Hvala što ste posjetili Nature.com.Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Vrtuljak koji prikazuje tri slajda u isto vrijeme.Koristite gumbe Prethodno i Sljedeće za pomicanje kroz tri slajda istovremeno ili koristite gumbe klizača na kraju za kretanje kroz tri slajda odjednom.
Nedavno je razvijena antimikrobna platforma bez kemikalija koja se temelji na nanotehnologiji koja koristi nanostrukture umjetne vode (EWNS).EWNS imaju visok površinski naboj i zasićeni su reaktivnim kisikovim vrstama (ROS) koje mogu stupiti u interakciju s brojnim mikroorganizmima, uključujući i patogene koji se prenose hranom, i onesposobiti ih.Ovdje je pokazano da se njihova svojstva tijekom sinteze mogu fino podesiti i optimizirati kako bi se dodatno poboljšao njihov antibakterijski potencijal.Laboratorijska platforma EWNS dizajnirana je za fino podešavanje svojstava EWNS-a promjenom parametara sinteze.Karakterizacija svojstava EWNS (naboj, veličina i sadržaj ROS-a) primjenom suvremenih analitičkih metoda.Osim toga, procijenjen je njihov mikrobni inaktivacijski potencijal protiv mikroorganizama koji se prenose hranom kao što su Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum i Saccharomyces cerevisiae.Ovdje prikazani rezultati pokazuju da se svojstva EWNS-a mogu fino podesiti tijekom sinteze, što rezultira eksponencijalnim povećanjem učinkovitosti inaktivacije.Konkretno, površinski naboj povećao se za faktor četiri i reaktivne vrste kisika su se povećale.Brzina uklanjanja mikroba ovisila je o mikrobima i kretala se od 1,0 do 3,8 log nakon 45-minutnog izlaganja dozi aerosola od 40 000 #/cc EWNS.
Kontaminacija mikrobima glavni je uzrok bolesti koje se prenose hranom uzrokovane gutanjem patogena ili njihovih toksina.Samo u Sjedinjenim Državama bolesti izazvane hranom uzrokuju oko 76 milijuna bolesti, 325 000 bolničkih prijema i 5 000 smrti svake godine1.Osim toga, Ministarstvo poljoprivrede Sjedinjenih Država (USDA) procjenjuje da je povećana konzumacija svježih proizvoda odgovorna za 48% svih prijavljenih bolesti izazvanih hranom u Sjedinjenim Državama2.Trošak bolesti i smrti uzrokovanih patogenima koji se prenose hranom u Sjedinjenim Državama vrlo je visok, a Centar za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) procjenjuje na više od 15,6 milijardi USD godišnje3.
Trenutačno se kemijske4, radijacijske5 i toplinske6 antimikrobne intervencije kako bi se osigurala sigurnost hrane uglavnom provode na ograničenim kritičnim kontrolnim točkama (CCP) duž lanca proizvodnje (obično nakon žetve i/ili tijekom pakiranja), a ne kontinuirano.stoga su skloni unakrsnoj kontaminaciji.7. Bolja kontrola bolesti koje se prenose hranom i kvarenja hrane zahtijeva antimikrobne intervencije koje se potencijalno mogu primijeniti u cijelom kontinuumu od farme do stola uz smanjenje utjecaja na okoliš i troškova.
