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最近、人工水ナノ構造（EWNS）を使用したナノテクノロジーに基づく化学物質を含まない抗菌プラットフォームが開発されました。EWNS は高い表面電荷を持ち、食品媒介病原体を含む多くの微生物と相互作用して不活化できる活性酸素種 (ROS) で飽和しています。ここでは、合成中のそれらの特性を微調整および最適化して、抗菌性の可能性をさらに高めることができることが示されています。EWNS ラボラトリー プラットフォームは、合成パラメーターを変更することで EWNS の特性を微調整するように設計されました。最新の分析手法を使用した EWNS 特性 (ROS の電荷、サイズ、および含有量) の特性評価。さらに、大腸菌、サルモネラ・エンテリカ、リステリア無害菌、マイコバクテリウム・パラアクシデンタム、サッカロミセス・セレビシエなどの食中毒微生物に対する微生物不活化能についても評価されました。ここで示した結果は、EWNS の特性を合成中に微調整することができ、その結果、不活化効率が指数関数的に増加することを示しています。特に、表面電荷は 4 倍に増加し、活性酸素種が増加しました。微生物除去率は微生物に依存し、40,000 #/cc EWNS のエアロゾル線量に 45 分間曝露した後、1.0 ～ 3.8 log の範囲でした。
微生物汚染は、病原体またはその毒素の摂取によって引き起こされる食中毒の主な原因です。米国だけでも、食中毒は毎年約 7,600 万人の病気を引き起こし、32 万 5,000 人が入院し、5,000 人が死亡しています1。さらに、米国農務省 (USDA) は、米国で報告されているすべての食中毒の 48% は生鮮食品の消費増加が原因であると推定しています2。米国における食中毒病原体によって引き起こされる病気と死亡のコストは非常に高く、疾病管理予防センター (CDC) の推定では年間 156 億米ドル以上とされています3。
現在、食品の安全性を確保するための化学的4、放射線5、および熱的6抗菌介入は、継続的ではなく、生産チェーンに沿った限られた重要管理点（CCP）（通常は収穫後および/または包装中）でほとんど実施されています。したがって、相互汚染が起こりやすくなります。7. 食中毒や食品の腐敗をより適切に管理するには、環境への影響とコストを削減しながら、農場から食卓までの一連の過程に潜在的に適用できる抗菌介入が必要です。
最近、人工水ナノ構造 (EWNS) を使用して表面および浮遊細菌を不活性化できる、化学物質を含まないナノテクノロジーベースの抗菌プラットフォームが開発されました。EWNSは、エレクトロスプレーと水のイオン化という2つの並行プロセスを使用して合成されました（図1a）。これまでの研究では、EWNS が独特の物理的および生物学的特性を持っていることが示されています 8,9,10。EWNS は構造ごとに平均 10 個の電子を持ち、平均ナノスケール サイズは 25 nm です (図 1b、c)8、9、10。さらに、電子スピン共鳴（ESR）は、EWNS が大量の活性酸素種（ROS）、主にヒドロキシル（OH・）およびスーパーオキシド（O2-）ラジカルを含むことを示しました（図1c）8。EVNSは長時間空気中に存在し、空気中に浮遊し、表面に存在する微生物と衝突し、そのROSペイロードを運び、微生物の不活化を引き起こす可能性があります（図1d）。これらの初期の研究では、EWNS が表面や空気中のさまざまなグラム陰性菌やグラム陽性菌 (マイコバクテリアを含む) と相互作用して不活化できることも示されました。透過型電子顕微鏡検査により、不活化は細胞膜の破壊によって引き起こされることが示されました。さらに、急性吸入研究では、高用量の EWNS が肺の損傷や炎症を引き起こさないことが示されています 8。
(a) エレクトロスプレーは、液体が入った毛細管と対極の間に高電圧が印加されると発生します。(b) 高圧の適用により、(i) 水のエレクトロスプレーと (ii) EWNS 内に捕捉された活性酸素種 (イオン) の形成という 2 つの異なる現象が生じます。(c) EWNS の独特な構造。(d) EWNS はナノスケールの性質のため、移動性が高く、空気中の病原体と相互作用する可能性があります。
