có thể được sử dụng để nhắm mục tiêu EWNS11 vào các bề mặt. EPES sử dụng điện tích EWNS kết hợp với điện trường mạnh để “hướng” trực tiếp vào bề mặt mục tiêu. Chi tiết về hệ thống EPES được trình bày trong một ấn phẩm gần đây của Pyrgiotakis et al.11. Theo đó, EPES bao gồm một buồng PVC được in 3D với các đầu thuôn nhọn chứa hai tấm kim loại thép không gỉ (thép không gỉ 304, được đánh bóng gương) song song ở giữa, cách nhau 15,24 cm. Các tấm được kết nối với nguồn điện cao áp bên ngoài (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), tấm dưới luôn mang điện tích dương và tấm trên luôn được nối đất (nổi). Các bức tường của buồng được phủ bằng giấy nhôm, được nối đất để ngăn ngừa mất hạt. Buồng có một cửa nạp phía trước được bịt kín cho phép đặt các bề mặt thử nghiệm lên giá đỡ bằng nhựa, nâng chúng lên khỏi tấm kim loại phía dưới để tránh nhiễu điện áp cao.
Hiệu suất lắng đọng của EWNS trong EPES được tính toán theo một quy trình đã được phát triển trước đó, được mô tả chi tiết trong Hình bổ sung S111.
Là một buồng điều khiển, luồng khí thứ hai đi qua buồng hình trụ được kết nối nối tiếp với hệ thống EPES bằng một bộ lọc HEPA trung gian để loại bỏ EWNS. Như thể hiện trong hình 2c, sol khí EWNS được bơm qua hai buồng được kết nối nối tiếp. Bộ lọc giữa buồng điều khiển và hệ thống EPES loại bỏ bất kỳ EWNS nào còn sót lại, dẫn đến nhiệt độ (T), độ ẩm tương đối (RH) và nồng độ ozone không đổi.
Các vi sinh vật gây bệnh qua thực phẩm quan trọng đã được phát hiện gây ô nhiễm rau quả tươi, chẳng hạn như Escherichia coli (ATCC #27325), một chỉ thị phân, Salmonella enterica (ATCC #53647), một tác nhân gây bệnh qua thực phẩm, Listeria innocua (ATCC #33090), một loại thay thế cho Listeria monocytogenes gây bệnh, Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) như một loại thay thế cho nấm men gây hư hỏng, và Mycobacterium parafortuitous (ATCC #19686) như một loại vi khuẩn sống có khả năng kháng bệnh cao hơn, được mua từ ATCC (Manassas, Virginia).
Chọn ngẫu nhiên các hộp cà chua bi hữu cơ từ chợ địa phương và bảo quản lạnh ở 4°C cho đến khi sử dụng (tối đa 3 ngày). Chọn những quả cà chua có kích thước khoảng 1/2 inch đường kính để thử nghiệm.
Các quy trình ủ, cấy giống, tiếp xúc và đếm khuẩn lạc đã được mô tả chi tiết trong các ấn phẩm trước đây của chúng tôi và được giải thích chi tiết trong Dữ liệu bổ sung 11. Hiệu quả của EWNS được đánh giá bằng cách cho cà chua đã cấy giống tiếp xúc với mật độ 40.000 #/cm3 trong 45 phút. Tóm lại, tại thời điểm t = 0 phút, ba quả cà chua được sử dụng để đánh giá số lượng vi sinh vật sống sót. Ba quả cà chua được đặt trong EPES và tiếp xúc với EWNS ở mật độ 40.000 #/cm3 (cà chua tiếp xúc với EWNS) và ba quả khác được đặt trong buồng đối chứng (cà chua đối chứng). Không có nhóm cà chua nào được xử lý thêm. Cà chua tiếp xúc với EWNS và cà chua đối chứng được lấy ra sau 45 phút để đánh giá tác động của EWNS.
Mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần. Phân tích dữ liệu được thực hiện theo quy trình được mô tả trong Dữ liệu bổ sung.