Nedavno je razvijena antimikrobna platforma bez kemikalija, zasnovana na nanotehnologiji, koja može inaktivirati površinske i zračne bakterije pomoću umjetnih vodenih nanostruktura (EWNS).EWNS je sintetiziran korištenjem dva paralelna procesa, elektrospreja i ionizacije vode (slika 1a).Prethodne studije pokazale su da EWNS imaju jedinstven skup fizičkih i bioloških svojstava8,9,10.EWNS imaju prosječno 10 elektrona po strukturi i prosječnu veličinu nanoskale od 25 nm (Sl. 1b,c)8,9,10.Osim toga, elektronska spinska rezonancija (ESR) pokazala je da EWNS sadrži veliku količinu reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), uglavnom hidroksilnih (OH•) i superoksidnih (O2-) radikala (Sl. 1c)8.EVNS je u zraku dulje vrijeme i može se sudariti s mikroorganizmima koji lebde u zraku i prisutni su na površini, isporučujući svoj teret ROS-a i uzrokujući inaktivaciju mikroorganizama (Slika 1d).Ove rane studije također su pokazale da EWNS može komunicirati s različitim gram-negativnim i gram-pozitivnim bakterijama, uključujući mikobakterije, na površinama i u zraku i deaktivirati ih.Transmisijska elektronska mikroskopija pokazala je da je inaktivacija uzrokovana prekidom stanične membrane.Osim toga, studije akutnog udisanja pokazale su da visoke doze EWNS-a ne uzrokuju oštećenje pluća ili upalu 8 .
(a) Elektrosprej nastaje kada se visoki napon primijeni između kapilarne cijevi koja sadrži tekućinu i protuelektrode.(b) Primjena visokog tlaka rezultira s dva različita fenomena: (i) elektrosprejanjem vode i (ii) stvaranjem reaktivnih kisikovih vrsta (iona) zarobljenih u EWNS-u.(c) Jedinstvena struktura EWNS-a.(d) Zbog svoje nanorazmjerne prirode, EWNS su vrlo mobilni i mogu komunicirati s patogenima koji se prenose zrakom.
Nedavno je također dokazana sposobnost antimikrobne platforme EWNS da deaktivira mikroorganizme iz hrane na površini svježe hrane.Također je pokazano da se površinski naboj EWNS-a u kombinaciji s električnim poljem može koristiti za postizanje ciljane isporuke.Štoviše, preliminarni rezultati za organske rajčice nakon 90-minutnog izlaganja EWNS-u od oko 50 000 #/cm3 bili su ohrabrujući, s uočenim različitim mikroorganizmima koji se prenose hranom kao što su E. coli i Listeria 11.Osim toga, preliminarni organoleptički testovi nisu pokazali nikakve senzorske učinke u usporedbi s kontrolnim rajčicama.Iako su ovi početni rezultati inaktivacije ohrabrujući za primjenu u sigurnosti hrane čak i pri vrlo niskim dozama EWNS od 50 000#/cc.Vidite, jasno je da bi veći inaktivacijski potencijal bio korisniji za daljnje smanjenje rizika od infekcije i kvarenja.
Ovdje ćemo svoje istraživanje usmjeriti na razvoj platforme za generiranje EWNS-a kako bismo omogućili fino podešavanje parametara sinteze i optimizaciju fizikalno-kemijskih svojstava EWNS-a kako bismo poboljšali njihov antibakterijski potencijal.Konkretno, optimizacija je usmjerena na povećanje njihovog površinskog naboja (kako bi se poboljšala ciljana isporuka) i ROS sadržaja (kako bi se poboljšala učinkovitost inaktivacije).Obilježite optimizirana fizikalno-kemijska svojstva (veličinu, naboj i sadržaj ROS-a) koristeći suvremene analitičke metode i koristite uobičajene prehrambene mikroorganizme kao što je E. .
EVNS je sintetiziran istodobnim elektrosprejanjem i ionizacijom vode visoke čistoće (18 MΩ cm–1).Električni nebulizator 12 obično se koristi za atomizaciju tekućina i sintezu polimernih i keramičkih čestica 13 i vlakana 14 kontrolirane veličine.
Kao što je detaljno opisano u prethodnim publikacijama 8, 9, 10, 11, u tipičnom eksperimentu, visoki napon je primijenjen između metalne kapilare i uzemljene protuelektrode.Tijekom ovog procesa javljaju se dva različita fenomena: i) elektrosprej i ii) ionizacija vode.Jako električno polje između dviju elektroda uzrokuje nakupljanje negativnih naboja na površini kondenzirane vode, što rezultira stvaranjem Taylorovih stožaca.Kao rezultat toga nastaju visoko nabijene kapljice vode koje se nastavljaju raspadati na manje čestice, kao u Rayleighovoj teoriji16.Istodobno, jaka električna polja uzrokuju cijepanje nekih molekula vode i odvajanje elektrona (ioniziranje), što dovodi do stvaranja velike količine reaktivnih kisikovih vrsta (ROS)17.Istovremeno generirani ROS18 je kapsuliran u EWNS (slika 1c).