EWNS 抗菌プラットフォームが生鮮食品の表面の食品由来微生物を不活化する能力も最近証明されました。EWNS の表面電荷を電場と組み合わせて使用​​すると、標的を絞った送達を達成できることも示されています。さらに、約 50,000 #/cm3 の EWNS で 90 分間暴露した後の有機トマトの予備結果は、大腸菌やリステリア 11 などのさまざまな食中毒微生物が観察され、有望な結果でした。さらに、予備的な官能試験では、対照トマトと比較して感覚への影響は示されませんでした。これらの初期不活化結果は、50,000#/cc という非常に低い EWNS 用量であっても、食品安全用途にとって有望なものです。感染や腐敗のリスクをさらに減らすには、不活化の可能性が高いほど有益であることは明らかです。
ここでは、合成パラメータの微調整と EWNS の物理化学的特性の最適化を可能にして抗菌力を高めるための EWNS 生成プラットフォームの開発に研究を集中します。特に、最適化は、表面電荷（標的送達を改善するため）およびＲＯＳ含有量（不活化効率を改善するため）を増加させることに焦点を当ててきた。最新の分析手法を使用して最適化された物理化学的特性 (サイズ、電荷、ROS 含有量) を特徴付け、大腸菌などの一般的な食品微生物を使用します。
EVNS は、高純度水 (18 MΩ cm-1) のエレクトロスプレーとイオン化を同時に行うことによって合成されました。電気ネブライザ１２は、典型的には、液体の噴霧化、ならびに制御されたサイズのポリマーおよびセラミック粒子１３および繊維１４の合成に使用される。
以前の出版物 8、9、10、11 で詳しく説明されているように、典型的な実験では、金属キャピラリーと接地された対電極の間に高電圧が印加されました。このプロセス中に、i) エレクトロスプレーと ii) 水のイオン化という 2 つの異なる現象が発生します。2 つの電極間の強い電場により、凝縮水の表面にマイナス電荷が蓄積され、その結果テイラー コーンが形成されます。その結果、レイリー理論のように、高度に帯電した水滴が形成され、より小さな粒子に分解され続けます16。同時に、強い電場により一部の水分子が分裂して電子を剥ぎ取り（イオン化）、大量の活性酸素種（ROS）が生成されます17。同時に生成されたROS18はEWNSにカプセル化されました（図1c）。
図上。図２ａは、この研究で開発され、ＥＷＮＳ合成で使用されたＥＷＮＳ生成システムを示す。密閉ボトルに保存した精製水をテフロンチューブ（内径 2 mm）を通して 30G ステンレス鋼針（金属毛細管）に供給しました。図 2b に示すように、水の流れはボトル内の空気圧によって制御されます。針はテフロン製コンソールに取り付けられており、対電極から一定の距離になるように手動で調整できます。対極は、中央にサンプリング用の穴が開いた研磨されたアルミニウムのディスクです。対極の下にはアルミニウムのサンプリング漏斗があり、サンプリングポートを介して残りの実験装置に接続されています（図2b）。サンプラーの動作を妨げる可能性のある電荷の蓄積を避けるために、すべてのサンプラー コンポーネントは電気的に接地されています。
(a) 人工水ナノ構造生成システム (EWNS)。(b) 最も重要なパラメータを示すサンプラーとエレクトロスプレーの断面図。(c) 細菌の不活化のための実験装置。
上で説明した EWNS 生成システムは、主要な動作パラメータを変更して、EWNS プロパティの微調整を容易にすることができます。印加電圧（V）、針と対極間の距離（L）、キャピラリー内の水流量（φ）を調整することでEWNS特性を微調整します。さまざまな組み合わせを表すために使用される記号: [V (kV)、L (cm)]。特定のセット[V、L]の安定したテイラーコーンが得られるように水流を調整します。この研究の目的のために、対電極 (D) の開口直径は 0.5 インチ (1.29 cm) に保たれました。
幾何学的形状と非対称性が限られているため、電界強度を第一原理から計算することはできません。代わりに、QuickField™ ソフトウェア (Svendborg、デンマーク)19 を使用して電場を計算しました。電場は均一ではないため、キャピラリ先端の電場の値を各種構成の参考値として使用しました。
