Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Bu süre zarfında, desteğin devamlılığını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Aynı anda üç slayt gösteren bir döner slayt. Önceki ve Sonraki düğmelerini kullanarak üç slayt arasında aynı anda ilerleyebilir veya sondaki kaydırma düğmelerini kullanarak üç slayt arasında aynı anda ilerleyebilirsiniz.
Son zamanlarda, yapay su nanoyapıları (EWNS) kullanan nanoteknolojiye dayalı, kimyasal içermeyen bir antimikrobiyal platform geliştirilmiştir. EWNS'ler yüksek yüzey yüküne sahiptir ve gıda kaynaklı patojenler de dahil olmak üzere birçok mikroorganizmayla etkileşime girip onları etkisiz hale getirebilen reaktif oksijen türleri (ROS) ile doyurulmuştur. Burada, sentez sırasında özelliklerinin ince ayarlanarak antibakteriyel potansiyellerinin daha da artırılabileceği gösterilmiştir. EWNS laboratuvar platformu, sentez parametreleri değiştirilerek EWNS'lerin özelliklerinin ince ayarlanması için tasarlanmıştır. EWNS özelliklerinin (yük, boyut ve ROS içeriği) modern analitik yöntemler kullanılarak karakterizasyonu yapılmıştır. Ayrıca, Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum ve Saccharomyces cerevisiae gibi gıda kaynaklı mikroorganizmalara karşı mikrobiyal inaktivasyon potansiyelleri değerlendirilmiştir. Burada sunulan sonuçlar, EWNS'lerin özelliklerinin sentez sırasında ince ayarlanabileceğini ve bunun da inaktivasyon verimliliğinde üstel bir artışa yol açtığını göstermektedir. Özellikle, yüzey yükü dört kat arttı ve reaktif oksijen türleri de arttı. Mikrobiyal uzaklaştırma oranı mikrobiyal türe bağlıydı ve 40.000 #/cc EWNS aerosol dozuna 45 dakika maruz kaldıktan sonra 1,0 ile 3,8 log arasında değişti.
Mikrobiyal kontaminasyon, patojenlerin veya toksinlerinin yutulması sonucu oluşan gıda kaynaklı hastalıkların ana nedenidir. Yalnızca Amerika Birleşik Devletleri'nde, gıda kaynaklı hastalıklar her yıl yaklaşık 76 milyon hastalığa, 325.000 hastaneye yatışa ve 5.000 ölüme neden olmaktadır¹. Buna ek olarak, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA), taze ürün tüketimindeki artışın Amerika Birleşik Devletleri'nde bildirilen tüm gıda kaynaklı hastalıkların %48'inden sorumlu olduğunu tahmin etmektedir². Amerika Birleşik Devletleri'nde gıda kaynaklı patojenlerin neden olduğu hastalık ve ölümlerin maliyeti çok yüksektir; Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından yılda 15,6 milyar ABD dolarından fazla olarak tahmin edilmektedir³.
Şu anda, gıda güvenliğini sağlamak için kullanılan kimyasal4, radyasyon5 ve termal6 antimikrobiyal müdahaleler, sürekli olarak değil, çoğunlukla üretim zinciri boyunca sınırlı kritik kontrol noktalarında (genellikle hasattan sonra ve/veya paketleme sırasında) gerçekleştirilmektedir. Bu nedenle, çapraz bulaşmaya yatkındırlar. 7. Gıda kaynaklı hastalıkların ve gıda bozulmasının daha iyi kontrolü, çevresel etkiyi ve maliyetleri azaltırken, çiftlikten sofraya kadar olan tüm süreçte uygulanabilecek antimikrobiyal müdahaleler gerektirir.
