Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Въртележка, показваща три слайда едновременно.Използвайте бутоните Предишен и Следващ, за да преминете през три слайда наведнъж, или използвайте бутоните на плъзгача в края, за да преминете през три слайда наведнъж.
Наскоро беше разработена антимикробна платформа без химикали, базирана на нанотехнологии, използващи изкуствени водни наноструктури (EWNS).EWNS имат висок повърхностен заряд и са наситени с реактивни кислородни видове (ROS), които могат да взаимодействат и да инактивират редица микроорганизми, включително хранителни патогени.Тук е показано, че техните свойства по време на синтеза могат да бъдат фино настроени и оптимизирани, за да подобрят допълнително техния антибактериален потенциал.Лабораторната платформа EWNS е проектирана за фина настройка на свойствата на EWNS чрез промяна на параметрите на синтеза.Характеризиране на свойствата на EWNS (заряд, размер и съдържание на ROS) с помощта на съвременни аналитични методи.В допълнение, те бяха оценени за техния микробен инактивиращ потенциал срещу хранителни микроорганизми като Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum и Saccharomyces cerevisiae.Представените тук резултати показват, че свойствата на EWNS могат да бъдат фино настроени по време на синтез, което води до експоненциално увеличение на ефективността на инактивиране.По-специално, повърхностният заряд се увеличава с фактор четири и реактивните кислородни видове се увеличават.Степента на отстраняване на микробите е микробно зависима и варира от 1,0 до 3,8 log след 45-минутно излагане на аерозолна доза от 40 000 #/cc EWNS.
Микробното замърсяване е основната причина за хранителни заболявания, причинени от поглъщането на патогени или техните токсини.Само в Съединените щати хранителните заболявания причиняват около 76 милиона заболявания, 325 000 приема в болница и 5 000 смъртни случая всяка година1.В допълнение, Министерството на земеделието на Съединените щати (USDA) изчислява, че повишената консумация на пресни продукти е причина за 48% от всички докладвани заболявания, причинени от храна в Съединените щати2.Разходите за болести и смърт, причинени от хранителни патогени в Съединените щати, са много високи, оценени от Центровете за контрол и превенция на заболяванията (CDC) на повече от 15,6 милиарда щатски долара годишно3.
Понастоящем химически4, радиационни5 и термични6 антимикробни интервенции за осигуряване на безопасността на храните се извършват предимно в ограничени критични контролни точки (CCP) по производствената верига (обикновено след прибиране на реколтата и/или по време на опаковането), а не непрекъснато.по този начин те са склонни към кръстосано замърсяване.7. По-добрият контрол на болестите, пренасяни с храни, и развалянето на храни изисква антимикробни интервенции, които потенциално могат да бъдат приложени в континуума от фермата до масата, като същевременно намаляват въздействието върху околната среда и разходите.
Наскоро беше разработена антимикробна платформа без химикали, базирана на нанотехнологии, която може да инактивира повърхностни и въздушни бактерии, използвайки изкуствени водни наноструктури (EWNS).EWNS беше синтезиран с помощта на два паралелни процеса, електроспрей и водна йонизация (фиг. 1а).Предишни проучвания показват, че EWNS имат уникален набор от физични и биологични свойства8,9,10.EWNS имат средно 10 електрона на структура и среден наномащабен размер от 25 nm (фиг. 1b, c) 8,9,10.В допълнение, електронният спинов резонанс (ESR) показа, че EWNS съдържа голямо количество реактивни кислородни видове (ROS), главно хидроксилни (OH•) и супероксидни (O2-) радикали (Фиг. 1c)8.EVNS е във въздуха за дълго време и може да се сблъска с микроорганизми, суспендирани във въздуха и присъстващи на повърхността, доставяйки техния ROS полезен товар и причинявайки инактивиране на микроорганизми (фиг. 1d).Тези ранни проучвания също така показаха, че EWNS може да взаимодейства и да инактивира различни грам-отрицателни и грам-положителни бактерии, включително микобактерии, на повърхности и във въздуха.Трансмисионната електронна микроскопия показа, че инактивирането е причинено от разрушаване на клетъчната мембрана.В допълнение, проучвания за остра инхалация показват, че високите дози EWNS не причиняват белодробно увреждане или възпаление 8 .
