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Recientemente, se ha desarrollado una plataforma antimicrobiana libre de químicos basada en nanotecnología que utiliza nanoestructuras de agua artificial (EWNS).Los EWNS tienen una alta carga superficial y están saturados con especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden interactuar e inactivar una serie de microorganismos, incluidos los patógenos transmitidos por los alimentos.Aquí se muestra que sus propiedades durante la síntesis se pueden ajustar y optimizar para mejorar aún más su potencial antibacteriano.La plataforma de laboratorio EWNS se diseñó para ajustar las propiedades de EWNS cambiando los parámetros de síntesis.Caracterización de las propiedades EWNS (carga, tamaño y contenido de ROS) utilizando métodos analíticos modernos.Además, fueron evaluados por su potencial de inactivación microbiana frente a microorganismos transmitidos por alimentos como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria inocua, Mycobacterium paraaccidentum y Saccharomyces cerevisiae.Los resultados presentados aquí demuestran que las propiedades de EWNS se pueden ajustar durante la síntesis, lo que da como resultado un aumento exponencial en la eficiencia de inactivación.En particular, la carga superficial aumentó por un factor de cuatro y las especies reactivas de oxígeno aumentaron.La tasa de eliminación microbiana dependía de los microbios y oscilaba entre 1,0 y 3,8 log después de una exposición de 45 minutos a una dosis de aerosol de 40.000 #/cc EWNS.
La contaminación microbiana es la principal causa de enfermedades transmitidas por los alimentos causadas por la ingestión de patógenos o sus toxinas.Solo en los Estados Unidos, las enfermedades transmitidas por los alimentos causan alrededor de 76 millones de enfermedades, 325 000 ingresos hospitalarios y 5000 muertes cada año1.Además, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) estima que el aumento del consumo de productos frescos es responsable del 48 % de todas las enfermedades transmitidas por los alimentos notificadas en los Estados Unidos2.El costo de las enfermedades y muertes causadas por patógenos transmitidos por los alimentos en los Estados Unidos es muy alto, estimado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) en más de US$15,600 millones por año3.
Actualmente, las intervenciones antimicrobianas químicas4, de radiación5 y térmicas6 para garantizar la inocuidad de los alimentos se llevan a cabo principalmente en puntos críticos de control (PCC) limitados a lo largo de la cadena de producción (generalmente después de la cosecha y/o durante el envasado) en lugar de hacerlo de forma continua.por lo tanto, son propensos a la contaminación cruzada.7. Un mejor control de las enfermedades transmitidas por los alimentos y el deterioro de los alimentos requiere intervenciones antimicrobianas que puedan aplicarse potencialmente en todo el proceso continuo de la granja a la mesa y, al mismo tiempo, reducir el impacto ambiental y los costos.
Recientemente, se ha desarrollado una plataforma antimicrobiana basada en nanotecnología libre de productos químicos que puede inactivar bacterias superficiales y en el aire utilizando nanoestructuras de agua artificial (EWNS).EWNS se sintetizó utilizando dos procesos paralelos, electropulverización e ionización de agua (Fig. 1a).Estudios previos han demostrado que EWNS tiene un conjunto único de propiedades físicas y biológicas8,9,10.EWNS tiene un promedio de 10 electrones por estructura y un tamaño de nanoescala promedio de 25 nm (Fig. 1b, c) 8,9,10.Además, la resonancia de espín electrónico (ESR) mostró que EWNS contiene una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS), principalmente radicales hidroxilo (OH•) y superóxido (O2-) (Fig. 1c)8.EVNS está en el aire durante mucho tiempo y puede chocar con microorganismos suspendidos en el aire y presentes en la superficie, liberando su carga útil de ROS y provocando la inactivación de los microorganismos (Fig. 1d).Estos primeros estudios también mostraron que EWNS puede interactuar e inactivar varias bacterias gramnegativas y grampositivas, incluidas las micobacterias, en las superficies y en el aire.La microscopía electrónica de transmisión mostró que la inactivación fue causada por la ruptura de la membrana celular.Además, los estudios de inhalación aguda han demostrado que las dosis altas de EWNS no causan daño o inflamación pulmonar 8 .
