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Récemment, une plateforme antimicrobienne sans produits chimiques, basée sur la nanotechnologie et utilisant des nanostructures d'eau artificielles (EWNS), a été développée. Les EWNS présentent une charge de surface élevée et sont saturées en espèces réactives de l'oxygène (ROS) capables d'interagir avec de nombreux micro-organismes, notamment des pathogènes d'origine alimentaire, et de les inactiver. Cette étude montre que leurs propriétés peuvent être finement ajustées et optimisées lors de la synthèse afin d'améliorer leur potentiel antibactérien. La plateforme de laboratoire EWNS a été conçue pour ajuster les propriétés des EWNS en modifiant les paramètres de synthèse. Les propriétés des EWNS (charge, taille et teneur en ROS) ont été caractérisées à l'aide de méthodes analytiques modernes. De plus, leur potentiel d'inactivation microbienne a été évalué contre des micro-organismes d'origine alimentaire tels qu'Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum et Saccharomyces cerevisiae. Les résultats présentés ici démontrent que les propriétés des EWNS peuvent être finement ajustées lors de la synthèse, ce qui entraîne une augmentation exponentielle de l'efficacité d'inactivation. En particulier, la charge de surface a quadruplé et la concentration en espèces réactives de l'oxygène a augmenté. Le taux d'élimination microbienne dépendait du type de micro-organismes et variait de 1,0 à 3,8 log après 45 minutes d'exposition à une dose d'aérosol de 40 000 particules/cm³ d'EWNS.
La contamination microbienne est la principale cause des maladies d'origine alimentaire dues à l'ingestion d'agents pathogènes ou de leurs toxines. Aux États-Unis seulement, ces maladies sont responsables d'environ 76 millions de cas, 325 000 hospitalisations et 5 000 décès chaque année¹. De plus, le Département de l'Agriculture des États-Unis (USDA) estime que la consommation accrue de fruits et légumes frais est responsable de 48 % de tous les cas de maladies d'origine alimentaire déclarés aux États-Unis². Le coût des maladies et des décès causés par les agents pathogènes d'origine alimentaire aux États-Unis est très élevé : les Centres pour le contrôle et la prévention des maladies (CDC) l'estiment à plus de 15,6 milliards de dollars par an³.
Actuellement, les interventions antimicrobiennes chimiques, par irradiation et thermiques visant à garantir la sécurité alimentaire sont principalement mises en œuvre à des points critiques de contrôle (PCC) limités le long de la chaîne de production (généralement après la récolte et/ou lors du conditionnement), et non de manière continue. Elles sont donc sujettes à la contamination croisée. Un meilleur contrôle des maladies d'origine alimentaire et de l'altération des aliments nécessite des interventions antimicrobiennes potentiellement applicables tout au long de la chaîne « de la production à la consommation », tout en réduisant l'impact environnemental et les coûts.
Récemment, une plateforme antimicrobienne sans produits chimiques, basée sur les nanotechnologies, a été développée. Elle permet d'inactiver les bactéries présentes en surface et dans l'air grâce à des nanostructures d'eau artificielles (EWNS). Les EWNS ont été synthétisées par deux procédés parallèles : l'électrospray et l'ionisation de l'eau (Fig. 1a). Des études antérieures ont démontré que les EWNS possèdent des propriétés physiques et biologiques uniques^8,9,10. Chaque structure contient en moyenne 10 électrons et présente une taille nanométrique moyenne de 25 nm (Fig. 1b,c)^8,9,10. De plus, la résonance paramagnétique électronique (RPE) a révélé que les EWNS contiennent une grande quantité d'espèces réactives de l'oxygène (ERO), principalement des radicaux hydroxyle (OH•) et superoxyde (O_2-^-) (Fig. 1c)⁸. Les EWNS restent longtemps en suspension dans l'air et peuvent entrer en collision avec les micro-organismes présents en surface ou dans l'air, libérant ainsi leurs ERO et inactivant les micro-organismes (Fig. 1d). Ces premières études ont également montré que l'EWNS peut interagir avec diverses bactéries Gram-négatives et Gram-positives, y compris les mycobactéries, et les inactiver, aussi bien sur les surfaces que dans l'air. La microscopie électronique à transmission a révélé que cette inactivation était due à la rupture de la membrane cellulaire. De plus, des études d'inhalation aiguë ont démontré que de fortes doses d'EWNS ne provoquent ni lésions pulmonaires ni inflammation⁸.
