نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
شريط تمرير يعرض ثلاث شرائح في وقت واحد. استخدم زري "السابق" و"التالي" للتنقل بين الشرائح الثلاث في كل مرة، أو استخدم أزرار التمرير في النهاية للتنقل بين الشرائح الثلاث في كل مرة.
طُوِّرت مؤخرًا منصة مضادة للميكروبات خالية من المواد الكيميائية، تعتمد على تقنية النانو باستخدام هياكل نانوية مائية اصطناعية (EWNS). تتميز هذه الهياكل بشحنة سطحية عالية وتشبعها بأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) التي تتفاعل مع عدد من الكائنات الدقيقة، بما في ذلك مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء، وتُعطِّلها. تُظهر هذه الدراسة إمكانية ضبط خصائص هذه الهياكل وتحسينها أثناء عملية التصنيع لتعزيز فعاليتها المضادة للبكتيريا. صُمِّمت منصة مختبرية خاصة بهياكل EWNS لضبط خصائصها بدقة من خلال تغيير معايير التصنيع. تم توصيف خصائص هياكل EWNS (الشحنة، والحجم، ومحتوى أنواع الأكسجين التفاعلية) باستخدام أساليب تحليلية حديثة. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم قدرتها على تعطيل الميكروبات المنقولة بالغذاء، مثل الإشريكية القولونية، والسالمونيلا المعوية، والليستيريا غير الضارة، والمتفطرة شبه العرضية، والخميرة الجعوية. تُظهر النتائج المعروضة هنا إمكانية ضبط خصائص جسيمات EWNS بدقة أثناء عملية التصنيع، مما يؤدي إلى زيادة هائلة في كفاءة التثبيط. وعلى وجه الخصوص، زادت الشحنة السطحية بمقدار أربعة أضعاف، كما زادت أنواع الأكسجين التفاعلية. وكان معدل إزالة الميكروبات مرتبطًا بنوع الميكروب، وتراوح بين 1.0 و3.8 لوغاريتم بعد التعرض لمدة 45 دقيقة لجرعة رذاذ من جسيمات EWNS مقدارها 40,000 جسيم/سم مكعب.
يُعد التلوث الميكروبي السبب الرئيسي للأمراض المنقولة بالغذاء، والناجمة عن تناول مسببات الأمراض أو سمومها. في الولايات المتحدة وحدها، تتسبب الأمراض المنقولة بالغذاء في حوالي 76 مليون حالة مرضية، و325 ألف حالة دخول إلى المستشفيات، و5 آلاف حالة وفاة سنويًا.¹ إضافةً إلى ذلك، تُشير تقديرات وزارة الزراعة الأمريكية إلى أن زيادة استهلاك المنتجات الطازجة مسؤولة عن 48% من جميع حالات الأمراض المنقولة بالغذاء المُبلغ عنها في الولايات المتحدة.² وتُعدّ تكلفة الأمراض والوفيات الناجمة عن مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء في الولايات المتحدة باهظة للغاية، حيث تُقدّرها مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها بأكثر من 15.6 مليار دولار أمريكي سنويًا.³
تُجرى حاليًا التدخلات الكيميائية والإشعاعية والحرارية المضادة للميكروبات لضمان سلامة الغذاء في الغالب عند نقاط تحكم حرجة محدودة على طول سلسلة الإنتاج (عادةً بعد الحصاد و/أو أثناء التعبئة والتغليف) بدلاً من تطبيقها بشكل مستمر، مما يجعلها عرضةً للتلوث المتبادل. يتطلب تحسين مكافحة الأمراض المنقولة بالغذاء وتلف الأغذية تدخلات مضادة للميكروبات يمكن تطبيقها على امتداد سلسلة الإنتاج من المزرعة إلى المستهلك، مع تقليل الأثر البيئي والتكاليف.
