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Recientemente, se ha desarrollado una plataforma antimicrobiana sin químicos basada en nanotecnología que utiliza nanoestructuras de agua artificial (EWNS). Las EWNS poseen una alta carga superficial y están saturadas con especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden interactuar con diversos microorganismos, incluidos patógenos transmitidos por los alimentos, e inactivarlos. En este trabajo se demuestra que sus propiedades durante la síntesis pueden ajustarse y optimizarse para potenciar aún más su actividad antibacteriana. La plataforma de laboratorio de EWNS se diseñó para ajustar con precisión las propiedades de las EWNS modificando los parámetros de síntesis. Se caracterizaron las propiedades de las EWNS (carga, tamaño y contenido de ROS) mediante métodos analíticos modernos. Además, se evaluó su potencial de inactivación microbiana frente a microorganismos transmitidos por los alimentos, como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum y Saccharomyces cerevisiae. Los resultados presentados demuestran que las propiedades de las EWNS pueden ajustarse durante la síntesis, lo que resulta en un aumento exponencial de la eficiencia de inactivación. En particular, la carga superficial aumentó cuatro veces y las especies reactivas de oxígeno también aumentaron. La tasa de eliminación microbiana dependió de la microbiota y varió de 1,0 a 3,8 log después de una exposición de 45 minutos a una dosis de aerosol de 40 000 #/cc de EWNS.
La contaminación microbiana es la principal causa de enfermedades transmitidas por los alimentos, provocadas por la ingestión de patógenos o sus toxinas. Solo en Estados Unidos, estas enfermedades causan aproximadamente 76 millones de casos, 325 000 hospitalizaciones y 5000 muertes cada año¹. Además, el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA) estima que el aumento del consumo de productos frescos es responsable del 48 % de todas las enfermedades transmitidas por los alimentos notificadas en el país². El costo de las enfermedades y muertes causadas por patógenos transmitidos por los alimentos en Estados Unidos es muy elevado, estimado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) en más de 15 600 millones de dólares anuales³.
Actualmente, las intervenciones antimicrobianas químicas4, por radiación5 y térmicas6 para garantizar la inocuidad de los alimentos se llevan a cabo principalmente en puntos críticos de control (PCC) limitados a lo largo de la cadena de producción (generalmente después de la cosecha y/o durante el envasado) en lugar de forma continua. Por lo tanto, son propensas a la contaminación cruzada. 7. Un mejor control de las enfermedades transmitidas por los alimentos y el deterioro de los alimentos requiere intervenciones antimicrobianas que puedan aplicarse a lo largo de todo el proceso, desde la granja hasta la mesa, reduciendo al mismo tiempo el impacto ambiental y los costos.
Recientemente, se ha desarrollado una plataforma antimicrobiana basada en nanotecnología y libre de químicos que puede inactivar bacterias superficiales y aéreas utilizando nanoestructuras de agua artificial (EWNS). Las EWNS se sintetizaron utilizando dos procesos paralelos, electrospray e ionización de agua (Fig. 1a). Estudios previos han demostrado que las EWNS tienen un conjunto único de propiedades físicas y biológicas8,9,10. Las EWNS tienen un promedio de 10 electrones por estructura y un tamaño promedio a nanoescala de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Además, la resonancia de espín electrónico (ESR) mostró que las EWNS contienen una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS), principalmente radicales hidroxilo (OH•) y superóxido (O2-) (Fig. 1c)8. Las EWNS permanecen en el aire durante mucho tiempo y pueden colisionar con microorganismos suspendidos en el aire y presentes en la superficie, liberando su carga útil de ROS y causando la inactivación de los microorganismos (Fig. 1d). Estos primeros estudios también demostraron que el EWNS puede interactuar con diversas bacterias gramnegativas y grampositivas, incluidas las micobacterias, e inactivarlas en superficies y en el aire. La microscopía electrónica de transmisión mostró que la inactivación se debía a la alteración de la membrana celular. Además, estudios de inhalación aguda han demostrado que las dosis altas de EWNS no causan daño pulmonar ni inflamación⁸.
(a) La electrospray se produce cuando se aplica un alto voltaje entre un tubo capilar que contiene líquido y un contraelectrodo. (b) La aplicación de alta presión da lugar a dos fenómenos diferentes: (i) la electrospray de agua y (ii) la formación de especies reactivas de oxígeno (iones) atrapadas en las EWNS. (c) La estructura única de las EWNS. (d) Debido a su naturaleza a nanoescala, las EWNS son altamente móviles y pueden interactuar con patógenos transportados por el aire.