(a) L'électropulvérisation se produit lorsqu'une haute tension est appliquée entre un tube capillaire contenant un liquide et une contre-électrode. (b) L'application d'une haute pression entraîne deux phénomènes distincts : (i) l'électropulvérisation d'eau et (ii) la formation d'espèces réactives de l'oxygène (ions) piégées dans les EWNS. (c) La structure unique des EWNS. (d) De par leur nature nanométrique, les EWNS sont très mobiles et peuvent interagir avec les agents pathogènes aéroportés.
L'efficacité de la plateforme antimicrobienne EWNS pour inactiver les micro-organismes d'origine alimentaire à la surface des aliments frais a été récemment démontrée. Il a également été montré que la charge de surface de l'EWNS, combinée à un champ électrique, permet un ciblage précis. De plus, les résultats préliminaires obtenus sur des tomates biologiques après 90 minutes d'exposition à une concentration d'EWNS d'environ 50 000 #/cm³ sont encourageants, avec l'observation de divers micro-organismes d'origine alimentaire tels que *E. coli* et *Listeria*. Par ailleurs, les tests organoleptiques préliminaires n'ont révélé aucun effet sensoriel par rapport aux tomates témoins. Bien que ces premiers résultats d'inactivation soient encourageants pour les applications de sécurité alimentaire, même à de très faibles doses d'EWNS (50 000 #/cm³), il est clair qu'un potentiel d'inactivation plus élevé serait plus avantageux pour réduire davantage les risques d'infection et d'altération.
Nos recherches porteront sur le développement d'une plateforme de génération d'EWNS permettant un ajustement précis des paramètres de synthèse et l'optimisation des propriétés physico-chimiques des EWNS afin d'améliorer leur potentiel antibactérien. L'optimisation s'est notamment concentrée sur l'augmentation de leur charge de surface (pour un ciblage plus précis) et de leur teneur en ROS (pour une meilleure efficacité d'inactivation). Les propriétés physico-chimiques optimisées (taille, charge et teneur en ROS) seront caractérisées par des méthodes analytiques modernes, en utilisant des micro-organismes alimentaires courants tels que *E. coli*.
L’EVNS a été synthétisé par électropulvérisation et ionisation simultanées d’eau de haute pureté (18 MΩ cm–1). Le nébuliseur électrique 12 est généralement utilisé pour l’atomisation de liquides et la synthèse de particules polymères et céramiques 13 et de fibres 14 de taille contrôlée.
Comme décrit en détail dans les publications précédentes 8, 9, 10, 11, une expérience typique consiste à appliquer une haute tension entre un capillaire métallique et une contre-électrode reliée à la terre. Ce processus met en jeu deux phénomènes distincts : i) l’électropulvérisation et ii) l’ionisation de l’eau. Le champ électrique intense entre les deux électrodes provoque l’accumulation de charges négatives à la surface de l’eau condensée, entraînant la formation de cônes de Taylor. Il se forme ainsi des gouttelettes d’eau fortement chargées, qui se fragmentent ensuite en particules plus petites, conformément à la théorie de Rayleigh¹⁶. Simultanément, le champ électrique intense provoque la dissociation de certaines molécules d’eau et l’arrachement d’électrons (ionisation), ce qui conduit à la formation d’une grande quantité d’espèces réactives de l’oxygène (ERO)¹⁷. Les ERO ainsi générées¹⁸ sont encapsulées dans des EWNS (Fig. 1c).