طُوِّرت مؤخرًا منصة مضادة للميكروبات تعتمد على تقنية النانو وخالية من المواد الكيميائية، قادرة على تعطيل البكتيريا السطحية والمحمولة جوًا باستخدام هياكل نانوية اصطناعية من الماء (EWNS). تم تصنيع هذه الهياكل باستخدام عمليتين متوازيتين: الرش الكهروستاتيكي وتأيين الماء (الشكل 1أ). أظهرت دراسات سابقة أن لهياكل EWNS مجموعة فريدة من الخصائص الفيزيائية والبيولوجية^8،9،10. تحتوي هذه الهياكل على 10 إلكترونات في المتوسط، ويبلغ متوسط ​​حجمها النانوي 25 نانومترًا (الشكل 1ب، ج)^8،9،10. بالإضافة إلى ذلك، أظهر رنين الدوران الإلكتروني (ESR) أن هياكل EWNS تحتوي على كمية كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، وخاصة جذور الهيدروكسيل (OH•) وجذور الأكسيد الفائق (O2-) (الشكل 1ج)⁸. تبقى هياكل EWNS في الهواء لفترة طويلة، ويمكنها الاصطدام بالكائنات الدقيقة العالقة في الهواء والموجودة على السطح، حاملةً معها حمولتها من أنواع الأكسجين التفاعلية، مما يؤدي إلى تعطيلها (الشكل 1د). أظهرت هذه الدراسات المبكرة أيضًا أن مادة EWNS قادرة على التفاعل مع أنواع مختلفة من البكتيريا سالبة وموجبة الغرام، بما في ذلك المتفطرات، على الأسطح وفي الهواء، وتعطيلها. وأظهر الفحص المجهري الإلكتروني النافذ أن التعطيل ناتج عن تمزق غشاء الخلية. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات الاستنشاق الحاد أن الجرعات العالية من مادة EWNS لا تسبب تلفًا أو التهابًا في الرئة.
(أ) يحدث الرش الكهروستاتيكي عند تطبيق جهد كهربائي عالٍ بين أنبوب شعري يحتوي على سائل وقطب كهربائي مضاد. (ب) يؤدي تطبيق ضغط عالٍ إلى ظاهرتين مختلفتين: (1) الرش الكهروستاتيكي للماء، و(2) تكوين أنواع الأكسجين التفاعلية (أيونات) محصورة في جسيمات الماء النانوية الكهروكيميائية. (ج) البنية الفريدة لجسيمات الماء النانوية الكهروكيميائية. (د) نظرًا لطبيعتها النانوية، تتميز جسيمات الماء النانوية الكهروكيميائية بحركية عالية، ويمكنها التفاعل مع مسببات الأمراض المحمولة جوًا.
لقد تم مؤخرًا إثبات قدرة منصة EWNS المضادة للميكروبات على تعطيل الكائنات الدقيقة المنقولة بالغذاء على سطح الأطعمة الطازجة. كما تبين أن الشحنة السطحية لـ EWNS، بالاشتراك مع مجال كهربائي، يمكن استخدامها لتحقيق توصيل مُوجَّه. علاوة على ذلك، كانت النتائج الأولية للطماطم العضوية بعد تعريضها لمدة 90 دقيقة لـ EWNS بكثافة تقارب 50,000 ميكروغرام/سم³ مُشجِّعة، حيث لوحظ وجود العديد من الكائنات الدقيقة المنقولة بالغذاء مثل الإشريكية القولونية والليستيريا. بالإضافة إلى ذلك، لم تُظهر الاختبارات الحسية الأولية أي تأثيرات حسية مقارنةً بالطماطم غير المعالجة. على الرغم من أن نتائج التعطيل الأولية هذه مُشجِّعة لتطبيقات سلامة الأغذية حتى مع جرعات EWNS المنخفضة جدًا (50,000 ميكروغرام/سم³)، فمن الواضح أن زيادة قدرة التعطيل ستكون أكثر فائدة لتقليل خطر العدوى والتلف.
سنركز في هذا البحث على تطوير منصة لتوليد جسيمات نانوية بلورية مغلفة بطبقة رقيقة (EWNS) لتمكين ضبط معايير التخليق وتحسين الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذه الجسيمات لتعزيز قدرتها المضادة للبكتيريا. وقد انصبّ التركيز بشكل خاص على زيادة الشحنة السطحية (لتحسين التوصيل الموجه) ومحتوى أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) (لتحسين كفاءة التثبيط). سنقوم بتوصيف الخصائص الفيزيائية والكيميائية المُحسّنة (الحجم، والشحنة، ومحتوى أنواع الأكسجين التفاعلية) باستخدام أساليب تحليلية حديثة، وذلك باستخدام كائنات دقيقة شائعة في الأغذية مثل الإشريكية القولونية.
تم تصنيع EVNS عن طريق الرش الكهربائي والتأيين المتزامنين للماء عالي النقاوة (18 ميجا أوم سم–1). يُستخدم البخاخ الكهربائي 12 عادةً لترذيذ السوائل وتصنيع جزيئات البوليمر والسيراميك 13 والألياف 14 ذات الحجم المُتحكم به.