Recientemente se ha demostrado la capacidad de la plataforma antimicrobiana EWNS para inactivar microorganismos transmitidos por los alimentos en la superficie de alimentos frescos. También se ha demostrado que la carga superficial de EWNS, en combinación con un campo eléctrico, puede utilizarse para lograr una administración dirigida. Además, los resultados preliminares obtenidos con tomates orgánicos tras una exposición de 90 minutos a una concentración de EWNS de aproximadamente 50 000 #/cm³ fueron alentadores, observándose la presencia de diversos microorganismos transmitidos por los alimentos, como E. coli y Listeria 11. Asimismo, las pruebas organolépticas preliminares no mostraron efectos sensoriales en comparación con los tomates de control. Si bien estos resultados iniciales de inactivación son prometedores para aplicaciones de seguridad alimentaria, incluso a dosis muy bajas de EWNS de 50 000 #/cm³, es evidente que un mayor potencial de inactivación sería más beneficioso para reducir aún más el riesgo de infección y deterioro.
Aquí, centraremos nuestra investigación en el desarrollo de una plataforma de generación de EWNS para permitir el ajuste fino de los parámetros de síntesis y la optimización de las propiedades fisicoquímicas de EWNS para mejorar su potencial antibacteriano. En particular, la optimización se ha centrado en aumentar su carga superficial (para mejorar la administración dirigida) y el contenido de ROS (para mejorar la eficiencia de inactivación). Caracterizaremos las propiedades fisicoquímicas optimizadas (tamaño, carga y contenido de ROS) utilizando métodos analíticos modernos y utilizaremos microorganismos alimentarios comunes como E. .
El EVNS se sintetizó mediante electroaspersión e ionización simultáneas de agua de alta pureza (18 MΩ cm–1). El nebulizador eléctrico 12 se utiliza habitualmente para la atomización de líquidos y la síntesis de partículas de polímero y cerámica 13 y fibras 14 de tamaño controlado.
Como se detalla en publicaciones anteriores 8, 9, 10, 11, en un experimento típico, se aplicó un alto voltaje entre un capilar metálico y un contraelectrodo conectado a tierra. Durante este proceso, ocurren dos fenómenos diferentes: i) electrospray y ii) ionización del agua. Un fuerte campo eléctrico entre los dos electrodos provoca la acumulación de cargas negativas en la superficie del agua condensada, lo que da lugar a la formación de conos de Taylor. Como resultado, se forman gotas de agua altamente cargadas, que continúan fragmentándose en partículas más pequeñas, como en la teoría de Rayleigh16. Al mismo tiempo, los fuertes campos eléctricos provocan que algunas moléculas de agua se dividan y pierdan electrones (ionización), lo que conduce a la formación de una gran cantidad de especies reactivas de oxígeno (ROS)17. Las ROS18 generadas simultáneamente se encapsularon en EWNS (Fig. 1c).
La figura 2a muestra el sistema de generación de EWNS desarrollado y utilizado en la síntesis de EWNS en este estudio. Agua purificada almacenada en una botella cerrada se introdujo a través de un tubo de teflón (2 mm de diámetro interno) en una aguja de acero inoxidable de calibre 30 (capilar metálico). El flujo de agua se controla mediante la presión de aire dentro de la botella, como se muestra en la figura 2b. La aguja está montada en una consola de teflón y se puede ajustar manualmente a una distancia determinada del contraelectrodo. El contraelectrodo es un disco de aluminio pulido con un orificio en el centro para la toma de muestras. Debajo del contraelectrodo hay un embudo de muestreo de aluminio, que está conectado al resto del montaje experimental a través de un puerto de muestreo (Fig. 2b). Para evitar la acumulación de carga que podría interrumpir el funcionamiento del muestreador, todos los componentes del muestreador están conectados a tierra.
(a) Sistema de generación de nanoestructuras de agua (EWNS). (b) Sección transversal del muestreador y el sistema de electroaspersión, que muestra los parámetros más importantes. (c) Montaje experimental para la inactivación de bacterias.
