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Recentemente è stata sviluppata una piattaforma antimicrobica priva di sostanze chimiche basata sulla nanotecnologia che utilizza nanostrutture di acqua artificiale (EWNS).Gli EWNS hanno un'elevata carica superficiale e sono saturi di specie reattive dell'ossigeno (ROS) che possono interagire e inattivare un numero di microrganismi, compresi i patogeni di origine alimentare.Qui è dimostrato che le loro proprietà durante la sintesi possono essere perfezionate e ottimizzate per migliorare ulteriormente il loro potenziale antibatterico.La piattaforma di laboratorio EWNS è stata progettata per mettere a punto le proprietà di EWNS modificando i parametri di sintesi.Caratterizzazione delle proprietà EWNS (carica, dimensione e contenuto di ROS) utilizzando metodi analitici moderni.Inoltre, sono stati valutati per il loro potenziale di inattivazione microbica contro microrganismi di origine alimentare come Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocua, Mycobacterium paraaccidentum e Saccharomyces cerevisiae.I risultati qui presentati dimostrano che le proprietà di EWNS possono essere perfezionate durante la sintesi, determinando un aumento esponenziale dell'efficienza di inattivazione.In particolare, la carica superficiale è aumentata di un fattore quattro e le specie reattive dell'ossigeno sono aumentate.Il tasso di rimozione microbica era microbiologicamente dipendente e variava da 1,0 a 3,8 log dopo un'esposizione di 45 minuti a una dose di aerosol di 40.000 #/cc EWNS.
La contaminazione microbica è la principale causa di malattie di origine alimentare causate dall'ingestione di agenti patogeni o delle loro tossine.Solo negli Stati Uniti, le malattie di origine alimentare causano circa 76 milioni di malattie, 325.000 ricoveri ospedalieri e 5.000 decessi ogni anno1.Inoltre, il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) stima che l'aumento del consumo di prodotti freschi sia responsabile del 48% di tutte le malattie di origine alimentare segnalate negli Stati Uniti2.Il costo delle malattie e dei decessi causati da agenti patogeni di origine alimentare negli Stati Uniti è molto elevato, stimato dai Centers for Disease Control and Prevention (CDC) a più di 15,6 miliardi di dollari all'anno3.
Attualmente, gli interventi antimicrobici chimici4, radioattivi5 e termici6 per garantire la sicurezza alimentare sono per lo più eseguiti in punti critici di controllo limitati (CCP) lungo la catena di produzione (di solito dopo il raccolto e/o durante il confezionamento) piuttosto che continuamente.quindi, sono soggetti a contaminazione incrociata.7. Un migliore controllo delle malattie di origine alimentare e del deterioramento degli alimenti richiede interventi antimicrobici che possono potenzialmente essere applicati attraverso il continuum dalla fattoria alla tavola, riducendo al contempo l'impatto ambientale ei costi.
Recentemente, è stata sviluppata una piattaforma antimicrobica basata su nanotecnologie e priva di sostanze chimiche che può inattivare i batteri di superficie e presenti nell'aria utilizzando nanostrutture di acqua artificiale (EWNS).EWNS è stato sintetizzato utilizzando due processi paralleli, elettrospray e ionizzazione dell'acqua (Fig. 1a).Precedenti studi hanno dimostrato che gli EWNS hanno un insieme unico di proprietà fisiche e biologiche8,9,10.Gli EWNS hanno una media di 10 elettroni per struttura e una dimensione nanometrica media di 25 nm (Fig. 1b, c) 8,9,10.Inoltre, la risonanza di spin elettronico (ESR) ha mostrato che EWNS contiene una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS), principalmente radicali idrossilici (OH•) e superossido (O2-) (Fig. 1c)8.L'EVNS è nell'aria da molto tempo e può scontrarsi con microrganismi sospesi nell'aria e presenti in superficie, consegnando il loro carico utile ROS e causando l'inattivazione dei microrganismi (Fig. 1d).Questi primi studi hanno anche mostrato che EWNS può interagire e inattivare vari batteri gram-negativi e gram-positivi, compresi i micobatteri, sulle superfici e nell'aria.La microscopia elettronica a trasmissione ha mostrato che l'inattivazione era causata dalla rottura della membrana cellulare.Inoltre, studi sull'inalazione acuta hanno dimostrato che alte dosi di EWNS non causano danni ai polmoni o infiammazioni8.
