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Recentemente è stata sviluppata una piattaforma antimicrobica priva di sostanze chimiche basata sulla nanotecnologia e sull'utilizzo di nanostrutture di acqua artificiale (EWNS). Le EWNS presentano un'elevata carica superficiale e sono sature di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in grado di interagire con numerosi microrganismi, inclusi i patogeni di origine alimentare, e di inattivarli. In questo studio si dimostra che le loro proprietà durante la sintesi possono essere ottimizzate e regolate con precisione per migliorarne ulteriormente il potenziale antibatterico. La piattaforma di laboratorio EWNS è stata progettata per ottimizzare le proprietà delle EWNS modificando i parametri di sintesi. Sono state caratterizzate le proprietà delle EWNS (carica, dimensione e contenuto di ROS) utilizzando metodi analitici moderni. Inoltre, è stato valutato il loro potenziale di inattivazione microbica nei confronti di microrganismi di origine alimentare come Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium paraaccidentum e Saccharomyces cerevisiae. I risultati qui presentati dimostrano che le proprietà delle EWNS possono essere ottimizzate durante la sintesi, determinando un aumento esponenziale dell'efficienza di inattivazione. In particolare, la carica superficiale è aumentata di un fattore quattro e le specie reattive dell'ossigeno sono aumentate. Il tasso di rimozione microbica era dipendente dal tipo di microrganismo e variava da 1,0 a 3,8 log dopo un'esposizione di 45 minuti a una dose di aerosol di 40.000 #/cc EWNS.
La contaminazione microbica è la principale causa di malattie di origine alimentare, dovute all'ingestione di agenti patogeni o delle loro tossine. Solo negli Stati Uniti, le malattie di origine alimentare causano circa 76 milioni di casi di malattia, 325.000 ricoveri ospedalieri e 5.000 decessi ogni anno¹. Inoltre, il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) stima che l'aumento del consumo di prodotti freschi sia responsabile del 48% di tutte le malattie di origine alimentare segnalate negli Stati Uniti². Il costo delle malattie e dei decessi causati da agenti patogeni di origine alimentare negli Stati Uniti è molto elevato, stimato dai Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie (CDC) in oltre 15,6 miliardi di dollari all'anno³.
Attualmente, gli interventi antimicrobici chimici4, radiativi5 e termici6 per garantire la sicurezza alimentare vengono perlopiù effettuati in punti critici di controllo (CCP) limitati lungo la catena di produzione (di solito dopo la raccolta e/o durante il confezionamento) piuttosto che in modo continuo. Pertanto, sono soggetti a contaminazione incrociata. 7. Un migliore controllo delle malattie di origine alimentare e del deterioramento degli alimenti richiede interventi antimicrobici che possano essere potenzialmente applicati lungo l'intera filiera "dal campo alla tavola", riducendo al contempo l'impatto ambientale e i costi.
Recentemente è stata sviluppata una piattaforma antimicrobica basata sulla nanotecnologia e priva di sostanze chimiche, in grado di inattivare batteri superficiali e aerodispersi utilizzando nanostrutture artificiali di acqua (EWNS). Le EWNS sono state sintetizzate mediante due processi paralleli: elettrospray e ionizzazione dell'acqua (Fig. 1a). Studi precedenti hanno dimostrato che le EWNS possiedono un insieme unico di proprietà fisiche e biologiche8,9,10. Le EWNS hanno una media di 10 elettroni per struttura e una dimensione media su scala nanometrica di 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10. Inoltre, la risonanza di spin elettronico (ESR) ha mostrato che le EWNS contengono una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS), principalmente radicali idrossilici (OH•) e superossido (O2-) (Fig. 1c)8. Le EWNS rimangono sospese nell'aria per lungo tempo e possono entrare in collisione con i microrganismi sospesi nell'aria e presenti sulla superficie, rilasciando il loro carico di ROS e causando l'inattivazione dei microrganismi (Fig. 1d). Questi primi studi hanno anche dimostrato che l'EWNS può interagire con vari batteri Gram-negativi e Gram-positivi, inclusi i micobatteri, presenti sulle superfici e nell'aria, e inattivarli. La microscopia elettronica a trasmissione ha mostrato che l'inattivazione era causata dalla rottura della membrana cellulare. Inoltre, studi di inalazione acuta hanno dimostrato che dosi elevate di EWNS non causano danni o infiammazioni polmonari 8.