研究中、電圧と針と対電極間の距離のいくつかの組み合わせが、テイラーコーンの形成、テイラーコーンの安定性、EWNS 生成の安定性、および再現性の観点から評価されました。さまざまな組み合わせを補足表 S1 に示します。
EWNS 生成システムの出力は、粒子数濃度測定用の走査移動度粒度分析装置 (SMPS、モデル 3936、TSI、ミネソタ州ショーレビュー)、およびエアロゾル ファラデー電位計 (TSI、モデル 3068B、ミネソタ州ショーレビュー) に直接接続されました。) エアロゾル電流の値は、以前の出版物で説明したように測定されました。SMPS とエアロゾル電位計は両方とも、流量 0.5 L/min (サンプルの合計流量 1 L/min) でサンプリングしました。粒子数濃度とエアロゾル流量を 120 秒間測定しました。測定は 30 回繰り返されます。現在の測定に基づいて、エアロゾルの総電荷が計算され、選択された EWNS 粒子の所定の合計数に対する平均 EWNS 電荷が推定されます。EWNS の平均コストは、式 (1) を使用して計算できます。
ここで、IEl は測定電流、NSMPS は SMPS で測定されたデジタル濃度、φEl は電位計あたりの流量です。
相対湿度 (RH) は表面電荷に影響を与えるため、実験中は温度と (RH) をそれぞれ 21°C と 45% で一定に保ちました。
原子間力顕微鏡 (AFM)、Asylum MFP-3D (Asylum Research、カリフォルニア州サンタバーバラ)、および AC260T プローブ (オリンパス、東京、日本) を使用して、EWNS のサイズと寿命を測定しました。AFM 走査周波数は 1 Hz、走査領域は 5 μm × 5 μm、走査線数は 256 でした。すべての画像は、Asylum ソフトウェア (マスク範囲 100 nm、閾値 100 pm) を使用して 1 次画像位置合わせを受けました。
試験漏斗を取り外し、雲母表面上で粒子の凝集と不規則な液滴の形成を避けるために、平均時間 120 秒間、雲母表面を対電極から 2.0 cm の距離に置きました。EWNS を、新たに切断した雲母 (Ted Pella、カリフォルニア州レディング) の表面に直接スプレーしました。AFMスパッタリング直後のマイカ表面の画像。切断したばかりの未修飾の雲母の表面の接触角は 0°に近いため、EVNS は雲母の表面にドーム状に分布します。拡散液滴の直径 (a) と高さ (h) は、AFM トポグラフィーから直接測定され、以前に検証された方法を使用して EWNS ドーム型拡散体積を計算するために使用されました。オンボード EWNS の体積が同じであると仮定すると、等価直径は式 (2) を使用して計算できます。
以前に開発した方法に基づいて、電子スピン共鳴 (ESR) スピン トラップを使用して、EWNS における短寿命ラジカル中間体の存在を検出しました。エアロゾルを、２３５ｍＭのＤＥＰＭＰＯ（５－（ジエトキシホスホリル）－５－メチル－１－ピロリン－Ｎ－オキシド）（Ｏｘｉｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）溶液を含有する６５０μｍミジェットスパージャー（Ａｃｅ Ｇｌａｓｓ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）を通して泡立てた。オレゴン州ポートランド）。すべての ESR 測定は、Bruker EMX 分光計 (Bruker Instruments Inc.、米国マサチューセッツ州ビレリカ) とフラット パネル セルを使用して実行されました。データの収集と分析には、Acquisit ソフトウェア (Bruker Instruments Inc.、米国マサチューセッツ州ビレリカ) を使用しました。ROS の特性の決定は、一連の動作条件 [-6.5 kV、4.0 cm] に対してのみ実行されました。EWNS 濃度は、衝突体における EWNS 損失を考慮した後、SMPS を使用して測定されました。
オゾンレベルは、205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies、ボルダー、コロラド州) を使用して監視されました8、9、10。
すべての EWNS プロパティでは、平均値が測定値として使用され、標準偏差が測定誤差として使用されます。T 検定を実行して、最適化された EWNS 属性の値をベース EWNS の対応する値と比較しました。
