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최근 나노기술 기반의 인공 물 나노구조(EWNS)를 이용한 화학물질 무첨가 항균 플랫폼이 개발되었습니다. EWNS는 높은 표면 전하를 띠고 있으며, 반응성 산소종(ROS)으로 포화되어 있어 식품 매개 병원균을 포함한 다양한 미생물과 상호작용하여 불활성화시킬 수 있습니다. 본 연구에서는 합성 과정에서 EWNS의 특성을 미세 조정하고 최적화하여 항균 효능을 더욱 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. EWNS 실험실 플랫폼은 합성 매개변수를 변경하여 EWNS의 특성을 미세 조정할 수 있도록 설계되었습니다. 최신 분석 방법을 사용하여 EWNS의 특성(전하, 크기 및 ROS 함량)을 분석했습니다. 또한, 대장균, 살모넬라균, 리스테리아균, 마이코박테리움 파라아시덴툼, 사카로미세스 세레비지애와 같은 식품 매개 미생물에 대한 항균 효능을 평가했습니다. 본 연구 결과는 EWNS의 특성을 합성 과정에서 미세 조정할 수 있으며, 이를 통해 불활성화 효율을 기하급수적으로 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. 특히, 표면 전하는 4배 증가했고 반응성 산소종도 증가했다. 미생물 제거율은 미생물 종류에 따라 달랐으며, 40,000 #/cc EWNS 에어로졸에 45분간 노출시킨 후 1.0~3.8 log 범위였다.
미생물 오염은 병원균이나 그 독소를 섭취함으로써 발생하는 식중독의 주요 원인입니다. 미국에서만 식중독으로 인해 매년 약 7,600만 건의 질병이 발생하고, 32만 5천 건의 입원 사례가 발생하며, 5천 명이 사망합니다.¹ 또한, 미국 농무부(USDA)는 신선 농산물 소비 증가가 미국 내 보고된 모든 식중독 사례의 48%를 차지한다고 추산합니다.² 미국에서 식중독 병원균으로 인한 질병 및 사망 비용은 매우 높으며, 질병통제예방센터(CDC)는 연간 156억 달러 이상으로 추산하고 있습니다.³
현재 식품 안전을 보장하기 위한 화학적4, 방사선5 및 열6 항균 처리는 생산 과정 전반에 걸쳐 제한적인 중요 관리점(CCP)(일반적으로 수확 후 및/또는 포장 중)에서만 이루어지고 있어 지속적으로 적용되지 못하고 있습니다. 따라서 교차 오염의 위험이 높습니다. 7. 식중독 및 식품 변질을 효과적으로 관리하려면 환경 영향과 비용을 줄이면서 농장에서 식탁까지 전 과정에 걸쳐 적용할 수 있는 항균 처리가 필요합니다.
최근, 화학 물질을 사용하지 않는 나노기술 기반의 항균 플랫폼이 개발되었는데, 이는 인공 물 나노구조(EWNS)를 이용하여 표면 및 공기 중 세균을 불활성화할 수 있습니다. EWNS는 전기분무와 물 이온화라는 두 가지 병렬 공정을 통해 합성되었습니다(그림 1a). 이전 연구에 따르면 EWNS는 독특한 물리적 및 생물학적 특성을 가지고 있습니다.8,9,10 EWNS는 구조당 평균 10개의 전자를 가지며 평균 나노 크기는 25nm입니다(그림 1b,c)8,9,10. 또한, 전자 스핀 공명(ESR) 분석 결과 EWNS에는 다량의 반응성 산소종(ROS), 주로 수산화 라디칼(OH•)과 초산화물 라디칼(O2-)이 함유되어 있는 것으로 나타났습니다(그림 1c)8. EWNS는 공기 중에 장시간 존재하며 공기 중 및 표면에 존재하는 미생물과 충돌하여 ROS를 전달함으로써 미생물을 불활성화시킬 수 있습니다(그림 1d). 이러한 초기 연구에서는 EWNS가 표면과 공기 중의 마이코박테리아를 포함한 다양한 그람 음성 및 그람 양성 박테리아와 상호 작용하여 이를 불활성화시킬 수 있다는 사실도 보여주었습니다. 투과 전자 현미경을 통해 불활성화는 세포막 파괴로 인해 발생했음을 알 수 있었습니다. 또한 급성 흡입 연구에서는 고용량의 EWNS가 폐 손상이나 염증을 유발하지 않는다는 사실이 밝혀졌습니다. 8
(a) 액체가 담긴 모세관과 대전극 사이에 고전압이 가해질 때 전기분무가 발생합니다. (b) 고압이 가해지면 두 가지 현상이 나타납니다. (i) 물의 전기분무 및 (ii) EWNS 내에 포획된 반응성 산소종(이온)의 생성. (c) EWNS의 독특한 구조. (d) 나노 크기의 특성으로 인해 EWNS는 이동성이 매우 뛰어나 공기 중 병원균과 상호작용할 수 있습니다.