(a) L'elettrospray si verifica quando viene applicata un'alta tensione tra un tubo capillare contenente liquido e un controelettrodo.(b) L'applicazione di alta pressione si traduce in due diversi fenomeni: (i) elettrospraying di acqua e (ii) formazione di specie reattive dell'ossigeno (ioni) intrappolate nell'EWNS.(c) La struttura unica di EWNS.(d) A causa della loro natura nanometrica, gli EWNS sono altamente mobili e possono interagire con agenti patogeni presenti nell'aria.
Recentemente è stata dimostrata anche la capacità della piattaforma antimicrobica EWNS di inattivare i microrganismi di origine alimentare sulla superficie del cibo fresco.È stato anche dimostrato che la carica superficiale di EWNS in combinazione con un campo elettrico può essere utilizzata per ottenere un'erogazione mirata.Inoltre, i risultati preliminari per i pomodori biologici dopo un'esposizione di 90 minuti a un EWNS di circa 50.000 #/cm3 sono stati incoraggianti, con vari microrganismi di origine alimentare come E. coli e Listeria 11 osservati.Inoltre, i test organolettici preliminari non hanno mostrato effetti sensoriali rispetto ai pomodori di controllo.Sebbene questi risultati iniziali di inattivazione siano incoraggianti per le applicazioni di sicurezza alimentare anche a dosi EWNS molto basse di 50.000#/cc.vedi, è chiaro che un potenziale di inattivazione più elevato sarebbe più vantaggioso per ridurre ulteriormente il rischio di infezione e deterioramento.
Qui, concentreremo la nostra ricerca sullo sviluppo di una piattaforma di generazione di EWNS per consentire la messa a punto dei parametri di sintesi e l'ottimizzazione delle proprietà fisico-chimiche di EWNS per migliorare il loro potenziale antibatterico.In particolare, l'ottimizzazione si è concentrata sull'aumento della loro carica superficiale (per migliorare la consegna mirata) e del contenuto di ROS (per migliorare l'efficienza di inattivazione).Caratterizzare le proprietà fisico-chimiche ottimizzate (dimensioni, carica e contenuto di ROS) utilizzando metodi analitici moderni e utilizzare microrganismi alimentari comuni come E. .
EVNS è stato sintetizzato mediante elettrospray e ionizzazione simultanei di acqua ad alta purezza (18 MΩ cm-1).Il nebulizzatore elettrico 12 è tipicamente utilizzato per l'atomizzazione di liquidi e la sintesi di particelle polimeriche e ceramiche 13 e fibre 14 di dimensione controllata.
Come dettagliato nelle precedenti pubblicazioni 8, 9, 10, 11, in un tipico esperimento, è stata applicata un'alta tensione tra un capillare metallico e un controelettrodo messo a terra.Durante questo processo si verificano due diversi fenomeni: i) elettrospray e ii) ionizzazione dell'acqua.Un forte campo elettrico tra i due elettrodi provoca l'accumulo di cariche negative sulla superficie dell'acqua condensata, con conseguente formazione di coni di Taylor.Di conseguenza, si formano goccioline d'acqua altamente cariche, che continuano a rompersi in particelle più piccole, come nella teoria di Rayleigh16.Allo stesso tempo, forti campi elettrici provocano la scissione di alcune molecole d'acqua e la rimozione di elettroni (ionizzazione), che porta alla formazione di una grande quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS)17.Il ROS18 generato simultaneamente è stato incapsulato in EWNS (Fig. 1c).