(a) L'elettrospray si verifica quando viene applicata un'alta tensione tra un tubo capillare contenente liquido e un controelettrodo. (b) L'applicazione di alta pressione determina due fenomeni diversi: (i) elettrospray dell'acqua e (ii) formazione di specie reattive dell'ossigeno (ioni) intrappolate nell'EWNS. (c) La struttura unica dell'EWNS. (d) Grazie alla loro natura su scala nanometrica, gli EWNS sono altamente mobili e possono interagire con agenti patogeni aerotrasportati.
È stata recentemente dimostrata anche la capacità della piattaforma antimicrobica EWNS di inattivare i microrganismi patogeni presenti sulla superficie degli alimenti freschi. È stato inoltre dimostrato che la carica superficiale dell'EWNS, in combinazione con un campo elettrico, può essere utilizzata per ottenere un rilascio mirato. Inoltre, i risultati preliminari ottenuti su pomodori biologici dopo un'esposizione di 90 minuti a un EWNS di circa 50.000 #/cm³ sono stati incoraggianti, con l'inattivazione di diversi microrganismi patogeni come E. coli e Listeria. In aggiunta, i test organolettici preliminari non hanno evidenziato effetti sensoriali rispetto ai pomodori di controllo. Sebbene questi risultati iniziali di inattivazione siano incoraggianti per le applicazioni nel settore della sicurezza alimentare, anche a dosi molto basse di EWNS (50.000 #/cm³), è chiaro che un potenziale di inattivazione maggiore sarebbe più vantaggioso per ridurre ulteriormente il rischio di infezione e deterioramento.
Qui, concentreremo la nostra ricerca sullo sviluppo di una piattaforma di generazione di EWNS per consentire la messa a punto dei parametri di sintesi e l'ottimizzazione delle proprietà fisico-chimiche degli EWNS per migliorarne il potenziale antibatterico. In particolare, l'ottimizzazione si è concentrata sull'aumento della loro carica superficiale (per migliorare il rilascio mirato) e del contenuto di ROS (per migliorare l'efficienza di inattivazione). Caratterizzare le proprietà fisico-chimiche ottimizzate (dimensioni, carica e contenuto di ROS) utilizzando metodi analitici moderni e utilizzare microrganismi alimentari comuni come E. .
L'EVNS è stato sintetizzato mediante elettrospray simultaneo e ionizzazione di acqua ad elevata purezza (18 MΩ cm–1). Il nebulizzatore elettrico 12 viene tipicamente utilizzato per l'atomizzazione di liquidi e la sintesi di particelle polimeriche e ceramiche 13 e fibre 14 di dimensioni controllate.
Come dettagliato nelle precedenti pubblicazioni 8, 9, 10, 11, in un esperimento tipico, è stata applicata un'alta tensione tra un capillare metallico e un controelettrodo messo a terra. Durante questo processo, si verificano due fenomeni diversi: i) elettrospray e ii) ionizzazione dell'acqua. Un forte campo elettrico tra i due elettrodi provoca l'accumulo di cariche negative sulla superficie dell'acqua condensata, con conseguente formazione di coni di Taylor. Di conseguenza, si formano goccioline d'acqua altamente cariche, che continuano a frammentarsi in particelle più piccole, come nella teoria di Rayleigh16. Allo stesso tempo, i forti campi elettrici causano la scissione di alcune molecole d'acqua e la perdita di elettroni (ionizzazione), il che porta alla formazione di una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS)17. Le ROS18 generate simultaneamente sono state incapsulate in EWNS (Fig. 1c).