図2cは、地表でのEWNSの標的送達に使用できる、以前に開発され特性が決定された静電沈降（EPES）「プル」システムを示しています。EPES は、強い電場の影響下でターゲットの表面に直接「誘導」できる EVNS 電荷を使用します。EPES システムの詳細は、Pyrgiotakis らによる最近の出版物に記載されています。１１．したがって、EPES は、テーパー端を備えた 3D プリントされた PVC チャンバーで構成され、中央に 15.24 cm 離れた 2 枚の平行なステンレス鋼 (304 ステンレス鋼、ミラーコーティングされた) 金属プレートが含まれています。ボードは外部高電圧源 (ニューヨーク州ホーポージ、スペルマンの Bertran 205B-10R) に接続され、底部プレートは常に正電圧に接続され、上部プレートは常にグランド (フローティング グランド) に接続されました。チャンバーの壁はアルミニウム箔で覆われており、粒子の損失を防ぐために電気的に接地されています。チャンバーには密閉された前面ローディング ドアがあり、高電圧の干渉を避けるために底部の金属プレートの上に試験面を持ち上げるプラスチック スタンドに試験面を置くことができます。
EPES における EWNS の堆積効率は、補足図 S111 に詳述されている以前に開発されたプロトコルに従って計算されました。
制御チャンバーとして、2 番目の円筒形フロー チャンバーを EPES システムに直列に接続し、中間の HEPA フィルターを使用して EWNS を除去しました。図 2c に示すように、EWNS エアロゾルは 2 つの内蔵チャンバーを通してポンプで送られました。制御室と EPES の間のフィルターは、残留 EWNS を除去し、同じ温度 (T)、相対湿度 (RH)、オゾン レベルをもたらします。
生鮮食品を汚染する重要な食中毒微生物としては、大腸菌（ATCC #27325）、糞便指標菌、サルモネラ・エンテリカ（ATCC #53647）、食中毒病原体、無害リステリア（ATCC #33090）、ATCC（バージニア州マナサス）由来の病原性リステリア・モノサイトゲネスの代用物、サッカロマイセス・セレビシエ（ATCC #4）などが挙げられる。 098)、腐敗酵母の代替品、およびより耐性のある不活化細菌、Mycobacterium paralucky (ATCC #19686)。
地元の市場から有機グレープトマトの箱をランダムに購入し、使用するまで 4°C で冷蔵します (最長 3 日間)。実験用のトマトはすべて同じサイズで、直径約 1/2 インチでした。
培養、接種、曝露、コロニー数のプロトコールについては、以前の出版物と補足データに詳しく記載されています。EWNS の有効性は、接種したトマトを 40,000 #/cm3 に 45 分間暴露することによって評価されました。簡単に言うと、3 つのトマトを使用して、時間 t = 0 分の生存微生物を評価しました。3 個のトマトを EPES に入れ、40,000 #/cc の EWNS に曝露し (EWNS 曝露トマト)、残りの 3 個を対照チャンバーに配置しました (対照トマト)。両グループのトマトの追加加工は行われませんでした。EWNS に曝露したトマトと対照トマトを 45 分後に取り出して、EWNS の効果を評価しました。
各実験は 3 回繰り返して実行されました。データ分析は、補足データに記載されているプロトコルに従って実行されました。
不活化メカニズムは、曝露された EWNS サンプル (EWNS エアロゾル濃度 40,000 #/cm3 で 45 分間) および無害な細菌である大腸菌、サルモネラ エンテリカおよびラクトバチルス属の非照射サンプルの沈降によって評価されました。粒子を、２．５％グルタルアルデヒド、１．２５％パラホルムアルデヒドおよび０．０３％ピクリン酸を含む０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温で２時間固定した。洗浄後、1% 四酸化オスミウム (OsO4)/1.5% フェロシアン化カリウム (KFeCN6) で 2 時間後固定し、水で 3 回洗浄し、1% 酢酸ウラニルで 1 時間インキュベートし、水で 2 回洗浄し、50%、70%、90%、100% アルコールで 10 分間脱水します。次いで、サンプルをプロピレンオキシド中に１時間置き、プロピレンオキシドとＴＡＡＰ Ｅｐｏｎ（カリフォルニア州セントローランのマリバック・カナダ社）の１：１混合物を含浸させた。サンプルを TAAB Epon に埋め込み、60℃で 48 時間重合させました。硬化した粒状樹脂を切断し、AMT 2k CCDカメラ（米国マサチューセッツ州ウォーバーンのAdvanced Microscopy Techniques, Corp.）を備えた従来の透過型電子顕微鏡JEOL 1200EX（JEOL、東京、日本）を使用してTEMで可視化した。