كما هو موضح بالتفصيل في المنشورات السابقة 8، 9، 10، 11، في تجربة نموذجية، تم تطبيق جهد كهربائي عالٍ بين أنبوب شعري معدني وقطب كهربائي مضاد مؤرض. خلال هذه العملية، تحدث ظاهرتان مختلفتان: (1) الرش الكهروستاتيكي، و(2) تأين الماء. يتسبب المجال الكهربائي القوي بين القطبين في تراكم الشحنات السالبة على سطح الماء المكثف، مما يؤدي إلى تكوين مخاريط تايلور. ونتيجة لذلك، تتشكل قطرات ماء عالية الشحنة، والتي تستمر في التفتت إلى جزيئات أصغر، كما في نظرية رايلي 16. في الوقت نفسه، تتسبب المجالات الكهربائية القوية في انقسام بعض جزيئات الماء وفقدانها للإلكترونات (تأينها)، مما يؤدي إلى تكوين كمية كبيرة من أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) 17. تم تغليف أنواع الأكسجين التفاعلية المتولدة في الوقت نفسه 18 في جسيمات نانوية كربونية موصلة كهربائيًا (الشكل 1ج).
يوضح الشكل 2أ نظام توليد جسيمات النانو الكهربائية (EWNS) الذي طُوِّر واستُخدم في عملية التخليق في هذه الدراسة. يُغذَّى الماء النقي المخزن في زجاجة مغلقة عبر أنبوب من التفلون (قطره الداخلي 2 مم) إلى إبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ عيار 30 (أنبوب شعري معدني). يُتحكَّم في تدفق الماء بواسطة ضغط الهواء داخل الزجاجة، كما هو موضح في الشكل 2ب. تُثبَّت الإبرة على وحدة تحكم من التفلون، ويمكن ضبطها يدويًا على مسافة محددة من القطب المضاد. القطب المضاد عبارة عن قرص من الألومنيوم المصقول به ثقب في المنتصف لأخذ العينات. يوجد أسفل القطب المضاد قمع لأخذ العينات مصنوع من الألومنيوم، ومتصل ببقية جهاز التجربة عبر منفذ أخذ العينات (الشكل 2ب). ولتجنب تراكم الشحنات الذي قد يُعطِّل عمل جهاز أخذ العينات، تُؤرَّض جميع مكوناته كهربائيًا.
(أ) نظام توليد البنية النانوية المائية المُهندسة (EWNS). (ب) مقطع عرضي لجهاز أخذ العينات والرش الكهروستاتيكي، يوضح أهم المعايير. (ج) الإعداد التجريبي لتعطيل البكتيريا.
يُمكن لنظام توليد الموجات الكهرومغناطيسية الموصوف أعلاه تغيير معايير التشغيل الرئيسية لتسهيل ضبط خصائص الموجات الكهرومغناطيسية بدقة. اضبط الجهد المطبق (V)، والمسافة بين الإبرة والقطب المضاد (L)، وتدفق الماء (φ) عبر الأنبوب الشعري لضبط خصائص الموجات الكهرومغناطيسية بدقة. الرمز المستخدم لتمثيل التركيبات المختلفة هو: [V (كيلوفولت)، L (سم)]. اضبط تدفق الماء للحصول على مخروط تايلور مستقر بقيمة محددة [V، L]. لأغراض هذه الدراسة، تم تثبيت قطر فتحة القطب المضاد (D) عند 1.29 سم (0.5 بوصة).
نظراً لمحدودية الهندسة وعدم التناظر، لا يمكن حساب شدة المجال الكهربائي من المبادئ الأساسية. لذا، استُخدم برنامج QuickField™ (سفيندبورغ، الدنمارك)¹⁹ لحساب المجال الكهربائي. ولأن المجال الكهربائي غير منتظم، فقد استُخدمت قيمته عند طرف الأنبوب الشعري كقيمة مرجعية لمختلف التكوينات.
خلال الدراسة، تم تقييم عدة توليفات من الجهد والمسافة بين الإبرة والقطب المضاد من حيث تكوين مخروط تايلور، واستقرار مخروط تايلور، واستقرار إنتاج EWNS، وقابلية التكرار. تُعرض التوليفات المختلفة في الجدول التكميلي S1.