Na sl.Slika 2a prikazuje sustav generiranja EWNS-a razvijen i korišten u sintezi EWNS-a u ovoj studiji.Pročišćena voda pohranjena u zatvorenoj boci uvedena je kroz teflonsku cijev (unutarnjeg promjera 2 mm) u iglu od nehrđajućeg čelika 30G (metalna kapilara).Protok vode kontrolira tlak zraka unutar boce, kao što je prikazano na slici 2b.Igla je postavljena na teflonsku konzolu i može se ručno podesiti na određenu udaljenost od kontra elektrode.Protuelektroda je polirani aluminijski disk s rupom u sredini za uzorkovanje.Ispod protuelektrode nalazi se aluminijski lijevak za uzorkovanje, koji je spojen s ostatkom eksperimentalnog sustava preko priključka za uzorkovanje (slika 2b).Kako bi se izbjeglo nakupljanje naboja koje bi moglo poremetiti rad uzorkivača, sve komponente uzorkivača su električno uzemljene.
(a) Projektirani sustav generiranja nanostrukture vode (EWNS).(b) Poprečni presjek uzorkivača i elektrospreja, koji pokazuje najvažnije parametre.(c) Eksperimentalna postavka za inaktivaciju bakterija.
Gore opisani sustav za generiranje EWNS-a može mijenjati ključne radne parametre kako bi se olakšalo fino podešavanje svojstava EWNS-a.Podesite primijenjeni napon (V), udaljenost između igle i protuelektrode (L) i protok vode (φ) kroz kapilaru za fino podešavanje karakteristika EWNS-a.Simbol koji se koristi za predstavljanje različitih kombinacija: [V (kV), L (cm)].Podesite protok vode kako biste dobili stabilan Taylorov stožac određenog skupa [V, L].Za potrebe ove studije, promjer otvora protuelektrode (D) držan je na 0,5 inča (1,29 cm).
Zbog ograničene geometrije i asimetrije, jakost električnog polja ne može se izračunati iz prvih principa.Umjesto toga, softver QuickField™ (Svendborg, Danska)19 korišten je za izračunavanje električnog polja.Električno polje nije uniformno, pa je vrijednost električnog polja na vrhu kapilare korištena kao referentna vrijednost za različite konfiguracije.
Tijekom studije procijenjeno je nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i protuelektrode u smislu formiranja Taylorovog stošca, stabilnosti Taylorovog stošca, stabilnosti proizvodnje EWNS-a i ponovljivosti.Razne kombinacije prikazane su u Dodatnoj tablici S1.
Izlaz sustava za generiranje EWNS-a bio je izravno povezan s analizatorom veličine čestica skenirajuće mobilnosti (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, MN) za mjerenje koncentracije broja čestica, kao i s aerosolnim Faradayevim elektrometrom (TSI, model 3068B, Shoreview, MN).) za struje aerosola izmjereno je kako je opisano u našoj prethodnoj publikaciji.I SMPS i aerosolni elektrometar uzorkovani su brzinom protoka od 0,5 L/min (ukupni protok uzorka 1 L/min).Brojna koncentracija čestica i protok aerosola mjereni su 120 sekundi.Mjerenje se ponavlja 30 puta.Na temelju trenutnih mjerenja izračunava se ukupni naboj aerosola i procjenjuje se prosječni EWNS naboj za zadani ukupan broj odabranih EWNS čestica.Prosječna cijena EWNS-a može se izračunati pomoću jednadžbe (1):
gdje je IEl izmjerena struja, NSMPS digitalna koncentracija izmjerena SMPS-om, a φEl je brzina protoka po elektrometru.
Budući da relativna vlažnost (RH) utječe na površinski naboj, temperatura i (RH) održavani su konstantnima tijekom eksperimenta na 21°C odnosno 45%.