Son zamanlarda, yapay su nanoyapıları (EWNS) kullanılarak yüzey ve havada bulunan bakterileri etkisiz hale getirebilen, kimyasal içermeyen, nanoteknoloji tabanlı bir antimikrobiyal platform geliştirilmiştir. EWNS, elektrosprey ve su iyonizasyonu olmak üzere iki paralel işlem kullanılarak sentezlenmiştir (Şekil 1a). Önceki çalışmalar, EWNS'nin benzersiz bir dizi fiziksel ve biyolojik özelliğe sahip olduğunu göstermiştir8,9,10. EWNS, yapı başına ortalama 10 elektrona ve ortalama 25 nm nano ölçekli boyuta sahiptir (Şekil 1b,c)8,9,10. Ek olarak, elektron spin rezonansı (ESR), EWNS'nin esas olarak hidroksil (OH•) ve süperoksit (O2-) radikalleri olmak üzere büyük miktarda reaktif oksijen türü (ROS) içerdiğini göstermiştir (Şekil 1c)8. EWNS uzun süre havada kalır ve havada asılı bulunan ve yüzeyde bulunan mikroorganizmalarla çarpışarak ROS yükünü iletir ve mikroorganizmaların etkisiz hale getirilmesine neden olur (Şekil 1d). Bu erken dönem çalışmalar ayrıca EWNS'nin yüzeylerde ve havada bulunan mikobakteriler de dahil olmak üzere çeşitli gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerle etkileşime girip onları etkisiz hale getirebildiğini göstermiştir. İletim elektron mikroskobu, etkisizleştirmenin hücre zarının bozulmasından kaynaklandığını göstermiştir. Ek olarak, akut inhalasyon çalışmaları, yüksek dozda EWNS'nin akciğer hasarına veya iltihaplanmaya neden olmadığını göstermiştir⁸.
(a) Sıvı içeren bir kılcal tüp ile karşı elektrot arasına yüksek voltaj uygulandığında elektrosprey oluşur. (b) Yüksek basınç uygulanması iki farklı olaya yol açar: (i) suyun elektrospreylenmesi ve (ii) EWNS'de hapsolmuş reaktif oksijen türlerinin (iyonların) oluşumu. (c) EWNS'nin benzersiz yapısı. (d) Nano ölçekli yapıları nedeniyle EWNS'ler oldukça hareketlidir ve havada bulunan patojenlerle etkileşime girebilirler.
EWNS antimikrobiyal platformunun, taze gıdaların yüzeyindeki gıda kaynaklı mikroorganizmaları etkisiz hale getirme yeteneği de yakın zamanda gösterilmiştir. Ayrıca, EWNS'nin yüzey yükünün bir elektrik alanı ile birlikte hedefli dağıtım sağlamak için kullanılabileceği de gösterilmiştir. Dahası, yaklaşık 50.000 #/cm3 EWNS'ye 90 dakika maruz kaldıktan sonra organik domatesler için elde edilen ön sonuçlar cesaret verici olup, E. coli ve Listeria 11 gibi çeşitli gıda kaynaklı mikroorganizmalar gözlemlenmiştir. Ek olarak, ön organoleptik testler, kontrol domateslerine kıyasla herhangi bir duyusal etki göstermemiştir. Bu ilk etkisizleştirme sonuçları, 50.000 #/cm3 gibi çok düşük EWNS dozlarında bile gıda güvenliği uygulamaları için cesaret verici olsa da, enfeksiyon ve bozulma riskini daha da azaltmak için daha yüksek bir etkisizleştirme potansiyelinin daha faydalı olacağı açıktır.
Burada, sentez parametrelerinin ince ayarını ve EWNS'lerin fizikokimyasal özelliklerinin optimizasyonunu sağlayarak antibakteriyel potansiyellerini artırmak için bir EWNS üretim platformunun geliştirilmesine odaklanacağız. Özellikle, optimizasyon, yüzey yüklerini (hedefli dağıtımı iyileştirmek için) ve ROS içeriğini (inaktivasyon verimliliğini iyileştirmek için) artırmaya odaklanmıştır. Optimize edilmiş fizikokimyasal özellikleri (boyut, yük ve ROS içeriği) modern analitik yöntemler kullanarak karakterize edeceğiz ve E. coli gibi yaygın gıda mikroorganizmalarını kullanacağız.
