Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Vrteška koja prikazuje tri slajda istovremeno.Koristite dugmad Prethodno i Sljedeće da se krećete kroz tri slajda odjednom ili koristite dugmad klizača na kraju da se krećete kroz tri slajda odjednom.
Nedavno je razvijena antimikrobna platforma bez hemikalija zasnovana na nanotehnologiji koja koristi nanostrukture umjetne vode (EWNS).EWNS imaju visok površinski naboj i zasićeni su reaktivnim kisikovim vrstama (ROS) koje mogu stupiti u interakciju s brojnim mikroorganizmima i inaktivirati ih, uključujući patogene koji se prenose hranom.Ovdje je pokazano da se njihova svojstva tokom sinteze mogu fino podesiti i optimizirati kako bi se dodatno poboljšao njihov antibakterijski potencijal.EWNS laboratorijska platforma je dizajnirana da fino podesi svojstva EWNS promjenom parametara sinteze.Karakterizacija svojstava EWNS-a (naboj, veličina i sadržaj ROS-a) korišćenjem savremenih analitičkih metoda.Osim toga, procijenjen je njihov potencijal mikrobne inaktivacije protiv mikroorganizama iz hrane kao što su Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum i Saccharomyces cerevisiae.Ovdje predstavljeni rezultati pokazuju da se svojstva EWNS-a mogu fino podesiti tokom sinteze, što rezultira eksponencijalnim povećanjem efikasnosti inaktivacije.Konkretno, površinski naboj se povećao za faktor četiri, a reaktivne vrste kiseonika su porasle.Brzina uklanjanja mikroba bila je mikrobno ovisna i kretala se od 1,0 do 3,8 log nakon 45-minutnog izlaganja aerosolnoj dozi od 40 000 #/cc EWNS.
Mikrobna kontaminacija je glavni uzrok bolesti koje se prenose hranom uzrokovane gutanjem patogena ili njihovih toksina.Samo u Sjedinjenim Državama bolesti koje se prenose hranom uzrokuju oko 76 miliona bolesti, 325.000 hospitalizacija i 5.000 smrti svake godine1.Osim toga, Ministarstvo poljoprivrede Sjedinjenih Država (USDA) procjenjuje da je povećana potrošnja svježih proizvoda odgovorna za 48% svih prijavljenih bolesti koje se prenose hranom u Sjedinjenim Državama2.Troškovi bolesti i smrti uzrokovani patogenima koji se prenose hranom u Sjedinjenim Državama su vrlo visoki, a procjenjuju ih Centri za kontrolu i prevenciju bolesti (CDC) na više od 15,6 milijardi američkih dolara godišnje3.
Trenutno se hemijske4, radijacijske5 i termalne6 antimikrobne intervencije kako bi se osigurala sigurnost hrane uglavnom provode na ograničenim kritičnim kontrolnim tačkama (CCP) duž proizvodnog lanca (obično nakon žetve i/ili tokom pakovanja), a ne kontinuirano.stoga su skloni unakrsnoj kontaminaciji.7. Bolja kontrola bolesti koje se prenose hranom i kvarenja hrane zahtijevaju antimikrobne intervencije koje se potencijalno mogu primijeniti u cijelom kontinuumu od farme do stola uz smanjenje utjecaja na okoliš i troškove.