تم توصيل مخرج نظام توليد جسيمات EWNS مباشرةً بجهاز تحليل حجم الجسيمات المتحركة (SMPS، طراز 3936، TSI، شورفيو، مينيسوتا) لقياس تركيز عدد الجسيمات، بالإضافة إلى مقياس فاراداي الكهربائي للهباء الجوي (TSI، طراز 3068B، شورفيو، مينيسوتا). وقد تم قياس تيارات الهباء الجوي كما هو موضح في منشورنا السابق. أخذ كل من جهاز SMPS ومقياس فاراداي الكهربائي للهباء الجوي عينات بمعدل تدفق 0.5 لتر/دقيقة (إجمالي تدفق العينة 1 لتر/دقيقة). تم قياس تركيز عدد الجسيمات وتدفق الهباء الجوي لمدة 120 ثانية، وتكرر القياس 30 مرة. وبناءً على قياسات التيار، تم حساب إجمالي شحنة الهباء الجوي، وتم تقدير متوسط ​​شحنة EWNS لعدد إجمالي محدد من جسيمات EWNS المختارة. ويمكن حساب متوسط ​​تكلفة EWNS باستخدام المعادلة (1).
حيث IEl هو التيار المقاس، وNSMPS هو التركيز الرقمي المقاس بواسطة SMPS، وφEl هو معدل التدفق لكل مقياس كهربائي.
نظرًا لأن الرطوبة النسبية (RH) تؤثر على الشحنة السطحية، فقد تم الحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة النسبية ثابتة أثناء التجربة عند 21 درجة مئوية و 45٪ على التوالي.
استُخدم المجهر الذري الماسح (AFM)، وجهاز Asylum MFP-3D (شركة Asylum Research، سانتا باربرا، كاليفورنيا)، ومسبار AC260T (شركة Olympus، طوكيو، اليابان) لقياس حجم وعمر جسيمات EWNS. كان تردد مسح المجهر الذري الماسح 1 هرتز، ومساحة المسح 5 ميكرومتر × 5 ميكرومتر، وعدد خطوط المسح 256 خطًا. خضعت جميع الصور لمحاذاة صور من الدرجة الأولى باستخدام برنامج Asylum (نطاق القناع 100 نانومتر، والعتبة 100 بيكومتر).
أُزيل قمع الاختبار ووُضع سطح الميكا على بُعد 2.0 سم من القطب المضاد لمدة 120 ثانية لتجنب تكتل الجسيمات وتكوّن قطرات غير منتظمة على سطح الميكا. رُشّت مادة EWNS مباشرةً على سطح الميكا المقطوعة حديثًا (Ted Pella، ريدينغ، كاليفورنيا). صورة لسطح الميكا مباشرةً بعد عملية الرشّ باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). زاوية التلامس لسطح الميكا غير المُعدّلة والمقطوعة حديثًا قريبة من 0°، لذا تتوزع مادة EWNS على سطح الميكا على شكل قبة. قِيس قطر (a) وارتفاع (h) القطرات المنتشرة مباشرةً من صورة مجهر القوة الذرية، واستُخدمت لحساب حجم انتشار EWNS المقبب باستخدام طريقتنا التي سبق التحقق من صحتها. بافتراض أن حجم EWNS الموجود على الجهاز متساوٍ، يمكن حساب القطر المكافئ باستخدام المعادلة (2).
استنادًا إلى طريقتنا المطورة سابقًا، استُخدم مصيدة دوران رنين الدوران الإلكتروني (ESR) للكشف عن وجود وسائط جذرية قصيرة العمر في رذاذ EWNS. تم تمرير الرذاذ عبر موزع رذاذ صغير (650 ميكرومتر، Ace Glass، فيني لاند، نيوجيرسي) يحتوي على محلول 235 ملي مولار من DEPMPO (5-(ثنائي إيثوكسي فوسفوريل)-5-ميثيل-1-بيرولين-N-أكسيد) (Oxis International Inc.، بورتلاند، أوريغون). أُجريت جميع قياسات ESR باستخدام مطياف Bruker EMX (Bruker Instruments Inc.، بيليريكا، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) ولوحة مسطحة. استُخدم برنامج Acquisit (Bruker Instruments Inc.، بيليريكا، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) لجمع البيانات وتحليلها. تم تحديد خصائص أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) فقط ضمن مجموعة من ظروف التشغيل [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم]. تم قياس تركيزات EWNS باستخدام SMPS بعد مراعاة فقدان EWNS في جهاز الصدم.
