Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan CSS yang terbatas. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang lebih baru (atau menonaktifkan Mode Kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Carousel yang menampilkan tiga slide sekaligus. Gunakan tombol Sebelumnya dan Berikutnya untuk berpindah antar tiga slide sekaligus, atau gunakan tombol penggeser di bagian akhir untuk berpindah antar tiga slide sekaligus.
Baru-baru ini, platform antimikroba bebas bahan kimia berbasis nanoteknologi menggunakan nanostruktur air buatan (EWNS) telah dikembangkan. EWNS memiliki muatan permukaan yang tinggi dan jenuh dengan spesies oksigen reaktif (ROS) yang dapat berinteraksi dengan dan menonaktifkan sejumlah mikroorganisme, termasuk patogen bawaan makanan. Di sini ditunjukkan bahwa sifat-sifatnya selama sintesis dapat disesuaikan dan dioptimalkan untuk lebih meningkatkan potensi antibakterinya. Platform laboratorium EWNS dirancang untuk menyesuaikan sifat-sifat EWNS dengan mengubah parameter sintesis. Karakterisasi sifat-sifat EWNS (muatan, ukuran, dan kandungan ROS) dilakukan menggunakan metode analitik modern. Selain itu, potensi inaktivasi mikroba terhadap mikroorganisme bawaan makanan seperti Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum, dan Saccharomyces cerevisiae juga dievaluasi. Hasil yang disajikan di sini menunjukkan bahwa sifat-sifat EWNS dapat disesuaikan selama sintesis, menghasilkan peningkatan efisiensi inaktivasi secara eksponensial. Secara khusus, muatan permukaan meningkat empat kali lipat dan spesies oksigen reaktif meningkat. Tingkat penghilangan mikroba bergantung pada jenis mikroba dan berkisar antara 1,0 hingga 3,8 log setelah paparan selama 45 menit terhadap dosis aerosol 40.000 #/cc EWNS.
Kontaminasi mikroba adalah penyebab utama penyakit bawaan makanan yang disebabkan oleh konsumsi patogen atau toksinnya. Di Amerika Serikat saja, penyakit bawaan makanan menyebabkan sekitar 76 juta kasus penyakit, 325.000 rawat inap, dan 5.000 kematian setiap tahunnya¹. Selain itu, Departemen Pertanian Amerika Serikat (USDA) memperkirakan bahwa peningkatan konsumsi produk segar bertanggung jawab atas 48% dari semua kasus penyakit bawaan makanan yang dilaporkan di Amerika Serikat². Biaya penyakit dan kematian yang disebabkan oleh patogen bawaan makanan di Amerika Serikat sangat tinggi, diperkirakan oleh Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit (CDC) lebih dari US$15,6 miliar per tahun³.
Saat ini, intervensi antimikroba kimia4, radiasi5 dan termal6 untuk memastikan keamanan pangan sebagian besar dilakukan pada titik kontrol kritis (CCP) yang terbatas di sepanjang rantai produksi (biasanya setelah panen dan/atau selama pengemasan) daripada secara terus menerus. Dengan demikian, intervensi tersebut rentan terhadap kontaminasi silang. 7. Pengendalian yang lebih baik terhadap penyakit bawaan makanan dan pembusukan makanan membutuhkan intervensi antimikroba yang berpotensi dapat diterapkan di seluruh rantai produksi dari pertanian hingga meja makan, sekaligus mengurangi dampak lingkungan dan biaya.
Baru-baru ini, platform antimikroba berbasis nanoteknologi tanpa bahan kimia telah dikembangkan yang dapat menonaktifkan bakteri permukaan dan udara menggunakan nanostruktur air buatan (EWNS). EWNS disintesis menggunakan dua proses paralel, elektrospray dan ionisasi air (Gambar 1a). Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa EWNS memiliki serangkaian sifat fisik dan biologis yang unik8,9,10. EWNS memiliki rata-rata 10 elektron per struktur dan ukuran skala nano rata-rata 25 nm (Gambar 1b,c)8,9,10. Selain itu, resonansi spin elektron (ESR) menunjukkan bahwa EWNS mengandung sejumlah besar spesies oksigen reaktif (ROS), terutama radikal hidroksil (OH•) dan superoksida (O2-) (Gambar 1c)8. EWNS berada di udara dalam waktu lama dan dapat bertabrakan dengan mikroorganisme yang tersuspensi di udara dan yang ada di permukaan, melepaskan muatan ROS mereka dan menyebabkan inaktivasi mikroorganisme (Gambar 1d). Studi awal ini juga menunjukkan bahwa EWNS dapat berinteraksi dengan dan menonaktifkan berbagai bakteri gram-negatif dan gram-positif, termasuk mikobakteri, pada permukaan dan di udara. Mikroskop elektron transmisi menunjukkan bahwa penonaktifan tersebut disebabkan oleh gangguan membran sel. Selain itu, studi inhalasi akut menunjukkan bahwa dosis tinggi EWNS tidak menyebabkan kerusakan atau peradangan paru-paru 8.