Nedavno je razvijena antimikrobna platforma zasnovana na nanotehnologiji bez hemikalija koja može inaktivirati površinske i vazdušne bakterije koristeći veštačke vodene nanostrukture (EWNS).EWNS je sintetizovan korišćenjem dva paralelna procesa, elektrosprej i jonizacije vode (slika 1a).Prethodne studije su pokazale da EWNS ima jedinstven skup fizičkih i bioloških svojstava8,9,10.EWNS imaju u prosjeku 10 elektrona po strukturi i prosječnu veličinu nanoskala od 25 nm (sl. 1b,c)8,9,10.Osim toga, elektronska spinska rezonanca (ESR) je pokazala da EWNS sadrži veliku količinu reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), uglavnom hidroksilnih (OH•) i superoksidnih (O2-) radikala (slika 1c)8.EVNS je dugo u vazduhu i može da se sudari sa mikroorganizmima suspendovanim u vazduhu i prisutnim na površini, isporučujući svoj ROS korisni teret i izazivajući inaktivaciju mikroorganizama (slika 1d).Ove rane studije su također pokazale da EWNS može komunicirati i inaktivirati različite gram-negativne i gram-pozitivne bakterije, uključujući mikobakterije, na površinama iu zraku.Transmisiona elektronska mikroskopija pokazala je da je do inaktivacije došlo zbog oštećenja stanične membrane.Osim toga, studije akutnog udisanja pokazale su da visoke doze EWNS-a ne uzrokuju oštećenje ili upalu pluća 8 .
(a) Elektrosprej nastaje kada se između kapilarne cijevi koja sadrži tekućinu i protuelektrode dovede visoki napon.(b) Primjena visokog pritiska dovodi do dva različita fenomena: (i) elektroprskanja vode i (ii) formiranja reaktivnih vrsta kiseonika (jona) zarobljenih u EWNS.(c) Jedinstvena struktura EWNS-a.(d) Zbog svoje nanorazmjerne prirode, EWNS su vrlo pokretne i mogu komunicirati sa patogenima u zraku.
Nedavno je dokazana i sposobnost EWNS antimikrobne platforme da inaktivira mikroorganizme koji se prenose hranom na površini svježe hrane.Također se pokazalo da se površinski naboj EWNS-a u kombinaciji s električnim poljem može koristiti za postizanje ciljane isporuke.Štaviše, preliminarni rezultati za organski paradajz nakon 90-minutnog izlaganja na EWNS od oko 50.000 #/cm3 bili su ohrabrujući, s različitim mikroorganizmima koji se prenose hranom kao što su E. coli i Listeria 11.Osim toga, preliminarni organoleptički testovi nisu pokazali senzorne efekte u odnosu na kontrolni paradajz.Iako su ovi početni rezultati inaktivacije ohrabrujući za primjene u sigurnosti hrane čak i pri vrlo niskim dozama EWNS od 50 000#/cc.Vidite, jasno je da bi veći potencijal inaktivacije bio korisniji za dalje smanjenje rizika od infekcije i kvarenja.
Ovdje ćemo fokusirati naše istraživanje na razvoj platforme za generiranje EWNS-a kako bi se omogućilo fino podešavanje parametara sinteze i optimizacija fizičko-hemijskih svojstava EWNS-a kako bi se poboljšao njihov antibakterijski potencijal.Optimizacija se posebno fokusirala na povećanje njihovog površinskog naboja (da bi se poboljšala ciljana isporuka) i ROS sadržaja (da bi se poboljšala efikasnost inaktivacije).Okarakterizirajte optimizirana fizičko-hemijska svojstva (veličina, naboj i sadržaj ROS) koristeći savremene analitičke metode i koristite uobičajene prehrambene mikroorganizme kao što je E. .
EVNS je sintetizovan istovremenim elektrosprejanjem i jonizacijom vode visoke čistoće (18 MΩ cm–1).Električni nebulizator 12 se obično koristi za atomizaciju tekućina i sintezu polimernih i keramičkih čestica 13 i vlakana 14 kontrolirane veličine.
Kao što je detaljno opisano u prethodnim publikacijama 8, 9, 10, 11, u tipičnom eksperimentu, visoki napon je primijenjen između metalne kapilare i uzemljene protuelektrode.Tokom ovog procesa javljaju se dva različita fenomena: i) elektrosprej i ii) jonizacija vode.Jako električno polje između dvije elektrode uzrokuje nakupljanje negativnih naboja na površini kondenzirane vode, što rezultira formiranjem Taylorovih čunjeva.Kao rezultat, formiraju se visoko nabijene kapljice vode, koje se nastavljaju raspadati na manje čestice, kao u Rayleighovoj teoriji16.Istovremeno, jaka električna polja uzrokuju cijepanje nekih molekula vode i skidanje elektrona (joniziranje), što dovodi do stvaranja velike količine reaktivnih vrsta kisika (ROS)17.Istovremeno generisani ROS18 je inkapsuliran u EWNS (slika 1c).