(a) El electrospray se produce cuando se aplica un alto voltaje entre un tubo capilar que contiene líquido y un contraelectrodo.(b) La aplicación de alta presión da como resultado dos fenómenos diferentes: (i) electropulverización de agua y (ii) formación de especies reactivas de oxígeno (iones) atrapadas en el EWNS.(c) La estructura única de EWNS.(d) Debido a su naturaleza a nanoescala, los EWNS son muy móviles y pueden interactuar con patógenos transportados por el aire.
Recientemente también se ha demostrado la capacidad de la plataforma antimicrobiana EWNS para inactivar los microorganismos transmitidos por los alimentos en la superficie de los alimentos frescos.También se ha demostrado que la carga superficial de EWNS en combinación con un campo eléctrico se puede utilizar para lograr una entrega específica.Además, los resultados preliminares para los tomates orgánicos después de una exposición de 90 minutos a un EWNS de alrededor de 50 000 #/cm3 fueron alentadores, y se observaron varios microorganismos transmitidos por los alimentos, como E. coli y Listeria 11.Además, las pruebas organolépticas preliminares no mostraron efectos sensoriales en comparación con los tomates de control.Aunque estos resultados iniciales de inactivación son alentadores para las aplicaciones de seguridad alimentaria incluso a dosis muy bajas de EWNS de 50 000#/cc.Véase, está claro que un mayor potencial de inactivación sería más beneficioso para reducir aún más el riesgo de infección y deterioro.
Aquí, centraremos nuestra investigación en el desarrollo de una plataforma de generación de EWNS para permitir el ajuste fino de los parámetros de síntesis y la optimización de las propiedades fisicoquímicas de EWNS para mejorar su potencial antibacteriano.En particular, la optimización se ha centrado en aumentar su carga de superficie (para mejorar la entrega dirigida) y el contenido de ROS (para mejorar la eficiencia de inactivación).Caracterice propiedades fisicoquímicas optimizadas (tamaño, carga y contenido de ROS) utilizando métodos analíticos modernos y utilice microorganismos alimentarios comunes como E. .
EVNS se sintetizó mediante electropulverización e ionización simultáneas de agua de alta pureza (18 MΩ cm–1).El nebulizador eléctrico 12 se usa típicamente para la atomización de líquidos y la síntesis de polímeros y partículas cerámicas 13 y fibras 14 de tamaño controlado.
Como se detalla en las publicaciones anteriores 8, 9, 10, 11, en un experimento típico, se aplicó un alto voltaje entre un capilar metálico y un contraelectrodo conectado a tierra.Durante este proceso ocurren dos fenómenos diferentes: i) electrospray y ii) ionización del agua.Un fuerte campo eléctrico entre los dos electrodos hace que se acumulen cargas negativas en la superficie del agua condensada, lo que da como resultado la formación de conos de Taylor.Como resultado, se forman gotitas de agua altamente cargadas, que continúan dividiéndose en partículas más pequeñas, como en la teoría de Rayleigh16.Al mismo tiempo, los fuertes campos eléctricos hacen que algunas moléculas de agua se dividan y desprendan electrones (ionización), lo que da lugar a la formación de una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS)17.ROS18 generado simultáneamente se encapsuló en EWNS (Fig. 1c).
En la fig.2a muestra el sistema de generación de EWNS desarrollado y utilizado en la síntesis de EWNS en este estudio.El agua purificada almacenada en una botella cerrada se alimentó a través de un tubo de teflón (diámetro interior de 2 mm) a una aguja de acero inoxidable 30G (capilar metálico).El flujo de agua está controlado por la presión del aire dentro de la botella, como se muestra en la Figura 2b.La aguja está montada en una consola de teflón y puede ajustarse manualmente a cierta distancia del contraelectrodo.El contraelectrodo es un disco de aluminio pulido con un orificio en el centro para el muestreo.Debajo del contraelectrodo hay un embudo de muestreo de aluminio, que está conectado al resto de la configuración experimental a través de un puerto de muestreo (Fig. 2b).Para evitar la acumulación de carga que podría interrumpir el funcionamiento del muestreador, todos los componentes del muestreador están eléctricamente conectados a tierra.
(a) Sistema de generación de nanoestructuras de agua de ingeniería (EWNS).(b) Sección transversal del muestreador y electrospray, mostrando los parámetros más importantes.( c ) Configuración experimental para la inactivación de bacterias.