(a) Elektrospray terjadi ketika tegangan tinggi diterapkan antara tabung kapiler berisi cairan dan elektroda lawan. (b) Penerapan tekanan tinggi menghasilkan dua fenomena berbeda: (i) elektrospray air dan (ii) pembentukan spesies oksigen reaktif (ion) yang terperangkap dalam EWNS. (c) Struktur unik EWNS. (d) Karena sifatnya yang berskala nano, EWNS sangat mudah bergerak dan dapat berinteraksi dengan patogen di udara.
Kemampuan platform antimikroba EWNS untuk menonaktifkan mikroorganisme penyebab penyakit bawaan makanan pada permukaan makanan segar juga baru-baru ini telah ditunjukkan. Telah juga ditunjukkan bahwa muatan permukaan EWNS yang dikombinasikan dengan medan listrik dapat digunakan untuk mencapai pengiriman yang ditargetkan. Lebih jauh lagi, hasil awal untuk tomat organik setelah paparan 90 menit pada EWNS sekitar 50.000 #/cm3 cukup menjanjikan, dengan berbagai mikroorganisme penyebab penyakit bawaan makanan seperti E. coli dan Listeria 11 teramati. Selain itu, uji organoleptik awal menunjukkan tidak ada efek sensorik dibandingkan dengan tomat kontrol. Meskipun hasil penonaktifan awal ini menjanjikan untuk aplikasi keamanan pangan bahkan pada dosis EWNS yang sangat rendah yaitu 50.000 #/cm3, jelas bahwa potensi penonaktifan yang lebih tinggi akan lebih bermanfaat untuk lebih mengurangi risiko infeksi dan pembusukan.
Di sini, kami akan memfokuskan penelitian kami pada pengembangan platform generasi EWNS untuk memungkinkan penyesuaian parameter sintesis dan optimasi sifat fisikokimia EWNS guna meningkatkan potensi antibakterinya. Secara khusus, optimasi difokuskan pada peningkatan muatan permukaan (untuk meningkatkan pengiriman yang ditargetkan) dan kandungan ROS (untuk meningkatkan efisiensi inaktivasi). Karakterisasi sifat fisikokimia yang dioptimalkan (ukuran, muatan, dan kandungan ROS) menggunakan metode analitik modern dan menggunakan mikroorganisme makanan umum seperti E. coli.
EVNS disintesis dengan penyemprotan elektro simultan dan ionisasi air dengan kemurnian tinggi (18 MΩ cm–1). Nebulizer listrik 12 biasanya digunakan untuk atomisasi cairan dan sintesis partikel polimer dan keramik 13 serta serat 14 dengan ukuran terkontrol.
Sebagaimana dijelaskan secara rinci dalam publikasi sebelumnya 8, 9, 10, 11, dalam percobaan tipikal, tegangan tinggi diterapkan antara kapiler logam dan elektroda lawan yang diarde. Selama proses ini, dua fenomena berbeda terjadi: i) elektrospray dan ii) ionisasi air. Medan listrik yang kuat antara kedua elektroda menyebabkan muatan negatif menumpuk di permukaan air yang terkondensasi, sehingga terbentuk kerucut Taylor. Akibatnya, tetesan air bermuatan tinggi terbentuk, yang terus pecah menjadi partikel yang lebih kecil, seperti dalam teori Rayleigh16. Pada saat yang sama, medan listrik yang kuat menyebabkan beberapa molekul air terpecah dan melepaskan elektron (mengionisasi), yang menyebabkan terbentuknya sejumlah besar spesies oksigen reaktif (ROS)17. ROS yang dihasilkan secara bersamaan18 dienkapsulasi dalam EWNS (Gambar 1c).
