ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงผลเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
โปรแกรมแสดงภาพสไลด์แบบหมุนเวียน แสดงภาพสามภาพพร้อมกัน ใช้ปุ่ม "ก่อนหน้า" และ "ถัดไป" เพื่อเลื่อนดูสไลด์ทีละสามภาพ หรือใช้ปุ่มเลื่อนที่ด้านท้ายเพื่อเลื่อนดูสไลด์ทีละสามภาพ
เมื่อเร็วๆ นี้ ได้มีการพัฒนาแพลตฟอร์มต้านจุลชีพแบบปราศจากสารเคมีโดยใช้เทคโนโลยีนาโน โดยใช้โครงสร้างนาโนน้ำเทียม (EWNS) EWNS มีประจุบนพื้นผิวสูงและอิ่มตัวด้วยสารออกซิเจนที่ว่องไว (ROS) ซึ่งสามารถทำปฏิกิริยาและยับยั้งจุลินทรีย์หลายชนิด รวมถึงเชื้อก่อโรคในอาหาร ในที่นี้แสดงให้เห็นว่าคุณสมบัติของ EWNS ในระหว่างการสังเคราะห์สามารถปรับแต่งและเพิ่มประสิทธิภาพเพื่อเพิ่มศักยภาพในการต้านเชื้อแบคทีเรียให้ดียิ่งขึ้น แพลตฟอร์มห้องปฏิบัติการ EWNS ถูกออกแบบมาเพื่อปรับแต่งคุณสมบัติของ EWNS โดยการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์การสังเคราะห์ มีการวิเคราะห์คุณสมบัติของ EWNS (ประจุ ขนาด และปริมาณ ROS) โดยใช้วิธีการวิเคราะห์ที่ทันสมัย ​​นอกจากนี้ ยังมีการประเมินศักยภาพในการยับยั้งจุลินทรีย์ก่อโรคในอาหาร เช่น Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum และ Saccharomyces cerevisiae ผลลัพธ์ที่นำเสนอในที่นี้แสดงให้เห็นว่าคุณสมบัติของ EWNS สามารถปรับแต่งได้อย่างละเอียดในระหว่างการสังเคราะห์ ส่งผลให้ประสิทธิภาพในการยับยั้งเชื้อเพิ่มขึ้นอย่างมาก โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ประจุบนพื้นผิวเพิ่มขึ้นถึงสี่เท่า และชนิดของออกซิเจนที่ออกฤทธิ์ก็เพิ่มขึ้น อัตราการกำจัดจุลินทรีย์ขึ้นอยู่กับชนิดของจุลินทรีย์ และมีค่าตั้งแต่ 1.0 ถึง 3.8 ล็อก หลังจากสัมผัสกับละออง EWNS ในปริมาณ 40,000 #/cc เป็นเวลา 45 นาที
การปนเปื้อนของจุลินทรีย์เป็นสาเหตุหลักของโรคที่เกิดจากอาหาร ซึ่งเกิดจากการรับประทานเชื้อโรคหรือสารพิษของเชื้อโรคเหล่านั้น ในสหรัฐอเมริกาเพียงประเทศเดียว โรคที่เกิดจากอาหารก่อให้เกิดการเจ็บป่วยประมาณ 76 ล้านราย การเข้ารักษาในโรงพยาบาล 325,000 ราย และเสียชีวิต 5,000 รายในแต่ละปี¹ นอกจากนี้ กระทรวงเกษตรของสหรัฐอเมริกา (USDA) ประมาณการว่าการบริโภคผักและผลไม้สดที่เพิ่มขึ้นเป็นสาเหตุของโรคที่เกิดจากอาหารทั้งหมดที่รายงานในสหรัฐอเมริกาถึง 48%² ค่าใช้จ่ายของโรคและการเสียชีวิตที่เกิดจากเชื้อโรคในอาหารในสหรัฐอเมริกานั้นสูงมาก โดยศูนย์ควบคุมและป้องกันโรค (CDC) ประมาณการไว้ที่มากกว่า 15.6 พันล้านดอลลาร์สหรัฐต่อปี³
ปัจจุบัน การแทรกแซงทางเคมี4 รังสี5 และความร้อน6 เพื่อฆ่าเชื้อจุลินทรีย์เพื่อความปลอดภัยของอาหารส่วนใหญ่ดำเนินการเฉพาะจุดควบคุมวิกฤต (CCP) ที่จำกัดตามห่วงโซ่การผลิต (โดยปกติหลังการเก็บเกี่ยวและ/หรือระหว่างการบรรจุ) มากกว่าที่จะดำเนินการอย่างต่อเนื่อง ดังนั้นจึงมีแนวโน้มที่จะเกิดการปนเปื้อนข้าม 7. การควบคุมโรคที่เกิดจากอาหารและการเน่าเสียของอาหารที่ดีขึ้นจำเป็นต้องมีการแทรกแซงเพื่อฆ่าเชื้อจุลินทรีย์ที่สามารถนำไปใช้ได้ตลอดห่วงโซ่การผลิตตั้งแต่ฟาร์มจนถึงโต๊ะอาหาร ในขณะเดียวกันก็ลดผลกระทบต่อสิ่งแวดล้อมและต้นทุน