최근 EWNS 항균 플랫폼이 신선 식품 표면의 식중독 미생물을 불활성화시키는 능력이 입증되었습니다. 또한 EWNS의 표면 전하와 전기장을 결합하여 표적 전달을 달성할 수 있음이 밝혀졌습니다. 더욱이, 약 50,000 #/cm³의 EWNS에 90분 동안 노출시킨 유기농 토마토에 대한 예비 결과는 고무적이었으며, 대장균(E. coli)과 리스테리아균(Listeria)¹¹과 같은 다양한 식중독 미생물이 관찰되었습니다. 또한 예비 관능 검사 결과, 대조군 토마토와 비교했을 때 관능적 영향은 나타나지 않았습니다. 이러한 초기 불활성화 결과는 50,000 #/cm³의 매우 낮은 EWNS 농도에서도 식품 안전 분야에 적용될 수 있는 가능성을 보여주지만, 감염 및 부패 위험을 더욱 줄이기 위해서는 더 높은 불활성화 잠재력이 더욱 유익할 것입니다.
본 연구에서는 EWNS 생성 플랫폼 개발에 초점을 맞춰 합성 매개변수를 미세 조정하고 EWNS의 물리화학적 특성을 최적화하여 항균 효능을 향상시키는 데 중점을 두었습니다. 특히, 표면 전하 증가(표적 전달 개선) 및 ROS 함량 증가(불활성화 효율 향상)에 중점을 두었습니다. 최적화된 물리화학적 특성(크기, 전하 및 ROS 함량)은 최신 분석 방법을 사용하여 특성화하고, E. coli와 같은 일반적인 식품 미생물을 활용했습니다.
EVNS는 고순도 물(18 MΩ cm–1)의 동시 전기분무 및 이온화에 의해 합성되었습니다. 전기 분무기 12는 일반적으로 액체의 분무와 제어된 크기의 고분자 및 세라믹 입자 13 및 섬유 14의 합성에 사용됩니다.
이전 논문 8, 9, 10, 11에서 자세히 설명했듯이, 일반적인 실험에서 금속 모세관과 접지된 대향 전극 사이에 고전압을 인가했습니다. 이 과정에서 두 가지 현상이 발생합니다. i) 전기분무 및 ii) 물 이온화입니다. 두 전극 사이의 강한 전기장은 응축된 물 표면에 음전하가 축적되도록 하여 테일러 콘을 형성합니다. 결과적으로 고전하를 띤 물방울이 형성되고, 이는 레일리 이론16에서처럼 계속해서 더 작은 입자로 분열됩니다. 동시에 강한 전기장은 일부 물 분자를 분열시키고 전자를 탈리(이온화)시켜 다량의 반응성 산소종(ROS)17을 생성합니다. 동시에 생성된 ROS18는 EWNS에 캡슐화됩니다(그림 1c).
그림 2a는 본 연구에서 개발 및 사용된 EWNS 생성 시스템을 보여줍니다. 밀폐된 병에 저장된 정제수는 테플론 튜브(내경 2mm)를 통해 30G 스테인리스 스틸 바늘(금속 모세관)로 공급됩니다. 물의 흐름은 그림 2b에서와 같이 병 내부의 공기압으로 제어됩니다. 바늘은 테플론 콘솔에 장착되어 있으며, 대향 전극으로부터 특정 거리로 수동으로 조절할 수 있습니다. 대향 전극은 중앙에 시료 채취용 구멍이 있는 연마된 알루미늄 디스크입니다. 대향 전극 아래에는 알루미늄 시료 채취 깔때기가 있으며, 이는 시료 채취 포트를 통해 나머지 실험 장치에 연결됩니다(그림 2b). 시료 채취기 작동을 방해할 수 있는 전하 축적을 방지하기 위해 모든 시료 채취기 구성 요소는 접지되어 있습니다.