Gambar 2a menunjukkan sistem pembangkitan EWNS yang dikembangkan dan digunakan dalam sintesis EWNS pada penelitian ini. Air murni yang disimpan dalam botol tertutup dialirkan melalui tabung Teflon (diameter dalam 2 mm) ke dalam jarum baja tahan karat 30G (kapiler logam). Aliran air dikendalikan oleh tekanan udara di dalam botol, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b. Jarum dipasang pada konsol Teflon dan dapat disesuaikan secara manual ke jarak tertentu dari elektroda lawan. Elektroda lawan adalah cakram aluminium yang dipoles dengan lubang di tengah untuk pengambilan sampel. Di bawah elektroda lawan terdapat corong pengambilan sampel aluminium, yang terhubung ke bagian lain dari perangkat percobaan melalui port pengambilan sampel (Gambar 2b). Untuk menghindari penumpukan muatan yang dapat mengganggu pengoperasian alat pengambilan sampel, semua komponen alat pengambilan sampel dihubungkan ke ground listrik.
(a) Sistem Generasi Nanostruktur Air Rekayasa (EWNS). (b) Penampang alat pengambilan sampel dan elektrospray, menunjukkan parameter terpenting. (c) Susunan eksperimental untuk inaktivasi bakteri.
Sistem pembangkitan EWNS yang dijelaskan di atas mampu mengubah parameter operasi utama untuk memfasilitasi penyetelan halus sifat-sifat EWNS. Sesuaikan tegangan yang diterapkan (V), jarak antara jarum dan elektroda lawan (L), dan aliran air (φ) melalui kapiler untuk menyetel halus karakteristik EWNS. Simbol yang digunakan untuk mewakili kombinasi yang berbeda: [V (kV), L (cm)]. Sesuaikan aliran air untuk mendapatkan kerucut Taylor yang stabil dari set [V, L] tertentu. Untuk keperluan penelitian ini, diameter lubang elektroda lawan (D) dijaga pada 0,5 inci (1,29 cm).
Karena geometri dan asimetri yang terbatas, kekuatan medan listrik tidak dapat dihitung dari prinsip pertama. Sebagai gantinya, perangkat lunak QuickField™ (Svendborg, Denmark)19 digunakan untuk menghitung medan listrik. Medan listrik tidak seragam, sehingga nilai medan listrik di ujung kapiler digunakan sebagai nilai referensi untuk berbagai konfigurasi.
Selama penelitian, beberapa kombinasi tegangan dan jarak antara jarum dan elektroda lawan dievaluasi dalam hal pembentukan kerucut Taylor, stabilitas kerucut Taylor, stabilitas produksi EWNS, dan reproduktivitas. Berbagai kombinasi tersebut ditunjukkan pada Tabel Tambahan S1.
Output dari sistem pembangkitan EWNS dihubungkan langsung ke Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) untuk pengukuran konsentrasi jumlah partikel, serta ke Aerosol Faraday Electrometer (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN). Arus aerosol diukur seperti yang dijelaskan dalam publikasi kami sebelumnya. Baik SMPS maupun elektrometer aerosol mengambil sampel pada laju aliran 0,5 L/min (total aliran sampel 1 L/min). Konsentrasi jumlah partikel dan aliran aerosol diukur selama 120 detik. Pengukuran diulang 30 kali. Berdasarkan pengukuran arus, total muatan aerosol dihitung dan muatan EWNS rata-rata diperkirakan untuk jumlah total partikel EWNS terpilih. Biaya rata-rata EWNS dapat dihitung menggunakan Persamaan (1):
di mana IEl adalah arus yang diukur, NSMPS adalah konsentrasi digital yang diukur dengan SMPS, dan φEl adalah laju aliran per elektrometer.
Karena kelembapan relatif (RH) memengaruhi muatan permukaan, suhu dan (RH) dijaga konstan selama percobaan masing-masing pada 21°C dan 45%.