El sistema de generación EWNS descrito anteriormente permite modificar parámetros operativos clave para optimizar sus propiedades. Ajuste la tensión aplicada (V), la distancia entre la aguja y el contraelectrodo (L) y el caudal de agua (φ) a través del capilar para ajustar las características EWNS. Símbolo utilizado para representar diferentes combinaciones: [V (kV), L (cm)]. Ajuste el caudal de agua para obtener un cono de Taylor estable con un valor específico de [V, L]. Para este estudio, el diámetro de apertura del contraelectrodo (D) se mantuvo en 0,5 pulgadas (1,29 cm).
Debido a la geometría limitada y la asimetría, la intensidad del campo eléctrico no se puede calcular a partir de principios fundamentales. En su lugar, se utilizó el software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)¹⁹ para calcularlo. Dado que el campo eléctrico no es uniforme, se utilizó el valor del campo eléctrico en la punta del capilar como valor de referencia para diversas configuraciones.
Durante el estudio, se evaluaron diversas combinaciones de voltaje y distancia entre la aguja y el contraelectrodo en cuanto a la formación del cono de Taylor, su estabilidad, la estabilidad de la producción de EWNS y la reproducibilidad. En la Tabla S1 del material complementario se muestran varias combinaciones.
La salida del sistema de generación EWNS se conectó directamente a un analizador de tamaño de partículas por movilidad de escaneo (SMPS, modelo 3936, TSI, Shoreview, MN) para la medición de la concentración numérica de partículas, así como a un electrómetro de Faraday de aerosoles (TSI, modelo 3068B, Shoreview, MN). Las corrientes de aerosol se midieron como se describe en nuestra publicación anterior. Tanto el SMPS como el electrómetro de aerosoles tomaron muestras a un caudal de 0,5 L/min (caudal total de la muestra: 1 L/min). La concentración numérica de partículas y el caudal de aerosol se midieron durante 120 segundos. La medición se repitió 30 veces. Con base en las mediciones de corriente, se calcula la carga total de aerosol y se estima la carga promedio de EWNS para un número total dado de partículas EWNS seleccionadas. El costo promedio de EWNS se puede calcular utilizando la ecuación (1):
donde IEl es la corriente medida, NSMPS es la concentración digital medida con el SMPS y φEl es el caudal por electrómetro.
Debido a que la humedad relativa (HR) afecta la carga superficial, la temperatura y la HR se mantuvieron constantes durante el experimento a 21 °C y 45 %, respectivamente.
Se utilizó microscopía de fuerza atómica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Bárbara, CA) y sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japón) para medir el tamaño y la vida útil de las EWNS. La frecuencia de escaneo del AFM fue de 1 Hz, el área de escaneo fue de 5 μm × 5 μm y se emplearon 256 líneas de escaneo. Todas las imágenes se sometieron a una alineación de primer orden utilizando el software Asylum (rango de máscara de 100 nm, umbral de 100 pm).
Se retiró el embudo de prueba y se colocó la superficie de mica a una distancia de 2,0 cm del contraelectrodo durante un tiempo de promediado de 120 s para evitar la aglomeración de partículas y la formación de gotas irregulares en la superficie de mica. Se pulverizó EWNS directamente sobre la superficie de mica recién cortada (Ted Pella, Redding, CA). Imagen de la superficie de mica inmediatamente después de la pulverización catódica AFM. El ángulo de contacto de la superficie de mica recién cortada sin modificar es cercano a 0°, por lo que EVNS se distribuye sobre la superficie de mica en forma de cúpula. El diámetro (a) y la altura (h) de las gotas difusoras se midieron directamente a partir de la topografía AFM y se utilizaron para calcular el volumen de difusión en cúpula de EWNS utilizando nuestro método previamente validado. Suponiendo que el EWNS a bordo tiene el mismo volumen, el diámetro equivalente se puede calcular utilizando la ecuación (2):
Basándonos en nuestro método previamente desarrollado, se utilizó una trampa de espín de resonancia de espín electrónico (ESR) para detectar la presencia de intermedios radicales de corta duración en EWNS. Los aerosoles se burbujearon a través de un difusor Midget de 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) que contenía una solución de 235 mM de DEPMPO(5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Todas las mediciones de ESR se realizaron utilizando un espectrómetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, EE. UU.) y una celda de panel plano. El software Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, EE. UU.) se utilizó para recopilar y analizar los datos. La determinación de las características de las ROS se llevó a cabo solo para un conjunto de condiciones de operación [-6,5 kV, 4,0 cm]. Las concentraciones de EWNS se midieron utilizando el SMPS después de tener en cuenta las pérdidas de EWNS en el impactador.