El sistema de generación de EWNS descrito anteriormente es capaz de cambiar parámetros operativos clave para facilitar el ajuste fino de las propiedades de EWNS.Ajuste el voltaje aplicado (V), la distancia entre la aguja y el contraelectrodo (L) y el flujo de agua (φ) a través del capilar para ajustar las características de EWNS.Símbolo utilizado para representar diferentes combinaciones: [V (kV), L (cm)].Ajuste el flujo de agua para obtener un cono de Taylor estable de cierto conjunto [V, L].Para los fines de este estudio, el diámetro de apertura del contraelectrodo (D) se mantuvo en 0,5 pulgadas (1,29 cm).
Debido a la geometría limitada y la asimetría, la intensidad del campo eléctrico no se puede calcular a partir de los primeros principios.En su lugar, se utilizó el software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)19 para calcular el campo eléctrico.El campo eléctrico no es uniforme, por lo que el valor del campo eléctrico en la punta del capilar se utilizó como valor de referencia para varias configuraciones.
Durante el estudio, se evaluaron varias combinaciones de voltaje y distancia entre la aguja y el contraelectrodo en términos de formación de cono de Taylor, estabilidad del cono de Taylor, estabilidad de producción de EWNS y reproducibilidad.Varias combinaciones se muestran en la Tabla complementaria S1.
La salida del sistema de generación EWNS se conectó directamente a un analizador de tamaño de partículas Scanning Mobility (SMPS, modelo 3936, TSI, Shoreview, MN) para medir la concentración del número de partículas, así como a un electrómetro de Aerosol Faraday (TSI, modelo 3068B, Shoreview, MN).) para corrientes de aerosol se midió como se describe en nuestra publicación anterior.Tanto el SMPS como el electrómetro de aerosol muestrearon a una velocidad de flujo de 0,5 l/min (flujo de muestra total de 1 l/min).El número de concentración de partículas y el flujo de aerosol se midieron durante 120 segundos.La medición se repite 30 veces.Con base en las mediciones actuales, se calcula la carga total de aerosol y se estima la carga promedio de EWNS para un número total determinado de partículas de EWNS seleccionadas.El costo promedio de EWNS se puede calcular usando la Ecuación (1):
donde IEl es la corriente medida, NSMPS es la concentración digital medida con el SMPS y φEl es el caudal por electrómetro.
Debido a que la humedad relativa (HR) afecta la carga superficial, la temperatura y (HR) se mantuvieron constantes durante el experimento a 21 °C y 45 %, respectivamente.
Se utilizaron microscopía de fuerza atómica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) y la sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japón) para medir el tamaño y la vida útil del EWNS.La frecuencia de escaneo AFM fue de 1 Hz, el área de escaneo fue de 5 μm × 5 μm y 256 líneas de escaneo.Todas las imágenes se sometieron a una alineación de imágenes de primer orden utilizando el software Asylum (rango de máscara 100 nm, umbral 100 pm).
Se retiró el embudo de prueba y se colocó la superficie de mica a una distancia de 2,0 cm del contraelectrodo durante un tiempo medio de 120 s para evitar la aglomeración de partículas y la formación de gotitas irregulares sobre la superficie de mica.EWNS se roció directamente sobre la superficie de mica recién cortada (Ted Pella, Redding, CA).Imagen de la superficie de mica inmediatamente después de la pulverización con AFM.El ángulo de contacto de la superficie de la mica no modificada recién cortada es cercano a 0°, por lo que EVNS se distribuye en la superficie de la mica en forma de cúpula.El diámetro (a) y la altura (h) de las gotitas que se difunden se midieron directamente desde la topografía AFM y se usaron para calcular el volumen de difusión del domo EWNS usando nuestro método previamente validado.Suponiendo que el EWNS integrado tenga el mismo volumen, el diámetro equivalente se puede calcular utilizando la Ecuación (2):
Sobre la base de nuestro método desarrollado anteriormente, se utilizó una trampa de espín de resonancia de espín de electrones (ESR) para detectar la presencia de intermedios radicales de corta duración en EWNS.Los aerosoles se burbujearon a través de un rociador Midget de 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) que contenía una solución 235 mM de DEPMPO (5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc.).Portland, Oregon).Todas las mediciones de ESR se realizaron con un espectrómetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EE. UU.) y una celda de panel plano.Se utilizó el software Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EE. UU.) para recopilar y analizar los datos.La determinación de las características del ROS se llevó a cabo únicamente para un conjunto de condiciones de operación [-6,5 kV, 4,0 cm].Las concentraciones de EWNS se midieron utilizando el SMPS después de tener en cuenta las pérdidas de EWNS en el impactador.