(a) 공학적으로 설계된 물 나노구조 생성 시스템(EWNS). (b) 주요 매개변수를 보여주는 샘플러 및 전기분무 장치의 단면도. (c) 박테리아 불활성화를 위한 실험 장치.
위에서 설명한 EWNS 생성 시스템은 주요 작동 매개변수를 변경하여 EWNS 특성을 미세 조정할 수 있습니다. 인가 전압(V), 바늘과 대향 전극 사이의 거리(L), 모세관을 통과하는 물의 유량(φ)을 조정하여 EWNS 특성을 미세 조정할 수 있습니다. 다양한 조합을 나타내는 기호는 [V(kV), L(cm)]입니다. 특정 [V, L] 값에서 안정적인 테일러 콘이 생성되도록 물의 유량을 조정하십시오. 본 연구에서는 대향 전극의 개구부 직경(D)을 0.5인치(1.29cm)로 고정했습니다.
제한된 기하학적 구조와 비대칭성으로 인해 전기장 세기는 기본 원리로부터 계산할 수 없습니다. 대신 QuickField™ 소프트웨어(Svendborg, 덴마크)19를 사용하여 전기장을 계산했습니다. 전기장은 균일하지 않으므로 모세관 끝부분의 전기장 값을 다양한 구성에 대한 기준값으로 사용했습니다.
본 연구에서는 테일러 콘 형성, 테일러 콘 안정성, EWNS 생성 안정성 및 재현성 측면에서 바늘과 대향 전극 사이의 전압 및 거리의 여러 조합을 평가했습니다. 다양한 조합은 보충 표 S1에 나와 있습니다.
EWNS 생성 시스템의 출력은 입자 수 농도 측정을 위해 스캐닝 이동도 입자 크기 분석기(SMPS, 모델 3936, TSI, Shoreview, MN)에 직접 연결되었고, 에어로졸 전류 측정을 위해 에어로졸 패러데이 전위계(TSI, 모델 3068B, Shoreview, MN)에도 연결되었습니다. 에어로졸 전류 측정은 이전 논문에 설명된 바와 같습니다. SMPS와 에어로졸 전위계 모두 0.5 L/min의 유속(총 시료 유량 1 L/min)으로 샘플링했습니다. 입자 수 농도와 에어로졸 유량은 120초 동안 측정했으며, 이 측정은 30회 반복했습니다. 전류 측정값을 기반으로 총 에어로졸 전하량을 계산하고, 선택된 EWNS 입자의 총 개수에 대한 평균 EWNS 전하량을 추정했습니다. EWNS의 평균 비용은 식 (1)을 사용하여 계산할 수 있습니다.
여기서 IEl은 측정된 전류이고, NSMPS는 SMPS로 측정된 디지털 농도이며, φEl은 전위계당 유량입니다.
상대 습도(RH)는 표면 전하에 영향을 미치므로 실험 동안 온도와 상대 습도는 각각 21°C와 45%로 일정하게 유지되었습니다.
원자력 현미경(AFM), Asylum MFP-3D(Asylum Research, Santa Barbara, CA) 및 AC260T 프로브(Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 EWNS의 크기와 수명을 측정했습니다. AFM 스캔 주파수는 1Hz, 스캔 영역은 5μm × 5μm, 스캔 라인 수는 256개였습니다. 모든 이미지는 Asylum 소프트웨어(마스크 범위 100nm, 임계값 100pm)를 사용하여 1차 이미지 정렬을 수행했습니다.