La figura 2a mostra il sistema di generazione EWNS sviluppato e utilizzato nella sintesi EWNS in questo studio. Acqua purificata, conservata in una bottiglia chiusa, è stata fatta passare attraverso un tubo di teflon (diametro interno di 2 mm) in un ago di acciaio inossidabile 30G (capillare metallico). Il flusso d'acqua è controllato dalla pressione dell'aria all'interno della bottiglia, come mostrato in figura 2b. L'ago è montato su una console in teflon e può essere regolato manualmente a una certa distanza dal controelettrodo. Il controelettrodo è un disco di alluminio lucidato con un foro al centro per il campionamento. Al di sotto del controelettrodo si trova un imbuto di campionamento in alluminio, collegato al resto della configurazione sperimentale tramite una porta di campionamento (Fig. 2b). Per evitare l'accumulo di carica che potrebbe interferire con il funzionamento del campionatore, tutti i componenti del campionatore sono messi a terra.
(a) Sistema di generazione di nanostrutture d'acqua ingegnerizzate (EWNS). (b) Sezione trasversale del campionatore e dell'elettrospray, che mostra i parametri più importanti. (c) Configurazione sperimentale per l'inattivazione dei batteri.
Il sistema di generazione EWNS descritto sopra è in grado di modificare i parametri operativi chiave per facilitare la messa a punto delle proprietà EWNS. Regolando la tensione applicata (V), la distanza tra l'ago e il controelettrodo (L) e il flusso d'acqua (φ) attraverso il capillare, è possibile ottimizzare le caratteristiche EWNS. Il simbolo utilizzato per rappresentare le diverse combinazioni è: [V (kV), L (cm)]. Regolando il flusso d'acqua si ottiene un cono di Taylor stabile di una determinata combinazione di [V, L]. Ai fini di questo studio, il diametro dell'apertura del controelettrodo (D) è stato mantenuto a 0,5 pollici (1,29 cm).
A causa della geometria limitata e dell'asimmetria, l'intensità del campo elettrico non può essere calcolata a partire dai principi fondamentali. Pertanto, è stato utilizzato il software QuickField™ (Svendborg, Danimarca)¹⁹ per calcolare il campo elettrico. Il campo elettrico non è uniforme, quindi il valore del campo elettrico sulla punta del capillare è stato utilizzato come valore di riferimento per le diverse configurazioni.
Durante lo studio, sono state valutate diverse combinazioni di tensione e distanza tra l'ago e il controelettrodo in termini di formazione del cono di Taylor, stabilità del cono di Taylor, stabilità della produzione di EWNS e riproducibilità. Le varie combinazioni sono riportate nella Tabella supplementare S1.
L'uscita del sistema di generazione EWNS è stata collegata direttamente a un analizzatore di dimensioni delle particelle a mobilità di scansione (SMPS, modello 3936, TSI, Shoreview, MN) per la misurazione della concentrazione numerica delle particelle, nonché a un elettrometro di Faraday per aerosol (TSI, modello 3068B, Shoreview, MN). La corrente di aerosol è stata misurata come descritto nella nostra precedente pubblicazione. Sia l'SMPS che l'elettrometro per aerosol hanno campionato a una velocità di flusso di 0,5 L/min (flusso totale del campione 1 L/min). La concentrazione numerica delle particelle e il flusso di aerosol sono stati misurati per 120 secondi. La misurazione è stata ripetuta 30 volte. Sulla base delle misurazioni di corrente, viene calcolata la carica totale di aerosol e viene stimata la carica EWNS media per un dato numero totale di particelle EWNS selezionate. Il costo medio di EWNS può essere calcolato utilizzando l'equazione (1):
dove IEl è la corrente misurata, NSMPS è la concentrazione digitale misurata con l'SMPS e φEl è la portata per elettrometro.
Poiché l'umidità relativa (UR) influenza la carica superficiale, la temperatura e l'UR sono state mantenute costanti durante l'esperimento rispettivamente a 21 °C e 45%.