Sulla fig.2a mostra il sistema di generazione EWNS sviluppato e utilizzato nella sintesi EWNS in questo studio.L'acqua purificata conservata in una bottiglia chiusa è stata alimentata attraverso un tubo di teflon (2 mm di diametro interno) in un ago in acciaio inossidabile da 30 G (capillare metallico).Il flusso dell'acqua è controllato dalla pressione dell'aria all'interno della bottiglia, come mostrato nella Figura 2b.L'ago è montato su una console in teflon e può essere regolato manualmente a una certa distanza dal controelettrodo.Il controelettrodo è un disco di alluminio lucidato con un foro al centro per il campionamento.Sotto il controelettrodo c'è un imbuto di campionamento in alluminio, che è collegato al resto della configurazione sperimentale tramite una porta di campionamento (Fig. 2b).Per evitare l'accumulo di carica che potrebbe interrompere il funzionamento del campionatore, tutti i componenti del campionatore sono dotati di messa a terra elettrica.
(a) Sistema di generazione di nanostrutture idriche ingegnerizzate (EWNS).(b) Sezione trasversale del campionatore e dell'elettrospray, che mostra i parametri più importanti.(c) Configurazione sperimentale per l'inattivazione dei batteri.
Il sistema di generazione EWNS sopra descritto è in grado di modificare i parametri operativi chiave per facilitare la messa a punto delle proprietà EWNS.Regolare la tensione applicata (V), la distanza tra l'ago e il controelettrodo (L) e il flusso d'acqua (φ) attraverso il capillare per mettere a punto le caratteristiche EWNS.Simbolo utilizzato per rappresentare diverse combinazioni: [V (kV), L (cm)].Regolare il flusso d'acqua per ottenere un cono di Taylor stabile di un certo insieme [V, L].Ai fini di questo studio, il diametro di apertura del controelettrodo (D) è stato mantenuto a 0,5 pollici (1,29 cm).
A causa della geometria limitata e dell'asimmetria, l'intensità del campo elettrico non può essere calcolata dai primi principi.Invece, per calcolare il campo elettrico è stato utilizzato il software QuickField™ (Svendborg, Danimarca)19.Il campo elettrico non è uniforme, quindi il valore del campo elettrico all'estremità del capillare è stato utilizzato come valore di riferimento per varie configurazioni.
Durante lo studio, sono state valutate diverse combinazioni di tensione e distanza tra l'ago e il controelettrodo in termini di formazione del cono di Taylor, stabilità del cono di Taylor, stabilità della produzione di EWNS e riproducibilità.Varie combinazioni sono mostrate nella Tabella Supplementare S1.
L'uscita del sistema di generazione EWNS è stata collegata direttamente a un analizzatore di dimensioni delle particelle di mobilità a scansione (SMPS, modello 3936, TSI, Shoreview, MN) per la misurazione della concentrazione del numero di particelle, nonché a un elettrometro di Faraday per aerosol (TSI, modello 3068B, Shoreview, MN).) per le correnti di aerosol è stata misurata come descritto nella nostra precedente pubblicazione.Sia l'SMPS che l'elettrometro per aerosol hanno campionato a una portata di 0,5 L/min (flusso totale del campione 1 L/min).La concentrazione numerica di particelle e il flusso di aerosol sono stati misurati per 120 secondi.La misurazione viene ripetuta 30 volte.Sulla base delle misurazioni correnti, viene calcolata la carica totale di aerosol e viene stimata la carica EWNS media per un determinato numero totale di particelle EWNS selezionate.Il costo medio di EWNS può essere calcolato utilizzando l'equazione (1):
dove IEl è la corrente misurata, NSMPS è la concentrazione digitale misurata con SMPS e φEl è la portata per elettrometro.
Poiché l'umidità relativa (RH) influisce sulla carica superficiale, la temperatura e (RH) sono state mantenute costanti durante l'esperimento rispettivamente a 21°C e 45%.