La figure 2a présente le système de génération d'EWNS développé et utilisé pour la synthèse d'EWNS dans cette étude. De l'eau purifiée, stockée dans une bouteille fermée, est acheminée par un tube en téflon (2 mm de diamètre intérieur) jusqu'à une aiguille en acier inoxydable 30G (capillaire métallique). Le débit d'eau est contrôlé par la pression d'air à l'intérieur de la bouteille, comme illustré sur la figure 2b. L'aiguille est montée sur une console en téflon et peut être positionnée manuellement à une distance précise de la contre-électrode. Cette dernière est un disque en aluminium poli percé en son centre pour le prélèvement d'échantillons. Sous la contre-électrode se trouve un entonnoir de prélèvement en aluminium, relié au reste du dispositif expérimental par un port de prélèvement (figure 2b). Afin d'éviter toute accumulation de charges susceptibles de perturber le fonctionnement de l'échantillonneur, tous ses composants sont mis à la terre.
(a) Système de génération de nanostructures d'eau artificielles (EWNS). (b) Coupe transversale de l'échantillonneur et de l'électrospray, montrant les paramètres les plus importants. (c) Dispositif expérimental pour l'inactivation des bactéries.
Le système de génération d'EWNS décrit ci-dessus permet de modifier les principaux paramètres de fonctionnement afin d'ajuster précisément les propriétés des EWNS. Il est possible de régler la tension appliquée (V), la distance entre l'aiguille et la contre-électrode (L) et le débit d'eau (φ) dans le capillaire pour optimiser les caractéristiques des EWNS. Les différentes combinaisons sont représentées par le symbole [V (kV), L (cm)]. Le débit d'eau doit être ajusté pour obtenir un cône de Taylor stable pour une valeur donnée de [V, L]. Dans le cadre de cette étude, le diamètre de l'ouverture de la contre-électrode (D) a été fixé à 1,29 cm (0,5 pouce).
En raison de la géométrie contrainte et de l'asymétrie, l'intensité du champ électrique ne peut être calculée par des méthodes ab initio. Le logiciel QuickField™ (Svendborg, Danemark)¹⁹ a donc été utilisé pour effectuer ce calcul. Le champ électrique n'étant pas uniforme, sa valeur à l'extrémité du capillaire a servi de référence pour les différentes configurations.
Au cours de cette étude, plusieurs combinaisons de tension et de distance entre l'aiguille et la contre-électrode ont été évaluées en termes de formation du cône de Taylor, de stabilité de ce cône, de stabilité de la production d'EWNS et de reproductibilité. Différentes combinaisons sont présentées dans le tableau supplémentaire S1.
La sortie du système de génération d'EWNS était directement connectée à un analyseur de taille de particules par mobilité de balayage (SMPS, modèle 3936, TSI, Shoreview, MN) pour la mesure de la concentration en nombre de particules, ainsi qu'à un électromètre Faraday pour aérosols (TSI, modèle 3068B, Shoreview, MN). Le courant d'aérosol a été mesuré comme décrit dans notre publication précédente. Le SMPS et l'électromètre ont tous deux échantillonné à un débit de 0,5 L/min (débit total d'échantillonnage : 1 L/min). La concentration en nombre de particules et le flux d'aérosol ont été mesurés pendant 120 secondes. La mesure a été répétée 30 fois. À partir des mesures de courant, la charge totale d'aérosol a été calculée et la charge moyenne d'EWNS a été estimée pour un nombre total donné de particules d'EWNS sélectionnées. Le coût moyen d'EWNS peut être calculé à l'aide de l'équation (1) :
où IEl est le courant mesuré, NSMPS est la concentration numérique mesurée avec le SMPS et φEl est le débit par électromètre.
Étant donné que l'humidité relative (HR) affecte la charge de surface, la température et (HR) ont été maintenues constantes pendant l'expérience à 21°C et 45%, respectivement.
La taille et la durée de vie des EWNS ont été mesurées par microscopie à force atomique (AFM), à l'aide d'un microscope Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) et d'une sonde AC260T (Olympus, Tokyo, Japon). La fréquence de balayage de l'AFM était de 1 Hz, la zone de balayage de 5 μm × 5 μm et 256 lignes de balayage ont été acquises. Toutes les images ont été alignées au premier ordre à l'aide du logiciel Asylum (portée du masque : 100 nm, seuil : 100 pm).
