Ďakujeme za návštevu stránky Nature.com. Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS. Pre dosiahnutie čo najlepšieho zážitku odporúčame používať aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v prehliadači Internet Explorer). Medzitým budeme stránku vykresľovať bez štýlov a JavaScriptu, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu.
Karusel zobrazujúci tri snímky súčasne. Pomocou tlačidiel Predchádzajúci a Ďalší sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz alebo pomocou tlačidiel posuvníka na konci sa môžete pohybovať medzi tromi snímkami naraz.
Nedávno bola vyvinutá bezchemická antimikrobiálna platforma založená na nanotechnológii s využitím umelých vodných nanostruktúr (EWNS). EWNS majú vysoký povrchový náboj a sú nasýtené reaktívnymi formami kyslíka (ROS), ktoré môžu interagovať s množstvom mikroorganizmov vrátane patogénov prenášaných potravinami a inaktivovať ich. Tu sa ukazuje, že ich vlastnosti počas syntézy je možné jemne doladiť a optimalizovať, aby sa ďalej zvýšil ich antibakteriálny potenciál. Laboratórna platforma EWNS bola navrhnutá tak, aby doladila vlastnosti EWNS zmenou parametrov syntézy. Charakterizácia vlastností EWNS (náboj, veľkosť a obsah ROS) pomocou moderných analytických metód. Okrem toho boli hodnotené z hľadiska ich mikrobiálneho inaktivačného potenciálu proti mikroorganizmom prenášaným potravinami, ako sú Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum a Saccharomyces cerevisiae. Výsledky prezentované v tomto dokumente ukazujú, že vlastnosti EWNS je možné jemne doladiť počas syntézy, čo vedie k exponenciálnemu zvýšeniu účinnosti inaktivácie. Konkrétne sa povrchový náboj zvýšil štvornásobne a zvýšili sa reaktívne formy kyslíka. Rýchlosť odstraňovania mikróbov bola mikrobiálne závislá a pohybovala sa od 1,0 do 3,8 log po 45-minútovej expozícii dávke aerosólu 40 000 #/cc EWNS.
Mikrobiálna kontaminácia je hlavnou príčinou ochorení prenášaných potravinami spôsobených požitím patogénov alebo ich toxínov. Len v Spojených štátoch spôsobujú choroby prenášané potravinami približne 76 miliónov ochorení, 325 000 hospitalizácií a 5 000 úmrtí ročne1. Okrem toho Ministerstvo poľnohospodárstva Spojených štátov (USDA) odhaduje, že zvýšená konzumácia čerstvých produktov je zodpovedná za 48 % všetkých hlásených ochorení prenášaných potravinami v Spojených štátoch2. Náklady na choroby a úmrtia spôsobené patogénmi prenášanými potravinami v Spojených štátoch sú veľmi vysoké, Centrá pre kontrolu a prevenciu chorôb (CDC) ich odhadujú na viac ako 15,6 miliardy USD ročne3.
V súčasnosti sa chemické4, radiačné5 a tepelné6 antimikrobiálne zásahy na zaistenie bezpečnosti potravín vykonávajú väčšinou v obmedzených kritických kontrolných bodoch (CCP) pozdĺž výrobného reťazca (zvyčajne po zbere úrody a/alebo počas balenia), a nie nepretržite. Preto sú náchylné na krížovú kontamináciu. 7. Lepšia kontrola chorôb prenášaných potravinami a kazenia potravín si vyžaduje antimikrobiálne zásahy, ktoré sa potenciálne môžu uplatňovať v celom procese „od farmy až po stôl“ a zároveň znižovať vplyv na životné prostredie a náklady.