Per misurare le dimensioni e la durata degli EWNS sono stati utilizzati un microscopio a forza atomica (AFM), un Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) e una sonda AC260T (Olympus, Tokyo, Giappone). La frequenza di scansione dell'AFM era di 1 Hz, l'area di scansione di 5 μm × 5 μm e 256 linee di scansione. Tutte le immagini sono state sottoposte ad allineamento di primo ordine utilizzando il software Asylum (intervallo della maschera 100 nm, soglia 100 pm).
L'imbuto di prova è stato rimosso e la superficie di mica è stata posizionata a una distanza di 2,0 cm dal controelettrodo per un tempo di media di 120 s per evitare l'agglomerazione delle particelle e la formazione di goccioline irregolari sulla superficie di mica. L'EWNS è stato spruzzato direttamente sulla superficie di mica appena tagliata (Ted Pella, Redding, CA). Immagine della superficie di mica immediatamente dopo la deposizione tramite sputtering AFM. L'angolo di contatto della superficie di mica appena tagliata non modificata è vicino a 0°, quindi l'EWNS è distribuito sulla superficie di mica a forma di cupola. Il diametro (a) e l'altezza (h) delle goccioline in diffusione sono stati misurati direttamente dalla topografia AFM e utilizzati per calcolare il volume di diffusione a cupola dell'EWNS utilizzando il nostro metodo precedentemente validato. Supponendo che l'EWNS a bordo abbia lo stesso volume, il diametro equivalente può essere calcolato utilizzando l'equazione (2):
Basandoci sul metodo da noi precedentemente sviluppato, è stata utilizzata una trappola di spin a risonanza di spin elettronico (ESR) per rilevare la presenza di intermedi radicalici di breve durata in EWNS. Gli aerosol sono stati fatti gorgogliare attraverso uno sparger Midget da 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) contenente una soluzione 235 mM di DEPMPO (5-(dietossifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-ossido) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Tutte le misurazioni ESR sono state eseguite utilizzando uno spettrometro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) e una cella a pannello piatto. Il software Acquisit (Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA) è stato utilizzato per raccogliere e analizzare i dati. La determinazione delle caratteristiche delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) è stata effettuata solo per una serie di condizioni operative [-6,5 kV, 4,0 cm]. Le concentrazioni di EWNS sono state misurate utilizzando lo SMPS dopo aver tenuto conto delle perdite di EWNS nell'impattore.
I livelli di ozono sono stati monitorati utilizzando un monitor per ozono a doppio raggio 205™ (2B Technologies, Boulder, CO)8,9,10.
Per tutte le proprietà EWNS, il valore medio viene utilizzato come valore di misurazione e la deviazione standard come errore di misurazione. Sono stati eseguiti test t per confrontare i valori degli attributi EWNS ottimizzati con i valori corrispondenti dell'EBNS di base.
La Figura 2c mostra un sistema di "trazione" per precipitazione elettrostatica (EPES) precedentemente sviluppato e caratterizzato, utilizzabile per il rilascio mirato di EWNS sulla superficie. L'EPES utilizza cariche di EVNS che possono essere "guidate" direttamente sulla superficie del bersaglio sotto l'influenza di un forte campo elettrico. I dettagli del sistema EPES sono presentati in una recente pubblicazione di Pyrgiotakis et al. 11. L'EPES è costituito da una camera in PVC stampata in 3D con estremità rastremate e contiene due piastre metalliche parallele in acciaio inossidabile (acciaio inossidabile 304, con rivestimento a specchio) distanti 15,24 cm l'una dall'altra. Le piastre sono collegate a una sorgente esterna ad alta tensione (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), la piastra inferiore è sempre collegata a una tensione positiva e la piastra superiore è sempre collegata a terra (massa flottante). Le pareti della camera sono rivestite con un foglio di alluminio, collegato a terra elettricamente per prevenire la perdita di particelle. La camera è dotata di uno sportello di carico frontale sigillato che consente di posizionare le superfici di prova su supporti di plastica che le sollevano al di sopra della piastra metallica inferiore per evitare interferenze ad alta tensione.
L'efficienza di deposizione di EWNS in EPES è stata calcolata secondo un protocollo precedentemente sviluppato e dettagliato nella Figura supplementare S111.