Mikroskopija atomske sile (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) i AC260T sonda (Olympus, Tokyo, Japan) korišteni su za mjerenje veličine i životnog vijeka EWNS-a.Frekvencija AFM skeniranja bila je 1 Hz, područje skeniranja bilo je 5 μm × 5 μm i 256 linija skeniranja.Sve su slike podvrgnute poravnanju slika prvog reda pomoću softvera Asylum (raspon maske 100 nm, prag 100 pm).
Ispitni lijevak je uklonjen i površina tinjca postavljena je na udaljenost od 2,0 cm od protuelektrode na prosječno vrijeme od 120 s kako bi se izbjegla aglomeracija čestica i stvaranje nepravilnih kapljica na površini liskuna.EWNS je raspršen izravno na površinu svježe izrezanog tinjca (Ted Pella, Redding, CA).Slika površine tinjca neposredno nakon AFM raspršivanja.Kontaktni kut površine svježe izrezanog nemodificiranog tinjca je blizu 0°, pa je EVNS raspoređen na površini tinjca u obliku kupole.Promjer (a) i visina (h) difuznih kapljica izmjereni su izravno iz AFM topografije i korišteni za izračunavanje kupolastog difuzijskog volumena EWNS koristeći našu prethodno validiranu metodu.Pod pretpostavkom da ugrađeni EWNS ima isti volumen, ekvivalentni promjer može se izračunati pomoću jednadžbe (2):
Na temelju naše prethodno razvijene metode, spinska zamka elektronske spinske rezonancije (ESR) korištena je za otkrivanje prisutnosti kratkotrajnih radikalnih intermedijera u EWNS.Aerosoli su propuhani kroz 650 μm Midget sparger (Ace Glass, Vineland, NJ) koji sadrži 235 mM otopinu DEPMPO (5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksida) (Oxis International Inc.).Portland, Oregon).Sva mjerenja ESR-a provedena su korištenjem Bruker EMX spektrometra (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD) i stanične ćelije.Za prikupljanje i analizu podataka korišten je softver Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD).Određivanje karakteristika ROS-a provedeno je samo za skup radnih uvjeta [-6,5 kV, 4,0 cm].Koncentracije EWNS-a izmjerene su pomoću SMPS-a nakon uzimanja u obzir gubitaka EWNS-a u impaktoru.
Razine ozona praćene su pomoću 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Za sva EWNS svojstva srednja vrijednost se koristi kao vrijednost mjerenja, a standardna devijacija se koristi kao greška mjerenja.T-testovi su provedeni kako bi se usporedile vrijednosti optimiziranih EWNS atributa s odgovarajućim vrijednostima osnovnog EWNS-a.
Slika 2c prikazuje prethodno razvijen i okarakteriziran elektrostatski taložni (EPES) "pull" sustav koji se može koristiti za ciljanu isporuku EWNS-a na površini.EPES koristi EVNS naboje koji se pod utjecajem jakog električnog polja mogu “navesti” izravno na površinu mete.Pojedinosti EPES sustava predstavljene su u nedavnoj publikaciji Pyrgiotakisa i sur.11 .Dakle, EPES se sastoji od 3D tiskane PVC komore sa suženim krajevima i sadrži dvije paralelne metalne ploče od nehrđajućeg čelika (304 nehrđajući čelik, obložen zrcalom) u središtu udaljene 15,24 cm.Ploče su bile spojene na vanjski izvor visokog napona (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), donja ploča uvijek je bila spojena na pozitivni napon, a gornja ploča uvijek je bila spojena na masu (plutajuće uzemljenje).Stijenke komore prekrivene su aluminijskom folijom koja je električno uzemljena kako bi se spriječio gubitak čestica.Komora ima zapečaćena prednja vrata za punjenje koja omogućuju postavljanje ispitnih površina na plastične stalke koji ih podižu iznad donje metalne ploče kako bi se izbjegle smetnje visokog napona.