Các mẫu vi khuẩn E. coli, Enterobacter và L. innocua tiếp xúc với EWNS (45 phút, nồng độ sol khí EWNS 40.000 #/cm3) và không tiếp xúc được ly tâm để đánh giá cơ chế bất hoạt. Kết tủa được cố định trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng trong dung dịch natri cacodylat 0,1 M (pH 7,4) với chất cố định gồm 2,5% glutaraldehyde, 1,25% paraformaldehyde và 0,03% axit picric. Sau khi rửa, chúng được cố định bằng 1% osmium tetroxide (OsO4)/1,5% kali ferrocyanide (KFeCN6) trong 2 giờ, rửa 3 lần bằng nước và ủ trong 1% uranyl acetate trong 1 giờ, sau đó rửa hai lần bằng nước. Tiếp theo là khử nước trong 10 phút với mỗi dung dịch cồn 50%, 70%, 90%, 100%. Các mẫu sau đó được đặt trong propylene oxide trong 1 giờ và được tẩm bằng hỗn hợp propylene oxide và TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA) theo tỷ lệ 1:1. Các mẫu được nhúng trong TAAB Epon và trùng hợp ở 60°C trong 48 giờ. Nhựa dạng hạt đã đóng rắn được cắt và quan sát bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) sử dụng JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Nhật Bản), một kính hiển vi điện tử truyền qua thông thường được trang bị camera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, MA, Hoa Kỳ).
Tất cả các thí nghiệm đều được thực hiện lặp lại ba lần. Đối với mỗi thời điểm, dịch rửa vi khuẩn được cấy lên đĩa ba lần, tạo ra tổng cộng chín điểm dữ liệu cho mỗi thời điểm, giá trị trung bình được sử dụng làm nồng độ vi khuẩn cho sinh vật cụ thể đó. Độ lệch chuẩn được sử dụng làm sai số đo. Tất cả các điểm đều được tính.
Logarit của sự giảm nồng độ vi khuẩn so với thời điểm t = 0 phút được tính bằng công thức sau:
trong đó C0 là nồng độ vi khuẩn trong mẫu đối chứng tại thời điểm 0 (tức là sau khi bề mặt đã khô nhưng trước khi được đặt vào buồng) và Cn là nồng độ vi khuẩn trên bề mặt sau n phút tiếp xúc.
Để tính đến sự phân hủy tự nhiên của vi khuẩn trong suốt thời gian tiếp xúc 45 phút, mức độ giảm logarit cũng được tính toán so với nhóm đối chứng sau 45 phút như sau:
Trong đó, Cn là nồng độ vi khuẩn trong mẫu đối chứng tại thời điểm n và Cn-Control là nồng độ vi khuẩn của mẫu đối chứng tại thời điểm n. Dữ liệu được trình bày dưới dạng mức giảm theo logarit so với mẫu đối chứng (không tiếp xúc với EWNS).
Trong quá trình nghiên cứu, một số tổ hợp điện áp và khoảng cách giữa kim và điện cực đối diện đã được đánh giá về sự hình thành nón Taylor, độ ổn định của nón Taylor, độ ổn định sản xuất EWNS và khả năng tái tạo. Các tổ hợp khác nhau được thể hiện trong Bảng bổ sung S1. Hai trường hợp đã được chọn để nghiên cứu đầy đủ, cho thấy các đặc tính ổn định và có thể tái tạo (nón Taylor, sản xuất EWNS và độ ổn định theo thời gian). Hình 3 thể hiện kết quả về điện tích, kích thước và hàm lượng ROS cho hai trường hợp. Kết quả cũng được tóm tắt trong Bảng 1. Để tham khảo, Hình 3 và Bảng 1 bao gồm các đặc tính của EWNS8, 9, 10, 11 chưa được tối ưu hóa đã được tổng hợp trước đó (EWNS cơ bản). Các tính toán về ý nghĩa thống kê bằng cách sử dụng phép thử t hai phía được công bố lại trong Bảng bổ sung S2. Ngoài ra, dữ liệu bổ sung bao gồm các nghiên cứu về ảnh hưởng của đường kính lỗ lấy mẫu điện cực đối diện (D) và khoảng cách giữa điện cực nối đất và đầu kim (L) (Hình bổ sung S2 và S3).