تمت مراقبة مستويات الأوزون باستخدام جهاز مراقبة الأوزون ثنائي الحزمة 205 (2B Technologies، بولدر، كولورادو) 8،9،10.
بالنسبة لجميع خصائص نظام EWNS، يُستخدم المتوسط ​​كقيمة قياس، والانحراف المعياري كخطأ قياس. أُجريت اختبارات T لمقارنة قيم سمات نظام EWNS المُحسَّنة مع القيم المقابلة لنظام EWNS الأساسي.
يوضح الشكل 2ج نظام "سحب" الترسيب الكهروستاتيكي (EPES) الذي طُوِّر ووُصِف سابقًا، والذي يُمكن استخدامه لتوصيل جسيمات EWNS بدقة إلى السطح. يستخدم نظام EPES شحنات EVNS التي يُمكن "توجيهها" مباشرةً إلى سطح الهدف تحت تأثير مجال كهربائي قوي. تُعرض تفاصيل نظام EPES في منشور حديث لـ Pyrgiotakis وآخرون¹¹. يتكون نظام EPES من حجرة مطبوعة ثلاثية الأبعاد من مادة PVC ذات نهايات مدببة، وتحتوي على لوحين معدنيين متوازيين من الفولاذ المقاوم للصدأ (304، مطلي بطبقة عاكسة) في المنتصف، يفصل بينهما مسافة 15.24 سم. وُصِلَ اللوحان بمصدر جهد عالٍ خارجي (Bertran 205B-10R، Spellman، Hauppauge، نيويورك)، حيث وُصِلَ اللوح السفلي دائمًا بجهد موجب، واللوح العلوي دائمًا بالأرض (أرضية عائمة). غُطِّيت جدران الحجرة برقائق ألومنيوم مؤرضة كهربائيًا لمنع فقدان الجسيمات. تحتوي الحجرة على باب تحميل أمامي محكم الإغلاق يسمح بوضع أسطح الاختبار على حوامل بلاستيكية ترفعها فوق الصفيحة المعدنية السفلية لتجنب التداخل عالي الجهد.
تم حساب كفاءة ترسيب EWNS في EPES وفقًا لبروتوكول تم تطويره مسبقًا ومفصل بالتفصيل في الشكل التكميلي S111.
كغرفة تحكم، تم توصيل غرفة تدفق أسطوانية ثانية على التوالي بنظام EPES، حيث استُخدم مرشح HEPA وسيط لإزالة جزيئات EWNS. وكما هو موضح في الشكل 2ج، تم ضخ رذاذ EWNS عبر غرفتين مدمجتين. يعمل المرشح الموجود بين غرفة التحكم ونظام EPES على إزالة أي جزيئات EWNS متبقية، مما يضمن ثبات درجة الحرارة (T) والرطوبة النسبية (RH) ومستويات الأوزون.
تم العثور على كائنات دقيقة مهمة تنتقل عن طريق الغذاء تلوث الأطعمة الطازجة مثل الإشريكية القولونية (ATCC #27325)، وهي مؤشر برازي، والسالمونيلا المعوية (ATCC #53647)، وهي مسببات الأمراض المنقولة بالغذاء، والليستيريا غير الضارة (ATCC #33090)، وهي بديل لليستيريا المستوحدة الممرضة، والمشتقة من ATCC (ماناساس، فيرجينيا)، والخميرة الجعوية (ATCC #4098)، وهي بديل لخميرة التلف، وبكتيريا معطلة أكثر مقاومة، وهي المتفطرة البارالوكية (ATCC #19686).
اشترِ علبًا عشوائية من طماطم العنب العضوية من السوق المحلي، وضعها في الثلاجة على درجة حرارة 4 مئوية حتى استخدامها (لمدة تصل إلى 3 أيام). كانت جميع حبات الطماطم المستخدمة في التجربة متساوية الحجم، بقطر حوالي 1.25 سم.
تم تفصيل بروتوكولات الاستزراع والتلقيح والتعريض وعدّ المستعمرات في منشورنا السابق وفي البيانات التكميلية. قُيِّمَت فعالية نظام EWNS بتعريض الطماطم الملقحة لـ 40,000 وحدة/سم³ لمدة 45 دقيقة. باختصار، استُخدمت ثلاث طماطم لتقييم الكائنات الدقيقة المتبقية عند الزمن t = 0 دقيقة. وُضِعَت ثلاث طماطم في محلول EPES وعُرِّضَت لنظام EWNS بتركيز 40,000 وحدة/سم³ (الطماطم المعرضة لنظام EWNS)، بينما وُضِعَت الطماطم الثلاث المتبقية في حجرة التحكم (طماطم التحكم). لم تُجرَ أي معالجة إضافية للطماطم في المجموعتين. أُزيلت الطماطم المعرضة لنظام EWNS وطماطم التحكم بعد 45 دقيقة لتقييم تأثير نظام EWNS.