Na sl.2a prikazuje EWNS sistem generisanja razvijen i korišten u EWNS sintezi u ovoj studiji.Pročišćena voda pohranjena u zatvorenoj boci je stavljena kroz teflonsku cijev (unutarnjeg prečnika 2 mm) u iglu od nerđajućeg čelika 30G (metalna kapilara).Protok vode se kontroliše pritiskom vazduha unutar boce, kao što je prikazano na slici 2b.Igla je postavljena na teflonsku konzolu i može se ručno podesiti na određenu udaljenost od kontra elektrode.Kontra elektroda je polirani aluminijumski disk sa rupom u sredini za uzorkovanje.Ispod kontraelektrode nalazi se aluminijumski lijevak za uzorkovanje, koji je povezan s ostatkom eksperimentalne instalacije preko priključka za uzorkovanje (slika 2b).Kako bi se izbjeglo nakupljanje naboja koje bi moglo poremetiti rad uzorkivača, sve komponente uzorkivača su električno uzemljene.
(a) Projektovani sistem za generisanje nanostrukture vode (EWNS).(b) Poprečni presjek uzorkivača i elektrospreja, koji pokazuje najvažnije parametre.(c) Eksperimentalna postavka za inaktivaciju bakterija.
Gore opisani sistem generisanja EWNS-a je sposoban da promeni ključne operativne parametre kako bi olakšao fino podešavanje svojstava EWNS-a.Podesite primijenjeni napon (V), udaljenost između igle i kontra elektrode (L) i protok vode (φ) kroz kapilaru kako biste fino podesili karakteristike EWNS.Simbol koji se koristi za predstavljanje različitih kombinacija: [V (kV), L (cm)].Podesite protok vode da dobijete stabilan Taylor konus određenog skupa [V, L].Za potrebe ove studije, prečnik otvora kontra elektrode (D) je držan na 0,5 inča (1,29 cm).
Zbog ograničene geometrije i asimetrije, jačina električnog polja ne može se izračunati iz prvih principa.Umjesto toga, za izračunavanje električnog polja korišten je softver QuickField™ (Svendborg, Danska)19.Električno polje nije uniformno, pa je vrijednost električnog polja na vrhu kapilare korištena kao referentna vrijednost za različite konfiguracije.
Tokom studije, nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i kontraelektrode je procijenjeno u smislu formiranja Taylor konusa, stabilnosti Taylor konusa, stabilnosti proizvodnje EWNS i reproduktivnosti.Različite kombinacije su prikazane u Dodatnoj tabeli S1.
Izlaz sistema za generisanje EWNS bio je direktno povezan na analizator veličine čestica mobilnosti skeniranja (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, MN) za mjerenje koncentracije broja čestica, kao i na aerosol Faraday elektrometar (TSI, model 3068B, Shoreview, MN).) za struje aerosola izmjeren je kako je opisano u našoj prethodnoj publikaciji.I SMPS i aerosolni elektrometar uzorkovani su pri brzini protoka od 0,5 L/min (ukupni protok uzorka 1 L/min).Brojna koncentracija čestica i protok aerosola mjereni su 120 sekundi.Mjerenje se ponavlja 30 puta.Na osnovu trenutnih mjerenja, izračunava se ukupno punjenje aerosola i procjenjuje se prosječno punjenje EWNS za dati ukupan broj odabranih EWNS čestica.Prosječna cijena EWNS-a može se izračunati pomoću jednačine (1):
gdje je IEl izmjerena struja, NSMPS je digitalna koncentracija mjerena pomoću SMPS, a φEl je brzina protoka po elektrometru.
Budući da relativna vlažnost (RH) utiče na površinsko punjenje, temperatura i (RH) su održavane konstantnim tokom eksperimenta na 21°C odnosno 45%.