EVNS, yüksek saflıktaki suyun (18 MΩ cm–1) eş zamanlı elektro püskürtme ve iyonizasyonu ile sentezlendi. Elektrikli nebulizatör 12, tipik olarak sıvıların atomizasyonu ve kontrollü boyutta polimer ve seramik parçacıklarının 13 ve liflerinin 14 sentezi için kullanılır.
Önceki yayınlarda 8, 9, 10, 11 ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, tipik bir deneyde, metal bir kılcal boru ile topraklanmış bir karşı elektrot arasına yüksek bir voltaj uygulandı. Bu işlem sırasında iki farklı olay meydana gelir: i) elektrosprey ve ii) su iyonizasyonu. İki elektrot arasındaki güçlü bir elektrik alanı, yoğunlaşmış suyun yüzeyinde negatif yüklerin birikmesine neden olarak Taylor konilerinin oluşmasına yol açar. Sonuç olarak, Rayleigh teorisinde olduğu gibi daha küçük parçacıklara ayrılmaya devam eden yüksek yüklü su damlacıkları oluşur. Aynı zamanda, güçlü elektrik alanları bazı su moleküllerinin parçalanmasına ve elektronlarını koparmasına (iyonlaşmasına) neden olarak büyük miktarda reaktif oksijen türünün (ROS) oluşmasına yol açar. Eş zamanlı olarak üretilen ROS18, EWNS'ye kapsüllendi (Şekil 1c).
Şekil 2a'da, bu çalışmada EWNS sentezinde geliştirilen ve kullanılan EWNS üretim sistemi gösterilmektedir. Kapalı bir şişede saklanan saflaştırılmış su, bir Teflon tüp (2 mm iç çap) aracılığıyla 30G paslanmaz çelik bir iğneye (metal kılcal boru) beslenmiştir. Şekil 2b'de gösterildiği gibi, suyun akışı şişenin içindeki hava basıncı ile kontrol edilir. İğne, bir Teflon konsola monte edilmiştir ve karşı elektrottan belirli bir mesafeye manuel olarak ayarlanabilir. Karşı elektrot, örnekleme için ortasında bir delik bulunan cilalı bir alüminyum disktir. Karşı elektrotun altında, bir örnekleme portu aracılığıyla deney düzeneğinin geri kalanına bağlanan bir alüminyum örnekleme hunisi bulunur (Şekil 2b). Örnekleyici çalışmasını bozabilecek yük birikimini önlemek için, tüm örnekleyici bileşenleri elektriksel olarak topraklanmıştır.
(a) Mühendislik ürünü Su Nanoyapısı Üretim Sistemi (EWNS). (b) En önemli parametreleri gösteren numune alma cihazının ve elektrospreyin kesiti. (c) Bakteri inaktivasyonu için deneysel düzenek.
Yukarıda açıklanan EWNS üretim sistemi, EWNS özelliklerinin ince ayarını kolaylaştırmak için temel çalışma parametrelerini değiştirebilme özelliğine sahiptir. EWNS özelliklerini ince ayarlamak için uygulanan voltajı (V), iğne ile karşı elektrot arasındaki mesafeyi (L) ve kılcal borudan geçen su akışını (φ) ayarlayın. Farklı kombinasyonları temsil etmek için kullanılan sembol: [V (kV), L (cm)]. Belirli bir [V, L] setinde kararlı bir Taylor konisi elde etmek için su akışını ayarlayın. Bu çalışma amacıyla, karşı elektrotun açıklık çapı (D) 0,5 inç (1,29 cm) olarak sabit tutulmuştur.
Sınırlı geometri ve asimetri nedeniyle, elektrik alan şiddeti temel prensiplerden hesaplanamaz. Bunun yerine, elektrik alanı hesaplamak için QuickField™ yazılımı (Svendborg, Danimarka)19 kullanılmıştır. Elektrik alanı homojen olmadığından, kılcal borunun ucundaki elektrik alan değeri çeşitli konfigürasyonlar için referans değer olarak kullanılmıştır.