أُجريت كل تجربة ثلاث مرات. وتم تحليل البيانات وفقًا للبروتوكول الموضح في البيانات التكميلية.
تم تقييم آليات التعطيل عن طريق ترسيب عينات من جسيمات EWNS المعرضة للإشعاع (لمدة 45 دقيقة عند تركيز 40,000 جسيم/سم³ من جسيمات EWNS) وعينات غير معرضة للإشعاع من بكتيريا غير ضارة مثل الإشريكية القولونية، والسالمونيلا المعوية، واللاكتوباسيلس. تم تثبيت الجسيمات في محلول مكون من 2.5% غلوتارالدهيد، و1.25% بارافورمالدهيد، و0.03% حمض البيكريك في محلول منظم من كاكوديليت الصوديوم بتركيز 0.1 مولار (الأس الهيدروجيني 7.4) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسل، تُثبّت العينات بمحلول رباعي أكسيد الأوزميوم (OsO4) بتركيز 1% وفيروسيانيد البوتاسيوم (KFeCN6) بتركيز 1.5% لمدة ساعتين، ثم تُغسل ثلاث مرات بالماء وتُحضن في محلول أسيتات اليورانيل بتركيز 1% لمدة ساعة، ثم تُغسل مرتين بالماء، ثم تُجفف لمدة 10 دقائق في محاليل كحول بتراكيز 50%، 70%، 90%، و100%. بعد ذلك، تُوضع العينات في أكسيد البروبيلين لمدة ساعة وتُشرب بمزيج بنسبة 1:1 من أكسيد البروبيلين وإيبون TAAP (شركة ماريفاك كندا، سانت لوران، كاليفورنيا). تُغمر العينات في إيبون TAAB وتُبلمر عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. تم قطع الراتنج الحبيبي المعالج وتصويره بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ باستخدام مجهر إلكتروني نافذ تقليدي JEOL 1200EX (JEOL، طوكيو، اليابان) مزود بكاميرا AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques، Corp.، Woburn، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية).
أُجريت جميع التجارب ثلاث مرات. عند كل نقطة زمنية، زُرعت غسولات بكتيرية ثلاث مرات، ما أسفر عن تسع نقاط بيانات لكل نقطة، واستُخدم متوسطها كتركيز بكتيري لذلك الكائن الدقيق. استُخدم الانحراف المعياري كخطأ قياس. جميع النقاط مهمة.
تم حساب لوغاريتم الانخفاض في تركيز البكتيريا مقارنةً بالوقت t = 0 دقيقة باستخدام الصيغة التالية:
حيث C0 هو تركيز البكتيريا في عينة التحكم في الوقت 0 (أي بعد أن يجف السطح ولكن قبل وضعه في الحجرة) و Cn هو تركيز البكتيريا على السطح بعد n دقيقة من التعرض.
ولمراعاة التحلل الطبيعي للبكتيريا خلال فترة التعرض التي استمرت 45 دقيقة، تم حساب الانخفاض اللوغاريتمي مقارنة بالعينة الضابطة بعد 45 دقيقة على النحو التالي:
حيث Cn هو تركيز البكتيريا في عينة التحكم عند الزمن n و Cn-Control هو تركيز بكتيريا التحكم عند الزمن n. يتم عرض البيانات كانخفاض لوغاريتمي مقارنة بالتحكم (بدون التعرض لـ EWNS).