L'entonnoir de test a été retiré et la surface de mica a été placée à 2,0 cm de la contre-électrode pendant un temps d'intégration de 120 s afin d'éviter l'agglomération des particules et la formation de gouttelettes irrégulières. L'EWNS a été pulvérisé directement sur la surface de mica fraîchement découpé (Ted Pella, Redding, CA). L'image de la surface de mica immédiatement après la pulvérisation AFM montre que l'angle de contact de la surface de mica non modifié étant proche de 0°, l'EWNS se répartit sous forme de dôme. Le diamètre (a) et la hauteur (h) des gouttelettes diffusantes ont été mesurés directement à partir de la topographie AFM et utilisés pour calculer le volume de diffusion en dôme de l'EWNS selon notre méthode validée précédemment. En supposant que l'EWNS embarqué a le même volume, le diamètre équivalent peut être calculé à l'aide de l'équation (2).
En nous basant sur notre méthode précédemment développée, un piège à spin à résonance paramagnétique électronique (RPE) a été utilisé pour détecter la présence d'intermédiaires radicalaires de courte durée dans les EWNS. Les aérosols ont été barbotés dans un diffuseur Midget de 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) contenant une solution à 235 mM de DEPMPO (5-(diéthoxyphosphoryl)-5-méthyl-1-pyrroline-N-oxyde) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Toutes les mesures RPE ont été réalisées à l'aide d'un spectromètre Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, États-Unis) et d'une cellule à écran plat. Le logiciel Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, États-Unis) a été utilisé pour l'acquisition et l'analyse des données. La détermination des caractéristiques des ROS a été effectuée uniquement pour un ensemble de conditions opératoires [-6,5 kV, 4,0 cm]. Les concentrations d'EWNS ont été mesurées à l'aide du SMPS après correction des pertes d'EWNS dans l'impacteur.
Les niveaux d'ozone ont été surveillés à l'aide d'un moniteur d'ozone à double faisceau 205™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Pour toutes les propriétés EWNS, la valeur moyenne est utilisée comme valeur de mesure et l'écart type comme erreur de mesure. Des tests t ont été réalisés afin de comparer les valeurs des attributs EWNS optimisés aux valeurs correspondantes de l'EWNS de base.
La figure 2c présente un système d'« attraction » par précipitation électrostatique (EPES) précédemment développé et caractérisé, utilisable pour le dépôt ciblé de nanoparticules d'eau ionique (EWNS) en surface. L'EPES utilise des charges EVNS qui peuvent être guidées directement vers la surface de la cible sous l'influence d'un champ électrique intense. Les détails du système EPES sont présentés dans une publication récente de Pyrgiotakis et al.¹¹. L'EPES se compose d'une chambre en PVC imprimée en 3D, à extrémités coniques, contenant en son centre deux plaques métalliques parallèles en acier inoxydable (acier inoxydable 304, finition miroir), distantes de 15,24 cm. Ces plaques sont reliées à une source de haute tension externe (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY). La plaque inférieure est toujours reliée au pôle positif, et la plaque supérieure à la masse (masse flottante). Les parois de la chambre sont recouvertes d'une feuille d'aluminium, elle-même mise à la terre afin d'éviter toute perte de particules. La chambre est dotée d'une porte de chargement frontale étanche qui permet de placer les surfaces de test sur des supports en plastique les surélevant au-dessus de la plaque métallique inférieure afin d'éviter les interférences haute tension.
L'efficacité de dépôt de l'EWNS dans l'EPES a été calculée selon un protocole précédemment développé et détaillé dans la figure supplémentaire S111.
Une seconde chambre de contrôle, de type cylindrique, a été connectée en série au système EPES. Un filtre HEPA intermédiaire y éliminait les particules d'eau chaude non saturées (EWNS). Comme illustré sur la figure 2c, l'aérosol d'EWNS était pompé à travers deux chambres intégrées. Le filtre situé entre la chambre de contrôle et le système EPES éliminait toute trace d'EWNS, maintenant ainsi les mêmes niveaux de température (T), d'humidité relative (HR) et d'ozone.