테스트 깔때기를 제거하고 운모 표면을 대전극에서 2.0cm 떨어진 위치에 놓고 120초 동안 평균화하여 입자 응집 및 운모 표면에 불규칙한 액적 형성을 방지했습니다. EWNS는 새로 절단한 운모 표면에 직접 분사했습니다(Ted Pella, Redding, CA). AFM 스퍼터링 직후의 운모 표면 이미지입니다. 새로 절단한 변형되지 않은 운모 표면의 접촉각은 0°에 가깝기 때문에 EVNS는 운모 표면에 돔 형태로 분포됩니다. 확산되는 액적의 직경(a)과 높이(h)는 AFM 지형에서 직접 측정하고 이전에 검증된 방법을 사용하여 EWNS 돔 확산 부피를 계산했습니다. 내장된 EWNS의 부피가 동일하다고 가정하면, 등가 직경은 식 (2)를 사용하여 계산할 수 있습니다.
이전에 개발한 방법을 기반으로, 전자 스핀 공명(ESR) 스핀 트랩을 사용하여 EWNS에서 수명이 짧은 라디칼 중간체의 존재를 검출했습니다. 에어로졸은 235 mM DEPMPO(5-(디에톡시포스포릴)-5-메틸-1-피롤린-N-옥사이드)(Oxis International Inc., Portland, Oregon) 용액이 들어 있는 650 μm Midget 스파저(Ace Glass, Vineland, NJ)를 통과시켰습니다. 모든 ESR 측정은 Bruker EMX 분광기(Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA)와 평판 셀을 사용하여 수행했습니다. 데이터 수집 및 분석에는 Acquisit 소프트웨어(Bruker Instruments Inc., Billerica, MA, USA)를 사용했습니다. ROS 특성 분석은 [-6.5 kV, 4.0 cm]의 특정 작동 조건에서만 수행했습니다. 임팩터에서의 EWNS 손실을 고려한 후 SMPS를 사용하여 EWNS 농도를 측정했습니다.
오존 수준은 205 듀얼 빔 오존 모니터™(2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10를 사용하여 모니터링되었습니다.
모든 EWNS 속성에 대해 평균값을 측정값으로, 표준편차를 측정 오차로 사용했습니다. 최적화된 EWNS 속성값과 기준 EWNS의 해당 값을 비교하기 위해 t-검정을 수행했습니다.
그림 2c는 표면에서 EWNS를 표적 전달하는 데 사용할 수 있는 이전에 개발 및 특성화된 정전기 집진(EPES) "끌어당기기" 시스템을 보여줍니다. EPES는 강한 전기장의 영향으로 표적 표면으로 직접 "유도"될 수 있는 EVNS 전하를 사용합니다. EPES 시스템에 대한 자세한 내용은 Pyrgiotakis 등이 최근 발표한 논문¹¹에 제시되어 있습니다. EPES는 끝이 가늘어지는 3D 프린팅된 PVC 챔버로 구성되며, 중앙에는 15.24cm 간격으로 평행하게 배치된 두 개의 스테인리스강(304 스테인리스강, 미러 코팅) 금속판이 있습니다. 이 판들은 외부 고전압 전원(Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY)에 연결되었으며, 아래쪽 판은 항상 양극 전압에, 위쪽 판은 항상 접지(부동 접지)에 연결되었습니다. 챔버 벽은 입자 손실을 방지하기 위해 전기적으로 접지된 알루미늄 호일로 덮여 있습니다. 이 챔버는 밀폐형 전면 로딩 도어를 갖추고 있어 테스트 표면을 플라스틱 스탠드 위에 올려놓아 바닥 금속판보다 높게 위치시킴으로써 고전압 간섭을 방지할 수 있습니다.
EPES 내 EWNS의 증착 효율은 이전에 개발된 프로토콜에 따라 계산되었으며, 자세한 내용은 보충 그림 S111에 나와 있습니다.
제어 챔버로서 두 번째 원통형 유동 챔버가 EPES 시스템에 직렬로 연결되었으며, 이 챔버에는 EWNS를 제거하기 위한 중간 HEPA 필터가 사용되었습니다. 그림 2c에서 볼 수 있듯이, EWNS 에어로졸은 내장된 두 개의 챔버를 통과하도록 펌핑되었습니다. 제어실과 EPES 사이에 있는 필터는 잔류 EWNS를 제거하여 온도(T), 상대 습도(RH) 및 오존 농도를 동일하게 유지합니다.