Mikroskopija atomske sile (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornija) i sonda AC260T (Olympus, Tokyo, Japan) korišteni su za mjerenje veličine i životnog vijeka EWNS-a.Frekvencija AFM skeniranja bila je 1 Hz, površina skeniranja je bila 5 μm × 5 μm i 256 linija skeniranja.Sve slike su podvrgnute poravnanju slike prvog reda pomoću softvera Asylum (opseg maske 100 nm, prag 100 pm).
Testni lijevak je uklonjen i površina liskuna je postavljena na udaljenosti od 2,0 cm od kontraelektrode u prosjeku od 120 s kako bi se izbjeglo aglomeriranje čestica i stvaranje nepravilnih kapljica na površini liskuna.EWNS je prskan direktno na površinu svježe isječenog liskuna (Ted Pella, Redding, CA).Slika površine liskuna odmah nakon AFM raspršivanja.Kontaktni ugao površine svježe rezanog nemodificiranog liskuna je blizu 0°, pa je EVNS raspoređen na površini liskuna u obliku kupole.Prečnik (a) i visina (h) difuznih kapljica izmereni su direktno iz AFM topografije i korišćeni za izračunavanje zapremine EWNS kupole difuzije koristeći našu prethodno validiranu metodu.Pod pretpostavkom da ugrađeni EWNS ima istu zapreminu, ekvivalentni prečnik se može izračunati pomoću jednačine (2):
Na osnovu naše prethodno razvijene metode, spin zamka elektronske spinske rezonancije (ESR) korištena je za detekciju prisutnosti kratkoživućih radikalnih intermedijara u EWNS.Aerosoli su propušteni kroz 650 μm Midget sparger (Ace Glass, Vineland, NJ) koji sadrži 235 mM rastvor DEPMPO (5-(dietoksifosforil)-5-metil-1-pirolin-N-oksid) (Oxis International Inc.).Portland, Oregon).Sva ESR mjerenja su obavljena korištenjem Bruker EMX spektrometra (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD) i ćelije ravnog panela.Za prikupljanje i analizu podataka korišten je softver Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, SAD).Određivanje karakteristika ROS-a izvršeno je samo za skup radnih uslova [-6,5 kV, 4,0 cm].Koncentracije EWNS mjerene su korištenjem SMPS nakon obračuna gubitaka EWNS u udarnom elementu.
Nivoi ozona su praćeni pomoću 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Za sva svojstva EWNS-a, srednja vrijednost se koristi kao vrijednost mjerenja, a standardna devijacija se koristi kao greška mjerenja.Izvršeni su T-testovi kako bi se uporedile vrijednosti optimiziranih EWNS atributa sa odgovarajućim vrijednostima osnovnog EWNS-a.
Slika 2c prikazuje prethodno razvijen i karakteriziran elektrostatički precipitacijski (EPES) “pull” sistem koji se može koristiti za ciljanu isporuku EWNS na površini.EPES koristi EVNS naboje koji se mogu „voditi“ direktno na površinu mete pod uticajem jakog električnog polja.Detalji EPES sistema predstavljeni su u nedavnoj publikaciji Pyrgiotakis et al.11 .Dakle, EPES se sastoji od 3D štampane PVC komore sa suženim krajevima i sadrži dvije paralelne metalne ploče od nehrđajućeg čelika (304 nehrđajući čelik, presvučene ogledalom) u sredini na udaljenosti od 15,24 cm.Ploče su bile spojene na eksterni izvor visokog napona (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), donja ploča je uvijek bila povezana na pozitivan napon, a gornja ploča je uvijek bila spojena na uzemljenje (plutajuće uzemljenje).Zidovi komore su prekriveni aluminijskom folijom, koja je električno uzemljena kako bi se spriječio gubitak čestica.Komora ima zatvorena prednja vrata za punjenje koja omogućavaju postavljanje testnih površina na plastične postolje koji ih podižu iznad donje metalne ploče kako bi se izbjegle smetnje visokog napona.