Come camera di controllo, una seconda camera di flusso cilindrica è stata collegata in serie al sistema EPES, in cui è stato utilizzato un filtro HEPA intermedio per rimuovere l'EWNS. Come mostrato nella Figura 2c, l'aerosol di EWNS è stato pompato attraverso due camere integrate. Il filtro tra la sala di controllo e l'EPES rimuove l'eventuale EWNS residuo, mantenendo così la stessa temperatura (T), umidità relativa (RH) e livelli di ozono.
Importanti microrganismi di origine alimentare sono stati trovati a contaminare alimenti freschi come E. coli (ATCC #27325), indicatore fecale, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogeno di origine alimentare, Listeria harmless (ATCC #33090), surrogato della patogena Listeria monocytogenes, derivato da ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), un sostituto del lievito responsabile del deterioramento e un batterio inattivato più resistente, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Acquistate confezioni a caso di pomodorini biologici dal vostro mercato locale e conservateli in frigorifero a 4 °C fino al momento dell'utilizzo (fino a 3 giorni). I pomodorini utilizzati per l'esperimento erano tutti della stessa dimensione, circa 1,2 cm di diametro.
I protocolli di coltura, inoculazione, esposizione e conteggio delle colonie sono descritti in dettaglio nella nostra precedente pubblicazione e nei Dati Supplementari. L'efficacia di EWNS è stata valutata esponendo i pomodori inoculati a 40.000 #/cm³ per 45 minuti. In breve, sono stati utilizzati tre pomodori per valutare i microrganismi sopravvissuti al tempo t = 0 min. Tre pomodori sono stati posti in EPES ed esposti a EWNS a 40.000 #/cm³ (pomodori esposti a EWNS) e i restanti tre sono stati posti nella camera di controllo (pomodori di controllo). Non è stata effettuata alcuna ulteriore lavorazione dei pomodori in entrambi i gruppi. I pomodori esposti a EWNS e i pomodori di controllo sono stati rimossi dopo 45 minuti per valutare l'effetto di EWNS.
Ciascun esperimento è stato condotto in triplice copia. L'analisi dei dati è stata effettuata secondo il protocollo descritto nei Dati supplementari.
I meccanismi di inattivazione sono stati valutati mediante sedimentazione di campioni di EWNS esposti (45 min a una concentrazione di aerosol di EWNS di 40.000 #/cm3) e campioni non irradiati di batteri innocui E. coli, Salmonella enterica e Lactobacillus. Le particelle sono state fissate in glutaraldeide al 2,5%, paraformaldeide all'1,25% e acido picrico allo 0,03% in tampone di cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,4) per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio, post-fissazione con tetrossido di osmio all'1% (OsO4)/ferrocianuro di potassio all'1,5% (KFeCN6) per 2 ore, lavaggio 3 volte in acqua e incubazione in acetato di uranile all'1% per 1 ora, quindi lavaggio due volte in acqua, infine disidratazione per 10 minuti in alcol al 50%, 70%, 90%, 100%. I campioni sono stati quindi immersi in ossido di propilene per 1 ora e impregnati con una miscela 1:1 di ossido di propilene e TAAP Epon (Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA). I ​​campioni sono stati inglobati in TAAB Epon e polimerizzati a 60 °C per 48 ore. La resina granulare polimerizzata è stata tagliata e visualizzata tramite TEM utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione convenzionale JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Giappone) dotato di una telecamera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplice copia. Per ogni punto temporale, i lavaggi batterici sono stati inoculati in triplice copia, ottenendo un totale di nove punti dati per punto, la cui media è stata utilizzata come concentrazione batterica per quel particolare microrganismo. La deviazione standard è stata utilizzata come errore di misurazione. Tutti i punti sono conteggiati.
Il logaritmo della diminuzione della concentrazione batterica rispetto a t = 0 min è stato calcolato utilizzando la seguente formula:
dove C0 è la concentrazione di batteri nel campione di controllo al tempo 0 (ovvero dopo che la superficie si è asciugata ma prima di essere inserita nella camera) e Cn è la concentrazione di batteri sulla superficie dopo n minuti di esposizione.