Çalışma sırasında, iğne ile karşı elektrot arasındaki voltaj ve mesafe kombinasyonlarının Taylor konisi oluşumu, Taylor konisi stabilitesi, EWNS üretim stabilitesi ve tekrarlanabilirliği açısından değerlendirilmesi yapılmıştır. Çeşitli kombinasyonlar Ek Tablo S1'de gösterilmiştir.
EWNS üretim sisteminin çıkışı, parçacık sayısı konsantrasyonu ölçümü için doğrudan bir Tarama Hareketliliği Parçacık Boyutu Analiz Cihazına (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) ve aerosol akımları için bir Aerosol Faraday Elektrometresine (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN) bağlandı. Aerosol akımları, önceki yayınımızda açıklandığı gibi ölçüldü. Hem SMPS hem de aerosol elektrometresi 0,5 L/dak akış hızında (toplam örnek akışı 1 L/dak) örnekleme yaptı. Parçacıkların sayı konsantrasyonu ve aerosol akışı 120 saniye boyunca ölçüldü. Ölçüm 30 kez tekrarlandı. Akım ölçümlerine dayanarak, toplam aerosol yükü hesaplandı ve belirli bir toplam seçilen EWNS parçacık sayısı için ortalama EWNS yükü tahmin edildi. EWNS'nin ortalama maliyeti Denklem (1) kullanılarak hesaplanabilir:
Burada IEl ölçülen akımı, NSMPS SMPS ile ölçülen dijital konsantrasyonu ve φEl ise elektrometre başına akış hızını temsil etmektedir.
Bağıl nem (RH) yüzey yükünü etkilediğinden, deney boyunca sıcaklık ve bağıl nem sırasıyla 21°C ve %45'te sabit tutuldu.
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) ve AC260T probu (Olympus, Tokyo, Japonya) kullanılarak EWNS'nin boyutu ve ömrü ölçüldü. AFM tarama frekansı 1 Hz, tarama alanı 5 μm × 5 μm ve 256 tarama çizgisiydi. Tüm görüntüler, Asylum yazılımı kullanılarak 1. dereceden görüntü hizalamasına tabi tutuldu (maske aralığı 100 nm, eşik 100 pm).
Deney hunisi çıkarıldı ve mika yüzeyi, parçacık kümelenmesini ve mika yüzeyinde düzensiz damlacıkların oluşmasını önlemek için 120 s'lik bir ortalama süre boyunca karşı elektrottan 2,0 cm uzaklığa yerleştirildi. EWNS, taze kesilmiş mika yüzeyine doğrudan püskürtüldü (Ted Pella, Redding, CA). AFM püskürtmesinden hemen sonra mika yüzeyinin görüntüsü. Taze kesilmiş, modifiye edilmemiş mika yüzeyinin temas açısı 0°'ye yakındır, bu nedenle EVNS, mika yüzeyinde kubbe şeklinde dağılır. Difüzyon yapan damlacıkların çapı (a) ve yüksekliği (h), AFM topografisinden doğrudan ölçüldü ve daha önce doğrulanmış yöntemimiz kullanılarak EWNS kubbeli difüzyon hacmi hesaplandı. Yerleşik EWNS'nin aynı hacme sahip olduğu varsayılarak, eşdeğer çap Denklem (2) kullanılarak hesaplanabilir:
Daha önce geliştirdiğimiz yönteme dayanarak, EWNS'deki kısa ömürlü radikal ara ürünlerin varlığını tespit etmek için bir elektron spin rezonansı (ESR) spin tuzağı kullanıldı. Aerosoller, 235 mM DEPMPO(5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksit) (Oxis International Inc., Portland, Oregon) çözeltisi içeren 650 μm'lik bir Midget sparger (Ace Glass, Vineland, NJ) içinden geçirildi. Tüm ESR ölçümleri, bir Bruker EMX spektrometresi (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, ABD) ve düz panel hücre kullanılarak gerçekleştirildi. Verilerin toplanması ve analizi için Acquisit yazılımı (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, ABD) kullanıldı. ROS'un özelliklerinin belirlenmesi yalnızca belirli çalışma koşulları [-6,5 kV, 4,0 cm] için yapıldı. EWNS konsantrasyonları, darbe cihazındaki EWNS kayıpları hesaba katıldıktan sonra SMPS kullanılarak ölçülmüştür.