Nedávno bola vyvinutá antimikrobiálna platforma bez chemikálií založená na nanotechnológiách, ktorá dokáže inaktivovať povrchové a vzdušné baktérie pomocou umelých vodných nanostruktúr (EWNS). EWNS boli syntetizované pomocou dvoch paralelných procesov, elektrosprejovania a ionizácie vody (obr. 1a). Predchádzajúce štúdie ukázali, že EWNS majú jedinečný súbor fyzikálnych a biologických vlastností8,9,10. EWNS majú v priemere 10 elektrónov na štruktúru a priemernú veľkosť v nanoškále 25 nm (obr. 1b,c)8,9,10. Okrem toho elektrónová spinová rezonancia (ESR) ukázala, že EWNS obsahujú veľké množstvo reaktívnych foriem kyslíka (ROS), najmä hydroxylových (OH•) a superoxidových (O2-) radikálov (obr. 1c)8. EVNS sú vo vzduchu dlhý čas a môžu sa zrážať s mikroorganizmami suspendovanými vo vzduchu a prítomnými na povrchu, čím dodávajú svoje užitočné zaťaženie ROS a spôsobujú inaktiváciu mikroorganizmov (obr. 1d). Tieto skoré štúdie tiež ukázali, že EWNS môžu interagovať s rôznymi gramnegatívnymi a grampozitívnymi baktériami vrátane mykobaktérií a inaktivovať ich na povrchoch a vo vzduchu. Transmisná elektrónová mikroskopia ukázala, že inaktivácia bola spôsobená narušením bunkovej membrány. Okrem toho štúdie akútnej inhalácie ukázali, že vysoké dávky EWNS nespôsobujú poškodenie pľúc ani zápal 8.
(a) Elektrosprej nastáva, keď sa medzi kapilárnu trubicu obsahujúcu kvapalinu a protielektródu aplikuje vysoké napätie. (b) Aplikácia vysokého tlaku vedie k dvom rôznym javom: (i) elektrospreju vody a (ii) tvorbe reaktívnych foriem kyslíka (iónov) zachytených v EWNS. (c) Unikátna štruktúra EWNS. (d) Vďaka svojej nanorozmernej povahe sú EWNS vysoko mobilné a môžu interagovať s patogénmi prenášanými vzduchom.
Nedávno bola preukázaná aj schopnosť antimikrobiálnej platformy EWNS inaktivovať mikroorganizmy prenášané potravinami na povrchu čerstvých potravín. Ukázalo sa tiež, že povrchový náboj EWNS v kombinácii s elektrickým poľom možno použiť na dosiahnutie cieleného dodávania. Okrem toho boli predbežné výsledky pre organické paradajky po 90-minútovej expozícii pri EWNS približne 50 000 #/cm3 povzbudivé, pričom sa pozorovali rôzne mikroorganizmy prenášané potravinami, ako napríklad E. coli a Listeria II. Okrem toho predbežné organoleptické testy nepreukázali žiadne senzorické účinky v porovnaní s kontrolnými paradajkami. Hoci tieto počiatočné výsledky inaktivácie sú povzbudivé pre aplikácie v oblasti bezpečnosti potravín aj pri veľmi nízkych dávkach EWNS 50 000#/cm3, je zrejmé, že vyšší inaktivačný potenciál by bol prospešnejší na ďalšie zníženie rizika infekcie a kazenia.
V tejto práci sa zameriame na výskum vývoja platformy na generovanie EWNS, ktorá umožní jemné doladenie parametrov syntézy a optimalizáciu fyzikálno-chemických vlastností EWNS s cieľom zvýšiť ich antibakteriálny potenciál. Optimalizácia sa zamerala najmä na zvýšenie ich povrchového náboja (na zlepšenie cieleného dodávania) a obsahu ROS (na zlepšenie účinnosti inaktivácie). Charakterizujeme optimalizované fyzikálno-chemické vlastnosti (veľkosť, náboj a obsah ROS) pomocou moderných analytických metód a používame bežné potravinárske mikroorganizmy, ako napríklad E.
EVNS bol syntetizovaný súčasným elektrorozprašovaním a ionizáciou vysoko čistej vody (18 MΩ cm–1). Elektrický rozprašovač 12 sa typicky používa na atomizáciu kvapalín a syntézu polymérnych a keramických častíc 13 a vlákien 14 s kontrolovanou veľkosťou.
Ako je podrobne opísané v predchádzajúcich publikáciách 8, 9, 10, 11, v typickom experimente bolo medzi kovovú kapiláru a uzemnenú protielektródu aplikované vysoké napätie. Počas tohto procesu dochádza k dvom rôznym javom: i) elektrosprej a ii) ionizácia vody. Silné elektrické pole medzi dvoma elektródami spôsobuje hromadenie záporných nábojov na povrchu kondenzovanej vody, čo vedie k tvorbe Taylorových kužeľov. V dôsledku toho sa tvoria vysoko nabité kvapôčky vody, ktoré sa ďalej rozpadajú na menšie častice, ako v Rayleighovej teórii16. Zároveň silné elektrické polia spôsobujú štiepenie niektorých molekúl vody a odštiepenie elektrónov (ionizáciu), čo vedie k tvorbe veľkého množstva reaktívnych foriem kyslíka (ROS)17. Súčasne generovaný ROS18 bol zapuzdrený v EWNS (obr. 1c).