(a) Електроспрей възниква, когато се приложи високо напрежение между капилярна тръба, съдържаща течност, и противоположния електрод.(b) Прилагането на високо налягане води до два различни явления: (i) електроразпръскване на вода и (ii) образуване на реактивни кислородни видове (йони), уловени в EWNS.(c) Уникалната структура на EWNS.(d) Поради техния наномащабен характер, EWNS са силно мобилни и могат да взаимодействат с въздушни патогени.
Наскоро беше демонстрирана и способността на антимикробната платформа EWNS да инактивира хранителни микроорганизми на повърхността на прясна храна.Доказано е също, че повърхностният заряд на EWNS в комбинация с електрическо поле може да се използва за постигане на целева доставка.Нещо повече, предварителните резултати за органични домати след 90-минутно излагане на EWNS от около 50 000 #/cm3 бяха окуражаващи, като бяха наблюдавани различни хранителни микроорганизми като Е. coli и Listeria 11.В допълнение, предварителните органолептични тестове не показват сензорни ефекти в сравнение с контролните домати.Въпреки че тези първоначални резултати от инактивирането са окуражаващи за приложения за безопасност на храните дори при много ниски дози EWNS от 50 000 #/cc.вижте, ясно е, че по-висок потенциал за инактивиране би бил по-полезен за допълнително намаляване на риска от инфекция и разваляне.
Тук ще фокусираме нашето изследване върху разработването на платформа за генериране на EWNS, за да позволим фина настройка на параметрите на синтеза и оптимизиране на физикохимичните свойства на EWNS, за да подобрим техния антибактериален потенциал.По-специално, оптимизацията се фокусира върху увеличаване на техния повърхностен заряд (за подобряване на целевата доставка) и съдържанието на ROS (за подобряване на ефективността на инактивиране).Характеризирайте оптимизираните физико-химични свойства (размер, заряд и съдържание на ROS), като използвате съвременни аналитични методи и използвайте обикновени хранителни микроорганизми като E. .
EVNS се синтезира чрез едновременно електроразпръскване и йонизация на вода с висока чистота (18 MΩ cm–1).Електрическият пулверизатор 12 обикновено се използва за пулверизиране на течности и синтез на полимерни и керамични частици 13 и влакна 14 с контролиран размер.
Както е описано подробно в предишни публикации 8, 9, 10, 11, в типичен експеримент беше приложено високо напрежение между метална капилярка и заземен противоположен електрод.По време на този процес възникват две различни явления: i) електроспрей и ii) йонизация на водата.Силно електрическо поле между двата електрода предизвиква натрупване на отрицателни заряди на повърхността на кондензираната вода, което води до образуването на конуси на Тейлър.В резултат на това се образуват силно заредени водни капки, които продължават да се разпадат на по-малки частици, както в теорията на Rayleigh16.В същото време силните електрически полета карат някои водни молекули да се разделят и отделят електрони (йонизират), което води до образуването на голямо количество реактивни кислородни видове (ROS)17.Едновременно генерираният ROS18 беше капсулиран в EWNS (фиг. 1в).
На фиг.2а показва системата за генериране на EWNS, разработена и използвана в синтеза на EWNS в това изследване.Пречистената вода, съхранявана в затворена бутилка, се подава през тефлонова тръба (2 mm вътрешен диаметър) в игла от неръждаема стомана 30G (метална капилярка).Потокът на водата се контролира от налягането на въздуха вътре в бутилката, както е показано на фигура 2b.Иглата е монтирана на тефлонова конзола и може ръчно да се регулира на определено разстояние от контра електрода.Противоположният електрод е полиран алуминиев диск с отвор в центъра за вземане на проби.Под противоположния електрод има алуминиева фуния за вземане на проби, която е свързана с останалата част от експерименталната настройка чрез порт за вземане на проби (фиг. 2b).За да се избегне натрупването на заряд, което може да наруши работата на пробовземателя, всички компоненти на пробовземателя са електрически заземени.
(a) Система за генериране на инженерна водна наноструктура (EWNS).(b) Напречно сечение на пробовземера и електроспрей, показващо най-важните параметри.( c ) Експериментална настройка за инактивиране на бактерии.