Efikasnost taloženja EWNS-a u EPES-u izračunata je prema prethodno razvijenom protokolu detaljno prikazanom na Dodatnoj slici S111.
Kao kontrolna komora, druga cilindrična protočna komora je serijski spojena na EPES sistem, u kojem je korišćen srednji HEPA filter za uklanjanje EWNS-a.Kao što je prikazano na slici 2c, EWNS aerosol je pumpan kroz dvije ugrađene komore.Filter između kontrolne sobe i EPES-a uklanja sve preostale EWNS što rezultira istom temperaturom (T), relativnom vlagom (RH) i nivoima ozona.
Utvrđeno je da važni mikroorganizmi koji se prenose hranom kontaminiraju svježu hranu kao što su E. coli (ATCC #27325), fekalni indikator, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen koji se prenosi hranom, bezopasna Listeria (ATCC #33090), surogat za patogenu Listeria monocytogenes, izveden iz MaATcharecesssa (MaATcharecesssa) (MaATcharecesssa SCC) CC #4098), zamjena za kvasac za kvarenje, i otpornija inaktivirana bakterija, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Kupite nasumične kutije organskog paradajza od grožđa sa vašeg lokalnog tržišta i ostavite u frižideru na 4°C do upotrebe (do 3 dana).Eksperimentalni paradajz je bio iste veličine, oko 1/2 inča u prečniku.
Protokoli kulture, inokulacije, izloženosti i brojanja kolonija detaljno su opisani u našoj prethodnoj publikaciji i detaljni u Dodatnim podacima.Efikasnost EWNS-a je procenjena izlaganjem inokulisanog paradajza 40.000 #/cm3 tokom 45 minuta.Ukratko, tri paradajza su korištena za procjenu preživjelih mikroorganizama u vremenu t = 0 min.Tri paradajza su stavljena u EPES i izložena EWNS pri 40.000 #/cc (paradajz izložen EWNS), a preostala tri su stavljena u kontrolnu komoru (kontrolni paradajz).Dodatna obrada paradajza u obe grupe nije vršena.Paradajz izložen EWNS-u i kontrolni paradajz uklonjeni su nakon 45 minuta kako bi se procijenio učinak EWNS-a.
Svaki eksperiment je izveden u tri primjerka.Analiza podataka obavljena je prema protokolu opisanom u Dodatnim podacima.
Mehanizmi inaktivacije su procijenjeni sedimentacijom izloženih EWNS uzoraka (45 min pri 40.000 #/cm3 EWNS koncentracije aerosola) i neozračenih uzoraka bezopasnih bakterija E. coli, Salmonella enterica i Lactobacillus.Čestice su fiksirane u 2,5% glutaraldehida, 1,25% paraformaldehida i 0,03% pikrinske kiseline u 0,1 M natrijum-kakodilatnom puferu (pH 7,4) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi.Nakon pranja, naknadno fiksirati sa 1% osmijum tetroksida (OsO4)/1,5% kalijum ferocijanida (KFeCN6) 2 sata, isprati 3 puta u vodi i inkubirati u 1% uranil acetatu 1 sat, zatim dva puta isprati u vodi, zatim dehidrirati 10 minuta 70 05%, 0% alkohola.Uzorci su zatim stavljeni u propilen oksid na 1 sat i impregnirani 1:1 mješavinom propilen oksida i TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA).Uzorci su ugrađeni u TAAB Epon i polimerizovani na 60°C tokom 48 sati.Stvrdnuta granulirana smola je izrezana i vizualizirana TEM pomoću konvencionalnog transmisionog elektronskog mikroskopa JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japan) opremljenog AMT 2k CCD kamerom (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, SAD).
Svi eksperimenti su izvedeni u tri primjerka.Za svaku vremensku tačku, bakterijska ispiranja su zasijana u tri primjerka, što je rezultiralo ukupno devet tačaka podataka po točki, čiji je prosjek korišten kao bakterijska koncentracija za taj određeni mikroorganizam.Kao greška mjerenja korištena je standardna devijacija.Svi bodovi se računaju.