Na obr. 2a je znázornený systém generovania EWNS vyvinutý a použitý pri syntéze EWNS v tejto štúdii. Čistená voda uložená v uzavretej fľaši bola privádzaná cez teflónovú trubicu (vnútorný priemer 2 mm) do ihly z nehrdzavejúcej ocele 30G (kovová kapilára). Prietok vody je riadený tlakom vzduchu vo vnútri fľaše, ako je znázornené na obrázku 2b. Ihla je namontovaná na teflónovej konzole a je možné ju manuálne nastaviť do určitej vzdialenosti od protielektródy. Protielektróda je leštený hliníkový disk s otvorom v strede na odber vzoriek. Pod protielektródou sa nachádza hliníkový odberový lievik, ktorý je pripojený k zvyšku experimentálneho zariadenia cez odberový port (obr. 2b). Aby sa zabránilo hromadeniu náboja, ktoré by mohlo narušiť prevádzku vzorkovača, všetky komponenty vzorkovača sú elektricky uzemnené.
(a) Systém na generovanie nanostruktúr vody (EWNS). (b) Prierez vzorkovača a elektrospreja zobrazujúci najdôležitejšie parametre. (c) Experimentálne usporiadanie na inaktiváciu baktérií.
Systém generovania EWNS opísaný vyššie je schopný meniť kľúčové prevádzkové parametre, aby sa uľahčilo jemné doladenie vlastností EWNS. Upravte aplikované napätie (V), vzdialenosť medzi ihlou a protielektródou (L) a prietok vody (φ) cez kapiláru, aby ste jemne doladili charakteristiky EWNS. Symbol použitý na znázornenie rôznych kombinácií: [V (kV), L (cm)]. Upravte prietok vody tak, aby ste dosiahli stabilný Taylorov kužeľ určitej sady [V, L]. Pre účely tejto štúdie bol priemer otvoru protielektródy (D) udržiavaný na hodnote 0,5 palca (1,29 cm).
Vzhľadom na obmedzenú geometriu a asymetriu nie je možné vypočítať intenzitu elektrického poľa z prvých princípov. Namiesto toho bol na výpočet elektrického poľa použitý softvér QuickField™ (Svendborg, Dánsko)19. Elektrické pole nie je rovnomerné, takže hodnota elektrického poľa na hrote kapiláry bola použitá ako referenčná hodnota pre rôzne konfigurácie.
Počas štúdie bolo hodnotených niekoľko kombinácií napätia a vzdialenosti medzi ihlou a protielektródou z hľadiska tvorby Taylorovho kužeľa, stability Taylorovho kužeľa, stability produkcie EWNS a reprodukovateľnosti. Rôzne kombinácie sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1.
Výstup generátora EWNS bol priamo pripojený k analyzátoru veľkosti častíc Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, MN) na meranie koncentrácie počtu častíc, ako aj k aerosólovému Faradayovmu elektrometru (TSI, model 3068B, Shoreview, MN). ) pre meranie aerosólových prúdov sa postupovalo podľa popisu v našej predchádzajúcej publikácii. SMPS aj aerosólový elektrometer odoberali vzorky pri prietoku 0,5 l/min (celkový prietok vzorky 1 l/min). Početná koncentrácia častíc a prietok aerosólu sa merali počas 120 sekúnd. Meranie sa opakovalo 30-krát. Na základe meraní prúdu sa vypočíta celkový náboj aerosólu a odhadne sa priemerný náboj EWNS pre daný celkový počet vybraných častíc EWNS. Priemerné náklady na EWNS možno vypočítať pomocou rovnice (1):
kde IEl je nameraný prúd, NSMPS je digitálna koncentrácia meraná pomocou SMPS a φEl je prietok na elektrometer.