La microscopia a forza atomica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) e la sonda AC260T (Olympus, Tokyo, Giappone) sono state utilizzate per misurare le dimensioni e la durata dell'EWNS.La frequenza di scansione AFM era di 1 Hz, l'area di scansione era di 5 μm × 5 μm e 256 linee di scansione.Tutte le immagini sono state sottoposte all'allineamento delle immagini di primo ordine utilizzando il software Asylum (gamma maschera 100 nm, soglia 100 pm).
L'imbuto di prova è stato rimosso e la superficie della mica è stata posta a una distanza di 2,0 cm dal controelettrodo per un tempo medio di 120 s per evitare l'agglomerazione delle particelle e la formazione di goccioline irregolari sulla superficie della mica.EWNS è stato spruzzato direttamente sulla superficie della mica appena tagliata (Ted Pella, Redding, CA).Immagine della superficie della mica subito dopo lo sputtering AFM.L'angolo di contatto della superficie della mica non modificata appena tagliata è vicino a 0°, quindi l'EVNS è distribuito sulla superficie della mica sotto forma di una cupola.Il diametro (a) e l'altezza (h) delle goccioline di diffusione sono stati misurati direttamente dalla topografia AFM e utilizzati per calcolare il volume di diffusione a cupola EWNS utilizzando il nostro metodo precedentemente convalidato.Supponendo che gli EWNS di bordo abbiano lo stesso volume, il diametro equivalente può essere calcolato utilizzando l'equazione (2):
Sulla base del nostro metodo sviluppato in precedenza, è stata utilizzata una trappola di spin di risonanza di spin elettronico (ESR) per rilevare la presenza di intermedi radicali di breve durata in EWNS.Gli aerosol sono stati fatti gorgogliare attraverso uno sparger Midget da 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) contenente una soluzione da 235 mM di DEPMPO (5- (diethoxyphosphoryl) -5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) (Oxis International Inc.).Portland, Oregon).Tutte le misurazioni ESR sono state eseguite utilizzando uno spettrometro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) e una cella a pannello piatto.Il software Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) è stato utilizzato per raccogliere e analizzare i dati.La determinazione delle caratteristiche del ROS è stata effettuata solo per un insieme di condizioni operative [-6,5 kV, 4,0 cm].Le concentrazioni di EWNS sono state misurate utilizzando l'SMPS dopo aver tenuto conto delle perdite di EWNS nell'impattore.
I livelli di ozono sono stati monitorati utilizzando un 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Per tutte le proprietà EWNS, il valore medio viene utilizzato come valore di misurazione e la deviazione standard viene utilizzata come errore di misurazione.Sono stati eseguiti test T per confrontare i valori degli attributi EWNS ottimizzati con i valori corrispondenti dell'EWNS di base.
La Figura 2c mostra un sistema di "pull" di precipitazione elettrostatica (EPES) precedentemente sviluppato e caratterizzato che può essere utilizzato per la consegna mirata di EWNS in superficie.EPES utilizza cariche EVNS che possono essere "guidate" direttamente sulla superficie del bersaglio sotto l'influenza di un forte campo elettrico.I dettagli del sistema EPES sono presentati in una recente pubblicazione di Pyrgiotakis et al.11 .Pertanto, EPES è costituito da una camera in PVC stampata in 3D con estremità affusolate e contiene due piastre metalliche parallele in acciaio inossidabile (acciaio inossidabile 304, con rivestimento a specchio) al centro a 15,24 cm di distanza.Le schede erano collegate a una sorgente esterna ad alta tensione (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), la piastra inferiore era sempre collegata a una tensione positiva e la piastra superiore era sempre collegata a terra (terra flottante).Le pareti della camera sono ricoperte da un foglio di alluminio, che è messo a terra elettricamente per prevenire la perdita di particelle.La camera ha una porta di caricamento anteriore sigillata che consente di posizionare le superfici di prova su supporti in plastica che le sollevano sopra la piastra metallica inferiore per evitare interferenze ad alta tensione.
L'efficienza di deposizione di EWNS in EPES è stata calcolata secondo un protocollo precedentemente sviluppato dettagliato nella Figura supplementare S111.