Los niveles de ozono se monitorearon utilizando un monitor de ozono de doble haz 205™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Para todas las propiedades de EWNS, se utiliza el valor medio como valor de medición y la desviación estándar como error de medición. Se realizaron pruebas t para comparar los valores de los atributos EWNS optimizados con los valores correspondientes del EWNS base.
La figura 2c muestra un sistema de precipitación electrostática (EPES) previamente desarrollado y caracterizado, que puede utilizarse para la entrega dirigida de EWNS en la superficie. EPES utiliza cargas de EVNS que pueden ser "guiadas" directamente a la superficie del objetivo bajo la influencia de un fuerte campo eléctrico. Los detalles del sistema EPES se presentan en una publicación reciente de Pyrgiotakis et al. 11. Así, EPES consiste en una cámara de PVC impresa en 3D con extremos cónicos y contiene dos placas metálicas paralelas de acero inoxidable (acero inoxidable 304, con recubrimiento de espejo) en el centro, separadas 15,24 cm. Las placas estaban conectadas a una fuente de alto voltaje externa (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY); la placa inferior siempre estaba conectada a voltaje positivo y la placa superior siempre estaba conectada a tierra (tierra flotante). Las paredes de la cámara están cubiertas con papel de aluminio, que está conectado a tierra eléctricamente para evitar la pérdida de partículas. La cámara dispone de una puerta frontal sellada que permite colocar las superficies de prueba sobre soportes de plástico que las elevan por encima de la placa metálica inferior para evitar interferencias de alto voltaje.
La eficiencia de deposición de EWNS en EPES se calculó de acuerdo con un protocolo desarrollado previamente y detallado en la Figura complementaria S111.
Como cámara de control, se conectó en serie una segunda cámara de flujo cilíndrica al sistema EPES, en la que se utilizó un filtro HEPA intermedio para eliminar las partículas de EWNS. Como se muestra en la Figura 2c, el aerosol de EWNS se bombeó a través de dos cámaras integradas. El filtro entre la sala de control y el sistema EPES elimina cualquier resto de EWNS, lo que resulta en la misma temperatura (T), humedad relativa (HR) y niveles de ozono.
Se ha descubierto que importantes microorganismos transmitidos por los alimentos contaminan los alimentos frescos, como E. coli (ATCC #27325), indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), patógeno transmitido por los alimentos, Listeria harmless (ATCC #33090), sustituto de la patógena Listeria monocytogenes, derivada de ATCC (Manassas, VA), Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), un sustituto de la levadura de deterioro, y una bacteria inactivada más resistente, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Compra cajas de tomates cherry orgánicos al azar en tu mercado local y refrigéralas a 4 °C hasta su uso (hasta 3 días). Todos los tomates utilizados en el experimento eran del mismo tamaño, aproximadamente 1,2 cm de diámetro.
Los protocolos de cultivo, inoculación, exposición y recuento de colonias se detallan en nuestra publicación anterior y en los Datos Suplementarios. La efectividad de EWNS se evaluó exponiendo tomates inoculados a 40 000 #/cm3 durante 45 minutos. Brevemente, se utilizaron tres tomates para evaluar los microorganismos supervivientes en el tiempo t = 0 min. Tres tomates se colocaron en EPES y se expusieron a EWNS a 40 000 #/cc (tomates expuestos a EWNS) y los tres restantes se colocaron en la cámara de control (tomates de control). No se realizó ningún procesamiento adicional de los tomates en ambos grupos. Los tomates expuestos a EWNS y los tomates de control se retiraron después de 45 minutos para evaluar el efecto de EWNS.
Cada experimento se realizó por triplicado. El análisis de datos se llevó a cabo según el protocolo descrito en los Datos Suplementarios.