Keďže relatívna vlhkosť (RH) ovplyvňuje povrchový náboj, teplota a (RH) sa počas experimentu udržiavali konštantné na 21 °C a 45 %.
Na meranie veľkosti a životnosti EWNS sa použila mikroskopia atómových síl (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) a sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japonsko). Frekvencia skenovania AFM bola 1 Hz, plocha skenovania bola 5 μm × 5 μm a 256 riadkov skenovania. Všetky snímky boli podrobené zarovnaniu obrazu 1. rádu pomocou softvéru Asylum (rozsah masky 100 nm, prah 100 pm).
Testovací lievik bol odstránený a povrch sľudy bol umiestnený vo vzdialenosti 2,0 cm od protielektródy na priemerný čas 120 s, aby sa zabránilo aglomerácii častíc a tvorbe nepravidelných kvapôčok na povrchu sľudy. EWNS (elektrónové naprašovanie sľudy) bolo nastriekané priamo na povrch čerstvo narezanej sľudy (Ted Pella, Redding, CA). Obrázok povrchu sľudy bezprostredne po AFM naprašovaní. Kontaktný uhol povrchu čerstvo narezanej nemodifikovanej sľudy je blízky 0°, takže EVNS je na povrchu sľudy rozložené vo forme kupoly. Priemer (a) a výška (h) difúznych kvapôčok boli merané priamo z topografie AFM a použité na výpočet difúzneho objemu kupoly EWNS pomocou našej predtým validovanej metódy. Za predpokladu, že integrované EWNS majú rovnaký objem, ekvivalentný priemer je možné vypočítať pomocou rovnice (2):
Na základe našej predtým vyvinutej metódy bola na detekciu prítomnosti krátkodobých radikálových medziproduktov v EWNS použitá spinová pasca s elektrónovou spinovou rezonanciou (ESR). Aerosóly boli prebublávané cez 650 μm Midget rozprašovač (Ace Glass, Vineland, NJ) obsahujúci 235 mM roztok DEPMPO(5-(dietoxyfosforyl)-5-metyl-1-pyrolín-N-oxidu) (Oxis International Inc.). Portland, Oregon. Všetky merania ESR boli vykonané pomocou spektrometra Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) a plochej cely. Na zber a analýzu údajov bol použitý softvér Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA). Stanovenie charakteristík ROS bolo vykonané iba pre súbor prevádzkových podmienok [-6,5 kV, 4,0 cm]. Koncentrácie EWNS boli merané pomocou SMPS po zohľadnení strát EWNS v impaktore.
Hladiny ozónu boli monitorované pomocou dvojlúčového ozónového monitora 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Colorado)8,9,10.
Pre všetky vlastnosti EWNS sa ako nameraná hodnota používa priemerná hodnota a ako chyba merania sa používa štandardná odchýlka. Na porovnanie hodnôt optimalizovaných atribútov EWNS so zodpovedajúcimi hodnotami základného EWNS boli vykonané t-testy.
Obrázok 2c zobrazuje predtým vyvinutý a charakterizovaný systém „ťahania“ elektrostatickej precipitácie (EPES), ktorý možno použiť na cielené dodávanie EWNS na povrch. EPES využíva náboje EVNS, ktoré je možné „viesť“ priamo na povrch cieľa vplyvom silného elektrického poľa. Podrobnosti o systéme EPES sú prezentované v nedávnej publikácii Pyrgiotakisa a kol. 11. EPES teda pozostáva z 3D tlačenej PVC komory so zúženými koncami, ktorá obsahuje dve paralelné kovové dosky z nehrdzavejúcej ocele (nehrdzavejúca oceľ 304 so zrkadlovým povlakom) v strede vzdialené od seba 15,24 cm. Dosky boli pripojené k externému zdroju vysokého napätia (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), spodná doska bola vždy pripojená ku kladnému napätiu a horná doska bola vždy pripojená k zemi (plávajúca zem). Steny komory sú pokryté hliníkovou fóliou, ktorá je elektricky uzemnená, aby sa zabránilo strate častíc. Komora má utesnené predné plniace dvierka, ktoré umožňujú umiestnenie testovacích povrchov na plastové stojany, ktoré ich zdvíhajú nad spodnú kovovú dosku, aby sa predišlo rušeniu vysokým napätím.