Ozon seviyeleri, 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10 kullanılarak izlendi.
Tüm EWNS özelliklerinde, ölçüm değeri olarak ortalama değer, ölçüm hatası olarak ise standart sapma kullanılmıştır. Optimize edilmiş EWNS özelliklerinin değerlerini, temel EWNS'nin karşılık gelen değerleriyle karşılaştırmak için T-testleri yapılmıştır.
Şekil 2c, yüzeyde EWNS'nin hedefli dağıtımı için kullanılabilen, daha önce geliştirilmiş ve karakterize edilmiş bir elektrostatik çökelme (EPES) "çekme" sistemini göstermektedir. EPES, güçlü bir elektrik alanının etkisi altında doğrudan hedefin yüzeyine "yönlendirilebilen" EVNS yüklerini kullanır. EPES sisteminin ayrıntıları, Pyrgiotakis ve ark. tarafından yakın zamanda yayınlanan bir makalede sunulmuştur. 11 Buna göre, EPES, konik uçlu 3 boyutlu yazıcıyla üretilmiş bir PVC hazneden oluşur ve merkezde 15,24 cm aralıkla yerleştirilmiş iki paralel paslanmaz çelik (304 paslanmaz çelik, ayna kaplamalı) metal plaka içerir. Plakalar harici bir yüksek voltaj kaynağına (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) bağlanmıştır; alt plaka her zaman pozitif voltaja, üst plaka ise her zaman toprağa (yüzer topraklama) bağlanmıştır. Hazne duvarları, parçacık kaybını önlemek için elektriksel olarak topraklanmış alüminyum folyo ile kaplanmıştır. Haznenin ön tarafında, test yüzeylerinin yüksek voltaj girişiminden kaçınmak için alt metal plakadan yukarı kaldıracak şekilde plastik ayaklar üzerine yerleştirilmesine olanak tanıyan, sızdırmaz bir yükleme kapısı bulunmaktadır.
EWNS'nin EPES içindeki birikim verimliliği, Ek Şekil S111'de ayrıntıları verilen daha önce geliştirilmiş bir protokole göre hesaplandı.
Kontrol odası olarak, EPES sistemine seri olarak ikinci bir silindirik akış odası bağlandı ve bu odada EWNS'yi uzaklaştırmak için ara bir HEPA filtresi kullanıldı. Şekil 2c'de gösterildiği gibi, EWNS aerosolü iki dahili odadan pompalanarak geçirildi. Kontrol odası ile EPES arasındaki filtre, kalan EWNS'yi uzaklaştırarak aynı sıcaklık (T), bağıl nem (RH) ve ozon seviyelerini sağlar.
E. coli (ATCC #27325), dışkı göstergesi; Salmonella enterica (ATCC #53647), gıda kaynaklı patojen; Listeria harmless (ATCC #33090), patojenik Listeria monocytogenes'in yerine geçen ve ATCC'den (Manassas, VA) türetilen Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), bozulmaya neden olan mayanın yerine geçen bir bakteri ve daha dirençli inaktive edilmiş bir bakteri olan Mycobacterium paralucky (ATCC #19686) gibi önemli gıda kaynaklı mikroorganizmaların taze gıdaları kirlettiği bulunmuştur.
Yerel pazarınızdan rastgele organik üzüm domates kutuları satın alın ve kullanana kadar (en fazla 3 gün) 4°C'de buzdolabında saklayın. Deneyde kullanılan domateslerin hepsi aynı boyuttaydı, yaklaşık 1/2 inç çapındaydı.