(a–c) Phân bố kích thước AFM. (d – f) Đặc tính điện tích bề mặt. (g) Đặc trưng của ROS và ESR.
Điều quan trọng cần lưu ý là trong tất cả các điều kiện trên, dòng điện ion hóa đo được nằm trong khoảng 2-6 µA, và điện áp nằm trong khoảng -3,8 đến -6,5 kV, dẫn đến công suất tiêu thụ của mô-đun tạo EWNS một đầu cực này nhỏ hơn 50 mW. Mặc dù EWNS được tổng hợp dưới áp suất cao, nồng độ ozone vẫn rất thấp, không bao giờ vượt quá 60 ppb.
Hình phụ S4 hiển thị các trường điện mô phỏng cho các kịch bản [-6,5 kV, 4,0 cm] và [-3,8 kV, 0,5 cm] tương ứng. Trường điện theo các kịch bản [-6,5 kV, 4,0 cm] và [-3,8 kV, 0,5 cm] được tính toán lần lượt là 2 × 10⁵ V/m và 4,7 × 10⁵ V/m. Điều này là điều dễ hiểu, vì tỷ lệ điện áp trên khoảng cách cao hơn nhiều trong trường hợp thứ hai.
Hình 3a,b thể hiện đường kính EWNS được đo bằng AFM8. Đường kính EWNS trung bình cho các trường hợp [-6,5 kV, 4,0 cm] và [-3,8 kV, 0,5 cm] được tính toán lần lượt là 27 nm và 19 nm. Độ lệch chuẩn hình học của các phân bố cho các trường hợp [-6,5 kV, 4,0 cm] và [-3,8 kV, 0,5 cm] lần lượt là 1,41 và 1,45, cho thấy sự phân bố kích thước hẹp. Cả kích thước trung bình và độ lệch chuẩn hình học đều rất gần với EWNS cơ bản, lần lượt là 25 nm và 1,41. Hình 3c thể hiện sự phân bố kích thước của EWNS cơ bản được đo bằng cùng phương pháp trong cùng điều kiện.
Hình 3d,e hiển thị kết quả đặc trưng điện tích. Dữ liệu là giá trị trung bình của 30 phép đo đồng thời nồng độ (#/cm3) và dòng điện (I). Phân tích cho thấy điện tích trung bình trên EWNS là 22 ± 6 e- và 44 ± 6 e- lần lượt đối với [-6,5 kV, 4,0 cm] và [-3,8 kV, 0,5 cm]. So với EWNS cơ bản (10 ± 2 e-), điện tích bề mặt của chúng cao hơn đáng kể, gấp đôi so với trường hợp [-6,5 kV, 4,0 cm] và gấp bốn lần so với trường hợp [-3,8 kV, 0,5 cm]. Hình 3f hiển thị dữ liệu thanh toán EWNS cơ bản.
Từ bản đồ nồng độ số lượng EWNS (Hình bổ sung S5 và S6), có thể thấy rằng cảnh [-6,5 kV, 4,0 cm] có số lượng hạt cao hơn đáng kể so với cảnh [-3,8 kV, 0,5 cm]. Cũng cần lưu ý rằng nồng độ số lượng EWNS đã được theo dõi trong tối đa 4 giờ (Hình bổ sung S5 và S6), trong đó độ ổn định của quá trình tạo EWNS cho thấy mức độ nồng độ số lượng hạt tương đương nhau trong cả hai trường hợp.
Hình 3g hiển thị phổ EPR sau khi trừ đi phổ nền (kiểm soát) đối với EWNS được tối ưu hóa ở [-6,5 kV, 4,0 cm]. Phổ ROS cũng được so sánh với phổ EWNS cơ bản trong một bài báo đã được công bố trước đó. Số lượng EWNS phản ứng với bẫy spin được tính toán là 7,5 × 104 EWNS/s, tương tự như phổ Baseline-EWNS8 đã được công bố trước đó. Phổ EPR cho thấy rõ sự hiện diện của hai loại ROS, trong đó O2- chiếm ưu thế, trong khi OH• có mặt với số lượng nhỏ hơn. Ngoài ra, so sánh trực tiếp cường độ đỉnh cho thấy EWNS được tối ưu hóa có hàm lượng ROS cao hơn đáng kể so với EWNS cơ bản.