Účinnosť depozície EWNS v EPES bola vypočítaná podľa predtým vyvinutého protokolu podrobne opísaného v doplnkovom obrázku S111.
Ako riadiaca komora bola k systému EPES sériovo zapojená druhá valcová prietoková komora, v ktorej sa na odstránenie EWNS použil medziľahlý HEPA filter. Ako je znázornené na obrázku 2c, aerosól EWNS bol prečerpávaný cez dve vstavané komory. Filter medzi riadiacou miestnosťou a EPES odstraňuje všetky zostávajúce EWNS, čo vedie k rovnakej teplote (T), relatívnej vlhkosti (RH) a hladine ozónu.
Zistilo sa, že dôležité mikroorganizmy prenášané potravinami kontaminujú čerstvé potraviny, ako napríklad E. coli (ATCC #27325), indikátor stolice, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogén prenášaný potravinami, Listeria infest (ATCC #33090), náhrada patogénnej Listeria monocytogenes, odvodená z ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), náhrada kvasiniek spôsobujúcich kazenie potravín, a odolnejšia inaktivovaná baktéria Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Kúpte si náhodné krabice bio hroznových paradajok z miestneho trhu a uchovávajte ich v chladničke pri teplote 4 °C až do spotreby (maximálne 3 dni). Experimentálne paradajky mali všetky rovnakú veľkosť, približne 1,25 cm v priemere.
Protokoly kultivácie, inokulácie, expozície a počítania kolónií sú podrobne opísané v našej predchádzajúcej publikácii a v doplnkových údajoch. Účinnosť EWNS bola hodnotená vystavením inokulovaných paradajok pôsobeniu 40 000 #/cm3 počas 45 minút. Stručne povedané, tri paradajky boli použité na vyhodnotenie prežívajúcich mikroorganizmov v čase t = 0 min. Tri paradajky boli umiestnené do EPES a vystavené EWNS v koncentrácii 40 000 #/cm3 (paradajky vystavené EWNS) a zvyšné tri boli umiestnené do kontrolnej komory (kontrolné paradajky). Ďalšie spracovanie paradajok v oboch skupinách sa nevykonalo. Paradajky vystavené EWNS a kontrolné paradajky boli po 45 minútach odstránené, aby sa vyhodnotil účinok EWNS.
Každý experiment sa uskutočnil v troch opakovaniach. Analýza údajov sa vykonala podľa protokolu opísaného v doplnkových údajoch.
Mechanizmy inaktivácie boli hodnotené sedimentáciou exponovaných vzoriek EWNS (45 minút pri koncentrácii aerosólu EWNS 40 000 #/cm3) a neožiarených vzoriek neškodných baktérií E. coli, Salmonella enterica a Lactobacillus. Častice boli fixované v 2,5 % glutaraldehyde, 1,25 % paraformaldehyde a 0,03 % kyseline pikrovej v 0,1 M pufri kakodylátu sodného (pH 7,4) počas 2 hodín pri izbovej teplote. Po premytí bola vykonaná dodatočná fixácia s 1 % oxidom osmia (OsO4)/1,5 % ferokyanidom draselným (KFeCN6) počas 2 hodín, 3-krát premytie vo vode a inkubácia v 1 % uranylacetátu počas 1 hodiny, potom dvakrát premytie vo vode a následne dehydratácia počas 10 minút v 50 %, 70 %, 90 % a 100 % alkohole. Vzorky boli potom umiestnené na 1 hodinu do propylénoxidu a impregnované zmesou propylénoxidu a TAAP Eponu v pomere 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Vzorky boli zaliate do TAAB Eponu a polymerizované pri teplote 60 °C počas 48 hodín. Vytvrdená granulovaná živica bola narezaná a vizualizovaná pomocou TEM s použitím konvenčného transmisného elektrónového mikroskopu JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japonsko) vybaveného CCD kamerou AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Všetky experimenty boli vykonané v troch opakovaniach. Pre každý časový bod boli bakteriálne výplachy vysiate v troch opakovaniach, čo viedlo k celkovému počtu deviatich dátových bodov na bod, ktorých priemer bol použitý ako bakteriálna koncentrácia pre daný mikroorganizmus. Štandardná odchýlka bola použitá ako chyba merania. Počítajú sa všetky body.