Come camera di controllo, una seconda camera di flusso cilindrica è stata collegata in serie al sistema EPES, in cui è stato utilizzato un filtro HEPA intermedio per rimuovere EWNS.Come mostrato nella Figura 2c, l'aerosol EWNS è stato pompato attraverso due camere incorporate.Il filtro tra la sala di controllo e l'EPES rimuove eventuali EWNS rimanenti, risultando negli stessi livelli di temperatura (T), umidità relativa (RH) e ozono.
È stato scoperto che importanti microrganismi di origine alimentare contaminano alimenti freschi come E. coli (ATCC #27325), indicatore fecale, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogeno di origine alimentare, Listeria innocua (ATCC #33090), surrogato della Listeria monocytogenes patogena, derivata da ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), un sostituto del lievito di deterioramento e altro batterio inattivato resistente, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Acquista scatole casuali di pomodorini biologici dal tuo mercato locale e conservali in frigorifero a 4°C fino al momento dell'utilizzo (fino a 3 giorni).I pomodori sperimentali erano tutti della stessa dimensione, circa 1/2 pollice di diametro.
I protocolli di coltura, inoculazione, esposizione e conteggio delle colonie sono dettagliati nella nostra precedente pubblicazione e dettagliati nei dati supplementari.L'efficacia di EWNS è stata valutata esponendo i pomodori inoculati a 40.000 #/cm3 per 45 minuti.In breve, tre pomodori sono stati utilizzati per valutare i microrganismi sopravvissuti al tempo t = 0 min.Tre pomodori sono stati posti in EPES ed esposti a EWNS a 40.000 #/cc (pomodori esposti a EWNS) e gli altri tre sono stati posti nella camera di controllo (pomodori di controllo).Non è stata effettuata un'ulteriore lavorazione dei pomodori in entrambi i gruppi.I pomodori esposti a EWNS e i pomodori di controllo sono stati rimossi dopo 45 minuti per valutare l'effetto di EWNS.
Ogni esperimento è stato condotto in triplice copia.L'analisi dei dati è stata eseguita secondo il protocollo descritto in Dati supplementari.
I meccanismi di inattivazione sono stati valutati mediante sedimentazione di campioni EWNS esposti (45 min a 40.000 #/cm3 di concentrazione di aerosol EWNS) e campioni non irradiati di batteri innocui E. coli, Salmonella enterica e Lactobacillus.Le particelle sono state fissate in glutaraldeide al 2,5%, paraformaldeide all'1,25% e acido picrico allo 0,03% in tampone cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,4) per 2 ore a temperatura ambiente.Dopo il lavaggio, post-fissare con tetrossido di osmio all'1% (OsO4)/ferrocianuro di potassio all'1,5% (KFeCN6) per 2 ore, lavare 3 volte in acqua e incubare in acetato di uranile all'1% per 1 ora, quindi lavare due volte in acqua, quindi disidratare per 10 minuti in alcool al 50%, 70%, 90%, 100%.I campioni sono stati quindi posti in ossido di propilene per 1 ora e impregnati con una miscela 1:1 di ossido di propilene e TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA).I campioni sono stati incorporati in TAAB Epon e polimerizzati a 60°C per 48 ore.La resina granulare indurita è stata tagliata e visualizzata da TEM utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione convenzionale JEOL 1200EX (JEOL, Tokyo, Giappone) dotato di una fotocamera CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato.Per ogni punto temporale, i lavaggi batterici sono stati seminati in triplicato, ottenendo un totale di nove punti dati per punto, la cui media è stata utilizzata come concentrazione batterica per quel particolare microrganismo.La deviazione standard è stata utilizzata come errore di misura.Tutti i punti contano.
Il logaritmo della diminuzione della concentrazione di batteri rispetto a t = 0 min è stato calcolato utilizzando la seguente formula:
dove C0 è la concentrazione di batteri nel campione di controllo al tempo 0 (cioè dopo che la superficie si è asciugata ma prima di essere collocata nella camera) e Cn è la concentrazione di batteri sulla superficie dopo n minuti di esposizione.