Hình 4 thể hiện hiệu suất lắng đọng của EWNS trong EPES. Dữ liệu cũng được tóm tắt trong Bảng I và so sánh với dữ liệu EWNS gốc. Đối với cả hai trường hợp EUNS, hiệu suất lắng đọng đạt gần 100% ngay cả ở điện áp thấp 3,0 kV. Thông thường, 3,0 kV là đủ để đạt được hiệu suất lắng đọng 100% bất kể sự thay đổi điện tích bề mặt. Trong cùng điều kiện, hiệu suất lắng đọng của Baseline-EWNS chỉ đạt 56% do điện tích thấp hơn (trung bình 10 electron trên mỗi EWNS).
Hình 5 và Bảng 2 tóm tắt mức độ bất hoạt của vi sinh vật được cấy trên bề mặt cà chua sau khi tiếp xúc với khoảng 40.000 #/cm3 EWNS trong 45 phút theo điều kiện tối ưu [-6,5 kV, 4,0 cm]. Vi khuẩn E. coli và L. innocua được cấy cho thấy sự giảm đáng kể 3,8 log sau 45 phút tiếp xúc. Trong cùng điều kiện, S. enterica cho thấy mức giảm thấp hơn là 2,2 log, trong khi S. cerevisiae và M. parafortuitum cho thấy mức giảm 1,0 log.
Ảnh hiển vi điện tử (Hình 6) mô tả những thay đổi vật lý do EWNS gây ra ở tế bào E. coli, Salmonella enterica và L. innocua dẫn đến sự bất hoạt. Vi khuẩn đối chứng cho thấy màng tế bào còn nguyên vẹn, trong khi vi khuẩn tiếp xúc với EWNS có màng ngoài bị hư hại.
Hình ảnh hiển vi điện tử của vi khuẩn đối chứng và vi khuẩn tiếp xúc cho thấy màng tế bào bị tổn thương.
Dữ liệu về các tính chất lý hóa của EWNS được tối ưu hóa cho thấy rằng các đặc tính của EWNS (điện tích bề mặt và hàm lượng ROS) đã được cải thiện đáng kể so với dữ liệu cơ bản về EWNS đã được công bố trước đây8,9,10,11. Mặt khác, kích thước của chúng vẫn nằm trong phạm vi nanomet, rất giống với các kết quả đã được công bố trước đây, cho phép chúng tồn tại trong không khí trong một thời gian dài. Sự phân tán kích thước quan sát được có thể được giải thích bằng sự thay đổi điện tích bề mặt, yếu tố quyết định cường độ của hiệu ứng Rayleigh, tính ngẫu nhiên và khả năng hợp nhất của EWNS. Tuy nhiên, như Nielsen et al.22 đã trình bày chi tiết, điện tích bề mặt cao làm giảm sự bay hơi bằng cách tăng hiệu quả năng lượng/sức căng bề mặt của giọt nước. Lý thuyết này đã được xác nhận thực nghiệm đối với các giọt siêu nhỏ22 và EWNS trong ấn phẩm trước đây của chúng tôi8. Sự mất mát theo thời gian cũng có thể ảnh hưởng đến kích thước và góp phần vào sự phân bố kích thước quan sát được.
Ngoài ra, điện tích trên mỗi cấu trúc khoảng 22–44 e-, tùy thuộc vào hoàn cảnh, cao hơn đáng kể so với EWNS cơ bản, có điện tích trung bình là 10 ± 2 electron trên mỗi cấu trúc. Tuy nhiên, cần lưu ý rằng đây là điện tích trung bình của EWNS. Seto et al. đã chỉ ra rằng điện tích không đồng đều và tuân theo phân bố log-chuẩn21. So với công trình trước đây của chúng tôi, việc tăng gấp đôi điện tích bề mặt làm tăng gấp đôi hiệu suất lắng đọng trong hệ thống EPES lên gần 100%11.