Los niveles de ozono se monitorearon usando un 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Para todas las propiedades de EWNS, el valor medio se usa como valor de medición y la desviación estándar se usa como error de medición.Se realizaron pruebas T para comparar los valores de los atributos EWNS optimizados con los valores correspondientes de la base EWNS.
La Figura 2c muestra un sistema de "tracción" de precipitación electrostática (EPES) previamente desarrollado y caracterizado que se puede usar para la entrega dirigida de EWNS en la superficie.EPES utiliza cargas EVNS que pueden "guiarse" directamente a la superficie del objetivo bajo la influencia de un fuerte campo eléctrico.Los detalles del sistema EPES se presentan en una publicación reciente de Pyrgiotakis et al.11Por lo tanto, EPES consta de una cámara de PVC impresa en 3D con extremos cónicos y contiene dos placas metálicas paralelas de acero inoxidable (acero inoxidable 304, recubiertas de espejo) en el centro con una separación de 15,24 cm.Las placas estaban conectadas a una fuente externa de alto voltaje (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), la placa inferior siempre estaba conectada a voltaje positivo y la placa superior siempre estaba conectada a tierra (tierra flotante).Las paredes de la cámara están cubiertas con papel de aluminio, que está eléctricamente conectado a tierra para evitar la pérdida de partículas.La cámara tiene una puerta de carga frontal sellada que permite colocar superficies de prueba en soportes de plástico que las elevan por encima de la placa de metal inferior para evitar interferencias de alto voltaje.
La eficiencia de deposición de EWNS en EPES se calculó de acuerdo con un protocolo desarrollado previamente detallado en la Figura complementaria S111.
Como cámara de control, se conectó en serie al sistema EPES una segunda cámara de flujo cilíndrica, en la que se utilizó un filtro HEPA intermedio para eliminar EWNS.Como se muestra en la Figura 2c, el aerosol EWNS se bombeó a través de dos cámaras integradas.El filtro entre la sala de control y EPES elimina cualquier EWNS restante, lo que da como resultado los mismos niveles de temperatura (T), humedad relativa (HR) y ozono.
Se ha encontrado que importantes microorganismos transmitidos por alimentos contaminan alimentos frescos como E. coli (ATCC #27325), indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), patógeno transmitido por alimentos, Listeria inofensiva (ATCC #33090), sustituto de Listeria monocytogenes patógena, derivada de ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), un sustituto de la levadura de deterioro y un inactivo más resistente bacteria ted, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Compre cajas aleatorias de tomates uva orgánicos en su mercado local y refrigere a 4°C hasta su uso (hasta 3 días).Los tomates experimentales eran todos del mismo tamaño, alrededor de 1/2 pulgada de diámetro.
Los protocolos de cultivo, inoculación, exposición y recuento de colonias se detallan en nuestra publicación anterior y se detallan en los Datos complementarios.La eficacia de EWNS se evaluó exponiendo tomates inoculados a 40 000 #/cm3 durante 45 minutos.Brevemente, se usaron tres tomates para evaluar los microorganismos sobrevivientes en el tiempo t = 0 min.Se colocaron tres tomates en EPES y se expusieron a EWNS a 40.000 #/cc (tomates expuestos a EWNS) y los tres restantes se colocaron en la cámara de control (tomates de control).No se llevó a cabo un procesamiento adicional de tomates en ambos grupos.Los tomates expuestos a EWNS y los tomates de control se retiraron después de 45 minutos para evaluar el efecto de EWNS.
Cada experimento se llevó a cabo por triplicado.El análisis de datos se realizó de acuerdo con el protocolo descrito en Datos complementarios.