เมื่อเร็วๆ นี้ ได้มีการพัฒนาแพลตฟอร์มต้านจุลชีพแบบปราศจากสารเคมีโดยใช้เทคโนโลยีนาโน ซึ่งสามารถยับยั้งแบคทีเรียบนพื้นผิวและในอากาศได้โดยใช้โครงสร้างนาโนน้ำเทียม (EWNS) EWNS ถูกสังเคราะห์ขึ้นโดยใช้กระบวนการคู่ขนานสองกระบวนการ ได้แก่ การพ่นด้วยไฟฟ้าและการแตกตัวเป็นไอออนของน้ำ (รูปที่ 1a) การศึกษาในอดีตแสดงให้เห็นว่า EWNS มีคุณสมบัติทางกายภาพและชีวภาพที่เป็นเอกลักษณ์8,9,10 EWNS มีอิเล็กตรอนเฉลี่ย 10 ตัวต่อโครงสร้าง และมีขนาดระดับนาโนเฉลี่ย 25 ​​นาโนเมตร (รูปที่ 1b,c)8,9,10 นอกจากนี้ การเรโซแนนซ์สปินอิเล็กตรอน (ESR) แสดงให้เห็นว่า EWNS มีสารออกซิเจนที่ว่องไว (ROS) จำนวนมาก โดยส่วนใหญ่เป็นอนุมูลไฮดรอกซิล (OH•) และอนุมูลซูเปอร์ออกไซด์ (O2-) (รูปที่ 1c)8 EWNS อยู่ในอากาศเป็นเวลานานและสามารถชนกับจุลินทรีย์ที่แขวนลอยอยู่ในอากาศและอยู่บนพื้นผิว ส่งมอบสาร ROS และทำให้จุลินทรีย์ไม่ทำงาน (รูปที่ 1d) การศึกษาในช่วงแรกเหล่านี้ยังแสดงให้เห็นว่า EWNS สามารถทำปฏิกิริยาและยับยั้งแบคทีเรียแกรมลบและแกรมบวกหลายชนิด รวมถึงไมโคแบคทีเรีย บนพื้นผิวและในอากาศได้ การใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านแสดงให้เห็นว่าการยับยั้งเกิดจากการทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ นอกจากนี้ การศึกษาการสูดดมแบบเฉียบพลันยังแสดงให้เห็นว่า EWNS ในปริมาณสูงไม่ก่อให้เกิดความเสียหายหรือการอักเสบในปอด 8
(a) การพ่นด้วยไฟฟ้าเกิดขึ้นเมื่อมีการใช้แรงดันไฟฟ้าสูงระหว่างหลอดแคปิลลารีที่มีของเหลวอยู่ภายในกับขั้วไฟฟ้าตรงข้าม (b) การใช้แรงดันสูงส่งผลให้เกิดปรากฏการณ์ที่แตกต่างกันสองอย่าง ได้แก่ (i) การพ่นน้ำด้วยไฟฟ้า และ (ii) การก่อตัวของสารออกซิเจนที่ว่องไว (ไอออน) ที่ถูกกักอยู่ใน EWNS (c) โครงสร้างที่เป็นเอกลักษณ์ของ EWNS (d) เนื่องจากมีขนาดระดับนาโน EWNS จึงเคลื่อนที่ได้สูงและสามารถโต้ตอบกับเชื้อโรคในอากาศได้
ความสามารถของแพลตฟอร์มต้านจุลชีพ EWNS ในการยับยั้งจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคในอาหารบนพื้นผิวของอาหารสดได้รับการพิสูจน์แล้วเมื่อเร็ว ๆ นี้ นอกจากนี้ยังแสดงให้เห็นว่าประจุบนพื้นผิวของ EWNS ร่วมกับสนามไฟฟ้าสามารถใช้ในการส่งสารไปยังเป้าหมายได้อย่างแม่นยำ ยิ่งไปกว่านั้น ผลการทดลองเบื้องต้นกับมะเขือเทศอินทรีย์หลังจากสัมผัสกับ EWNS ประมาณ 50,000 #/cm³ เป็นเวลา 90 นาที ก็เป็นที่น่าพอใจ โดยพบจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคในอาหารหลายชนิด เช่น E. coli และ Listeria 11 นอกจากนี้ การทดสอบทางประสาทสัมผัสเบื้องต้นแสดงให้เห็นว่าไม่มีผลกระทบต่อประสาทสัมผัสเมื่อเทียบกับมะเขือเทศกลุ่มควบคุม แม้ว่าผลการยับยั้งเบื้องต้นเหล่านี้จะน่าพอใจสำหรับการใช้งานด้านความปลอดภัยของอาหาร แม้ในปริมาณ EWNS ที่ต่ำมากเพียง 50,000 #/cc ก็ตาม แต่ก็เห็นได้ชัดว่าศักยภาพในการยับยั้งที่สูงขึ้นจะเป็นประโยชน์มากกว่าในการลดความเสี่ยงของการติดเชื้อและการเน่าเสียต่อไป
ในงานวิจัยนี้ เราจะมุ่งเน้นไปที่การพัฒนาแพลตฟอร์มการสร้าง EWNS เพื่อให้สามารถปรับแต่งพารามิเตอร์การสังเคราะห์และเพิ่มประสิทธิภาพคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของ EWNS เพื่อเพิ่มศักยภาพในการต้านเชื้อแบคทีเรีย โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การเพิ่มประสิทธิภาพได้มุ่งเน้นไปที่การเพิ่มประจุบนพื้นผิว (เพื่อปรับปรุงการส่งยาไปยังเป้าหมาย) และปริมาณ ROS (เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการยับยั้ง) เราจะทำการวิเคราะห์คุณสมบัติทางกายภาพและเคมีที่ได้รับการปรับปรุงแล้ว (ขนาด ประจุ และปริมาณ ROS) โดยใช้วิธีการวิเคราะห์ที่ทันสมัย ​​และใช้จุลินทรีย์ในอาหารทั่วไป เช่น E. coli เป็นต้น