Per tenere conto della naturale degradazione dei batteri durante l'esposizione di 45 minuti, anche la riduzione logaritmica rispetto al controllo dopo 45 minuti è stata calcolata come segue:
dove Cn è la concentrazione di batteri nel campione di controllo al tempo n e Cn-Control è la concentrazione di batteri di controllo al tempo n.I dati sono presentati come riduzione logaritmica rispetto al controllo (nessuna esposizione a EWNS).
Durante lo studio, sono state valutate diverse combinazioni di tensione e distanza tra l'ago e il controelettrodo in termini di formazione del cono di Taylor, stabilità del cono di Taylor, stabilità della produzione di EWNS e riproducibilità.Varie combinazioni sono mostrate nella Tabella Supplementare S1.Due casi che mostrano proprietà stabili e riproducibili (cono di Taylor, generazione di EWNS e stabilità nel tempo) sono stati selezionati per uno studio completo.Sulla fig.La Figura 3 mostra i risultati per la carica, le dimensioni e il contenuto di ROS in entrambi i casi.I risultati sono mostrati anche nella Tabella 1. Per riferimento, sia la Figura 3 che la Tabella 1 includono le proprietà dell'EWNS8, 9, 10, 11 non ottimizzato precedentemente sintetizzato (baseline-EWNS).I calcoli di significatività statistica utilizzando un test t a due code sono ripubblicati nella Tabella supplementare S2.Inoltre, dati aggiuntivi includono studi sull'effetto del diametro del foro di campionamento del controelettrodo (D) e della distanza tra l'elettrodo di messa a terra e la punta (L) (Figure supplementari S2 e S3).
(ac) Distribuzione delle dimensioni misurata da AFM.(df) Caratteristica di carica superficiale.(g) Caratterizzazione ROS dell'EPR.
È anche importante notare che per tutte le condizioni di cui sopra, la corrente di ionizzazione misurata era compresa tra 2 e 6 μA e la tensione tra -3,8 e -6,5 kV, con un conseguente consumo energetico inferiore a 50 mW per questo singolo modulo di contatto di generazione EWNS.Sebbene EWNS sia stato sintetizzato ad alta pressione, i livelli di ozono erano molto bassi, mai superiori a 60 ppb.
La figura supplementare S4 mostra i campi elettrici simulati per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], rispettivamente.Per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], i calcoli sul campo sono rispettivamente 2 × 105 V/m e 4,7 × 105 V/m.Ciò è previsto, poiché nel secondo caso il rapporto tensione-distanza è molto più elevato.
Sulla fig.3a,b mostra il diametro EWNS misurato con l'AFM8.I diametri EWNS medi calcolati erano rispettivamente di 27 nm e 19 nm per gli schemi [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm].Per gli scenari [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], le deviazioni standard geometriche delle distribuzioni sono rispettivamente 1,41 e 1,45, a indicare una distribuzione dimensionale ristretta.Sia la dimensione media che la deviazione standard geometrica sono molto vicine alla linea di base EWNS, rispettivamente a 25 nm e 1,41.Sulla fig.3c mostra la distribuzione delle dimensioni dell'EWNS di base misurata utilizzando lo stesso metodo nelle stesse condizioni.
Sulla fig.3d,e mostra i risultati della caratterizzazione della carica.I dati sono misurazioni medie di 30 misurazioni simultanee di concentrazione (#/cm3) e corrente (I).L'analisi mostra che la carica media sull'EWNS è di 22 ± 6 e- e 44 ± 6 e- rispettivamente per [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm].Hanno cariche superficiali significativamente più elevate rispetto all'EWNS di base (10 ± 2 e-), due volte maggiore dello scenario [-6,5 kV, 4,0 cm] e quattro volte maggiore dello scenario [-3,8 kV, 0,5 cm].La figura 3f mostra la carica.dati per Baseline-EWNS.