Kültür, aşılama, maruz bırakma ve koloni sayımı protokolleri önceki yayınımızda ve Ek Verilerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır. EWNS'nin etkinliği, aşılanmış domateslerin 40.000 #/cm3'e 45 dakika süreyle maruz bırakılmasıyla değerlendirilmiştir. Kısaca, t = 0 dakika anında hayatta kalan mikroorganizmaların değerlendirilmesi için üç domates kullanılmıştır. Üç domates EPES'e yerleştirilmiş ve 40.000 #/cm3'te EWNS'ye maruz bırakılmıştır (EWNS'ye maruz bırakılan domatesler) ve kalan üçü kontrol odasına yerleştirilmiştir (kontrol domatesleri). Her iki gruptaki domateslere ek işlem uygulanmamıştır. EWNS'ye maruz bırakılan domatesler ve kontrol domatesleri, EWNS'nin etkisini değerlendirmek için 45 dakika sonra çıkarılmıştır.
Her deney üçer kez tekrarlandı. Veri analizi, Ek Verilerde açıklanan protokole göre gerçekleştirildi.
İnaktivasyon mekanizmaları, EWNS'ye maruz bırakılan örneklerin (40.000 #/cm3 EWNS aerosol konsantrasyonunda 45 dakika) ve zararsız bakteriler olan E. coli, Salmonella enterica ve Lactobacillus'un ışınlanmamış örneklerinin çökelmesiyle değerlendirildi. Partiküller, oda sıcaklığında 2 saat boyunca 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7,4) %2,5 glutaraldehit, %1,25 paraformaldehit ve %0,03 pikrik asit ile sabitlendi. Yıkamadan sonra, 2 saat boyunca %1 osmiyum tetroksit (OsO4)/%1,5 potasyum ferrosiyanür (KFeCN6) ile son sabitleme yapıldı, suda 3 kez yıkandı ve 1 saat boyunca %1 uranil asetatta inkübe edildi, ardından suda iki kez yıkandı ve daha sonra %50, %70, %90, %100 alkolde 10 dakika süreyle dehidrate edildi. Numuneler daha sonra 1 saat süreyle propilen oksit içine yerleştirildi ve propilen oksit ile TAAP Epon'un (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) 1:1 karışımıyla emprenye edildi. Numuneler TAAB Epon'a gömüldü ve 60°C'de 48 saat süreyle polimerize edildi. Kürlenmiş granüler reçine kesildi ve AMT 2k CCD kamera (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, ABD) ile donatılmış geleneksel bir transmisyon elektron mikroskobu JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Japonya) kullanılarak TEM ile görüntülendi.
Tüm deneyler üçer kez tekrarlandı. Her zaman noktası için, bakteri yıkama çözeltilerine üçer kez bakteri aşılandı; bu da her nokta için toplam dokuz veri noktasıyla sonuçlandı ve bu verilerin ortalaması, ilgili mikroorganizmanın bakteri konsantrasyonu olarak kullanıldı. Standart sapma, ölçüm hatası olarak kullanıldı. Tüm noktalar dikkate alındı.
Bakteri konsantrasyonundaki azalmanın t = 0 dakikaya göre logaritması aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı:
Burada C0, 0 anındaki (yani yüzey kuruduktan sonra ancak odaya yerleştirilmeden önceki) kontrol örneğindeki bakteri konsantrasyonunu ve Cn ise n dakika maruz kalma süresinden sonra yüzeydeki bakteri konsantrasyonunu ifade eder.
45 dakikalık maruz kalma süresi boyunca bakterilerin doğal bozunmasını hesaba katmak için, 45 dakika sonra kontrole kıyasla logaritmik azalma aşağıdaki gibi hesaplanmıştır:
Burada Cn, n anındaki kontrol örneğindeki bakteri konsantrasyonunu ve Cn-Control ise n anındaki kontrol bakterilerinin konsantrasyonunu ifade eder. Veriler, kontrole (EWNS maruziyeti yok) kıyasla logaritmik azalma olarak sunulmuştur.