EVNS ถูกสังเคราะห์โดยการพ่นด้วยไฟฟ้าและการแตกตัวเป็นไอออนพร้อมกันของน้ำบริสุทธิ์สูง (18 MΩ cm–1) เครื่องพ่นละอองไฟฟ้า 12 โดยทั่วไปใช้สำหรับการทำให้ของเหลวเป็นละอองและการสังเคราะห์อนุภาคพอลิเมอร์และเซรามิก 13 และเส้นใย 14 ที่มีขนาดที่ควบคุมได้
ดังรายละเอียดในเอกสารเผยแพร่ก่อนหน้านี้ 8, 9, 10, 11 ในการทดลองทั่วไป จะมีการใช้แรงดันไฟฟ้าสูงระหว่างท่อโลหะและขั้วไฟฟ้าเคาน์เตอร์ที่ต่อลงดิน ในระหว่างกระบวนการนี้ จะเกิดปรากฏการณ์ที่แตกต่างกันสองอย่าง ได้แก่ i) การพ่นด้วยไฟฟ้า และ ii) การแตกตัวเป็นไอออนของน้ำ สนามไฟฟ้าแรงสูงระหว่างขั้วไฟฟ้าทั้งสองทำให้ประจุลบสะสมบนพื้นผิวของน้ำที่ควบแน่น ส่งผลให้เกิดการก่อตัวของกรวยเทย์เลอร์ ผลที่ตามมาคือ หยดน้ำที่มีประจุสูงจะก่อตัวขึ้น ซึ่งจะแตกตัวต่อไปเป็นอนุภาคขนาดเล็กตามทฤษฎีของเรย์ลีห์16 ในขณะเดียวกัน สนามไฟฟ้าแรงสูงทำให้โมเลกุลของน้ำบางส่วนแตกตัวและดึงอิเล็กตรอนออก (แตกตัวเป็นไอออน) ซึ่งนำไปสู่การก่อตัวของสารออกซิเจนที่ว่องไว (ROS) จำนวนมาก17 ROS ที่เกิดขึ้นพร้อมกัน18 ถูกห่อหุ้มไว้ใน EWNS (รูปที่ 1c)
ภาพที่ 2a แสดงระบบการสร้าง EWNS ที่พัฒนาและใช้ในการสังเคราะห์ EWNS ในการศึกษาครั้งนี้ น้ำบริสุทธิ์ที่เก็บไว้ในขวดปิดสนิทถูกส่งผ่านท่อเทฟลอน (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 2 มม.) เข้าไปในเข็มสแตนเลสขนาด 30G (หลอดแคปิลลารีโลหะ) การไหลของน้ำถูกควบคุมโดยความดันอากาศภายในขวด ดังแสดงในภาพที่ 2b เข็มถูกติดตั้งบนฐานเทฟลอนและสามารถปรับระยะห่างจากขั้วไฟฟ้าตรงข้ามได้ด้วยตนเอง ขั้วไฟฟ้าตรงข้ามเป็นแผ่นอลูมิเนียมขัดเงาที่มีรูตรงกลางสำหรับเก็บตัวอย่าง ด้านล่างของขั้วไฟฟ้าตรงข้ามเป็นกรวยเก็บตัวอย่างอลูมิเนียม ซึ่งเชื่อมต่อกับอุปกรณ์ทดลองส่วนที่เหลือผ่านทางพอร์ตเก็บตัวอย่าง (ภาพที่ 2b) เพื่อหลีกเลี่ยงการสะสมประจุที่อาจรบกวนการทำงานของเครื่องเก็บตัวอย่าง ส่วนประกอบทั้งหมดของเครื่องเก็บตัวอย่างจึงต่อลงดิน
(a) ระบบสร้างโครงสร้างนาโนของน้ำที่ได้รับการออกแบบทางวิศวกรรม (EWNS) (b) ภาพตัดขวางของอุปกรณ์เก็บตัวอย่างและระบบพ่นละอองไฟฟ้า แสดงพารามิเตอร์ที่สำคัญที่สุด (c) การจัดเตรียมอุปกรณ์ทดลองสำหรับการยับยั้งแบคทีเรีย
ระบบสร้าง EWNS ที่อธิบายไว้ข้างต้นสามารถเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์การทำงานหลักเพื่ออำนวยความสะดวกในการปรับแต่งคุณสมบัติของ EWNS อย่างละเอียด ปรับแรงดันไฟฟ้าที่ใช้ (V) ระยะห่างระหว่างเข็มและขั้วไฟฟ้าตรงข้าม (L) และการไหลของน้ำ (φ) ผ่านท่อแคปิลลารีเพื่อปรับแต่งคุณลักษณะของ EWNS สัญลักษณ์ที่ใช้แทนการรวมกันที่แตกต่างกัน: [V (kV), L (cm)] ปรับการไหลของน้ำเพื่อให้ได้กรวยเทย์เลอร์ที่เสถียรของชุด [V, L] ที่กำหนดไว้ สำหรับการศึกษาครั้งนี้ เส้นผ่านศูนย์กลางของช่องเปิดของขั้วไฟฟ้าตรงข้าม (D) ถูกกำหนดไว้ที่ 0.5 นิ้ว (1.29 ซม.)