Logaritmus poklesu koncentrácie baktérií v porovnaní s t = 0 min bol vypočítaný pomocou nasledujúceho vzorca:
kde C0 je koncentrácia baktérií v kontrolnej vzorke v čase 0 (t. j. po vysušení povrchu, ale pred umiestnením do komory) a Cn je koncentrácia baktérií na povrchu po n minútach expozície.
Aby sa zohľadnila prirodzená degradácia baktérií počas 45-minútovej expozície, logaritmické zníženie v porovnaní s kontrolnou skupinou po 45 minútach sa vypočítalo aj takto:
kde Cn je koncentrácia baktérií v kontrolnej vzorke v čase n a Cn-Control je koncentrácia kontrolných baktérií v čase n. Údaje sú prezentované ako logaritmické zníženie v porovnaní s kontrolnou skupinou (bez expozície EWNS).
Počas štúdie bolo hodnotených niekoľko kombinácií napätia a vzdialenosti medzi ihlou a protielektródou z hľadiska tvorby Taylorovho kužeľa, stability Taylorovho kužeľa, stability produkcie EWNS a reprodukovateľnosti. Rôzne kombinácie sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1. Pre komplexnú štúdiu boli vybrané dva prípady vykazujúce stabilné a reprodukovateľné vlastnosti (Taylorov kužeľ, tvorba EWNS a stabilita v čase). Obrázok 3 zobrazuje výsledky pre náboj, veľkosť a obsah ROS v oboch prípadoch. Výsledky sú tiež uvedené v tabuľke 1. Pre porovnanie, obrázok 3 aj tabuľka 1 zahŕňajú vlastnosti predtým syntetizovaných neoptimalizovaných EWNS8, 9, 10, 11 (základný EWNS). Výpočty štatistickej významnosti s použitím obojstranného t-testu sú znovu publikované v doplnkovej tabuľke S2. Okrem toho ďalšie údaje zahŕňajú štúdie vplyvu priemeru vzorkovacieho otvoru protielektródy (D) a vzdialenosti medzi uzemňovacou elektródou a hrotom (L) (doplnkové obrázky S2 a S3).
(ac) Rozloženie veľkosti merané pomocou AFM. (df) Charakteristika povrchového náboja. (g) Charakterizácia ROS EPR.
Je tiež dôležité poznamenať, že pre všetky vyššie uvedené podmienky bol nameraný ionizačný prúd medzi 2 a 6 μA a napätie medzi -3,8 a -6,5 kV, čo malo za následok spotrebu energie menej ako 50 mW pre tento jediný kontaktný modul generácie EWNS. Hoci bol EWNS syntetizovaný za vysokého tlaku, hladiny ozónu boli veľmi nízke a nikdy nepresiahli 60 ppb.
Doplnkový obrázok S4 zobrazuje simulované elektrické polia pre scenáre [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm]. Pre scenáre [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] sú výpočty poľa 2 × 10⁶ V/m a 4,7 × 10⁶ V/m. To sa očakáva, pretože v druhom prípade je pomer napätia a vzdialenosti oveľa vyšší.
Na obr. 3a,b je znázornený priemer EWNS meraný pomocou AFM8. Vypočítané priemerné priemery EWNS boli 27 nm a 19 nm pre schémy [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm]. Pre scenáre [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] sú geometrické štandardné odchýlky rozdelení 1,41 a 1,45, čo naznačuje úzke rozdelenie veľkosti. Priemerná veľkosť aj geometrická štandardná odchýlka sú veľmi blízke základnej hodnote EWNS, a to 25 nm a 1,41. Na obr. 3c je znázornené rozdelenie veľkosti základného EWNS meraného rovnakou metódou za rovnakých podmienok.
Na obr. 3d,e sú znázornené výsledky charakterizácie náboja. Údaje predstavujú priemerné merania z 30 simultánnych meraní koncentrácie (#/cm3) a prúdu (I). Analýza ukazuje, že priemerný náboj na EWNS je 22 ± 6 e- a 44 ± 6 e- pre [-6,5 kV, 4,0 cm] a [-3,8 kV, 0,5 cm] v uvedenom poradí. Majú výrazne vyššie povrchové náboje v porovnaní so základným EWNS (10 ± 2 e-), dvakrát väčšie ako v scenári [-6,5 kV, 4,0 cm] a štyrikrát väčšie ako v scenári [-3,8 kV, 0,5 cm]. Obrázok 3f zobrazuje údaje o náboji pre základný EWNS.