Çalışma sırasında, Taylor konisi oluşumu, Taylor konisi kararlılığı, EWNS üretim kararlılığı ve tekrarlanabilirliği açısından iğne ile karşı elektrot arasındaki voltaj ve mesafenin çeşitli kombinasyonları değerlendirildi. Çeşitli kombinasyonlar Ek Tablo S1'de gösterilmiştir. Kararlı ve tekrarlanabilir özellikler (Taylor konisi, EWNS oluşumu ve zaman içindeki kararlılık) gösteren iki durum kapsamlı çalışma için seçildi. Şekil 3'te her iki durumda da ROS'un yükü, boyutu ve içeriğine ilişkin sonuçlar gösterilmektedir. Sonuçlar ayrıca Tablo 1'de de gösterilmiştir. Referans olarak, hem Şekil 3 hem de Tablo 1, daha önce sentezlenen optimize edilmemiş EWNS8, 9, 10, 11'in (temel EWNS) özelliklerini içermektedir. İki kuyruklu t-testi kullanılarak yapılan istatistiksel anlamlılık hesaplamaları Ek Tablo S2'de yeniden yayınlanmıştır. Ek olarak, karşı elektrot örnekleme deliği çapının (D) ve topraklama elektrodu ile uç arasındaki mesafenin (L) etkisine ilişkin çalışmalar da ek veriler içermektedir (Ek Şekiller S2 ve S3).
(ac) AFM ile ölçülen boyut dağılımı. (df) Yüzey yükü karakteristiği. (g) EPR'nin ROS karakterizasyonu.
Ayrıca, yukarıdaki tüm koşullar için ölçülen iyonizasyon akımının 2 ile 6 μA arasında ve voltajın -3,8 ile -6,5 kV arasında olduğunu ve bunun sonucunda tek bir EWNS üretim kontak modülü için 50 mW'tan daha az güç tüketimi sağlandığını belirtmek önemlidir. EWNS yüksek basınç altında sentezlenmiş olmasına rağmen, ozon seviyeleri çok düşüktü ve hiçbir zaman 60 ppb'yi aşmadı.
Ek Şekil S4, sırasıyla [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryoları için simüle edilmiş elektrik alanlarını göstermektedir. [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryoları için alan hesaplamaları sırasıyla 2 × 10⁵ V/m ve 4,7 × 10⁵ V/m'dir. Bu beklenen bir sonuçtur, çünkü ikinci durumda gerilim-mesafe oranı çok daha yüksektir.
Şekil 3a,b'de AFM8 ile ölçülen EWNS çapı gösterilmektedir. Hesaplanan ortalama EWNS çapları, [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] şemaları için sırasıyla 27 nm ve 19 nm'dir. [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryoları için dağılımların geometrik standart sapmaları sırasıyla 1,41 ve 1,45 olup, dar bir boyut dağılımını göstermektedir. Hem ortalama boyut hem de geometrik standart sapma, sırasıyla 25 nm ve 1,41 olan temel EWNS'ye çok yakındır. Şekil 3c'de, aynı yöntem ve aynı koşullar altında ölçülen temel EWNS'nin boyut dağılımı gösterilmektedir.
Şekil 3d,e'de yük karakterizasyonunun sonuçları gösterilmektedir. Veriler, konsantrasyon (#/cm3) ve akım (I) değerlerinin 30 eş zamanlı ölçümünün ortalama değerleridir. Analiz, EWNS üzerindeki ortalama yükün [-6,5 kV, 4,0 cm] ve [-3,8 kV, 0,5 cm] için sırasıyla 22 ± 6 e- ve 44 ± 6 e- olduğunu göstermektedir. Bunlar, temel EWNS'ye (10 ± 2 e-) kıyasla önemli ölçüde daha yüksek yüzey yüklerine sahiptir; [-6,5 kV, 4,0 cm] senaryosuna göre iki kat, [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryosuna göre ise dört kat daha fazladır. Şekil 3f, Temel EWNS için yük verilerini göstermektedir.
EWNS sayısının konsantrasyon haritalarından (Ek Şekiller S5 ve S6), [-6,5 kV, 4,0 cm] senaryosunun [-3,8 kV, 0,5 cm] senaryosuna göre önemli ölçüde daha fazla parçacık içerdiği görülebilir. Ayrıca, EWNS sayı konsantrasyonunun 4 saate kadar izlendiği (Ek Şekiller S5 ve S6) ve her iki durumda da EWNS üretim kararlılığının aynı parçacık sayısı konsantrasyon seviyelerini gösterdiği de belirtilmelidir.