เนื่องจากข้อจำกัดทางเรขาคณิตและความไม่สมมาตร จึงไม่สามารถคำนวณความแรงของสนามไฟฟ้าจากหลักการพื้นฐานได้ ดังนั้นจึงใช้ซอฟต์แวร์ QuickField™ (Svendborg, เดนมาร์ก)19 ในการคำนวณสนามไฟฟ้า เนื่องจากสนามไฟฟ้าไม่สม่ำเสมอ จึงใช้ค่าสนามไฟฟ้าที่ปลายหลอดแคปิลลารีเป็นค่าอ้างอิงสำหรับการกำหนดค่าต่างๆ
ในระหว่างการศึกษา ได้มีการประเมินค่าแรงดันไฟฟ้าและระยะห่างระหว่างเข็มกับขั้วไฟฟ้าหลายแบบ ในแง่ของการก่อตัวของกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของการผลิต EWNS และความสามารถในการทำซ้ำได้ โดยค่าต่างๆ แสดงอยู่ในตารางเสริม S1
เอาต์พุตของระบบสร้าง EWNS เชื่อมต่อโดยตรงกับเครื่องวิเคราะห์ขนาดอนุภาคแบบสแกนนิ่งโมบิลิตี้ (SMPS, รุ่น 3936, TSI, Shoreview, MN) สำหรับการวัดความเข้มข้นของจำนวนอนุภาค และกับเครื่องวัดกระแสไฟฟ้าแบบฟาราเดย์ของละอองลอย (TSI, รุ่น 3068B, Shoreview, MN) สำหรับการวัดกระแสละอองลอยตามที่อธิบายไว้ในเอกสารเผยแพร่ก่อนหน้าของเรา ทั้ง SMPS และเครื่องวัดกระแสไฟฟ้าของละอองลอยเก็บตัวอย่างที่อัตราการไหล 0.5 ลิตร/นาที (อัตราการไหลของตัวอย่างทั้งหมด 1 ลิตร/นาที) ความเข้มข้นของจำนวนอนุภาคและการไหลของละอองลอยถูกวัดเป็นเวลา 120 วินาที การวัดนี้ทำซ้ำ 30 ครั้ง จากการวัดกระแสไฟฟ้า จะคำนวณประจุรวมของละอองลอยและประมาณประจุเฉลี่ยของ EWNS สำหรับจำนวนอนุภาค EWNS ที่เลือกทั้งหมดที่กำหนด ต้นทุนเฉลี่ยของ EWNS สามารถคำนวณได้โดยใช้สมการ (1):
โดยที่ IEl คือกระแสไฟฟ้าที่วัดได้, NSMPS คือความเข้มข้นแบบดิจิทัลที่วัดได้ด้วย SMPS และ φEl คืออัตราการไหลต่อเครื่องวัดกระแสไฟฟ้า
เนื่องจากความชื้นสัมพัทธ์ (RH) มีผลต่อประจุบนพื้นผิว ดังนั้นอุณหภูมิและความชื้นสัมพัทธ์จึงถูกควบคุมให้คงที่ตลอดการทดลอง โดยคงไว้ที่ 21°C และ 45% ตามลำดับ
ใช้กล้องจุลทรรศน์แรงอะตอม (AFM) รุ่น Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) และหัววัด AC260T (Olympus, Tokyo, Japan) ในการวัดขนาดและอายุการใช้งานของ EWNS ความถี่ในการสแกนของ AFM คือ 1 Hz พื้นที่การสแกนคือ 5 μm × 5 μm และจำนวนเส้นสแกน 256 เส้น ภาพทั้งหมดได้รับการจัดเรียงภาพลำดับที่ 1 โดยใช้ซอฟต์แวร์ Asylum (ช่วงมาสก์ 100 nm, เกณฑ์ 100 pm)
นำกรวยทดสอบออก และวางพื้นผิวไมกาที่ระยะห่าง 2.0 ซม. จากขั้วไฟฟ้าตรงข้ามเป็นเวลาเฉลี่ย 120 วินาที เพื่อหลีกเลี่ยงการรวมตัวของอนุภาคและการก่อตัวของหยดน้ำที่ไม่สม่ำเสมอบนพื้นผิวไมกา ฉีดพ่น EWNS โดยตรงลงบนพื้นผิวของไมกาที่ตัดใหม่ (Ted Pella, Redding, CA) ภาพพื้นผิวไมกาหลังจากสปัตเตอร์ด้วย AFM ทันที มุมสัมผัสของพื้นผิวไมกาที่ตัดใหม่ที่ไม่ได้ดัดแปลงนั้นใกล้เคียงกับ 0° ดังนั้น EVNS จึงกระจายตัวบนพื้นผิวไมกาในรูปทรงโดม วัดเส้นผ่านศูนย์กลาง (a) และความสูง (h) ของหยดน้ำที่แพร่กระจายโดยตรงจากภาพภูมิประเทศ AFM และใช้ในการคำนวณปริมาตรการแพร่กระจายแบบโดมของ EWNS โดยใช้วิธีการที่ได้รับการตรวจสอบแล้วก่อนหน้านี้ของเรา สมมติว่า EWNS บนเครื่องมีปริมาตรเท่ากัน สามารถคำนวณเส้นผ่านศูนย์กลางเทียบเท่าได้โดยใช้สมการ (2):
จากวิธีการที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้ของเรา ได้มีการใช้กับดักสปินแบบอิเล็กตรอนสปินเรโซแนนซ์ (ESR) เพื่อตรวจจับการมีอยู่ของสารตัวกลางอนุมูลอิสระที่มีอายุสั้นใน EWNS โดยทำการเป่าละอองผ่านหัวฉีด Midget ขนาด 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) ที่บรรจุสารละลาย DEPMPO (5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) ความเข้มข้น 235 mM (Oxis International Inc., Portland, Oregon) การวัด ESR ทั้งหมดดำเนินการโดยใช้เครื่องสเปกโทรเมตร Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) และเซลล์แบบแผงเรียบ ซอฟต์แวร์ Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) ถูกใช้ในการเก็บรวบรวมและวิเคราะห์ข้อมูล การกำหนดลักษณะเฉพาะของ ROS ดำเนินการเฉพาะภายใต้เงื่อนไขการทำงานชุดหนึ่ง [-6.5 kV, 4.0 cm] วัดความเข้มข้นของ EWNS โดยใช้ SMPS หลังจากหักลบการสูญเสีย EWNS ในเครื่องดักจับอนุภาคแล้ว