Učinkovitost taloženja EWNS-a u EPES-u izračunata je u skladu s prethodno razvijenim protokolom koji je detaljno prikazan na dodatnoj slici S111.
Kao kontrolna komora, druga cilindrična protočna komora bila je spojena u seriju na EPES sustav, u kojem je korišten srednji HEPA filter za uklanjanje EWNS.Kao što je prikazano na slici 2c, EWNS aerosol je pumpan kroz dvije ugrađene komore.Filtar između kontrolne sobe i EPES-a uklanja bilo koji preostali EWNS što rezultira istom temperaturom (T), relativnom vlagom (RH) i razinama ozona.
Utvrđeno je da važni mikroorganizmi koji se prenose hranom kontaminiraju svježu hranu kao što je E. coli (ATCC #27325), fekalni indikator, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen koji se prenosi hranom, bezopasna Listeria (ATCC #33090), surogat za patogenu Listeria monocytogenes, izvedena iz ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC # 4098), zamjenu za kvasac kvarenja i otporniju inaktiviranu bakteriju, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Kupite nasumične kutije organskih rajčica grožđa na lokalnoj tržnici i stavite u hladnjak na 4°C do upotrebe (do 3 dana).Sve eksperimentalne rajčice bile su iste veličine, promjera oko 1/2 inča.
Protokoli kulture, inokulacije, izlaganja i brojanja kolonija detaljno su opisani u našoj prethodnoj publikaciji i detaljno u Dodatnim podacima.Učinkovitost EWNS-a procijenjena je izlaganjem inokuliranih rajčica 40 000 #/cm3 tijekom 45 minuta.Ukratko, tri rajčice korištene su za procjenu preživjelih mikroorganizama u vremenu t = 0 min.Tri rajčice su stavljene u EPES i izložene EWNS-u pri 40 000 #/cc (EWNS izložene rajčice), a preostale tri su stavljene u kontrolnu komoru (kontrolne rajčice).Dodatna obrada rajčice u obje skupine nije provedena.Rajčice izložene EWNS-u i kontrolne rajčice uklonjene su nakon 45 minuta kako bi se procijenio učinak EWNS-a.
Svaki eksperiment je izveden u tri primjerka.Analiza podataka provedena je prema protokolu opisanom u Dodatnim podacima.
Mehanizmi inaktivacije procijenjeni su sedimentacijom eksponiranih EWNS uzoraka (45 min pri 40 000 #/cm3 EWNS koncentracije aerosola) i neozračenih uzoraka bezopasnih bakterija E. coli, Salmonella enterica i Lactobacillus.Čestice su fiksirane u 2,5% glutaraldehidu, 1,25% paraformaldehidu i 0,03% pikrinskoj kiselini u 0,1 M natrijevom kakodilatnom puferu (pH 7,4) 2 sata na sobnoj temperaturi.Nakon ispiranja, naknadno fiksirati s 1% osmij tetroksidom (OsO4)/1,5% kalij ferocijanidom (KFeCN6) 2 sata, isprati 3 puta u vodi i inkubirati u 1% uranil acetatu 1 sat, zatim isprati dva puta u vodi, zatim dehidrirati 10 minuta u 50%, 70%, 90%, 100% alkoholu.Uzorci su zatim stavljeni u propilen oksid na 1 sat i impregnirani sa 1:1 smjesom propilen oksida i TAAP Epona (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA).Uzorci su ugrađeni u TAAB Epon i polimerizirani na 60°C 48 sati.Stvrdnuta zrnasta smola izrezana je i vizualizirana TEM-om pomoću konvencionalnog prijenosnog elektronskog mikroskopa JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan) opremljenog AMT 2k CCD kamerom (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, SAD).
Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka.Za svaku vremensku točku, ispiranja bakterija su zasijana u tri primjerka, što je rezultiralo s ukupno devet točaka podataka po točki, čiji je prosjek korišten kao koncentracija bakterija za taj određeni mikroorganizam.Kao greška mjerenja korištena je standardna devijacija.Svi bodovi se računaju.