Системата за генериране на EWNS, описана по-горе, е способна да променя ключови работни параметри, за да улесни фината настройка на свойствата на EWNS.Регулирайте приложеното напрежение (V), разстоянието между иглата и противоположния електрод (L) и водния поток (φ) през капиляра, за да настроите фино характеристиките на EWNS.Символ, използван за представяне на различни комбинации: [V (kV), L (cm)].Регулирайте водния поток, за да получите стабилен конус на Тейлър с определен набор [V, L].За целите на това изследване диаметърът на отвора на противоположния електрод (D) се поддържа на 0,5 инча (1,29 cm).
Поради ограничената геометрия и асиметрия, силата на електрическото поле не може да бъде изчислена от първите принципи.Вместо това софтуерът QuickField™ (Svendborg, Дания)19 беше използван за изчисляване на електрическото поле.Електрическото поле не е еднородно, така че стойността на електрическото поле на върха на капиляра беше използвана като референтна стойност за различни конфигурации.
По време на изследването бяха оценени няколко комбинации от напрежение и разстояние между иглата и противоположния електрод по отношение на формирането на конуса на Тейлър, стабилността на конуса на Тейлър, стабилността на производството на EWNS и възпроизводимостта.Различни комбинации са показани в допълнителна таблица S1.
Изходът на системата за генериране на EWNS беше свързан директно към анализатор на размера на частиците със сканираща подвижност (SMPS, модел 3936, TSI, Shoreview, MN) за измерване на концентрацията на броя на частиците, както и към аерозолен фарадеев електрометър (TSI, модел 3068B, Shoreview, MN).) за аерозолни течения се измерва, както е описано в нашата предишна публикация.Както SMPS, така и аерозолният електрометър са взети проби при дебит от 0,5 L/min (общ поток на пробата 1 L/min).Бройната концентрация на частиците и аерозолният поток се измерват за 120 секунди.Измерването се повтаря 30 пъти.Въз основа на текущите измервания се изчислява общият аерозолен заряд и се изчислява средният заряд на EWNS за даден общ брой избрани частици EWNS.Средната цена на EWNS може да се изчисли с помощта на уравнение (1):
където IEl е измереният ток, NSMPS е цифровата концентрация, измерена с SMPS, а φEl е дебитът на електрометър.
Тъй като относителната влажност (RH) влияе върху повърхностния заряд, температурата и (RH) се поддържат постоянни по време на експеримента съответно при 21°C и 45%.
Микроскопия с атомна сила (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Санта Барбара, Калифорния) и сонда AC260T (Olympus, Токио, Япония) бяха използвани за измерване на размера и живота на EWNS.Честотата на сканиране на AFM беше 1 Hz, областта на сканиране беше 5 μm × 5 μm и 256 сканиращи линии.Всички изображения бяха подложени на подравняване на изображения от 1-ви ред с помощта на софтуер Asylum (обхват на маската 100 nm, праг 100 pm).
Тестовата фуния се отстранява и повърхността на слюдата се поставя на разстояние 2,0 cm от противоположния електрод за време на осредняване от 120 s, за да се избегне агломерация на частици и образуване на неправилни капчици върху повърхността на слюда.EWNS се напръсква директно върху повърхността на прясно нарязана слюда (Ted Pella, Redding, CA).Изображение на повърхността на слюда веднага след AFM разпръскване.Контактният ъгъл на повърхността на прясно изрязана немодифицирана слюда е близо до 0 °, така че EVNS се разпределя върху повърхността на слюдата под формата на купол.Диаметърът (a) и височината (h) на дифузиращите капчици бяха измерени директно от топографията на AFM и използвани за изчисляване на куполообразния дифузионен обем на EWNS, използвайки нашия предварително валидиран метод.Ако приемем, че бордовият EWNS има същия обем, еквивалентният диаметър може да се изчисли с помощта на уравнение (2):
Въз основа на нашия предварително разработен метод беше използван спинов капан за електронен спинов резонанс (ESR) за откриване на присъствието на краткотрайни радикални междинни съединения в EWNS.Аерозолите се барботират през 650 μm Midget sparger (Ace Glass, Vineland, NJ), съдържащ 235 mM разтвор на DEPMPO (5-(диетоксифосфорил)-5-метил-1-пиролин-N-оксид) (Oxis International Inc.).Портланд, Орегон).Всички измервания на ESR бяха извършени с помощта на спектрометър Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, САЩ) и клетка с плосък панел.Софтуерът Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, САЩ) беше използван за събиране и анализ на данните.Определянето на характеристиките на ROS е извършено само за набор от работни условия [-6,5 kV, 4,0 cm].Концентрациите на EWNS бяха измерени с помощта на SMPS след отчитане на загубите на EWNS в удрящия елемент.