ระดับโอโซนได้รับการตรวจสอบโดยใช้เครื่องตรวจวัดโอโซนแบบลำแสงคู่ 205™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10
สำหรับคุณสมบัติ EWNS ทั้งหมด ค่าเฉลี่ยจะถูกใช้เป็นค่าการวัด และค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานจะถูกใช้เป็นค่าความคลาดเคลื่อนในการวัด มีการทำการทดสอบ T เพื่อเปรียบเทียบค่าของคุณลักษณะ EWNS ที่ปรับให้เหมาะสมกับค่าที่สอดคล้องกันของ EWNS พื้นฐาน
รูปที่ 2c แสดงระบบ “ดึง” การตกตะกอนด้วยไฟฟ้าสถิต (EPES) ที่พัฒนาและกำหนดลักษณะไว้ก่อนหน้านี้ ซึ่งสามารถใช้สำหรับการส่ง EWNS ไปยังพื้นผิวเป้าหมายได้ EPES ใช้ประจุ EVNS ที่สามารถ “นำทาง” ไปยังพื้นผิวของเป้าหมายโดยตรงภายใต้อิทธิพลของสนามไฟฟ้าแรงสูง รายละเอียดของระบบ EPES ได้ถูกนำเสนอในสิ่งพิมพ์ล่าสุดโดย Pyrgiotakis et al. 11 ดังนั้น EPES ประกอบด้วยห้อง PVC ที่พิมพ์ด้วยเครื่องพิมพ์ 3 มิติที่มีปลายเรียว และมีแผ่นโลหะสแตนเลส (สแตนเลส 304 เคลือบเงา) สองแผ่นขนานกันอยู่ตรงกลางห่างกัน 15.24 ซม. แผ่นโลหะเชื่อมต่อกับแหล่งจ่ายไฟแรงสูงภายนอก (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY) แผ่นด้านล่างเชื่อมต่อกับแรงดันบวกเสมอ และแผ่นด้านบนเชื่อมต่อกับกราวด์เสมอ (กราวด์ลอยตัว) ผนังห้องถูกหุ้มด้วยฟอยล์อลูมิเนียม ซึ่งต่อลงดินเพื่อป้องกันการสูญเสียอนุภาค ห้องทดสอบมีประตูเปิดด้านหน้าที่ปิดสนิท ซึ่งช่วยให้สามารถวางพื้นผิวทดสอบบนขาตั้งพลาสติกที่ยกสูงขึ้นจากแผ่นโลหะด้านล่าง เพื่อหลีกเลี่ยงการรบกวนจากแรงดันไฟฟ้าสูง
ประสิทธิภาพการตกตะกอนของ EWNS ใน EPES ถูกคำนวณตามโปรโตคอลที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้ ซึ่งมีรายละเอียดอยู่ในภาพประกอบเพิ่มเติม S111
เพื่อเป็นห้องควบคุม ได้มีการต่อห้องไหลเวียนทรงกระบอกที่สองเข้ากับระบบ EPES แบบอนุกรม โดยใช้ตัวกรอง HEPA ตัวกลางเพื่อกำจัด EWNS ดังแสดงในรูปที่ 2c ละออง EWNS ถูกสูบผ่านห้องสองห้องที่ติดตั้งอยู่ภายใน ตัวกรองระหว่างห้องควบคุมและ EPES จะกำจัด EWNS ที่เหลืออยู่ ทำให้ได้อุณหภูมิ (T) ความชื้นสัมพัทธ์ (RH) และระดับโอโซนที่เท่ากัน
พบว่าจุลินทรีย์สำคัญที่ก่อให้เกิดโรคจากอาหารปนเปื้อนในอาหารสด เช่น อี. โคไล (ATCC #27325) ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้อุจจาระ ซัลโมเนลลา เอนเทอริกา (ATCC #53647) ซึ่งเป็นเชื้อก่อโรคในอาหาร ลิสเตอเรีย ฮาร์มเลส (ATCC #33090) ซึ่งเป็นตัวแทนของลิสเตอเรีย โมโนไซโตจีนส์ที่ก่อโรค ได้มาจาก ATCC (Manassas, VA) แซคคาโรไมเซส เซเรวิเซีย (ATCC #4098) ซึ่งเป็นตัวแทนของยีสต์ที่ทำให้เกิดการเน่าเสีย และแบคทีเรียที่ไม่ทำงานแล้วที่มีความทนทานมากกว่าอย่าง ไมโคแบคทีเรียม พาราลักกี (ATCC #19686)
ซื้อกล่องมะเขือเทศเชอร์รี่ออร์แกนิกแบบสุ่มจากตลาดท้องถิ่นของคุณ แล้วแช่เย็นที่อุณหภูมิ 4°C จนกว่าจะนำมาใช้ (นานถึง 3 วัน) มะเขือเทศที่ใช้ในการทดลองมีขนาดเท่ากันทั้งหมด ประมาณ 1/2 นิ้วในเส้นผ่านศูนย์กลาง