Logaritam smanjenja koncentracije bakterija u usporedbi s t = 0 min izračunat je pomoću sljedeće formule:
gdje je C0 koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u trenutku 0 (tj. nakon što se površina osušila, ali prije stavljanja u komoru), a Cn je koncentracija bakterija na površini nakon n minuta izlaganja.
Kako bi se uzela u obzir prirodna degradacija bakterija tijekom 45-minutnog izlaganja, log redukcija u usporedbi s kontrolom nakon 45 minuta također je izračunata kako slijedi:
gdje je Cn koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u trenutku n, a Cn-kontrola je koncentracija kontrolnih bakterija u trenutku n.Podaci su prikazani kao logaritamsko smanjenje u usporedbi s kontrolom (bez izloženosti EWNS).
Tijekom studije procijenjeno je nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i protuelektrode u smislu formiranja Taylorovog stošca, stabilnosti Taylorovog stošca, stabilnosti proizvodnje EWNS-a i ponovljivosti.Razne kombinacije prikazane su u Dodatnoj tablici S1.Dva slučaja koja pokazuju stabilna i ponovljiva svojstva (Taylorov stožac, generacija EWNS-a i stabilnost tijekom vremena) odabrana su za opsežnu studiju.Na sl.Slika 3 prikazuje rezultate za naboj, veličinu i sadržaj ROS-a u oba slučaja.Rezultati su također prikazani u tablici 1. Za referencu, i slika 3 i tablica 1 uključuju svojstva prethodno sintetiziranog neoptimiziranog EWNS8, 9, 10, 11 (osnovni-EWNS).Izračuni statističke značajnosti korištenjem dvosmjernog t-testa ponovno su objavljeni u Dodatnoj tablici S2.Osim toga, dodatni podaci uključuju studije o učinku promjera otvora za uzorkovanje protuelektrode (D) i udaljenosti između uzemljene elektrode i vrha (L) (dodatne slike S2 ​​i S3).
(ac) Distribucija veličine mjerena AFM.(df) Karakteristika površinskog naboja.(g) ROS karakterizacija EPR-a.
Također je važno napomenuti da je za sve gore navedene uvjete izmjerena struja ionizacije bila između 2 i 6 μA i napon između -3,8 i -6,5 kV, što je rezultiralo potrošnjom energije manjom od 50 mW za ovaj pojedinačni kontaktni modul EWNS generacije.Iako je EWNS sintetiziran pod visokim tlakom, razine ozona bile su vrlo niske, nikada nisu prelazile 60 ppb.
Dodatna slika S4 prikazuje simulirana električna polja za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm].Za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], izračuni polja su 2 × 105 V/m, odnosno 4,7 × 105 V/m.To je očekivano, budući da je u drugom slučaju omjer napona i udaljenosti puno veći.
Na sl.3a,b prikazuje EWNS promjer izmjeren pomoću AFM8.Izračunati prosječni promjeri EWNS bili su 27 nm i 19 nm za sheme [-6,5 kV, 4,0 cm], odnosno [-3,8 kV, 0,5 cm].Za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], geometrijske standardne devijacije distribucija su 1,41 odnosno 1,45, što ukazuje na usku distribuciju veličine.I srednja veličina i standardna geometrijska devijacija vrlo su blizu osnovnog EWNS-a, na 25 nm odnosno 1,41.Na sl.Slika 3c prikazuje distribuciju veličine osnovnog EWNS-a izmjerenu istom metodom pod istim uvjetima.
Na sl.3d,e prikazuje rezultate karakterizacije naboja.Podaci su prosječna mjerenja 30 istodobnih mjerenja koncentracije (#/cm3) i struje (I).Analiza pokazuje da je prosječni naboj na EWNS-u 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- za [-6,5 kV, 4,0 cm], odnosno [-3,8 kV, 0,5 cm].Imaju znatno veće površinske naboje u usporedbi s osnovnim EWNS-om (10 ± 2 e-), dva puta veći od scenarija [-6,5 kV, 4,0 cm] i četiri puta veći od [-3,8 kV, 0,5 cm].Slika 3f prikazuje naboj.podaci za Baseline-EWNS.