Z koncentračných máp čísla EWNS (doplnkové obrázky S5 a S6) je zrejmé, že scenár [-6,5 kV, 4,0 cm] má výrazne viac častíc ako scenár [-3,8 kV, 0,5 cm]. Za zmienku tiež stojí, že koncentrácia čísla EWNS bola monitorovaná až 4 hodiny (doplnkové obrázky S5 a S6), pričom stabilita generácie EWNS vykazovala v oboch prípadoch rovnaké úrovne koncentrácie počtu častíc.
Na obr. 3g je znázornené EPR spektrum po odčítaní optimalizovanej kontroly EWNS (pozadie) pri [-6,5 kV, 4,0 cm]. ROS spektrá boli tiež porovnané so scenárom Baseline-EWNS v predtým publikovanej práci. Počet EWNS reagujúcich so spinovými pascami bol vypočítaný na 7,5 × 104 EWNS/s, čo je podobné predtým publikovanému Baseline-EWNS8. EPR spektrá jasne ukázali prítomnosť dvoch typov ROS, pričom O2- bol prevládajúcim druhom a OH• bol menej hojný. Okrem toho priame porovnanie intenzít píkov ukázalo, že optimalizované EWNS mali výrazne vyšší obsah ROS v porovnaní so základným scenárom EWNS.
Na obr. 4 je znázornená účinnosť depozície EWNS v EPES. Údaje sú tiež zhrnuté v tabuľke I a porovnané s pôvodnými údajmi EWNS. V oboch prípadoch EUNS je depozícia blízka 100 % aj pri nízkom napätí 3,0 kV. Typicky je 3,0 kV dostatočné na 100 % depozíciu bez ohľadu na zmenu povrchového náboja. Za rovnakých podmienok bola účinnosť depozície Baseline-EWNS iba 56 % kvôli ich nižšiemu náboju (priemerne 10 elektrónov na EWNS).
Na obr. 5 a v tabuľke 2 je zhrnutá hodnota inaktivácie mikroorganizmov naočkovaných na povrchu paradajok po expozícii približne 40 000 #/cm3 EWNS počas 45 minút v optimálnom režime [-6,5 kV, 4,0 cm]. Inokulované E. coli a Lactobacillus innocuous vykazovali významný pokles o 3,8 logaritmu počas 45-minútovej expozície. Za rovnakých podmienok mala S. enterica pokles o 2,2 logaritmu, zatiaľ čo S. cerevisiae a M. parafortutum pokles o 1,0 logaritmu.
Elektrónové mikrofotografie (obrázok 6) zobrazujú fyzikálne zmeny vyvolané EWNS na neškodných bunkách Escherichia coli, Streptococcus a Lactobacillus, ktoré viedli k ich inaktivácii. Kontrolné baktérie mali neporušené bunkové membrány, zatiaľ čo exponované baktérie mali poškodené vonkajšie membrány.
Elektrónovo-mikroskopické zobrazenie kontrolných a exponovaných baktérií odhalilo poškodenie membrány.
Údaje o fyzikálno-chemických vlastnostiach optimalizovaných EWNS spoločne ukazujú, že vlastnosti (povrchový náboj a obsah ROS) EWNS sa výrazne zlepšili v porovnaní s predtým publikovanými základnými údajmi EWNS8,9,10,11. Na druhej strane, ich veľkosť zostala v nanometrovom rozsahu, čo je veľmi podobné výsledkom publikovaným predtým, čo im umožňuje zostať vo vzduchu dlhší čas. Pozorovanú polydisperzitu možno vysvetliť zmenami povrchového náboja, ktoré určujú veľkosť EWNS, náhodnosťou Rayleighovho efektu a potenciálnou koalescenciou. Ako však podrobne uviedli Nielsen a kol.22, vysoký povrchový náboj znižuje odparovanie účinným zvýšením povrchovej energie/napätia kvapky vody. V našej predchádzajúcej publikácii8 bola táto teória experimentálne potvrdená pre mikrokvapky22 a EWNS. Strata náboja počas času môže tiež ovplyvniť veľkosť a prispieť k pozorovanému rozloženiu veľkosti.