すべての実験は 3 回繰り返して実行されました。各時点で、細菌洗浄液を 3 回播種し、1 点あたり合計 9​​ つのデータ ポイントが得られ、その平均がその特定の微生物の細菌濃度として使用されました。標準偏差を測定誤差として使用した。すべてのポイントがカウントされます。
t = 0 分と比較した細菌濃度の減少の対数は、次の式を使用して計算されました。
ここで、C0は時間0（つまり、表面が乾燥した後、チャンバーに配置される前）での対照サンプル中の細菌の濃度であり、Cnはn分間の曝露後の表面上の細菌の濃度です。
45 分間の曝露中の細菌の自然分解を考慮して、45 分後の対照と比較した対数減少も次のように計算しました。
ここで、Cn は時間 n における対照サンプル中の細菌の濃度であり、Cn-Control は時間 n における対照細菌の濃度です。データは、対照（EWNS 曝露なし）と比較した対数減少として示されています。
研究中、電圧と針と対電極間の距離のいくつかの組み合わせが、テイラーコーンの形成、テイラーコーンの安定性、EWNS 生成の安定性、および再現性の観点から評価されました。さまざまな組み合わせを補足表 S1 に示します。安定性と再現性のある特性 (テイラー コーン、EWNS 生成、および経時的な安定性) を示す 2 つのケースが、包括的な研究のために選択されました。図上。図 3 は、両方の場合の ROS の電荷、サイズ、および含有量の結果を示しています。結果は表 1 にも示されています。参考として、図 3 と表 1 の両方には、以前に合成された最適化されていない EWNS8、9、10、11 (ベースライン-EWNS) の特性が含まれています。両側 t 検定を使用した統計的有意性の計算は、補足表 S2 に再公開されています。さらに、追加データには、対電極サンプリング穴直径 (D) および接地電極とチップ間の距離 (L) の影響の研究が含まれます (補足図 S2 および S3)。
(ac) AFM によって測定されたサイズ分布。(df) 表面電荷特性。(g) EPR の ROS 特性評価。
また、上記のすべての条件において、測定されたイオン化電流は 2 ～ 6 μA、電圧は -3.8 ～ -6.5 kV であり、この単一 EWNS 生成接触モジュールの消費電力は 50 mW 未満になることに注意することも重要です。EWNS は高圧下で合成されましたが、オゾン レベルは非常に低く、60 ppb を超えることはありませんでした。
補足図S4は、それぞれ[-6.5 kV、4.0 cm]および[-3.8 kV、0.5 cm]シナリオのシミュレートされた電場を示しています。[-6.5 kV、4.0 cm] および [-3.8 kV、0.5 cm] シナリオの場合、場の計算はそれぞれ 2 × 105 V/m および 4.7 × 105 V/m です。2 番目のケースでは電圧と距離の比がはるかに高いため、これは予想通りです。
図上。図 3a、b は、AFM8 で測定された EWNS 直径を示しています。計算された平均 EWNS 直径は、[-6.5 kV、4.0 cm] スキームと [-3.8 kV、0.5 cm] スキームでそれぞれ 27 nm と 19 nm でした。[-6.5 kV、4.0 cm] および [-3.8 kV、0.5 cm] のシナリオでは、分布の幾何標準偏差はそれぞれ 1.41 と 1.45 であり、サイズ分布が狭いことを示しています。平均サイズと幾何標準偏差は両方とも、ベースライン EWNS に非常に近く、それぞれ 25 nm と 1.41 です。図上。図３ｃは、同じ条件下で同じ方法を使用して測定されたベースＥＷＮＳのサイズ分布を示す。