Нивата на озон бяха наблюдавани с помощта на 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
За всички свойства на EWNS средната стойност се използва като стойност на измерване, а стандартното отклонение се използва като грешка на измерване.Бяха проведени T-тестове за сравняване на стойностите на оптимизираните EWNS атрибути със съответните стойности на базовия EWNS.
Фигура 2в показва предварително разработена и характеризирана електростатична преципитационна (EPES) система за „изтегляне“, която може да се използва за целенасочена доставка на EWNS на повърхността.EPES използва заряди EVNS, които могат да бъдат „насочени“ директно към повърхността на целта под въздействието на силно електрическо поле.Подробности за системата EPES са представени в скорошна публикация на Pyrgiotakis et al.11.Така EPES се състои от 3D отпечатана PVC камера със заострени краища и съдържа две успоредни метални плочи от неръждаема стомана (304 неръждаема стомана, огледално покритие) в центъра на 15,24 cm една от друга.Платките бяха свързани към външен източник на високо напрежение (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), долната плоча винаги беше свързана към положително напрежение, а горната плоча винаги беше свързана към земята (плаваща земя).Стените на камерата са покрити с алуминиево фолио, което е електрически заземено, за да се предотврати загубата на частици.Камерата има запечатана предна врата за зареждане, която позволява тестовите повърхности да бъдат поставени върху пластмасови стойки, които ги повдигат над долната метална плоча, за да се избегнат смущения при високо напрежение.
Ефективността на отлагане на EWNS в EPES беше изчислена съгласно предварително разработен протокол, подробно описан в допълнителна фигура S111.
Като контролна камера, втора цилиндрична проточна камера беше свързана последователно към системата EPES, в която беше използван междинен HEPA филтър за отстраняване на EWNS.Както е показано на фигура 2c, EWNS аерозолът се изпомпва през две вградени камери.Филтърът между контролната зала и EPES премахва всички останали EWNS, което води до същата температура (T), относителна влажност (RH) и нива на озон.
Установено е, че важни хранителни микроорганизми замърсяват пресни храни като E. coli (ATCC #27325), фекален индикатор, Salmonella enterica (ATCC #53647), хранителен патоген, безвредна Listeria (ATCC #33090), заместител на патогенна Listeria monocytogenes, получена от ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC # 4098), заместител на маята за разваляне и по-устойчива инактивирана бактерия Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Купете произволни кутии с органични гроздови домати от местния пазар и ги съхранявайте в хладилник при 4°C до употреба (до 3 дни).Всички експериментални домати бяха с еднакъв размер, около 1/2 инча в диаметър.
Протоколите за култура, инокулация, експозиция и преброяване на колониите са описани подробно в предишната ни публикация и подробно в допълнителните данни.Ефективността на EWNS беше оценена чрез излагане на инокулираните домати на 40 000 #/cm3 за 45 минути.Накратко, три домата бяха използвани за оценка на оцелелите микроорганизми в момент t = 0 минути.Три домата бяха поставени в EPES и бяха изложени на EWNS при 40 000 #/cc (домати, изложени на EWNS), а останалите три бяха поставени в контролната камера (контролни домати).Допълнителна обработка на домати и в двете групи не е извършена.Експонираните на EWNS домати и контролните домати бяха отстранени след 45 минути, за да се оцени ефектът на EWNS.
Всеки експеримент се провежда в три екземпляра.Анализът на данните беше извършен съгласно протокола, описан в Допълнителни данни.