ขั้นตอนการเพาะเลี้ยง การปลูกเชื้อ การสัมผัส และการนับจำนวนโคโลนีได้อธิบายไว้โดยละเอียดในเอกสารเผยแพร่ก่อนหน้าของเรา และมีรายละเอียดอยู่ในข้อมูลเพิ่มเติม ประสิทธิภาพของ EWNS ได้รับการประเมินโดยการนำมะเขือเทศที่ปลูกเชื้อแล้วไปสัมผัสกับ EWNS ที่ความเข้มข้น 40,000 #/cm³ เป็นเวลา 45 นาที โดยสรุปคือ ใช้มะเขือเทศสามลูกในการประเมินจำนวนจุลินทรีย์ที่รอดชีวิต ณ เวลา t = 0 นาที มะเขือเทศสามลูกถูกวางใน EPES และสัมผัสกับ EWNS ที่ความเข้มข้น 40,000 #/cc (มะเขือเทศที่สัมผัสกับ EWNS) และอีกสามลูกที่เหลือถูกวางไว้ในห้องควบคุม (มะเขือเทศกลุ่มควบคุม) ไม่มีการดำเนินการแปรรูปเพิ่มเติมใดๆ กับมะเขือเทศในทั้งสองกลุ่ม มะเขือเทศที่สัมผัสกับ EWNS และมะเขือเทศกลุ่มควบคุมถูกนำออกหลังจาก 45 นาที เพื่อประเมินผลของ EWNS
การทดลองแต่ละครั้งดำเนินการซ้ำ 3 ครั้ง การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการตามระเบียบวิธีที่อธิบายไว้ในข้อมูลเพิ่มเติม
กลไกการยับยั้งถูกประเมินโดยการตกตะกอนของตัวอย่าง EWNS ที่สัมผัสกับรังสี (45 นาที ที่ความเข้มข้นของละอองลอย EWNS 40,000 #/cm3) และตัวอย่างแบคทีเรียที่ไม่เป็นอันตราย ได้แก่ E. coli, Salmonella enterica และ Lactobacillus ที่ไม่ได้รับการฉายรังสี อนุภาคถูกตรึงด้วยกลูตารัลดีไฮด์ 2.5%, พาราฟอร์มาลดีไฮด์ 1.25% และกรดพิคริก 0.03% ในบัฟเฟอร์โซเดียมคาโคไดเลต 0.1 M (pH 7.4) เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หลังจากล้างแล้ว ให้ตรึงตัวอย่างด้วยสารละลายออสเมียมเตตระออกไซด์ (OsO4) 1% / โพแทสเซียมเฟอร์โรไซยาไนด์ (KFeCN6) 1.5% เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้างด้วยน้ำ 3 ครั้ง และบ่มในยูรานิลอะซิเตต 1% เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นล้างด้วยน้ำอีก 2 ครั้ง แล้วทำให้แห้งโดยการแช่ในแอลกอฮอล์ความเข้มข้น 50%, 70%, 90%, 100% เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นวางตัวอย่างในโพรพิลีนออกไซด์เป็นเวลา 1 ชั่วโมง และชุบด้วยส่วนผสมของโพรพิลีนออกไซด์และ TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA) ในอัตราส่วน 1:1 ตัวอย่างถูกฝังใน TAAB Epon และทำให้เกิดพอลิเมอไรเซชันที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง นำเรซินเม็ดที่ผ่านการบ่มแล้วมาตัดและถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านทั่วไป JEOL 1200EX (JEOL, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ที่ติดตั้งกล้อง CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, แมสซาชูเซตส์, สหรัฐอเมริกา)
การทดลองทั้งหมดดำเนินการซ้ำ 3 ครั้ง สำหรับแต่ละช่วงเวลา จะทำการเพาะเชื้อแบคทีเรียในน้ำล้างซ้ำ 3 ครั้ง ทำให้ได้ข้อมูลทั้งหมด 9 จุดต่อช่วงเวลา โดยค่าเฉลี่ยของข้อมูลทั้งหมดจะถูกนำมาใช้เป็นความเข้มข้นของแบคทีเรียสำหรับจุลินทรีย์ชนิดนั้นๆ และใช้ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานเป็นค่าความคลาดเคลื่อนในการวัด ข้อมูลทุกจุดมีค่าเท่ากัน
คำนวณค่าลอการิทึมของการลดลงของความเข้มข้นของแบคทีเรียเมื่อเทียบกับเวลา t = 0 นาที โดยใช้สูตรต่อไปนี้:
โดยที่ C0 คือความเข้มข้นของแบคทีเรียในตัวอย่างควบคุม ณ เวลา 0 (กล่าวคือ หลังจากพื้นผิวแห้งแล้ว แต่ก่อนที่จะนำไปวางในห้องทดลอง) และ Cn คือความเข้มข้นของแบคทีเรียบนพื้นผิวหลังจากสัมผัสเป็นเวลา n นาที
เพื่อชดเชยการเสื่อมสภาพตามธรรมชาติของแบคทีเรียในระหว่างการสัมผัสเป็นเวลา 45 นาที จึงได้คำนวณค่าการลดลงของจำนวนแบคทีเรียเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมหลังจาก 45 นาที ดังนี้:
โดยที่ Cn คือความเข้มข้นของแบคทีเรียในตัวอย่างควบคุม ณ เวลา n และ Cn-Control คือความเข้มข้นของแบคทีเรียในกลุ่มควบคุม ณ เวลา n ข้อมูลแสดงในรูปของค่าลอการิทึมของการลดลงเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (ไม่มีการสัมผัสกับ EWNS)