Mikroskop gaya atom (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) dan probe AC260T (Olympus, Tokyo, Jepang) digunakan untuk mengukur ukuran dan umur EWNS. Frekuensi pemindaian AFM adalah 1 Hz, area pemindaian 5 μm × 5 μm, dan 256 garis pemindaian. Semua gambar dikenai penyelarasan gambar orde pertama menggunakan perangkat lunak Asylum (rentang masker 100 nm, ambang batas 100 pm).
Corong uji dilepas dan permukaan mika ditempatkan pada jarak 2,0 cm dari elektroda lawan selama waktu rata-rata 120 s untuk menghindari aglomerasi partikel dan pembentukan tetesan tidak beraturan pada permukaan mika. EWNS disemprotkan langsung ke permukaan mika yang baru dipotong (Ted Pella, Redding, CA). Gambar permukaan mika segera setelah penyemprotan AFM. Sudut kontak permukaan mika yang baru dipotong dan tidak dimodifikasi mendekati 0°, sehingga EVNS terdistribusi pada permukaan mika dalam bentuk kubah. Diameter (a) dan tinggi (h) tetesan yang berdifusi diukur langsung dari topografi AFM dan digunakan untuk menghitung volume difusi kubah EWNS menggunakan metode yang telah kami validasi sebelumnya. Dengan asumsi EWNS yang terpasang memiliki volume yang sama, diameter ekivalen dapat dihitung menggunakan Persamaan (2):
Berdasarkan metode yang telah kami kembangkan sebelumnya, perangkap spin resonansi spin elektron (ESR) digunakan untuk mendeteksi keberadaan intermediat radikal berumur pendek dalam EWNS. Aerosol dialirkan melalui sparger Midget 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) yang berisi larutan 235 mM DEPMPO (5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Semua pengukuran ESR dilakukan menggunakan spektrometer Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) dan sel panel datar. Perangkat lunak Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) digunakan untuk mengumpulkan dan menganalisis data. Penentuan karakteristik ROS hanya dilakukan untuk serangkaian kondisi operasi [-6,5 kV, 4,0 cm]. Konsentrasi EWNS diukur menggunakan SMPS setelah memperhitungkan kehilangan EWNS di impaktor.
Tingkat ozon dipantau menggunakan 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Untuk semua properti EWNS, nilai rata-rata digunakan sebagai nilai pengukuran, dan deviasi standar digunakan sebagai kesalahan pengukuran. Uji-t dilakukan untuk membandingkan nilai atribut EWNS yang dioptimalkan dengan nilai yang sesuai dari EWNS dasar.
Gambar 2c menunjukkan sistem "tarik" pengendapan elektrostatik (EPES) yang telah dikembangkan dan dikarakterisasi sebelumnya, yang dapat digunakan untuk pengiriman EWNS secara terarah di permukaan. EPES menggunakan muatan EVNS yang dapat "diarahkan" langsung ke permukaan target di bawah pengaruh medan listrik yang kuat. Detail sistem EPES disajikan dalam publikasi terbaru oleh Pyrgiotakis dkk. 11. Dengan demikian, EPES terdiri dari ruang PVC cetak 3D dengan ujung meruncing dan berisi dua pelat logam baja tahan karat (baja tahan karat 304, dilapisi cermin) paralel di tengah dengan jarak 15,24 cm. Pelat-pelat tersebut dihubungkan ke sumber tegangan tinggi eksternal (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), pelat bawah selalu dihubungkan ke tegangan positif, dan pelat atas selalu dihubungkan ke tanah (ground mengambang). Dinding ruang ditutupi dengan foil aluminium, yang diarde secara elektrik untuk mencegah kehilangan partikel. Ruang tersebut memiliki pintu masuk depan yang tertutup rapat yang memungkinkan permukaan uji ditempatkan di atas penyangga plastik yang mengangkatnya di atas pelat logam bawah untuk menghindari interferensi tegangan tinggi.
Efisiensi pengendapan EWNS dalam EPES dihitung berdasarkan protokol yang telah dikembangkan sebelumnya, yang dirinci dalam Gambar Tambahan S111.
Sebagai ruang kontrol, ruang aliran silindris kedua dihubungkan secara seri ke sistem EPES, di mana filter HEPA perantara digunakan untuk menghilangkan EWNS. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2c, aerosol EWNS dipompa melalui dua ruang terintegrasi. Filter antara ruang kontrol dan EPES menghilangkan sisa EWNS sehingga menghasilkan suhu (T), kelembaban relatif (RH), dan kadar ozon yang sama.