Механизмите на инактивиране бяха оценени чрез утаяване на експонирани EWNS проби (45 минути при 40 000 #/cm3 EWNS аерозолна концентрация) и необлъчени проби от безвредни бактерии E. coli, Salmonella enterica и Lactobacillus.Частиците се фиксират в 2.5% глутаралдехид, 1.25% параформалдехид и 0.03% пикринова киселина в 0.1 М натриев какодилатен буфер (рН 7.4) в продължение на 2 часа при стайна температура.След промиване фиксирайте с 1% осмиев тетроксид (OsO4)/1,5% калиев фероцианид (KFeCN6) за 2 часа, промийте 3 пъти с вода и инкубирайте в 1% уранил ацетат за 1 час, след това измийте два пъти с вода, след това дехидратирайте за 10 минути в 50%, 70%, 90%, 100% алкохол.След това пробите се поставят в пропилей оксид за 1 час и се импрегнират със смес 1:1 от пропилей оксид и TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, СА).Пробите се поставят в TAAB Epon и се полимеризират при 60°C в продължение на 48 часа.Втвърдената гранулирана смола се нарязва и визуализира от ТЕМ с помощта на конвенционален трансмисионен електронен микроскоп JEOL 1200EX (JEOL, Токио, Япония), оборудван с AMT 2k CCD камера (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Масачузетс, САЩ).
Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра.За всяка времева точка бактериалните промивки се посяват в три екземпляра, което води до общо девет точки от данни на точка, средната от които се използва като бактериална концентрация за този конкретен микроорганизъм.Стандартното отклонение беше използвано като грешка при измерване.Всички точки се броят.
Логаритъмът на намаляването на концентрацията на бактерии в сравнение с t = 0 min се изчислява по следната формула:
където C0 е концентрацията на бактерии в контролната проба в момент 0 (т.е. след като повърхността е изсъхнала, но преди да бъде поставена в камерата), а Cn е концентрацията на бактерии на повърхността след n минути експозиция.
За да се отчете естественото разграждане на бактериите по време на 45-минутното излагане, логаритмичното намаление в сравнение с контролата след 45 минути също беше изчислено, както следва:
където Cn е концентрацията на бактерии в контролната проба в момент n и Cn-контрол е концентрацията на контролни бактерии в момент n.Данните са представени като log намаление в сравнение с контролата (без експозиция на EWNS).
По време на изследването бяха оценени няколко комбинации от напрежение и разстояние между иглата и противоположния електрод по отношение на формирането на конуса на Тейлър, стабилността на конуса на Тейлър, стабилността на производството на EWNS и възпроизводимостта.Различни комбинации са показани в допълнителна таблица S1.Два случая, показващи стабилни и възпроизводими свойства (конус на Тейлър, генериране на EWNS и стабилност във времето), бяха избрани за цялостно проучване.На фиг.Фигура 3 показва резултатите за заряда, размера и съдържанието на ROS и в двата случая.Резултатите са показани също в таблица 1. За справка, както фигура 3, така и таблица 1 включват свойствата на предишния синтезиран неоптимизиран EWNS8, 9, 10, 11 (базова линия-EWNS).Изчисленията на статистическата значимост с помощта на двустранен t-тест са публикувани отново в допълнителна таблица S2.В допълнение, допълнителните данни включват изследвания на ефекта от диаметъра на отвора за вземане на проби от противоелектрода (D) и разстоянието между заземяващия електрод и върха (L) (допълнителни фигури S2 и S3).
( ac ) Разпределение на размера, измерено чрез AFM.(df) Характеристика на повърхностния заряд.ж) ROS характеристика на EPR.
Също така е важно да се отбележи, че за всички горепосочени условия, измереният йонизационен ток е между 2 и 6 μA и напрежение между -3,8 и -6,5 kV, което води до консумация на енергия от по-малко от 50 mW за този единичен контактен модул за генериране на EWNS.Въпреки че EWNS беше синтезиран под високо налягане, нивата на озон бяха много ниски, никога не надвишаващи 60 ppb.
Допълнителна фигура S4 показва симулираните електрически полета съответно за сценариите [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm].За сценариите [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm] изчисленията на полето са съответно 2 × 105 V/m и 4,7 × 105 V/m.Това се очаква, тъй като във втория случай съотношението напрежение-разстояние е много по-високо.
На фиг.3a, b показва диаметъра на EWNS, измерен с AFM8.Изчислените средни диаметри на EWNS бяха 27 nm и 19 nm за схемите [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm], съответно.За сценариите [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm], геометричните стандартни отклонения на разпределенията са съответно 1,41 и 1,45, което показва тясно разпределение на размера.Както средният размер, така и геометричното стандартно отклонение са много близки до базовата линия EWNS, съответно при 25 nm и 1,41.На фиг.3в показва разпределението на размера на основния EWNS, измерено с помощта на същия метод при същите условия.