Şekil 3g'de, optimize edilmiş EWNS kontrolünün (arka plan) [-6,5 kV, 4,0 cm]'de çıkarılmasından sonraki EPR spektrumu gösterilmektedir. ROS spektrumları ayrıca daha önce yayınlanmış bir çalışmadaki Baseline-EWNS senaryosuyla da karşılaştırılmıştır. Spin tuzaklarıyla reaksiyona giren EWNS sayısı 7,5 × 104 EWNS/s olarak hesaplanmıştır; bu, daha önce yayınlanmış Baseline-EWNS8'e benzerdir. EPR spektrumları, iki tür ROS'un varlığını açıkça göstermiştir; O2- baskın tür iken OH• daha az miktardadır. Ek olarak, tepe yoğunluklarının doğrudan karşılaştırılması, optimize edilmiş EWNS'nin temel EWNS'ye kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir ROS içeriğine sahip olduğunu göstermiştir.
Şekil 4'te, EPES'te EWNS'nin biriktirme verimliliği gösterilmektedir. Veriler ayrıca Tablo I'de özetlenmiş ve orijinal EWNS verileriyle karşılaştırılmıştır. Her iki EUNS durumu için de, 3,0 kV gibi düşük bir voltajda bile biriktirme %100'e yakındır. Tipik olarak, yüzey yükü değişiminden bağımsız olarak, %100 biriktirme için 3,0 kV yeterlidir. Aynı koşullar altında, Baseline-EWNS'nin biriktirme verimliliği, daha düşük yükleri (EWNS başına ortalama 10 elektron) nedeniyle yalnızca %56 olmuştur.
Şekil 5 ve Tablo 2'de, optimum modda [-6,5 kV, 4,0 cm] 45 dakika boyunca yaklaşık 40.000 #/cm3 EWNS'ye maruz bırakıldıktan sonra domates yüzeyine aşılanan mikroorganizmaların inaktivasyon değeri özetlenmiştir. Aşılanan E. coli ve Lactobacillus innocuous, 45 dakikalık maruz kalma süresi boyunca 3,8 log'luk önemli bir azalma göstermiştir. Aynı koşullar altında, S. enterica 2,2 log'luk bir azalma gösterirken, S. cerevisiae ve M. parafortutum 1,0 log'luk bir azalma göstermiştir.
Elektron mikrografları (Şekil 6), EWNS'nin zararsız Escherichia coli, Streptococcus ve Lactobacillus hücrelerinde neden olduğu ve bunların inaktivasyonuna yol açan fiziksel değişiklikleri göstermektedir. Kontrol bakterilerinin hücre zarları sağlamken, maruz kalan bakterilerin dış zarları hasar görmüştür.
Kontrol ve maruz bırakılan bakterilerin elektron mikroskobik görüntülemesi, zar hasarını ortaya çıkardı.
Optimize edilmiş EWNS'nin fizikokimyasal özelliklerine ilişkin veriler, EWNS'nin özelliklerinin (yüzey yükü ve ROS içeriği) daha önce yayınlanan EWNS temel verilerine kıyasla önemli ölçüde iyileştirildiğini göstermektedir8,9,10,11. Öte yandan, boyutları nanometre aralığında kalmış olup, daha önce bildirilen sonuçlara çok benzer şekilde, uzun süre havada kalmalarına olanak tanımıştır. Gözlemlenen polidispersite, EWNS'nin boyutunu belirleyen yüzey yükü değişiklikleri, Rayleigh etkisinin rastgeleliği ve potansiyel birleşme ile açıklanabilir. Bununla birlikte, Nielsen ve ark. 22 tarafından ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, yüksek yüzey yükü, su damlasının yüzey enerjisini/gerilimini etkili bir şekilde artırarak buharlaşmayı azaltır. Önceki yayınımızda8 bu teori, mikro damlacıklar 22 ve EWNS için deneysel olarak doğrulanmıştır. Zamanla yük kaybı da boyutu etkileyebilir ve gözlemlenen boyut dağılımına katkıda bulunabilir.