Mikroorganisme penting penyebab penyakit bawaan makanan telah ditemukan mencemari makanan segar, seperti E. coli (ATCC #27325), indikator feses, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen bawaan makanan, Listeria harmless (ATCC #33090), pengganti Listeria monocytogenes patogenik, yang berasal dari ATCC (Manassas, VA), Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), pengganti ragi pembusukan, dan bakteri yang lebih tahan dan dinonaktifkan, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Beli beberapa kotak tomat ceri organik secara acak dari pasar lokal Anda dan simpan di lemari es pada suhu 4°C hingga digunakan (hingga 3 hari). Tomat yang digunakan dalam percobaan semuanya berukuran sama, sekitar 1/2 inci diameternya.
Protokol kultur, inokulasi, paparan, dan penghitungan koloni dijelaskan secara rinci dalam publikasi kami sebelumnya dan dalam Data Tambahan. Efektivitas EWNS dievaluasi dengan memaparkan tomat yang telah diinokulasi pada 40.000 #/cm3 selama 45 menit. Singkatnya, tiga tomat digunakan untuk mengevaluasi mikroorganisme yang bertahan hidup pada waktu t = 0 menit. Tiga tomat ditempatkan dalam EPES dan dipaparkan pada EWNS dengan konsentrasi 40.000 #/cc (tomat yang terpapar EWNS) dan tiga tomat lainnya ditempatkan di ruang kontrol (tomat kontrol). Pemrosesan tambahan tomat pada kedua kelompok tidak dilakukan. Tomat yang terpapar EWNS dan tomat kontrol dikeluarkan setelah 45 menit untuk mengevaluasi efek EWNS.
Setiap percobaan dilakukan sebanyak tiga kali. Analisis data dilakukan sesuai dengan protokol yang dijelaskan dalam Data Tambahan.
Mekanisme inaktivasi dinilai dengan sedimentasi sampel EWNS yang terpapar (45 menit pada konsentrasi aerosol EWNS 40.000 #/cm3) dan sampel bakteri tidak berbahaya yang tidak disinari, yaitu E. coli, Salmonella enterica, dan Lactobacillus. Partikel-partikel tersebut difiksasi dalam larutan 2,5% glutaraldehida, 1,25% paraformaldehida, dan 0,03% asam pikrat dalam buffer natrium kakodilat 0,1 M (pH 7,4) selama 2 jam pada suhu kamar. Setelah dicuci, dilakukan fiksasi ulang dengan 1% osmium tetroksida (OsO4)/1,5% kalium ferrocyanida (KFeCN6) selama 2 jam, dicuci 3 kali dengan air, dan diinkubasi dalam 1% uranil asetat selama 1 jam, kemudian dicuci dua kali dengan air, lalu didehidrasi selama 10 menit dalam alkohol 50%, 70%, 90%, dan 100%. Sampel kemudian ditempatkan dalam propilen oksida selama 1 jam dan diimpregnasi dengan campuran 1:1 propilen oksida dan TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Sampel kemudian ditanamkan dalam TAAB Epon dan dipolimerisasi pada suhu 60°C selama 48 jam. Resin granular yang telah mengeras dipotong dan divisualisasikan dengan TEM menggunakan mikroskop elektron transmisi konvensional JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Jepang) yang dilengkapi dengan kamera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Semua percobaan dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan. Untuk setiap titik waktu, larutan pencuci bakteri diinokulasi sebanyak tiga kali, sehingga menghasilkan total sembilan titik data per titik, yang rata-ratanya digunakan sebagai konsentrasi bakteri untuk mikroorganisme tertentu. Deviasi standar digunakan sebagai kesalahan pengukuran. Semua titik dihitung.
Logaritma penurunan konsentrasi bakteri dibandingkan dengan t = 0 menit dihitung menggunakan rumus berikut:
di mana C0 adalah konsentrasi bakteri dalam sampel kontrol pada waktu 0 (yaitu setelah permukaan mengering tetapi sebelum ditempatkan di dalam ruang) dan Cn adalah konsentrasi bakteri pada permukaan setelah n menit terpapar.