ในระหว่างการศึกษา ได้มีการประเมินค่าแรงดันไฟฟ้าและระยะห่างระหว่างเข็มกับขั้วไฟฟ้าตรงข้ามหลายแบบ ในแง่ของการก่อตัวของกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของกรวยเทย์เลอร์ ความเสถียรของการผลิต EWNS และความสามารถในการทำซ้ำได้ ค่าต่างๆ แสดงอยู่ในตารางเสริม S1 ได้เลือกสองกรณีที่แสดงคุณสมบัติที่เสถียรและทำซ้ำได้ (กรวยเทย์เลอร์ การสร้าง EWNS และความเสถียรเมื่อเวลาผ่านไป) มาทำการศึกษาอย่างครอบคลุม รูปที่ 3 แสดงผลลัพธ์สำหรับประจุ ขนาด และปริมาณของ ROS ในทั้งสองกรณี ผลลัพธ์ยังแสดงอยู่ในตารางที่ 1 ด้วย สำหรับการอ้างอิง ทั้งรูปที่ 3 และตารางที่ 1 รวมถึงคุณสมบัติของ EWNS8, 9, 10, 11 ที่สังเคราะห์ไว้ก่อนหน้านี้โดยไม่ได้ปรับให้เหมาะสม (EWNS พื้นฐาน) การคำนวณความสำคัญทางสถิติโดยใช้การทดสอบ t แบบสองด้านได้ถูกตีพิมพ์ซ้ำในตารางเสริม S2 นอกจากนี้ ข้อมูลเพิ่มเติมยังรวมถึงการศึกษาผลกระทบของเส้นผ่านศูนย์กลางรูเก็บตัวอย่างของขั้วไฟฟ้าตรงข้าม (D) และระยะห่างระหว่างขั้วไฟฟ้ากราวด์กับปลายเข็ม (L) (รูปเสริม S2 และ S3)
(ac) การกระจายขนาดที่วัดโดย AFM (df) ลักษณะประจุบนพื้นผิว (g) การวิเคราะห์ลักษณะ ROS ของ EPR
สิ่งสำคัญที่ควรทราบอีกประการหนึ่งคือ ภายใต้เงื่อนไขทั้งหมดข้างต้น กระแสไอออนไนเซชันที่วัดได้อยู่ระหว่าง 2 ถึง 6 ไมโครแอมป์ และแรงดันไฟฟ้าอยู่ระหว่าง -3.8 ถึง -6.5 กิโลโวลต์ ส่งผลให้การใช้พลังงานน้อยกว่า 50 มิลลิวัตต์สำหรับโมดูลสัมผัสการสร้าง EWNS เดี่ยวนี้ แม้ว่า EWNS จะถูกสังเคราะห์ภายใต้ความดันสูง แต่ระดับโอโซนก็ต่ำมาก ไม่เคยเกิน 60 ppb
ภาพประกอบเพิ่มเติม S4 แสดงสนามไฟฟ้าจำลองสำหรับสถานการณ์ [-6.5 kV, 4.0 cm] และ [-3.8 kV, 0.5 cm] ตามลำดับ สำหรับสถานการณ์ [-6.5 kV, 4.0 cm] และ [-3.8 kV, 0.5 cm] การคำนวณสนามไฟฟ้าได้ค่า 2 × 10⁵ V/m และ 4.7 × 10⁵ V/m ตามลำดับ ซึ่งเป็นไปตามที่คาดไว้ เนื่องจากในกรณีที่สอง อัตราส่วนแรงดันต่อระยะทางมีค่าสูงกว่ามาก
ภาพที่ 3a และ 3b แสดงเส้นผ่านศูนย์กลางของ EWNS ที่วัดด้วย AFM8 เส้นผ่านศูนย์กลางเฉลี่ยของ EWNS ที่คำนวณได้คือ 27 นาโนเมตร และ 19 นาโนเมตร สำหรับแบบแผน [-6.5 kV, 4.0 cm] และ [-3.8 kV, 0.5 cm] ตามลำดับ สำหรับแบบแผน [-6.5 kV, 4.0 cm] และ [-3.8 kV, 0.5 cm] ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานทางเรขาคณิตของการกระจายตัวคือ 1.41 และ 1.45 ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าการกระจายขนาดแคบ ทั้งขนาดเฉลี่ยและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานทางเรขาคณิตนั้นใกล้เคียงกับ EWNS พื้นฐานมาก ซึ่งอยู่ที่ 25 นาโนเมตร และ 1.41 ตามลำดับ ภาพที่ 3c แสดงการกระจายขนาดของ EWNS พื้นฐานที่วัดโดยใช้วิธีเดียวกันภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน
รูปที่ 3d และ 3e แสดงผลการวิเคราะห์ประจุ ข้อมูลเป็นค่าเฉลี่ยของการวัดความเข้มข้น (#/cm3) และกระแสไฟฟ้า (I) พร้อมกัน 30 ครั้ง การวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่าประจุเฉลี่ยบน EWNS คือ 22 ± 6 e- และ 44 ± 6 e- สำหรับ [-6.5 kV, 4.0 cm] และ [-3.8 kV, 0.5 cm] ตามลำดับ ซึ่งมีประจุบนพื้นผิวสูงกว่า EWNS พื้นฐาน (10 ± 2 e-) อย่างมีนัยสำคัญ สูงกว่ากรณี [-6.5 kV, 4.0 cm] สองเท่า และสูงกว่ากรณี [-3.8 kV, 0.5 cm] สี่เท่า รูปที่ 3f แสดงข้อมูลประจุสำหรับ EWNS พื้นฐาน
จากแผนที่แสดงความเข้มข้นของจำนวน EWNS (ภาพประกอบเพิ่มเติม S5 และ S6) จะเห็นได้ว่าสถานการณ์ [-6.5 kV, 4.0 cm] มีจำนวนอนุภาคมากกว่าสถานการณ์ [-3.8 kV, 0.5 cm] อย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ยังควรสังเกตว่ามีการตรวจสอบความเข้มข้นของจำนวน EWNS นานถึง 4 ชั่วโมง (ภาพประกอบเพิ่มเติม S5 และ S6) ซึ่งความเสถียรของการเกิด EWNS แสดงให้เห็นระดับความเข้มข้นของจำนวนอนุภาคที่เท่ากันในทั้งสองกรณี