Los mecanismos de inactivación se evaluaron mediante sedimentación de muestras de EWNS expuestas (45 minutos a una concentración de aerosol de EWNS de 40 000 #/cm3) y muestras no irradiadas de bacterias inofensivas E. coli, Salmonella enterica y Lactobacillus.Las partículas se fijaron en glutaraldehído al 2,5 %, paraformaldehído al 1,25 % y ácido pícrico al 0,03 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) durante 2 horas a temperatura ambiente.Después del lavado, fijar con tetróxido de osmio al 1 % (OsO4)/ferrocianuro de potasio al 1,5 % (KFeCN6) durante 2 horas, lavar 3 veces en agua e incubar en acetato de uranilo al 1 % durante 1 hora, luego lavar dos veces en agua y luego deshidratar durante 10 minutos en alcohol al 50 %, 70 %, 90 % y 100 %.A continuación, las muestras se colocaron en óxido de propileno durante 1 hora y se impregnaron con una mezcla 1:1 de óxido de propileno y TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA).Las muestras se incluyeron en TAAB Epon y se polimerizaron a 60 °C durante 48 horas.La resina granular curada se cortó y visualizó mediante TEM utilizando un microscopio electrónico de transmisión convencional JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japón) equipado con una cámara CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, EE. UU.).
Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.Para cada punto de tiempo, los lavados bacterianos se sembraron por triplicado, lo que resultó en un total de nueve puntos de datos por punto, cuyo promedio se usó como la concentración bacteriana para ese microorganismo en particular.La desviación estándar se utilizó como error de medición.Todos los puntos cuentan.
El logaritmo de la disminución de la concentración de bacterias en comparación con t = 0 min se calculó mediante la siguiente fórmula:
donde C0 es la concentración de bacterias en la muestra de control en el tiempo 0 (es decir, después de que la superficie se haya secado pero antes de colocarla en la cámara) y Cn es la concentración de bacterias en la superficie después de n minutos de exposición.
Para tener en cuenta la degradación natural de las bacterias durante la exposición de 45 minutos, también se calculó la reducción logarítmica en comparación con el control después de 45 minutos de la siguiente manera:
donde Cn es la concentración de bacterias en la muestra de control en el tiempo n y Cn-Control es la concentración de bacterias de control en el tiempo n.Los datos se presentan como una reducción logarítmica en comparación con el control (sin exposición a EWNS).
Durante el estudio, se evaluaron varias combinaciones de voltaje y distancia entre la aguja y el contraelectrodo en términos de formación de cono de Taylor, estabilidad del cono de Taylor, estabilidad de producción de EWNS y reproducibilidad.Varias combinaciones se muestran en la Tabla complementaria S1.Se seleccionaron dos casos que mostraban propiedades estables y reproducibles (cono de Taylor, generación de EWNS y estabilidad en el tiempo) para un estudio exhaustivo.En la fig.La figura 3 muestra los resultados de carga, tamaño y contenido de ROS en ambos casos.Los resultados también se muestran en la Tabla 1. Como referencia, tanto la Figura 3 como la Tabla 1 incluyen las propiedades del EWNS8, 9, 10, 11 (línea de base-EWNS) no optimizado sintetizado previamente.Los cálculos de significación estadística utilizando una prueba t de dos colas se vuelven a publicar en la Tabla complementaria S2.Además, los datos adicionales incluyen estudios del efecto del diámetro del orificio de muestreo del contraelectrodo (D) y la distancia entre el electrodo de tierra y la punta (L) (Figuras complementarias S2 y S3).
( ac ) Distribución de tamaños medida por AFM.(df) Característica de carga superficial.( g ) Caracterización ROS del EPR.
También es importante tener en cuenta que para todas las condiciones anteriores, la corriente de ionización medida estuvo entre 2 y 6 μA y el voltaje entre -3,8 y -6,5 kV, lo que resultó en un consumo de energía de menos de 50 mW para este único módulo de contacto de generación EWNS.Aunque EWNS se sintetizó a alta presión, los niveles de ozono eran muy bajos y nunca superaban las 60 ppb.
La figura complementaria S4 muestra los campos eléctricos simulados para los escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente.Para los escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], los cálculos de campo son 2 × 105 V/m y 4,7 × 105 V/m, respectivamente.Esto es de esperar, ya que en el segundo caso la relación tensión-distancia es mucho mayor.
En la fig.3a,b muestra el diámetro EWNS medido con el AFM8.Los diámetros EWNS promedio calculados fueron 27 nm y 19 nm para los esquemas [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente.Para los escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], las desviaciones estándar geométricas de las distribuciones son 1,41 y 1,45, respectivamente, lo que indica una distribución de tamaño estrecha.Tanto el tamaño medio como la desviación estándar geométrica están muy cerca del EWNS de referencia, a 25 nm y 1,41, respectivamente.En la fig.3c muestra la distribución de tamaño de la base EWNS medida usando el mismo método bajo las mismas condiciones.