Iz mapa koncentracije EWNS broja (dopunske slike S5 i S6), može se vidjeti da scenarij [-6,5 kV, 4,0 cm] ima značajno više čestica od scenarija [-3,8 kV, 0,5 cm].Također je vrijedno napomenuti da je koncentracija broja EWNS praćena do 4 sata (dodatne slike S5 i S6), gdje je stabilnost generacije EWNS pokazala iste razine koncentracije broja čestica u oba slučaja.
Na sl.Slika 3g prikazuje EPR spektar nakon oduzimanja optimizirane EWNS kontrole (pozadina) na [-6,5 kV, 4,0 cm].ROS spektri također su uspoređeni s Baseline-EWNS scenarijem u prethodno objavljenom radu.Broj EWNS-a koji reagiraju sa spin zamkama izračunat je na 7,5 × 104 EWNS/s, što je slično prethodno objavljenom Baseline-EWNS8.EPR spektri jasno su pokazali prisutnost dva tipa ROS, s O2- kao dominantnom vrstom i OH• s manje zastupljenosti.Osim toga, izravna usporedba vršnih intenziteta pokazala je da optimizirani EWNS ima značajno veći sadržaj ROS-a u usporedbi s osnovnim EWNS-om.
Na sl.Slika 4 prikazuje učinkovitost taloženja EWNS-a u EPES-u.Podaci su također sažeti u tablici I i uspoređeni s izvornim podacima EWNS-a.Za oba slučaja EUNS-a taloženje je blizu 100% čak i pri niskom naponu od 3,0 kV.Obično je 3,0 kV dovoljno za 100% taloženje, bez obzira na promjenu površinskog naboja.Pod istim uvjetima, učinkovitost taloženja Baseline-EWNS-a bila je samo 56% zbog nižeg naboja (prosječno 10 elektrona po EWNS-u).
Na sl.5 i u tablici.Slika 2 sažima vrijednost inaktivacije mikroorganizama inokuliranih na površini rajčice nakon izlaganja oko 40 000 #/cm3 EWNS tijekom 45 minuta pri optimalnom načinu rada [-6,5 kV, 4,0 cm].Inokulirani E. coli i Lactobacillus innocuous pokazali su značajno smanjenje od 3,8 log tijekom izlaganja od 45 minuta.Pod istim uvjetima, S. enterica je imala pad od 2,2 log, dok su S. cerevisiae i M. parafortutum imale pad od 1,0 log.
Elektronske mikrografije (Slika 6) prikazuju fizičke promjene izazvane EWNS-om na bezopasnim stanicama Escherichia coli, Streptococcus i Lactobacillus koje dovode do njihove inaktivacije.Kontrolne bakterije imale su netaknute stanične membrane, dok su izložene bakterije imale oštećene vanjske membrane.
Elektronsko mikroskopsko snimanje kontrolnih i izloženih bakterija otkrilo je oštećenje membrane.
Podaci o fizikalno-kemijskim svojstvima optimiziranog EWNS-a zajedno pokazuju da su svojstva (površinski naboj i sadržaj ROS-a) EWNS-a značajno poboljšana u usporedbi s prethodno objavljenim osnovnim podacima EWNS-a8,9,10,11.S druge strane, njihova je veličina ostala u nanometarskom rasponu, vrlo slično prethodno objavljenim rezultatima, što im je omogućilo da ostanu u zraku dulje vrijeme.Opažena polidisperznost može se objasniti promjenama površinskog naboja koje određuju veličinu EWNS-a, slučajnošću Rayleighovog efekta i potencijalnom koalescencijom.Međutim, kako su detaljno opisali Nielsen et al.22, veliki površinski naboj smanjuje isparavanje učinkovitim povećanjem površinske energije/napona kapi vode.U našoj prethodnoj publikaciji8 ova je teorija eksperimentalno potvrđena za mikrokapljice 22 i EWNS.Gubitak naboja tijekom prekovremenog rada također može utjecati na veličinu i pridonijeti promatranoj distribuciji veličine.