ภาพที่ 3g แสดงสเปกตรัม EPR หลังจากลบค่าควบคุม EWNS ที่ปรับให้เหมาะสม (พื้นหลัง) ที่ [-6.5 kV, 4.0 cm] สเปกตรัม ROS ยังถูกเปรียบเทียบกับสถานการณ์ Baseline-EWNS ในงานวิจัยที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ด้วย จำนวน EWNS ที่ทำปฏิกิริยากับสปินแทรปคำนวณได้เท่ากับ 7.5 × 10⁴ EWNS/วินาที ซึ่งคล้ายกับ Baseline-EWNS⁸ ที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ สเปกตรัม EPR แสดงให้เห็นอย่างชัดเจนถึงการมีอยู่ของ ROS สองประเภท โดย O²⁻ เป็นชนิดที่เด่นกว่า และ OH• มีปริมาณน้อยกว่า นอกจากนี้ การเปรียบเทียบความเข้มของยอดโดยตรงแสดงให้เห็นว่า EWNS ที่ปรับให้เหมาะสมมีปริมาณ ROS สูงกว่า EWNS พื้นฐานอย่างมีนัยสำคัญ
ภาพที่ 4 แสดงประสิทธิภาพการตกตะกอนของ EWNS ใน EPES ข้อมูลสรุปไว้ในตารางที่ 1 และเปรียบเทียบกับข้อมูล EWNS ดั้งเดิม สำหรับ EUNS ทั้งสองกรณี การตกตะกอนใกล้เคียง 100% แม้ที่แรงดันต่ำ 3.0 kV โดยทั่วไป 3.0 kV ก็เพียงพอสำหรับการตกตะกอน 100% โดยไม่คำนึงถึงการเปลี่ยนแปลงประจุบนพื้นผิว ภายใต้เงื่อนไขเดียวกัน ประสิทธิภาพการตกตะกอนของ Baseline-EWNS อยู่ที่เพียง 56% เนื่องจากมีประจุต่ำกว่า (เฉลี่ย 10 อิเล็กตรอนต่อ EWNS)
ภาพที่ 5 และตารางที่ 2 สรุปค่าการยับยั้งจุลินทรีย์ที่เพาะเลี้ยงบนผิวมะเขือเทศหลังจากสัมผัสกับ EWNS ประมาณ 40,000 #/cm3 เป็นเวลา 45 นาทีในโหมดที่เหมาะสม [-6.5 kV, 4.0 cm] E. coli และ Lactobacillus innocuous ที่เพาะเลี้ยงแสดงให้เห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญถึง 3.8 ล็อกในช่วงเวลา 45 นาที ภายใต้สภาวะเดียวกัน S. enterica ลดลง 2.2 ล็อก ในขณะที่ S. cerevisiae และ M. parafortutum ลดลง 1.0 ล็อก
ภาพถ่ายอิเล็กตรอนไมโครสโคป (รูปที่ 6) แสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงทางกายภาพที่เกิดจาก EWNS ต่อเซลล์แบคทีเรีย Escherichia coli, Streptococcus และ Lactobacillus ที่ไม่เป็นอันตราย ซึ่งนำไปสู่การไม่ทำงานของเซลล์เหล่านั้น แบคทีเรียกลุ่มควบคุมมีเยื่อหุ้มเซลล์ที่สมบูรณ์ ในขณะที่แบคทีเรียที่ได้รับสาร EWNS มีเยื่อหุ้มเซลล์ชั้นนอกที่เสียหาย
การถ่ายภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนของแบคทีเรียกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่ได้รับสาร เผยให้เห็นความเสียหายของเยื่อหุ้มเซลล์
ข้อมูลเกี่ยวกับคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีของ EWNS ที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมโดยรวมแสดงให้เห็นว่าคุณสมบัติ (ประจุบนพื้นผิวและปริมาณ ROS) ของ EWNS ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับข้อมูลพื้นฐานของ EWNS ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้8,9,10,11 ในทางกลับกัน ขนาดของ EWNS ยังคงอยู่ในช่วงนาโนเมตร ซึ่งคล้ายกับผลลัพธ์ที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้มาก ทำให้สามารถคงอยู่ในอากาศได้เป็นเวลานาน ความหลากหลายของขนาดที่สังเกตได้นั้นสามารถอธิบายได้ด้วยการเปลี่ยนแปลงของประจุบนพื้นผิวที่กำหนดขนาดของ EWNS ความสุ่มของปรากฏการณ์เรย์ลี และการรวมตัวกันที่อาจเกิดขึ้น อย่างไรก็ตาม ดังที่ Nielsen et al. 22 ได้อธิบายไว้ ประจุบนพื้นผิวสูงจะช่วยลดการระเหยโดยการเพิ่มพลังงาน/แรงตึงผิวของหยดน้ำอย่างมีประสิทธิภาพ ในสิ่งพิมพ์ก่อนหน้าของเรา8 ทฤษฎีนี้ได้รับการยืนยันจากการทดลองสำหรับไมโครดรอปเล็ต 22 และ EWNS การสูญเสียประจุเมื่อเวลาผ่านไปอาจส่งผลต่อขนาดและมีส่วนทำให้เกิดการกระจายขนาดที่สังเกตได้