Untuk memperhitungkan degradasi alami bakteri selama paparan 45 menit, pengurangan log dibandingkan dengan kontrol setelah 45 menit juga dihitung sebagai berikut:
di mana Cn adalah konsentrasi bakteri dalam sampel kontrol pada waktu n dan Cn-Kontrol adalah konsentrasi bakteri kontrol pada waktu n. Data disajikan sebagai pengurangan logaritma dibandingkan dengan kontrol (tanpa paparan EWNS).
Selama penelitian, beberapa kombinasi tegangan dan jarak antara jarum dan elektroda lawan dievaluasi dalam hal pembentukan kerucut Taylor, stabilitas kerucut Taylor, stabilitas produksi EWNS, dan reproduktivitas. Berbagai kombinasi ditunjukkan pada Tabel Tambahan S1. Dua kasus yang menunjukkan sifat stabil dan dapat direproduksi (kerucut Taylor, generasi EWNS, dan stabilitas dari waktu ke waktu) dipilih untuk studi komprehensif. Pada Gambar 3 menunjukkan hasil untuk muatan, ukuran, dan kandungan ROS dalam kedua kasus tersebut. Hasilnya juga ditunjukkan pada Tabel 1. Sebagai referensi, baik Gambar 3 maupun Tabel 1 menyertakan sifat-sifat EWNS8, 9, 10, 11 yang sebelumnya disintesis dan belum dioptimalkan (EWNS dasar). Perhitungan signifikansi statistik menggunakan uji t dua arah dipublikasikan kembali pada Tabel Tambahan S2. Selain itu, data tambahan mencakup studi tentang pengaruh diameter lubang pengambilan sampel elektroda lawan (D) dan jarak antara elektroda tanah dan ujung (L) (Gambar Tambahan S2 dan S3).
(ac) Distribusi ukuran yang diukur dengan AFM. (df) Karakteristik muatan permukaan. (g) Karakterisasi ROS dari EPR.
Penting juga untuk dicatat bahwa untuk semua kondisi di atas, arus ionisasi yang terukur berada antara 2 dan 6 μA dan tegangan antara -3,8 dan -6,5 kV, menghasilkan konsumsi daya kurang dari 50 mW untuk modul kontak generasi EWNS tunggal ini. Meskipun EWNS disintesis di bawah tekanan tinggi, kadar ozon sangat rendah, tidak pernah melebihi 60 ppb.
Gambar Tambahan S4 menunjukkan medan listrik hasil simulasi untuk skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm], masing-masing. Untuk skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm], perhitungan medan masing-masing adalah 2 × 10⁵ V/m dan 4,7 × 10⁵ V/m. Hal ini sesuai dengan perkiraan, karena pada kasus kedua rasio tegangan-jarak jauh lebih tinggi.
Gambar 3a,b menunjukkan diameter EWNS yang diukur dengan AFM8. Diameter EWNS rata-rata yang dihitung adalah 27 nm dan 19 nm untuk skema [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm], masing-masing. Untuk skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm], deviasi standar geometris dari distribusinya masing-masing adalah 1,41 dan 1,45, menunjukkan distribusi ukuran yang sempit. Baik ukuran rata-rata maupun deviasi standar geometris sangat dekat dengan EWNS dasar, yaitu 25 nm dan 1,41, masing-masing. Gambar 3c menunjukkan distribusi ukuran EWNS dasar yang diukur menggunakan metode yang sama dalam kondisi yang sama.
Gambar 3d,e menunjukkan hasil karakterisasi muatan. Data merupakan pengukuran rata-rata dari 30 pengukuran simultan konsentrasi (#/cm3) dan arus (I). Analisis menunjukkan bahwa muatan rata-rata pada EWNS adalah 22 ± 6 e- dan 44 ± 6 e- untuk [-6,5 kV, 4,0 cm] dan [-3,8 kV, 0,5 cm], masing-masing. Muatan permukaannya jauh lebih tinggi dibandingkan dengan EWNS dasar (10 ± 2 e-), dua kali lebih besar daripada skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] dan empat kali lebih besar daripada [-3,8 kV, 0,5 cm]. Gambar 3f menunjukkan data muatan untuk Baseline-EWNS.