На фиг.3d,e показва резултатите от характеризирането на заряда.Данните са средни измервания от 30 едновременни измервания на концентрация (#/cm3) и ток (I).Анализът показва, че средният заряд на EWNS е 22 ± 6 e- и 44 ± 6 e- за [-6,5 kV, 4,0 cm] и [-3,8 kV, 0,5 cm], съответно.Те имат значително по-високи повърхностни заряди в сравнение с изходния EWNS (10 ± 2 e-), два пъти по-висок от сценария [-6,5 kV, 4,0 cm] и четири пъти по-голям от [-3,8 kV, 0,5 cm].Фигура 3f показва заряда.данни за Baseline-EWNS.
От картите на концентрацията на EWNS числото (допълнителни фигури S5 и S6) може да се види, че сценарият [-6,5 kV, 4,0 cm] има значително повече частици от сценария [-3,8 kV, 0,5 cm].Също така си струва да се отбележи, че концентрацията на броя на EWNS се наблюдава до 4 часа (допълнителни фигури S5 и S6), където стабилността на генериране на EWNS показва същите нива на концентрация на броя на частиците и в двата случая.
На фиг.3g показва EPR спектъра след изваждане на оптимизирания EWNS контрол (фон) при [-6,5 kV, 4,0 cm].ROS спектрите също бяха сравнени със сценария Baseline-EWNS в предишна публикувана работа.Броят на EWNS, реагиращи със спинови капани, беше изчислен на 7, 5 × 104 EWNS / s, което е подобно на публикувания по-рано Baseline-EWNS8.EPR спектрите ясно показват наличието на два вида ROS, като O2- е преобладаващият вид и OH• е по-малко изобилен.В допълнение, директно сравнение на пиковите интензитети показа, че оптимизираният EWNS има значително по-високо съдържание на ROS в сравнение с базовия EWNS.
На фиг.4 показва ефективността на отлагане на EWNS в EPES.Данните също са обобщени в таблица I и са сравнени с оригиналните данни на EWNS.И за двата случая на EUNS отлагането е близо до 100% дори при ниско напрежение от 3,0 kV.Обикновено 3,0 kV е достатъчно за 100% отлагане, независимо от промяната на повърхностния заряд.При същите условия ефективността на отлагане на Baseline-EWNS е само 56% поради по-ниския им заряд (средно 10 електрона на EWNS).
На фиг.5 и в табл.2 обобщава стойността на инактивиране на микроорганизми, инокулирани върху повърхността на домати след излагане на около 40 000 #/cm3 EWNS за 45 минути при оптимален режим [-6,5 kV, 4,0 cm].Инокулирани E. coli и Lactobacillus innocuous показват значително намаление от 3,8 log по време на 45-минутното излагане.При същите условия S. enterica има намаление от 2,2 log, докато S. cerevisiae и M. parafortutum имат намаление от 1,0 log.
Електронните микрографии (Фигура 6) изобразяват физическите промени, предизвикани от EWNS върху безвредните клетки на Escherichia coli, Streptococcus и Lactobacillus, водещи до тяхното инактивиране.Контролните бактерии имат непокътнати клетъчни мембрани, докато експонираните бактерии имат увредени външни мембрани.
Електронно-микроскопското изобразяване на контролни и експонирани бактерии разкрива увреждане на мембраната.
Данните за физикохимичните свойства на оптимизирания EWNS колективно показват, че свойствата (повърхностен заряд и съдържание на ROS) на EWNS са значително подобрени в сравнение с публикуваните по-рано базови данни за EWNS8,9,10,11.От друга страна, техният размер остава в нанометровия диапазон, много подобен на резултатите, докладвани по-рано, което им позволява да останат във въздуха за дълги периоди от време.Наблюдаваната полидисперсност може да се обясни с промени в повърхностния заряд, които определят размера на EWNS, произволността на ефекта на Rayleigh и потенциалната коалесценция.Въпреки това, както е описано подробно от Nielsen et al.22, високият повърхностен заряд намалява изпарението чрез ефективно увеличаване на повърхностната енергия/напрежението на водната капка.В предишната ни публикация8 тази теория беше експериментално потвърдена за микрокапки 22 и EWNS.Загубата на заряд по време на извънреден труд също може да повлияе на размера и да допринесе за наблюдаваното разпределение на размера.