Dalle mappe di concentrazione del numero EWNS (figure supplementari S5 e S6), si può vedere che lo scenario [-6,5 kV, 4,0 cm] ha molte più particelle rispetto allo scenario [-3,8 kV, 0,5 cm].Vale anche la pena notare che la concentrazione del numero EWNS è stata monitorata fino a 4 ore (Figure supplementari S5 e S6), dove la stabilità della generazione EWNS ha mostrato gli stessi livelli di concentrazione del numero di particelle in entrambi i casi.
Sulla fig.3g mostra lo spettro EPR dopo la sottrazione del controllo EWNS ottimizzato (sfondo) a [-6,5 kV, 4,0 cm].Gli spettri ROS sono stati anche confrontati con lo scenario Baseline-EWNS in un lavoro precedentemente pubblicato.Il numero di EWNS che reagiscono con spin trap è stato calcolato in 7,5 × 104 EWNS/s, che è simile al Baseline-EWNS8 precedentemente pubblicato.Gli spettri EPR hanno mostrato chiaramente la presenza di due tipi di ROS, con O2- come specie predominante e OH• come specie meno abbondante.Inoltre, un confronto diretto delle intensità di picco ha mostrato che l'EWNS ottimizzato aveva un contenuto di ROS significativamente più elevato rispetto all'EWNS di base.
Sulla fig.4 mostra l'efficienza di deposizione di EWNS in EPES.I dati sono anche riassunti nella Tabella I e confrontati con i dati EWNS originali.Per entrambi i casi di EUNS, la deposizione è vicina al 100% anche a bassa tensione di 3,0 kV.Tipicamente, 3,0 kV sono sufficienti per una deposizione del 100%, indipendentemente dalla variazione della carica superficiale.Nelle stesse condizioni, l'efficienza di deposizione di Baseline-EWNS era solo del 56% a causa della loro carica inferiore (in media 10 elettroni per EWNS).
Sulla fig.5 e in tabella.2 riassume il valore di inattivazione dei microrganismi inoculati sulla superficie dei pomodori dopo l'esposizione a circa 40.000 #/cm3 EWNS per 45 minuti nella modalità ottimale [-6,5 kV, 4,0 cm].E. coli e Lactobacillus innocui inoculati hanno mostrato una riduzione significativa di 3,8 log durante l'esposizione di 45 minuti.Nelle stesse condizioni, S. enterica ha avuto una diminuzione di 2,2 log, mentre S. cerevisiae e M. parafortutum hanno avuto una diminuzione di 1,0 log.
Le micrografie elettroniche (Figura 6) descrivono i cambiamenti fisici indotti da EWNS su cellule innocue di Escherichia coli, Streptococcus e Lactobacillus che portano alla loro inattivazione.I batteri di controllo avevano membrane cellulari intatte, mentre i batteri esposti avevano membrane esterne danneggiate.
L'imaging al microscopio elettronico del controllo e dei batteri esposti ha rivelato danni alla membrana.
I dati sulle proprietà fisico-chimiche dell'EWNS ottimizzato mostrano collettivamente che le proprietà (carica superficiale e contenuto di ROS) dell'EWNS sono state significativamente migliorate rispetto ai dati di base EWNS pubblicati in precedenza8,9,10,11.D'altra parte, le loro dimensioni sono rimaste nell'ordine dei nanometri, molto simili ai risultati precedentemente riportati, consentendo loro di rimanere in aria per lunghi periodi di tempo.La polidispersità osservata può essere spiegata dai cambiamenti di carica superficiale che determinano la dimensione di EWNS, la casualità dell'effetto Rayleigh e la potenziale coalescenza.Tuttavia, come dettagliato da Nielsen et al.22, l'elevata carica superficiale riduce l'evaporazione aumentando efficacemente l'energia/tensione superficiale della goccia d'acqua.Nella nostra precedente pubblicazione8 questa teoria è stata confermata sperimentalmente per le microgoccioline 22 e EWNS.La perdita di carica durante gli straordinari può anche influenzare le dimensioni e contribuire alla distribuzione delle dimensioni osservata.