خلال الدراسة، تم تقييم عدة توليفات من الجهد والمسافة بين الإبرة والقطب المضاد من حيث تكوين مخروط تايلور، واستقراره، واستقرار إنتاج جسيمات EWNS، وقابلية التكرار. تُعرض التوليفات المختلفة في الجدول التكميلي S1. تم اختيار حالتين تُظهران خصائص مستقرة وقابلة للتكرار (مخروط تايلور، وتوليد جسيمات EWNS، والاستقرار مع مرور الوقت) لإجراء دراسة شاملة. يوضح الشكل 3 نتائج الشحنة والحجم ومحتوى أنواع الأكسجين التفاعلية في كلتا الحالتين. كما تُعرض النتائج في الجدول 1. وللمقارنة، يتضمن كل من الشكل 3 والجدول 1 خصائص جسيمات EWNS8، 9، 10، 11 غير المُحسَّنة التي تم تصنيعها سابقًا (جسيمات EWNS الأساسية). أُعيد نشر حسابات الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t ثنائي الطرف في الجدول التكميلي S2. بالإضافة إلى ذلك، تتضمن البيانات الإضافية دراسات حول تأثير قطر فتحة أخذ العينات للقطب المضاد (D) والمسافة بين القطب الأرضي والطرف (L) (الشكلان التكميليان S2 وS3).
(أ) توزيع الحجم المقاس بواسطة المجهر الذري الماسح. (د) خصائص الشحنة السطحية. (ز) توصيف أنواع الأكسجين التفاعلية في الرنين المغناطيسي الإلكتروني.
من المهم أيضًا ملاحظة أنه في جميع الظروف المذكورة أعلاه، تراوح تيار التأين المقاس بين 2 و6 ميكروأمبير، والجهد بين -3.8 و-6.5 كيلوفولت، مما أدى إلى استهلاك طاقة أقل من 50 ميلي واط لوحدة التلامس هذه لتوليد EWNS. على الرغم من تصنيع EWNS تحت ضغط عالٍ، كانت مستويات الأوزون منخفضة جدًا، ولم تتجاوز 60 جزءًا في المليار.
يوضح الشكل التكميلي S4 الحقول الكهربائية المحاكاة لسيناريوهي [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم] و[-3.8 كيلو فولت، 0.5 سم] على التوالي. في هذين السيناريوهين، بلغت قيم الحقول المحسوبة 2 × 10⁵ فولت/متر و4.7 × 10⁵ فولت/متر على التوالي. وهذا متوقع، لأن نسبة الجهد إلى المسافة في الحالة الثانية أعلى بكثير.
يوضح الشكلان 3أ و3ب قطر جسيمات EWNS المقاسة باستخدام مجهر القوة الذرية AFM8. بلغ متوسط ​​قطر جسيمات EWNS المحسوب 27 نانومترًا و19 نانومترًا لنظامي [-6.5 كيلوفولت، 4.0 سم] و[-3.8 كيلوفولت، 0.5 سم] على التوالي. في هذين النظامين، بلغ الانحراف المعياري الهندسي للتوزيعات 1.41 و1.45 على التوالي، مما يشير إلى توزيع حجمي ضيق. يقترب كل من متوسط ​​الحجم والانحراف المعياري الهندسي من جسيمات EWNS الأساسية، حيث يبلغ 25 نانومترًا و1.41 على التوالي. يوضح الشكل 3ج توزيع حجم جسيمات EWNS الأساسية المقاسة باستخدام الطريقة نفسها وتحت الظروف نفسها.
يوضح الشكلان 3د و3هـ نتائج توصيف الشحنة. البيانات عبارة عن متوسط ​​قياسات 30 قياسًا متزامنًا للتركيز (عدد الإلكترونات/سم³) والتيار (I). يُظهر التحليل أن متوسط ​​الشحنة على EWNS هو 22 ± 6 إلكترونًا و44 ± 6 إلكترونًا عند [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم] و[-3.8 كيلو فولت، 0.5 سم] على التوالي. تتميز هذه الشحنات السطحية بأنها أعلى بكثير مقارنةً بـ EWNS الأساسي (10 ± 2 إلكترونًا)، أي ضعف قيمة الشحنة عند [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم] وأربعة أضعاف قيمة الشحنة عند [-3.8 كيلو فولت، 0.5 سم]. يوضح الشكل 3و بيانات الشحنة لـ EWNS الأساسي.
من خلال خرائط تركيز عدد جسيمات EWNS (الشكلان التكميليان S5 وS6)، يتضح أن سيناريو [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم] يحتوي على عدد جسيمات أكبر بكثير من سيناريو [-3.8 كيلو فولت، 0.5 سم]. ومن الجدير بالذكر أيضًا أنه تمت مراقبة تركيز عدد جسيمات EWNS لمدة تصل إلى 4 ساعات (الشكلان التكميليان S5 وS6)، حيث أظهر استقرار توليد جسيمات EWNS مستويات تركيز متماثلة في كلتا الحالتين.