D'importants micro-organismes d'origine alimentaire ont été trouvés contaminant les aliments frais tels que E. coli (ATCC #27325), indicateur fécal, Salmonella enterica (ATCC #53647), pathogène d'origine alimentaire, Listeria harmless (ATCC #33090), substitut de Listeria monocytogenes pathogène, dérivé de l'ATCC (Manassas, VA), Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), un substitut de levure d'altération, et une bactérie inactivée plus résistante, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Achetez des barquettes de tomates cerises bio au hasard sur votre marché local et conservez-les au réfrigérateur à 4 °C jusqu'à utilisation (3 jours maximum). Les tomates utilisées pour l'expérience étaient toutes de même taille, environ 1,25 cm de diamètre.
Les protocoles de culture, d'inoculation, d'exposition et de dénombrement des colonies sont détaillés dans notre publication précédente et dans les données supplémentaires. L'efficacité du traitement par EWNS a été évaluée en exposant des tomates inoculées à 40 000 #/cm³ pendant 45 minutes. Brièvement, trois tomates ont été utilisées pour évaluer la survie des micro-organismes au temps t = 0 min. Trois tomates ont été placées dans l'EPES et exposées à l'EWNS à 40 000 #/cm³ (tomates exposées à l'EWNS), tandis que les trois autres ont été placées dans la chambre témoin (tomates témoins). Aucun traitement supplémentaire n'a été appliqué aux tomates des deux groupes. Les tomates exposées à l'EWNS et les tomates témoins ont été retirées après 45 minutes afin d'évaluer l'effet du traitement.
Chaque expérience a été réalisée en trois exemplaires. L'analyse des données a été effectuée conformément au protocole décrit dans les données supplémentaires.
Les mécanismes d'inactivation ont été évalués par sédimentation d'échantillons exposés à des particules ultrafines (EWNS) (45 min à une concentration d'aérosol EWNS de 40 000 particules/cm³) et d'échantillons non irradiés de bactéries inoffensives : *Escherichia coli*, *Salmonella enterica* et *Lactobacillus*. Les particules ont été fixées dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 %, de paraformaldéhyde à 1,25 % et d'acide picrique à 0,03 % dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,4) pendant 2 heures à température ambiante. Après lavage, une post-fixation a été réalisée avec du tétroxyde d'osmium (OsO₄) à 1 % et du ferrocyanure de potassium (KFeCN₆) à 1,5 % pendant 2 heures, suivie de trois lavages à l'eau et d'une incubation dans de l'acétate d'uranyle à 1 % pendant 1 heure. Après deux lavages à l'eau, les échantillons ont été déshydratés pendant 10 minutes dans des solutions d'alcool à 50 %, 70 %, 90 % et 100 %. Les échantillons ont ensuite été placés dans de l'oxyde de propylène pendant une heure, puis imprégnés d'un mélange à parts égales d'oxyde de propylène et d'Epon TAAP (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). Ils ont ensuite été enrobés dans de l'Epon TAAB et polymérisés à 60 °C pendant 48 heures. La résine granulaire polymérisée a été coupée et observée par microscopie électronique à transmission (MET) à l'aide d'un microscope électronique à transmission conventionnel JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Japon) équipé d'une caméra CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, États-Unis).
Toutes les expériences ont été réalisées en trois exemplaires. Pour chaque point de mesure, les lavages bactériens ont été ensemencés en trois exemplaires, ce qui a permis d'obtenir neuf points de données par point. La moyenne de ces neuf points a été utilisée pour déterminer la concentration bactérienne du micro-organisme considéré. L'écart type a été utilisé comme indicateur d'erreur de mesure. Tous les points sont pris en compte.