En la fig.3d,e muestra los resultados de la caracterización de carga.Los datos son mediciones promedio de 30 mediciones simultáneas de concentración (#/cm3) y corriente (I).El análisis muestra que la carga promedio en el EWNS es de 22 ± 6 e- y 44 ± 6 e- para [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente.Tienen cargas superficiales significativamente más altas en comparación con el EWNS de referencia (10 ± 2 e-), dos veces mayores que el escenario [-6,5 kV, 4,0 cm] y cuatro veces mayores que el [-3,8 kV, 0,5 cm].La figura 3f muestra la carga.datos para Baseline-EWNS.
A partir de los mapas de concentración del número EWNS (Figuras complementarias S5 y S6), se puede ver que el escenario [-6,5 kV, 4,0 cm] tiene significativamente más partículas que el escenario [-3,8 kV, 0,5 cm].También vale la pena señalar que la concentración del número de EWNS se controló hasta 4 horas (Figuras complementarias S5 y S6), donde la estabilidad de la generación de EWNS mostró los mismos niveles de concentración del número de partículas en ambos casos.
En la fig.3g muestra el espectro EPR después de la sustracción del control EWNS optimizado (fondo) a [-6,5 kV, 4,0 cm].Los espectros de ROS también se compararon con el escenario Baseline-EWNS en un trabajo publicado anteriormente.Se calculó que el número de EWNS que reaccionan con las trampas giratorias es de 7,5 × 104 EWNS/s, que es similar al Baseline-EWNS8 publicado anteriormente.Los espectros EPR mostraron claramente la presencia de dos tipos de ROS, siendo O2- la especie predominante y OH• menos abundante.Además, una comparación directa de las intensidades máximas mostró que el EWNS optimizado tenía un contenido de ROS significativamente mayor en comparación con el EWNS de referencia.
En la fig.4 muestra la eficiencia de depósito de EWNS en EPES.Los datos también se resumen en la Tabla I y se comparan con los datos originales de EWNS.Para ambos casos de EUNS, la deposición es cercana al 100% incluso a una tensión baja de 3,0 kV.Por lo general, 3,0 kV es suficiente para una deposición del 100 %, independientemente del cambio de carga superficial.En las mismas condiciones, la eficiencia de deposición de Baseline-EWNS fue solo del 56% debido a su menor carga (promedio de 10 electrones por EWNS).
En la fig.5 y en la tabla.2 resume el valor de inactivación de los microorganismos inoculados en la superficie de los tomates después de la exposición a aproximadamente 40 000 #/cm3 EWNS durante 45 minutos en el modo óptimo [-6,5 kV, 4,0 cm].E. coli y Lactobacillus inocuos inoculados mostraron una reducción significativa de 3,8 logs durante los 45 minutos de exposición.Bajo las mismas condiciones, S. enterica tuvo una disminución de 2,2 log, mientras que S. cerevisiae y M. parafortutum tuvieron una disminución de 1,0 log.
Las micrografías electrónicas (Figura 6) muestran los cambios físicos inducidos por EWNS en células inofensivas de Escherichia coli, Streptococcus y Lactobacillus que conducen a su inactivación.Las bacterias de control tenían membranas celulares intactas, mientras que las bacterias expuestas tenían membranas externas dañadas.
Las imágenes de microscopía electrónica de las bacterias de control y expuestas revelaron daños en la membrana.
Los datos sobre las propiedades fisicoquímicas del EWNS optimizado muestran colectivamente que las propiedades (carga superficial y contenido de ROS) del EWNS mejoraron significativamente en comparación con los datos de referencia del EWNS publicados anteriormente8,9,10,11.Por otro lado, su tamaño se mantuvo en el rango de los nanómetros, muy similar a los resultados reportados anteriormente, lo que les permitió permanecer en el aire por largos periodos de tiempo.La polidispersidad observada puede explicarse por los cambios de carga superficial que determinan el tamaño de EWNS, la aleatoriedad del efecto Rayleigh y la coalescencia potencial.Sin embargo, como detallan Nielsen et al.22, la alta carga superficial reduce la evaporación al aumentar efectivamente la energía/tensión superficial de la gota de agua.En nuestra publicación anterior8, esta teoría se confirmó experimentalmente para las microgotas 22 y EWNS.La pérdida de carga durante el tiempo extra también puede afectar el tamaño y contribuir a la distribución de tamaño observada.