대장균(ATCC #27325, 분변 지표균), 살모넬라 엔테리카(ATCC #53647, 식중독 병원균), 리스테리아 무해균(ATCC #33090, 병원성 리스테리아 모노사이토제네스의 대체균, ATCC(버지니아주 매너서스)에서 유래), 사카로미세스 세레비지애(ATCC #4098, 부패 효모 대체균), 그리고 내성이 강한 불활성화 세균인 마이코박테리움 파랄럭키(ATCC #19686)와 같은 중요한 식중독 미생물이 신선 식품을 오염시키는 것으로 밝혀졌습니다.
지역 시장에서 유기농 방울토마토를 무작위로 구입하여 사용할 때까지 (최대 3일) 4°C에서 냉장 보관하세요. 실험에 사용한 토마토는 모두 지름 약 1/2인치로 크기가 동일했습니다.
배양, 접종, 노출 및 콜로니 계수 프로토콜은 이전 논문과 보충 자료에 자세히 설명되어 있습니다. EWNS의 효과는 접종된 토마토를 40,000 #/cm³의 압력으로 45분 동안 노출시켜 평가했습니다. 간단히 설명하면, 3개의 토마토를 사용하여 t = 0분 시점의 생존 미생물 수를 평가했습니다. 3개의 토마토는 EPES 용액에 넣고 40,000 #/cm³의 압력으로 EWNS에 노출시켰고(EWNS 노출 토마토), 나머지 3개는 대조군에 두었습니다(대조군 토마토). 두 그룹 모두 추가적인 가공은 하지 않았습니다. 45분 후 EWNS 노출 토마토와 대조군 토마토를 꺼내 EWNS의 효과를 평가했습니다.
각 실험은 3회 반복하여 수행하였다. 데이터 분석은 보충 자료에 설명된 프로토콜에 따라 진행하였다.
불활성화 메커니즘은 EWNS에 노출된 시료(40,000 #/cm3 EWNS 에어로졸 농도에서 45분)와 무해한 세균인 대장균, 살모넬라균, 락토바실러스의 비조사 시료의 침전을 통해 평가하였다. 입자는 0.1 M 카코딜산나트륨 완충액(pH 7.4)에 2.5% 글루타르알데히드, 1.25% 파라포름알데히드, 0.03% 피크르산을 첨가한 용액에 실온에서 2시간 동안 고정하였다. 세척 후, 1% 사산화오스뮴(OsO4)/1.5% 페로시안화칼륨(KFeCN6) 용액에 2시간 동안 후고정하고, 물로 3회 세척한 후, 1% 아세트산우라닐 용액에 1시간 동안 담갔다. 다시 물로 2회 세척하고, 50%, 70%, 90%, 100% 알코올에 각각 10분씩 담가 탈수시켰다. 그런 다음 시편을 프로필렌 옥사이드에 1시간 동안 담근 후, 프로필렌 옥사이드와 TAAP 에폰(Marivac Canada Inc., St. Laurent, CA)을 1:1로 혼합한 용액으로 함침시켰습니다. 시편을 TAAB 에폰에 매몰하고 60°C에서 48시간 동안 중합시켰습니다. 경화된 과립형 수지를 절단하여 JEOL 1200EX 투과 전자 현미경(JEOL, Tokyo, Japan)과 AMT 2k CCD 카메라(Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA)를 사용하여 TEM으로 관찰했습니다.
모든 실험은 3회 반복하여 수행하였다. 각 시점마다 세균 세척액을 3회 접종하여 총 9개의 데이터 포인트를 얻었으며, 이 데이터 포인트들의 평균값을 해당 미생물의 농도로 사용하였다. 표준편차를 측정 오차로 사용하였다. 모든 데이터 포인트는 유효하다.
t = 0분 대비 세균 농도 감소량의 로그값은 다음 공식을 사용하여 계산하였다.
여기서 C0는 시간 0에서의 대조 시료의 세균 농도(즉, 표면이 건조된 후이지만 챔버에 넣기 전)이고, Cn은 n분 노출 후 표면의 세균 농도입니다.
45분 노출 동안 박테리아의 자연적인 분해를 고려하기 위해 45분 후 대조군 대비 로그 감소율도 다음과 같이 계산했습니다.