Le logarithme de la diminution de la concentration bactérienne par rapport à t = 0 min a été calculé à l'aide de la formule suivante :
où C0 est la concentration de bactéries dans l'échantillon témoin au temps 0 (c'est-à-dire après que la surface a séché mais avant d'être placée dans la chambre) et Cn est la concentration de bactéries sur la surface après n minutes d'exposition.
Pour tenir compte de la dégradation naturelle des bactéries au cours des 45 minutes d'exposition, la réduction logarithmique par rapport au témoin après 45 minutes a également été calculée comme suit :
où Cn représente la concentration de bactéries dans l'échantillon témoin au temps n et Cn-Contrôle la concentration de bactéries témoins au temps n. Les données sont présentées sous forme de réduction logarithmique par rapport au témoin (absence d'exposition à l'EWNS).
Au cours de cette étude, plusieurs combinaisons de tension et de distance entre l'aiguille et la contre-électrode ont été évaluées en termes de formation et de stabilité du cône de Taylor, de stabilité de la production d'EWNS et de reproductibilité. Différentes combinaisons sont présentées dans le tableau supplémentaire S1. Deux cas présentant des propriétés stables et reproductibles (cône de Taylor, génération d'EWNS et stabilité temporelle) ont été sélectionnés pour une étude approfondie. La figure 3 présente les résultats relatifs à la charge, la taille et la concentration en ROS dans les deux cas. Ces résultats sont également présentés dans le tableau 1. À titre de référence, la figure 3 et le tableau 1 incluent les propriétés des EWNS non optimisés précédemment synthétisés^{8, 9, 10, 11} (EWNS de référence). Les calculs de signification statistique, effectués à l'aide d'un test t bilatéral, sont reproduits dans le tableau supplémentaire S2. De plus, des données supplémentaires incluent des études sur l'effet du diamètre (D) de l'orifice d'échantillonnage de la contre-électrode et de la distance (L) entre l'électrode de masse et la pointe (figures supplémentaires S2 et S3).
(ac) Distribution granulométrique mesurée par AFM. (df) Caractéristique de charge de surface. (g) Caractérisation ROS de l'EPR.
Il est également important de noter que, dans toutes les conditions décrites ci-dessus, le courant d'ionisation mesuré était compris entre 2 et 6 μA et la tension entre -3,8 et -6,5 kV, ce qui correspond à une consommation électrique inférieure à 50 mW pour ce module de génération d'EWNS. Bien que l'EWNS ait été synthétisé sous haute pression, les niveaux d'ozone sont restés très faibles, n'excédant jamais 60 ppb.
La figure supplémentaire S4 présente les champs électriques simulés pour les scénarios [-6,5 kV, 4,0 cm] et [-3,8 kV, 0,5 cm]. Pour ces scénarios, les champs calculés sont respectivement de 2 × 10⁵ V/m et 4,7 × 10⁵ V/m. Ce résultat est conforme aux attentes, le rapport tension/distance étant beaucoup plus élevé dans le second cas.
Les figures 3a et 3b présentent le diamètre des EWNS mesuré par AFM8. Les diamètres moyens calculés étaient de 27 nm et 19 nm pour les configurations [-6,5 kV, 4,0 cm] et [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivement. Pour ces configurations, les écarts-types géométriques des distributions étaient de 1,41 et 1,45, respectivement, indiquant une distribution granulométrique étroite. La taille moyenne et l'écart-type géométrique sont très proches de ceux des EWNS de référence, soit 25 nm et 1,41, respectivement. La figure 3c présente la distribution granulométrique des EWNS de référence, mesurée par la même méthode et dans les mêmes conditions.
Les figures 3d et 3e présentent les résultats de la caractérisation de charge. Les données correspondent à la moyenne de 30 mesures simultanées de concentration (nombre de particules/cm³) et de courant (I). L'analyse montre que la charge moyenne sur l'EWNS est de 22 ± 6 e⁻ et de 44 ± 6 e⁻ pour les potentiels [-6,5 kV, 4,0 cm] et [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivement. Ces charges de surface sont nettement supérieures à celles de l'EWNS de référence (10 ± 2 e⁻), deux fois plus élevées que pour le potentiel [-6,5 kV, 4,0 cm] et quatre fois plus élevées que pour le potentiel [-3,8 kV, 0,5 cm]. La figure 3f présente les données de charge pour l'EWNS de référence.