Los mecanismos de inactivación se evaluaron mediante la sedimentación de muestras expuestas de EWNS (45 min a una concentración de aerosol de EWNS de 40 000 #/cm3) y muestras no irradiadas de bacterias inocuas E. coli, Salmonella enterica y Lactobacillus. Las partículas se fijaron en glutaraldehído al 2,5 %, paraformaldehído al 1,25 % y ácido pícrico al 0,03 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) durante 2 horas a temperatura ambiente. Después del lavado, postfijación con tetróxido de osmio al 1 % (OsO4)/ferrocianuro de potasio al 1,5 % (KFeCN6) durante 2 horas, lavado 3 veces en agua e incubación en acetato de uranilo al 1 % durante 1 hora, luego lavado dos veces en agua, luego deshidratación durante 10 minutos en alcohol al 50 %, 70 %, 90 %, 100 %. Las muestras se colocaron en óxido de propileno durante 1 hora y se impregnaron con una mezcla 1:1 de óxido de propileno y TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). Posteriormente, las muestras se embebieron en TAAB Epon y se polimerizaron a 60 °C durante 48 horas. La resina granular curada se cortó y se visualizó mediante TEM utilizando un microscopio electrónico de transmisión convencional JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japón) equipado con una cámara CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, EE. UU.).
Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Para cada punto temporal, se inocularon muestras bacterianas por triplicado, obteniendo un total de nueve puntos de datos por muestra. El promedio de estos nueve puntos se utilizó como concentración bacteriana para ese microorganismo en particular. La desviación estándar se utilizó como error de medición. Todos los puntos son válidos.
El logaritmo de la disminución de la concentración de bacterias en comparación con t = 0 min se calculó utilizando la siguiente fórmula:
donde C0 es la concentración de bacterias en la muestra de control en el tiempo 0 (es decir, después de que la superficie se haya secado pero antes de ser colocada en la cámara) y Cn es la concentración de bacterias en la superficie después de n minutos de exposición.
Para tener en cuenta la degradación natural de las bacterias durante la exposición de 45 minutos, la reducción logarítmica en comparación con el control después de 45 minutos también se calculó de la siguiente manera:
donde Cn es la concentración de bacterias en la muestra de control en el tiempo n y Cn-Control es la concentración de bacterias de control en el tiempo n. Los datos se presentan como una reducción logarítmica en comparación con el control (sin exposición a EWNS).
Durante el estudio, se evaluaron varias combinaciones de voltaje y distancia entre la aguja y el contraelectrodo en términos de formación del cono de Taylor, estabilidad del cono de Taylor, estabilidad de la producción de EWNS y reproducibilidad. Varias combinaciones se muestran en la Tabla Suplementaria S1. Se seleccionaron dos casos que mostraron propiedades estables y reproducibles (cono de Taylor, generación de EWNS y estabilidad a lo largo del tiempo) para un estudio exhaustivo. En la figura 3 se muestran los resultados para la carga, el tamaño y el contenido de ROS en ambos casos. Los resultados también se muestran en la Tabla 1. Como referencia, tanto la Figura 3 como la Tabla 1 incluyen las propiedades de los EWNS8, 9, 10, 11 no optimizados previamente sintetizados (EWNS de referencia). Los cálculos de significancia estadística utilizando una prueba t de dos colas se republican en la Tabla Suplementaria S2. Además, los datos adicionales incluyen estudios del efecto del diámetro del orificio de muestreo del contraelectrodo (D) y la distancia entre el electrodo de tierra y la punta (L) (Figuras Suplementarias S2 y S3).
(ac) Distribución de tamaño medida por AFM. (df) Característica de carga superficial. (g) Caracterización de ROS de la EPR.
También es importante destacar que, para todas las condiciones mencionadas, la corriente de ionización medida se situó entre 2 y 6 μA y el voltaje entre -3,8 y -6,5 kV, lo que resultó en un consumo de energía inferior a 50 mW para este módulo de contacto de generación de EWNS. Si bien el EWNS se sintetizó a alta presión, los niveles de ozono fueron muy bajos, sin superar nunca los 60 ppb.
La Figura S4 complementaria muestra los campos eléctricos simulados para los escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Para estos escenarios, los cálculos de campo son 2 × 10⁵ V/m y 4,7 × 10⁵ V/m, respectivamente. Esto es previsible, ya que en el segundo caso la relación voltaje-distancia es mucho mayor.
En la figura 3a,b se muestra el diámetro de EWNS medido con el AFM8. Los diámetros promedio de EWNS calculados fueron de 27 nm y 19 nm para los esquemas [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Para los escenarios [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], las desviaciones estándar geométricas de las distribuciones son 1,41 y 1,45, respectivamente, lo que indica una distribución de tamaño estrecha. Tanto el tamaño medio como la desviación estándar geométrica están muy cerca de la línea base de EWNS, en 25 nm y 1,41, respectivamente. En la figura 3c se muestra la distribución de tamaño de la base de EWNS medida utilizando el mismo método bajo las mismas condiciones.