図上。3d、eは電荷特性評価の結果を示しています。データは、濃度 (#/cm3) と電流 (I) を 30 回同時に測定した平均値です。分析の結果、EWNS の平均電荷は [-6.5 kV、4.0 cm] および [-3.8 kV、0.5 cm] でそれぞれ 22 ± 6 e- および 44 ± 6 e- であることが示されています。これらはベースライン EWNS (10 ± 2 e-) と比較して著しく高い表面電荷を持ち、[-6.5 kV、4.0 cm] シナリオより 2 倍、[-3.8 kV、0.5 cm] シナリオより 4 倍大きくなります。図 3f は電荷を示しています。Baseline-EWNS のデータ。
EWNS 番号の濃度マップ (補足図 S5 および S6) から、[-6.5 kV、4.0 cm] シナリオには [-3.8 kV、0.5 cm] シナリオよりも大幅に多くの粒子があることがわかります。EWNS 数濃度が最大 4 時間監視されたことにも注目する価値があります (補足図 S5 および S6)。EWNS 生成安定性は、どちらの場合も同じレベルの粒子数濃度を示しました。
図上。3gは、[-6.5 kV、4.0 cm]で最適化されたEWNSコントロール（バックグラウンド）を差し引いた後のEPRスペクトルを示しています。ROS スペクトルは、以前に公開された研究の Baseline-EWNS シナリオとも比較されました。スピントラップと反応する EWNS の数は 7.5 × 104 EWNS/s と計算され、これは以前に公開された Baseline-EWNS8 と同様です。EPR スペクトルは 2 種類の ROS の存在を明確に示し、O2- が主な種であり、OH・ はそれほど豊富ではありません。さらに、ピーク強度の直接比較により、最適化された EWNS はベースライン EWNS と比較して ROS 含有量が大幅に高いことが示されました。
図上。図４は、ＥＰＥＳにおけるＥＷＮＳの堆積効率を示す。データは表 I にもまとめられ、元の EWNS データと比較されます。EUNS のどちらの場合でも、3.0 kV の低電圧でも堆積は 100% に近くなります。通常、表面電荷の変化に関係なく、100% の堆積には 3.0 kV で十分です。同じ条件下では、Baseline-EWNS の堆積効率は、電荷が低いため (EWNS あたり平均 10 電子) 56% にすぎませんでした。
図上。5と表にあります。図 2 は、最適モード [-6.5 kV、4.0 cm] で約 40,000 #/cm3 EWNS に 45 分間曝露した後のトマトの表面に接種された微生物の不活化値をまとめたものです。接種された大腸菌および無害な乳酸菌は、45 分間の曝露中に 3.8 log の大幅な減少を示しました。同じ条件下で、S. enterica は 2.2 log 減少しましたが、S. cerevisiae と M. parafortutum は 1.0 log 減少しました。
電子顕微鏡写真 (図 6) は、EWNS によって無害な大腸菌、連鎖球菌、乳酸桿菌の細胞に誘発され、それらの不活化につながる物理的変化を示しています。対照細菌は無傷の細胞膜を持っていましたが、曝露された細菌は外膜が損傷していました。
対照細菌および曝露細菌の電子顕微鏡画像により、膜損傷が明らかになった。
最適化された EWNS の物理化学的特性に関するデータを総合すると、EWNS の特性 (表面電荷と ROS 含有量) が、以前に公開された EWNS ベースライン データと比較して大幅に改善されたことが示されています 8、9、10、11。一方で、そのサイズは以前に報告された結果と非常によく似たナノメートルの範囲に留まり、長時間空気中に留まることができました。観察された多分散性は、EWNS のサイズ、レイリー効果のランダム性、および潜在的な合体を決定する表面電荷の変化によって説明できます。ただし、Nielsen et al. によって詳しく説明されているように。図２２に示されるように、高い表面電荷は、水滴の表面エネルギー／張力を効果的に増大させることによって蒸発を減少させる。私たちの以前の出版物 8 では、この理論は微小液滴 22 と EWNS について実験的に確認されました。時間外の充電の損失もサイズに影響を及ぼし、観察されるサイズ分布に寄与する可能性があります。