Logaritam smanjenja koncentracije bakterija u odnosu na t = 0 min izračunat je pomoću sljedeće formule:
gdje je C0 koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u trenutku 0 (tj. nakon što se površina osuši ali prije stavljanja u komoru) i Cn je koncentracija bakterija na površini nakon n minuta izlaganja.
Da bi se uzela u obzir prirodna degradacija bakterija tokom 45-minutnog izlaganja, log smanjenje u odnosu na kontrolu nakon 45 minuta također je izračunato na sljedeći način:
gdje je Cn koncentracija bakterija u kontrolnom uzorku u trenutku n, a Cn-Control je koncentracija kontrolne bakterije u trenutku n.Podaci su predstavljeni kao log smanjenja u poređenju sa kontrolom (bez izloženosti EWNS-u).
Tokom studije, nekoliko kombinacija napona i udaljenosti između igle i kontraelektrode je procijenjeno u smislu formiranja Taylor konusa, stabilnosti Taylor konusa, stabilnosti proizvodnje EWNS i reproduktivnosti.Različite kombinacije su prikazane u Dodatnoj tabeli S1.Dva slučaja koja pokazuju stabilna i ponovljiva svojstva (Taylor konus, EWNS generacija i stabilnost tokom vremena) odabrana su za sveobuhvatnu studiju.Na sl.Slika 3 prikazuje rezultate za punjenje, veličinu i sadržaj ROS-a u oba slučaja.Rezultati su takođe prikazani u tabeli 1. Za referencu, i slika 3 i tabela 1 uključuju svojstva prethodno sintetizovanog neoptimizovanog EWNS8, 9, 10, 11 (osnovni-EWNS).Izračuni statističke značajnosti korištenjem dvostranog t-testa ponovo su objavljeni u Dodatnoj tabeli S2.Osim toga, dodatni podaci uključuju studije učinka promjera rupe za uzorkovanje kontra elektrode (D) i udaljenosti između uzemljene elektrode i vrha (L) (dodatne slike S2 ​​i S3).
(ac) Raspodjela veličina mjerena AFM-om.(df) Karakteristika površinskog naboja.(g) ROS karakterizacija EPR-a.
Takođe je važno napomenuti da je za sve gore navedene uslove izmjerena jonizacijska struja bila između 2 i 6 μA i napon između -3,8 i -6,5 kV, što je rezultiralo potrošnjom energije manjom od 50 mW za ovaj pojedinačni EWNS generacijski kontaktni modul.Iako je EWNS sintetizovan pod visokim pritiskom, nivoi ozona su bili veoma niski, nikada nisu prelazili 60 ppb.
Dodatna slika S4 prikazuje simulirana električna polja za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm].Za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], proračuni polja su 2 × 105 V/m i 4,7 × 105 V/m, respektivno.Ovo je očekivano, jer je u drugom slučaju odnos napona i udaljenosti mnogo veći.
Na sl.3a,b prikazuje prečnik EWNS izmeren sa AFM8.Izračunati prosječni prečnici EWNS bili su 27 nm i 19 nm za šeme [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], respektivno.Za scenarije [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], geometrijske standardne devijacije distribucija su 1,41 i 1,45, respektivno, što ukazuje na usku distribuciju veličine.I srednja veličina i geometrijska standardna devijacija su veoma blizu osnovnoj liniji EWNS, na 25 nm i 1,41, respektivno.Na sl.3c prikazuje distribuciju veličine osnovnog EWNS-a izmjerenu korištenjem iste metode pod istim uvjetima.
Na sl.3d,e prikazuje rezultate karakterizacije naboja.Podaci su prosječna mjerenja 30 istovremenih mjerenja koncentracije (#/cm3) i struje (I).Analiza pokazuje da je prosječno punjenje na EWNS 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- za [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], respektivno.Imaju značajno veće površinske naboje u poređenju sa osnovnim EWNS (10 ± 2 e-), dva puta veće od scenarija [-6,5 kV, 4,0 cm] i četiri puta veće od [-3,8 kV, 0,5 cm].Slika 3f prikazuje punjenje.podaci za Baseline-EWNS.