Dari peta konsentrasi jumlah EWNS (Gambar Tambahan S5 dan S6), dapat dilihat bahwa skenario [-6,5 kV, 4,0 cm] memiliki partikel yang jauh lebih banyak daripada skenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Perlu juga dicatat bahwa konsentrasi jumlah EWNS dipantau hingga 4 jam (Gambar Tambahan S5 dan S6), di mana stabilitas pembangkitan EWNS menunjukkan tingkat konsentrasi jumlah partikel yang sama dalam kedua kasus tersebut.
Gambar 3g menunjukkan spektrum EPR setelah pengurangan kontrol EWNS yang dioptimalkan (latar belakang) pada [-6,5 kV, 4,0 cm]. Spektrum ROS juga dibandingkan dengan skenario Baseline-EWNS dalam karya yang diterbitkan sebelumnya. Jumlah EWNS yang bereaksi dengan perangkap spin dihitung sebesar 7,5 × 10⁴ EWNS/s, yang mirip dengan Baseline-EWNS⁸ yang diterbitkan sebelumnya. Spektrum EPR dengan jelas menunjukkan keberadaan dua jenis ROS, dengan O²⁻ sebagai spesies dominan dan OH• yang kurang melimpah. Selain itu, perbandingan langsung intensitas puncak menunjukkan bahwa EWNS yang dioptimalkan memiliki kandungan ROS yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan EWNS dasar.
Gambar 4 menunjukkan efisiensi deposisi EWNS dalam EPES. Data tersebut juga dirangkum dalam Tabel I dan dibandingkan dengan data EWNS asli. Untuk kedua kasus EUNS, deposisi mendekati 100% bahkan pada tegangan rendah 3,0 kV. Biasanya, 3,0 kV sudah cukup untuk deposisi 100%, terlepas dari perubahan muatan permukaan. Dalam kondisi yang sama, efisiensi deposisi Baseline-EWNS hanya 56% karena muatannya yang lebih rendah (rata-rata 10 elektron per EWNS).
Pada Gambar 5 dan Tabel 2 merangkum nilai inaktivasi mikroorganisme yang diinokulasi pada permukaan tomat setelah terpapar sekitar 40.000 #/cm3 EWNS selama 45 menit pada mode optimum [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli dan Lactobacillus innocuous yang diinokulasi menunjukkan pengurangan signifikan sebesar 3,8 log selama paparan 45 menit. Dalam kondisi yang sama, S. enterica mengalami penurunan 2,2 log, sedangkan S. cerevisiae dan M. parafortutum mengalami penurunan 1,0 log.
Mikrograf elektron (Gambar 6) menggambarkan perubahan fisik yang diinduksi oleh EWNS pada sel Escherichia coli, Streptococcus, dan Lactobacillus yang tidak berbahaya, yang menyebabkan inaktivasi sel-sel tersebut. Bakteri kontrol memiliki membran sel yang utuh, sedangkan bakteri yang terpapar memiliki membran luar yang rusak.
Pencitraan mikroskop elektron pada bakteri kontrol dan bakteri yang terpapar menunjukkan adanya kerusakan membran.
Data mengenai sifat fisikokimia EWNS yang dioptimalkan secara kolektif menunjukkan bahwa sifat-sifat (muatan permukaan dan kandungan ROS) EWNS meningkat secara signifikan dibandingkan dengan data dasar EWNS yang dipublikasikan sebelumnya8,9,10,11. Di sisi lain, ukurannya tetap berada dalam kisaran nanometer, sangat mirip dengan hasil yang dilaporkan sebelumnya, sehingga memungkinkan mereka untuk tetap berada di udara dalam waktu yang lama. Polidispersitas yang diamati dapat dijelaskan oleh perubahan muatan permukaan yang menentukan ukuran EWNS, keacakan efek Rayleigh, dan potensi koalesensi. Namun, seperti yang dijelaskan oleh Nielsen dkk. 22, muatan permukaan yang tinggi mengurangi penguapan dengan secara efektif meningkatkan energi/tegangan permukaan tetesan air. Dalam publikasi kami sebelumnya8, teori ini telah dikonfirmasi secara eksperimental untuk tetesan mikro 22 dan EWNS. Kehilangan muatan selama waktu yang lama juga dapat memengaruhi ukuran dan berkontribusi pada distribusi ukuran yang diamati.