يوضح الشكل 3g طيف الرنين المغناطيسي الإلكتروني (EPR) بعد طرح طيف التحكم الأمثل (الخلفية) عند [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم]. كما قورنت أطياف أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) مع سيناريو خط الأساس EWNS في دراسة منشورة سابقًا. حُسب عدد جزيئات EWNS المتفاعلة مع مصائد الدوران بـ 7.5 × 10⁴ جزيء/ثانية، وهو ما يُقارب قيمة خط الأساس EWNS⁸ المنشورة سابقًا. أظهرت أطياف الرنين المغناطيسي الإلكتروني بوضوح وجود نوعين من أنواع الأكسجين التفاعلية، حيث كان O₂⁻ هو النوع السائد، بينما كان OH• أقل وفرة. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت مقارنة مباشرة لشدة الذروة أن EWNS الأمثل يحتوي على نسبة أعلى بكثير من أنواع الأكسجين التفاعلية مقارنةً بـ EWNS الأساسي.
يوضح الشكل 4 كفاءة ترسيب جسيمات EWNS في EPES. كما تم تلخيص البيانات في الجدول 1 ومقارنتها ببيانات EWNS الأصلية. في كلتا حالتي EUNS، يقترب الترسيب من 100% حتى عند جهد منخفض يبلغ 3.0 كيلو فولت. عادةً، يكون 3.0 كيلو فولت كافيًا لترسيب كامل، بغض النظر عن تغير الشحنة السطحية. في ظل الظروف نفسها، بلغت كفاءة ترسيب Baseline-EWNS 56% فقط نظرًا لانخفاض شحنتها (بمعدل 10 إلكترونات لكل جسيم EWNS).
يلخص الشكل 5 والجدول 2 قيمة تعطيل الكائنات الدقيقة الملقحة على سطح الطماطم بعد تعريضها لحوالي 40,000 ميكرومتر/سم³ من الموجات الكهرومغناطيسية لمدة 45 دقيقة في الوضع الأمثل [-6.5 كيلو فولت، 4.0 سم]. أظهرت بكتيريا الإشريكية القولونية واللاكتوباسيلوس غير الضارة الملقحة انخفاضًا ملحوظًا بمقدار 3.8 لوغاريتمات خلال فترة التعرض البالغة 45 دقيقة. في ظل الظروف نفسها، انخفضت أعداد السالمونيلا المعوية بمقدار 2.2 لوغاريتم، بينما انخفضت أعداد الخميرة الجعوية وفطر بارافورتوتوم بمقدار 1.0 لوغاريتم.
تُظهر الصور المجهرية الإلكترونية (الشكل 6) التغيرات الفيزيائية التي يُحدثها عامل EWNS على خلايا بكتيريا الإشريكية القولونية، والمكورات العقدية، واللاكتوباسيلس غير الضارة، مما يؤدي إلى تعطيلها. كانت أغشية خلايا البكتيريا الضابطة سليمة، بينما كانت أغشية خلايا البكتيريا المعرضة للعامل متضررة.
كشف التصوير المجهري الإلكتروني للبكتيريا الضابطة والمعرضة عن تلف في الغشاء.
تُظهر البيانات المتعلقة بالخصائص الفيزيائية والكيميائية لجسيمات EWNS المُحسَّنة تحسُّنًا ملحوظًا في خصائصها (الشحنة السطحية ومحتوى أنواع الأكسجين التفاعلية) مقارنةً بالبيانات الأساسية المنشورة سابقًا^8،9،10،11. من جهة أخرى، بقي حجمها في نطاق النانومتر، وهو ما يُشابه النتائج المنشورة سابقًا، مما يسمح لها بالبقاء في الهواء لفترات طويلة. يُمكن تفسير التشتت الملحوظ في الحجم بتغيرات الشحنة السطحية التي تُحدد حجم جسيمات EWNS، وعشوائية تأثير رايلي، واحتمالية اندماجها. مع ذلك، وكما أوضح نيلسن وآخرون²²، فإن ارتفاع الشحنة السطحية يُقلل من التبخر عن طريق زيادة طاقة/توتر سطح قطرة الماء. في منشورنا السابق⁸، تم تأكيد هذه النظرية تجريبيًا بالنسبة للقطرات الميكروية²² وجسيمات EWNS. كما يُمكن أن يؤثر فقدان الشحنة بمرور الوقت على الحجم ويُساهم في توزيع الحجم الملحوظ.