여기서 Cn은 시간 n에서의 대조군 샘플 내 세균 농도이고, Cn-Control은 시간 n에서의 대조군 세균 농도입니다. 데이터는 대조군(EWNS 노출 없음) 대비 로그 감소율로 표시됩니다.
본 연구에서는 Taylor 콘 형성, Taylor 콘 안정성, EWNS 생성 안정성 및 재현성 측면에서 바늘과 대향 전극 사이의 전압 및 거리의 여러 조합을 평가했습니다. 다양한 조합은 보충표 S1에 제시되어 있습니다. 안정적이고 재현성 있는 특성(Taylor 콘, EWNS 생성 및 시간 경과에 따른 안정성)을 보이는 두 가지 경우를 선택하여 종합적인 연구를 진행했습니다. 그림 3은 두 경우 모두에서 ROS의 전하량, 크기 및 함량에 대한 결과를 보여줍니다. 결과는 표 1에도 제시되어 있습니다. 참고로, 그림 3과 표 1에는 이전에 합성된 최적화되지 않은 EWNS8, 9, 10, 11(기준 EWNS)의 특성도 포함되어 있습니다. 양측 t-검정을 사용한 통계적 유의성 계산 결과는 보충표 S2에 다시 제시되어 있습니다. 또한, 대향 전극 샘플링 홀 직경(D)과 접지 전극과 팁 사이의 거리(L)의 영향에 대한 연구 결과도 추가 자료에 포함되어 있습니다(보충 그림 S2 및 S3).
(ac) AFM으로 측정한 크기 분포. (df) 표면 전하 특성. (g) EPR의 ROS 특성 분석.
또한 위의 모든 조건에서 측정된 이온화 전류는 2~6μA, 전압은 -3.8~-6.5kV 범위였으며, 이로 인해 단일 EWNS 생성 접촉 모듈의 전력 소비량은 50mW 미만이었습니다. EWNS는 고압 조건에서 합성되었지만 오존 농도는 매우 낮아 60ppb를 초과하지 않았습니다.
보충 그림 S4는 각각 [-6.5 kV, 4.0 cm] 및 [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오에 대한 시뮬레이션된 전기장을 보여줍니다. [-6.5 kV, 4.0 cm] 및 [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오에서 계산된 전기장은 각각 2 × 10⁵ V/m 및 4.7 × 10⁵ V/m입니다. 이는 두 번째 경우의 전압-거리 비율이 훨씬 높기 때문에 예상되는 결과입니다.
그림 3a,b는 AFM8로 측정한 EWNS 직경을 보여줍니다. 계산된 평균 EWNS 직경은 [-6.5 kV, 4.0 cm] 조건에서 27 nm, [-3.8 kV, 0.5 cm] 조건에서 19 nm였습니다. [-6.5 kV, 4.0 cm] 및 [-3.8 kV, 0.5 cm] 조건에서 분포의 기하 표준 편차는 각각 1.41과 1.45로, 좁은 크기 분포를 나타냅니다. 평균 크기와 기하 표준 편차 모두 기준 EWNS의 25 nm 및 1.41 값과 매우 유사합니다. 그림 3c는 동일한 조건에서 동일한 방법으로 측정한 기준 EWNS의 크기 분포를 보여줍니다.
그림 3d,e는 ​​전하 특성 분석 결과를 보여줍니다. 데이터는 농도(#/cm³)와 전류(I)를 동시에 30회 측정하여 얻은 평균값입니다. 분석 결과, EWNS의 평균 전하는 [-6.5 kV, 4.0 cm] 조건에서 22 ± 6 e⁻, [-3.8 kV, 0.5 cm] 조건에서 44 ± 6 e⁻로 나타났습니다. 이는 기준 EWNS(10 ± 2 e⁻)에 비해 표면 전하가 상당히 높은 수치이며, [-6.5 kV, 4.0 cm] 조건보다 두 배, [-3.8 kV, 0.5 cm] 조건보다 네 배 더 높습니다. 그림 3f는 기준 EWNS의 전하 데이터를 보여줍니다.