Iz mapa koncentracije EWNS broja (dodatne slike S5 i S6), može se vidjeti da scenarij [-6,5 kV, 4,0 cm] ima znatno više čestica od scenarija [-3,8 kV, 0,5 cm].Također je vrijedno napomenuti da je koncentracija EWNS broja praćena do 4 sata (dodatne slike S5 i S6), pri čemu je stabilnost generiranja EWNS pokazala iste razine koncentracije broja čestica u oba slučaja.
Na sl.3g prikazuje EPR spektar nakon oduzimanja optimizovane EWNS kontrole (pozadina) na [-6,5 kV, 4,0 cm].ROS spektri su takođe upoređeni sa scenarijem Baseline-EWNS u prethodno objavljenom radu.Broj EWNS koji reaguju sa spin zamkama je izračunat na 7,5 × 104 EWNS/s, što je slično prethodno objavljenom Baseline-EWNS8.EPR spektri su jasno pokazali prisustvo dva tipa ROS, pri čemu je O2- dominantna vrsta, a OH• manje zastupljen.Osim toga, direktno poređenje vršnih intenziteta pokazalo je da optimizirani EWNS ima značajno veći sadržaj ROS u odnosu na osnovni EWNS.
Na sl.4 prikazuje efikasnost taloženja EWNS u EPES.Podaci su takođe sažeti u tabeli I i upoređeni sa originalnim podacima EWNS-a.Za oba slučaja EUNS-a, taloženje je blizu 100% čak i pri niskom naponu od 3,0 kV.Tipično, 3,0 kV je dovoljno za 100% taloženje, bez obzira na promjenu površinskog naboja.Pod istim uslovima, efikasnost taloženja Baseline-EWNS bila je samo 56% zbog njihovog nižeg naelektrisanja (prosečno 10 elektrona po EWNS).
Na sl.5 i u tabeli.2 sumira vrijednost inaktivacije mikroorganizama inokuliranih na površini paradajza nakon izlaganja oko 40 000 #/cm3 EWNS u trajanju od 45 minuta na optimalnom režimu [-6,5 kV, 4,0 cm].Inokulirane E. coli i Lactobacillus innocuous su pokazale značajno smanjenje od 3,8 log tokom 45-minutnog izlaganja.Pod istim uslovima, S. enterica je imala smanjenje od 2,2 log, dok su S. cerevisiae i M. parafortutum imale pad od 1,0 log.
Elektronski mikrosnimci (Slika 6) prikazuju fizičke promjene izazvane EWNS na bezopasnim stanicama Escherichia coli, Streptococcus i Lactobacillus koje dovode do njihove inaktivacije.Kontrolne bakterije su imale netaknute ćelijske membrane, dok su izložene bakterije imale oštećene vanjske membrane.
Elektronsko mikroskopsko snimanje kontrolnih i izloženih bakterija otkrilo je oštećenje membrane.
Podaci o fizičko-hemijskim svojstvima optimizovanog EWNS zajedno pokazuju da su svojstva (površinski naboj i sadržaj ROS) EWNS-a značajno poboljšana u poređenju sa prethodno objavljenim osnovnim podacima EWNS8,9,10,11.S druge strane, njihova veličina je ostala u nanometarskom rasponu, vrlo sličnom rezultatima ranije objavljenim, omogućavajući im da ostanu u zraku duži vremenski period.Uočena polidisperznost se može objasniti promjenama površinskog naboja koje određuju veličinu EWNS-a, slučajnost Rayleighovog efekta i potencijalnu koalescenciju.Međutim, kako su detaljno objasnili Nielsen et al.22, visoko površinsko punjenje smanjuje isparavanje efektivno povećavajući površinsku energiju/napetost kapljice vode.U našoj prethodnoj publikaciji8 ova teorija je eksperimentalno potvrđena za mikrokapljice 22 i EWNS.Gubitak punjenja tokom prekovremenog rada takođe može uticati na veličinu i doprineti posmatranoj distribuciji veličine.