D’après les cartes de concentration du nombre d’EWNS (figures supplémentaires S5 et S6), on constate que le scénario [-6,5 kV, 4,0 cm] présente une concentration de particules nettement supérieure à celle du scénario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Il est également à noter que la concentration d’EWNS a été suivie pendant 4 heures (figures supplémentaires S5 et S6), et que la stabilité de la génération d’EWNS est restée identique dans les deux cas.
La figure 3g présente le spectre RPE après soustraction du spectre de fond du contrôle EWNS optimisé à [-6,5 kV, 4,0 cm]. Les spectres des ROS ont également été comparés au scénario EWNS de référence décrit dans une publication antérieure. Le nombre d'EWNS réagissant avec les pièges à spin a été calculé à 7,5 × 10⁴ EWNS/s, une valeur similaire à celle obtenue pour le scénario EWNS8 de référence publié précédemment. Les spectres RPE ont clairement mis en évidence la présence de deux types de ROS, O₂⁻ étant l'espèce prédominante et OH• l'espèce moins abondante. De plus, une comparaison directe des intensités des pics a montré que l'EWNS optimisé présentait une teneur en ROS significativement plus élevée que l'EWNS de référence.
La figure 4 illustre l'efficacité de dépôt des EWNS dans l'EPES. Ces données sont également résumées dans le tableau I et comparées aux données initiales des EWNS. Dans les deux cas d'EWNS, le dépôt est proche de 100 % même à une faible tension de 3,0 kV. Typiquement, 3,0 kV suffisent pour un dépôt à 100 %, indépendamment de la variation de charge de surface. Dans les mêmes conditions, l'efficacité de dépôt des EWNS de référence n'était que de 56 % en raison de leur charge plus faible (en moyenne 10 électrons par EWNS).
La figure 5 et le tableau 2 résument l'inactivation des micro-organismes inoculés à la surface des tomates après exposition à environ 40 000 nanocycles/cm³ de faisceaux d'électrons non ionisés (EWNS) pendant 45 minutes dans les conditions optimales [-6,5 kV, 4,0 cm]. Les souches d'E. coli et de Lactobacillus innocuous inoculées ont présenté une réduction significative de 3,8 log au cours de ces 45 minutes d'exposition. Dans les mêmes conditions, la concentration de S. enterica a diminué de 2,2 log, tandis que celle de S. cerevisiae et de M. parafortutum a diminué de 1,0 log.
Les micrographies électroniques (figure 6) illustrent les modifications physiques induites par le courant d'eau ionique (EWNS) sur des cellules inoffensives d'Escherichia coli, de Streptococcus et de Lactobacillus, entraînant leur inactivation. Les bactéries témoins présentaient des membranes cellulaires intactes, tandis que les bactéries exposées avaient des membranes externes endommagées.
L'imagerie au microscope électronique des bactéries témoins et exposées a révélé des dommages membranaires.
Les données relatives aux propriétés physico-chimiques des EWNS optimisées montrent collectivement que leurs propriétés (charge de surface et teneur en ROS) ont été significativement améliorées par rapport aux données de référence publiées précédemment^8,9,10,11. Par ailleurs, leur taille est restée de l'ordre du nanomètre, très proche des résultats antérieurs, leur permettant de persister longtemps dans l'air. La polydispersité observée peut s'expliquer par les variations de charge de surface qui déterminent la taille des EWNS, le caractère aléatoire de l'effet Rayleigh et une éventuelle coalescence. Cependant, comme l'ont détaillé Nielsen et al.²², une charge de surface élevée réduit l'évaporation en augmentant l'énergie/tension de surface de la goutte d'eau. Dans notre publication précédente⁸, cette théorie a été confirmée expérimentalement pour les microgouttelettes²² et les EWNS. La perte de charge au fil du temps peut également affecter la taille et contribuer à la distribution granulométrique observée.