En la figura 3d,e se muestran los resultados de la caracterización de carga. Los datos son mediciones promedio de 30 mediciones simultáneas de concentración (#/cm3) y corriente (I). El análisis muestra que la carga promedio en el EWNS es de 22 ± 6 e- y 44 ± 6 e- para [-6,5 kV, 4,0 cm] y [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente. Tienen cargas superficiales significativamente mayores en comparación con el EWNS de referencia (10 ± 2 e-), dos veces mayores que el escenario [-6,5 kV, 4,0 cm] y cuatro veces mayores que el [-3,8 kV, 0,5 cm]. La figura 3f muestra los datos de carga para Baseline-EWNS.
A partir de los mapas de concentración del número de EWNS (Figuras complementarias S5 y S6), se observa que el escenario [-6,5 kV, 4,0 cm] presenta una cantidad significativamente mayor de partículas que el escenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Cabe destacar también que la concentración del número de EWNS se monitorizó durante 4 horas (Figuras complementarias S5 y S6), periodo durante el cual la estabilidad de la generación de EWNS mostró los mismos niveles de concentración de partículas en ambos casos.
En la figura 3g se muestra el espectro EPR después de la sustracción del control EWNS optimizado (fondo) en [-6,5 kV, 4,0 cm]. Los espectros ROS también se compararon con el escenario Baseline-EWNS en un trabajo publicado anteriormente. El número de EWNS que reaccionan con trampas de espín se calculó en 7,5 × 10⁴ EWNS/s, que es similar al Baseline-EWNS⁸ publicado anteriormente. Los espectros EPR mostraron claramente la presencia de dos tipos de ROS, siendo O₂⁻ la especie predominante y OH• la menos abundante. Además, una comparación directa de las intensidades de los picos mostró que el EWNS optimizado tenía un contenido de ROS significativamente mayor en comparación con el EWNS de referencia.
La figura 4 muestra la eficiencia de deposición de EWNS en EPES. Los datos también se resumen en la Tabla I y se comparan con los datos originales de EWNS. En ambos casos de EUNS, la deposición es cercana al 100% incluso a un voltaje bajo de 3,0 kV. Normalmente, 3,0 kV es suficiente para una deposición del 100%, independientemente del cambio de carga superficial. En las mismas condiciones, la eficiencia de deposición de Baseline-EWNS fue de solo el 56% debido a su menor carga (un promedio de 10 electrones por EWNS).
La figura 5 y la tabla 2 resumen el valor de inactivación de microorganismos inoculados en la superficie de tomates tras la exposición a aproximadamente 40 000 #/cm³ de EWNS durante 45 minutos en el modo óptimo [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli y Lactobacillus innocus inoculados mostraron una reducción significativa de 3,8 log durante los 45 minutos de exposición. En las mismas condiciones, S. enterica presentó una disminución de 2,2 log, mientras que S. cerevisiae y M. parafortutum mostraron una disminución de 1,0 log.
Las micrografías electrónicas (Figura 6) muestran los cambios físicos inducidos por el EWNS en células inocuas de Escherichia coli, Streptococcus y Lactobacillus, que provocan su inactivación. Las bacterias de control presentaban membranas celulares intactas, mientras que las bacterias expuestas tenían membranas externas dañadas.
Las imágenes obtenidas mediante microscopía electrónica de las bacterias de control y las expuestas revelaron daños en la membrana.
Los datos sobre las propiedades fisicoquímicas de las EWNS optimizadas muestran colectivamente que las propiedades (carga superficial y contenido de ROS) de las EWNS mejoraron significativamente en comparación con los datos de referencia de EWNS publicados anteriormente8,9,10,11. Por otro lado, su tamaño se mantuvo en el rango nanométrico, muy similar a los resultados previamente informados, lo que les permite permanecer en el aire durante largos períodos de tiempo. La polidispersidad observada puede explicarse por cambios en la carga superficial que determinan el tamaño de las EWNS, la aleatoriedad del efecto Rayleigh y la posible coalescencia. Sin embargo, como detallan Nielsen et al. 22, una alta carga superficial reduce la evaporación al aumentar efectivamente la energía/tensión superficial de la gota de agua. En nuestra publicación anterior8 esta teoría se confirmó experimentalmente para microgotas 22 y EWNS. La pérdida de carga con el tiempo también puede afectar el tamaño y contribuir a la distribución de tamaño observada.