EWNS 수 농도 분포도(보충 그림 S5 및 S6)에서 [-6.5 kV, 4.0 cm] 시나리오가 [-3.8 kV, 0.5 cm] 시나리오보다 훨씬 더 많은 입자를 생성하는 것을 확인할 수 있습니다. 또한, EWNS 수 농도를 최대 4시간 동안 모니터링한 결과(보충 그림 S5 및 S6), 두 경우 모두에서 EWNS 생성 안정성이 동일한 수준의 입자 수 농도를 나타내는 것을 확인할 수 있습니다.
그림 3g는 [-6.5 kV, 4.0 cm]에서 최적화된 EWNS 대조군(배경)을 뺀 후의 EPR 스펙트럼을 보여줍니다. ROS 스펙트럼은 이전에 발표된 연구의 기준선-EWNS 시나리오와도 비교되었습니다. 스핀 트랩과 반응하는 EWNS의 수는 7.5 × 10⁴ EWNS/s로 계산되었으며, 이는 이전에 발표된 기준선-EWNS8과 유사합니다. EPR 스펙트럼은 두 가지 유형의 ROS가 존재함을 명확히 보여주며, O₂⁻가 주요 종이고 OH•는 상대적으로 적게 존재합니다. 또한, 피크 강도를 직접 비교한 ​​결과, 최적화된 EWNS는 기준선 EWNS에 비해 ROS 함량이 현저히 높은 것으로 나타났습니다.
그림 4는 EPES에서 EWNS의 증착 효율을 보여줍니다. 데이터는 표 I에 요약되어 있으며 기존 EWNS 데이터와 비교되었습니다. 두 EWNS 모두 3.0kV의 낮은 전압에서도 증착률이 거의 100%에 달합니다. 일반적으로 표면 전하 변화와 관계없이 3.0kV는 100% 증착에 충분합니다. 동일한 조건에서 기준 EWNS의 증착 효율은 낮은 전하량(EWNS당 평균 10개의 전자)으로 인해 56%에 불과했습니다.
그림 5와 표 2는 최적 조건[-6.5kV, 4.0cm]에서 약 40,000 #/cm3의 EWNS에 45분간 노출시킨 후 토마토 표면에 접종된 미생물의 불활성화 값을 요약한 것이다. 접종된 대장균(E. coli)과 무해한 락토바실러스(Lactobacillus innocuous)는 45분 노출 동안 3.8 log의 유의미한 감소를 보였다. 동일 조건에서 살모넬라 엔테리카(S. enterica)는 2.2 log 감소를, 살모넬라 세레비지애(S. cerevisiae)와 메티실린 파라포르투툼(M. parafortutum)은 1.0 log 감소를 보였다.
전자 현미경 사진(그림 6)은 EWNS가 무해한 대장균, 연쇄상구균 및 락토바실러스 세포에 유발하는 물리적 변화와 그로 인한 불활성화를 보여줍니다. 대조군 세균은 세포막이 손상되지 않은 반면, EWNS에 노출된 세균은 외막이 손상되었습니다.
대조군과 노출된 박테리아를 전자 현미경으로 관찰한 결과 막 손상이 확인되었다.
최적화된 EWNS의 물리화학적 특성에 대한 데이터는 EWNS의 특성(표면 전하 및 ROS 함량)이 이전에 발표된 EWNS 기준 데이터8,9,10,11에 비해 크게 개선되었음을 종합적으로 보여줍니다. 한편, 크기는 나노미터 범위로 유지되어 이전에 보고된 결과와 매우 유사하며, 이로 인해 장시간 공기 중에 떠 있을 수 있습니다. 관찰된 다분산성은 EWNS의 크기를 결정하는 표면 전하 변화, 레일리 효과의 무작위성, 그리고 잠재적인 합체 현상으로 설명할 수 있습니다. 그러나 Nielsen 등22이 자세히 설명한 바와 같이, 높은 표면 전하는 물방울의 표면 에너지/장력을 효과적으로 증가시켜 증발을 감소시킵니다. 저희의 이전 논문8에서 이 이론은 미세 액적22 및 EWNS에 대해 실험적으로 확인되었습니다. 시간이 지남에 따라 발생하는 전하 손실 또한 크기에 영향을 미치고 관찰된 크기 분포에 기여할 수 있습니다.