Per tenere conto della naturale degradazione dei batteri durante l'esposizione di 45 minuti, la riduzione logaritmica rispetto al controllo dopo 45 minuti è stata calcolata come segue:
dove Cn è la concentrazione di batteri nel campione di controllo al tempo n e Cn-Controllo è la concentrazione di batteri di controllo al tempo n. I dati sono presentati come riduzione logaritmica rispetto al controllo (nessuna esposizione a EWNS).
Durante lo studio, sono state valutate diverse combinazioni di tensione e distanza tra l'ago e il controelettrodo in termini di formazione del cono di Taylor, stabilità del cono di Taylor, stabilità della produzione di EWNS e riproducibilità. Le varie combinazioni sono riportate nella Tabella supplementare S1. Due casi che mostravano proprietà stabili e riproducibili (cono di Taylor, generazione di EWNS e stabilità nel tempo) sono stati selezionati per uno studio completo. La Figura 3 mostra i risultati per la carica, la dimensione e il contenuto di ROS in entrambi i casi. I risultati sono riportati anche nella Tabella 1. Per riferimento, sia la Figura 3 che la Tabella 1 includono le proprietà degli EWNS non ottimizzati precedentemente sintetizzati8, 9, 10, 11 (EWNS di riferimento). I calcoli della significatività statistica utilizzando un test t a due code sono ripubblicati nella Tabella supplementare S2. Inoltre, dati aggiuntivi includono studi sull'effetto del diametro del foro di campionamento del controelettrodo (D) e della distanza tra l'elettrodo di terra e la punta (L) (Figure supplementari S2 e S3).
(ac) Distribuzione dimensionale misurata tramite AFM. (df) Caratteristica della carica superficiale. (g) Caratterizzazione ROS dell'EPR.
È inoltre importante notare che, per tutte le condizioni sopra descritte, la corrente di ionizzazione misurata era compresa tra 2 e 6 μA e la tensione tra -3,8 e -6,5 kV, con un consumo energetico inferiore a 50 mW per questo singolo modulo di contatto per la generazione di EWNS. Sebbene l'EBNS sia stato sintetizzato ad alta pressione, i livelli di ozono sono risultati molto bassi, non superando mai i 60 ppb.
La Figura supplementare S4 mostra i campi elettrici simulati per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], rispettivamente. Per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], i calcoli del campo sono rispettivamente 2 × 10⁵ V/m e 4,7 × 10⁵ V/m. Questo è prevedibile, poiché nel secondo caso il rapporto tensione-distanza è molto più elevato.
La figura 3a,b mostra il diametro EWNS misurato con l'AFM8. I diametri medi EWNS calcolati erano rispettivamente di 27 nm e 19 nm per gli schemi [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm]. Per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], le deviazioni standard geometriche delle distribuzioni sono rispettivamente 1,41 e 1,45, indicando una distribuzione dimensionale ristretta. Sia la dimensione media che la deviazione standard geometrica sono molto vicine al valore di riferimento dell'EBNS, rispettivamente di 25 nm e 1,41. La figura 3c mostra la distribuzione dimensionale dell'EBNS di base misurata utilizzando lo stesso metodo nelle stesse condizioni.
La figura 3d,e mostra i risultati della caratterizzazione della carica. I dati sono misurazioni medie di 30 misurazioni simultanee di concentrazione (#/cm3) e corrente (I). L'analisi mostra che la carica media sull'EWNS è di 22 ± 6 e- e 44 ± 6 e- rispettivamente per [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm]. Hanno cariche superficiali significativamente più elevate rispetto all'EWNS di riferimento (10 ± 2 e-), due volte maggiori rispetto allo scenario [-6,5 kV, 4,0 cm] e quattro volte maggiori rispetto a [-3,8 kV, 0,5 cm]. La figura 3f mostra i dati di carica per l'EWNS di riferimento.
Dalle mappe di concentrazione del numero di EWNS (Figure supplementari S5 e S6), si può notare che lo scenario [-6,5 kV, 4,0 cm] presenta un numero di particelle significativamente maggiore rispetto allo scenario [-3,8 kV, 0,5 cm]. Vale anche la pena notare che la concentrazione del numero di EWNS è stata monitorata fino a 4 ore (Figure supplementari S5 e S6), periodo durante il quale la stabilità della generazione di EWNS ha mostrato gli stessi livelli di concentrazione del numero di particelle in entrambi i casi.
La figura 3g mostra lo spettro EPR dopo la sottrazione del controllo EWNS ottimizzato (sfondo) a [-6,5 kV, 4,0 cm]. Gli spettri ROS sono stati anche confrontati con lo scenario Baseline-EWNS in un lavoro pubblicato in precedenza. Il numero di EWNS che reagiscono con le trappole di spin è stato calcolato essere 7,5 × 104 EWNS/s, che è simile al Baseline-EWNS8 pubblicato in precedenza. Gli spettri EPR hanno mostrato chiaramente la presenza di due tipi di ROS, con O2- come specie predominante e OH• come specie meno abbondante. Inoltre, un confronto diretto delle intensità dei picchi ha mostrato che l'EWNS ottimizzato aveva un contenuto di ROS significativamente più elevato rispetto all'EWNS di base.
La figura 4 mostra l'efficienza di deposizione di EWNS in EPES. I dati sono riassunti anche nella Tabella I e confrontati con i dati EWNS originali. Per entrambi i casi di EUNS, la deposizione è prossima al 100% anche a una bassa tensione di 3,0 kV. Tipicamente, 3,0 kV sono sufficienti per una deposizione del 100%, indipendentemente dalla variazione della carica superficiale. Nelle stesse condizioni, l'efficienza di deposizione di Baseline-EWNS era solo del 56% a causa della loro carica inferiore (in media 10 elettroni per EWNS).
Nella figura 5 e nella tabella 2 è riassunto il valore di inattivazione dei microrganismi inoculati sulla superficie dei pomodori dopo l'esposizione a circa 40.000 #/cm³ EWNS per 45 minuti in modalità ottimale [-6,5 kV, 4,0 cm]. E. coli e Lactobacillus innocuous inoculati hanno mostrato una riduzione significativa di 3,8 log durante i 45 minuti di esposizione. Nelle stesse condizioni, S. enterica ha avuto una diminuzione di 2,2 log, mentre S. cerevisiae e M. parafortutum hanno avuto una diminuzione di 1,0 log.
Le micrografie elettroniche (Figura 6) mostrano le modifiche fisiche indotte dalle nanoparticelle elettromagnetiche (EWNS) su cellule innocue di Escherichia coli, Streptococcus e Lactobacillus, che ne causano l'inattivazione. I batteri di controllo presentavano membrane cellulari intatte, mentre i batteri esposti avevano membrane esterne danneggiate.
L'analisi al microscopio elettronico di batteri di controllo e di batteri esposti ha rivelato danni alla membrana cellulare.
I dati sulle proprietà fisico-chimiche degli EWNS ottimizzati mostrano collettivamente che le proprietà (carica superficiale e contenuto di ROS) degli EWNS sono state significativamente migliorate rispetto ai dati di riferimento degli EWNS pubblicati in precedenza8,9,10,11. D'altra parte, le loro dimensioni sono rimaste nell'intervallo nanometrico, molto simili ai risultati precedentemente riportati, consentendo loro di rimanere in aria per lunghi periodi di tempo. La polidispersità osservata può essere spiegata dalle variazioni della carica superficiale che determinano le dimensioni degli EWNS, dalla casualità dell'effetto Rayleigh e dalla potenziale coalescenza. Tuttavia, come dettagliato da Nielsen et al. 22, un'elevata carica superficiale riduce l'evaporazione aumentando efficacemente l'energia/tensione superficiale della goccia d'acqua. Nella nostra precedente pubblicazione8 questa teoria è stata confermata sperimentalmente per le microgocce 22 e gli EWNS. La perdita di carica nel tempo può anche influenzare le dimensioni e contribuire alla distribuzione dimensionale osservata.