Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για την καλύτερη εμπειρία, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα ενημερωμένο πρόγραμμα περιήγησης (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, θα αποδώσουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ και JavaScript.
Ένα καρουζέλ που δείχνει τρεις διαφάνειες ταυτόχρονα.Χρησιμοποιήστε τα κουμπιά Προηγούμενο και Επόμενο για να μετακινηθείτε σε τρεις διαφάνειες κάθε φορά ή χρησιμοποιήστε τα κουμπιά ρυθμιστικού στο τέλος για να μετακινηθείτε σε τρεις διαφάνειες κάθε φορά.
Πρόσφατα, αναπτύχθηκε μια αντιμικροβιακή πλατφόρμα χωρίς χημικά που βασίζεται στη νανοτεχνολογία χρησιμοποιώντας τεχνητές νανοδομές νερού (EWNS).Τα EWNS έχουν υψηλό επιφανειακό φορτίο και είναι κορεσμένα με δραστικά είδη οξυγόνου (ROS) που μπορούν να αλληλεπιδράσουν και να αδρανοποιήσουν έναν αριθμό μικροοργανισμών, συμπεριλαμβανομένων των τροφιμογενών παθογόνων.Εδώ αποδεικνύεται ότι οι ιδιότητές τους κατά τη σύνθεση μπορούν να βελτιστοποιηθούν και να βελτιστοποιηθούν ώστε να ενισχυθεί περαιτέρω το αντιβακτηριακό τους δυναμικό.Η πλατφόρμα εργαστηρίου EWNS σχεδιάστηκε για να προσαρμόζει τις ιδιότητες του EWNS αλλάζοντας τις παραμέτρους σύνθεσης.Χαρακτηρισμός ιδιοτήτων EWNS (χρέωση, μέγεθος και περιεχόμενο ROS) με χρήση σύγχρονων αναλυτικών μεθόδων.Επιπλέον, αξιολογήθηκαν για το δυναμικό μικροβιακής απενεργοποίησης τους έναντι τροφιμογενών μικροοργανισμών όπως τα Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum και Saccharomyces cerevisiae.Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ καταδεικνύουν ότι οι ιδιότητες του EWNS μπορούν να ρυθμιστούν με ακρίβεια κατά τη διάρκεια της σύνθεσης, με αποτέλεσμα μια εκθετική αύξηση της αποτελεσματικότητας απενεργοποίησης.Ειδικότερα, το επιφανειακό φορτίο αυξήθηκε κατά τέσσερις φορές και οι αντιδραστικές μορφές οξυγόνου αυξήθηκαν.Ο ρυθμός μικροβιακής απομάκρυνσης ήταν μικροβιακά εξαρτημένος και κυμαινόταν από 1,0 έως 3,8 log μετά από 45 λεπτά έκθεσης σε δόση αερολύματος 40.000 #/cc EWNS.
Η μικροβιακή μόλυνση είναι η κύρια αιτία τροφιμογενών ασθενειών που προκαλούνται από την κατάποση παθογόνων ή τοξινών τους.Μόνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, οι τροφιμογενείς ασθένειες προκαλούν περίπου 76 εκατομμύρια ασθένειες, 325.000 εισαγωγές σε νοσοκομεία και 5.000 θανάτους κάθε χρόνο1.Επιπλέον, το Υπουργείο Γεωργίας των Ηνωμένων Πολιτειών (USDA) εκτιμά ότι η αυξημένη κατανάλωση φρέσκων προϊόντων ευθύνεται για το 48% όλων των αναφερόμενων τροφιμογενών ασθενειών στις Ηνωμένες Πολιτείες2.Το κόστος των ασθενειών και των θανάτων που προκαλούνται από τροφιμογενή παθογόνα στις Ηνωμένες Πολιτείες είναι πολύ υψηλό, εκτιμάται από τα Κέντρα Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (CDC) σε περισσότερα από 15,6 δισεκατομμύρια δολάρια ΗΠΑ ετησίως3.
Επί του παρόντος, οι χημικές4, οι ακτινοβολίες5 και οι θερμικές6 αντιμικροβιακές παρεμβάσεις για τη διασφάλιση της ασφάλειας των τροφίμων πραγματοποιούνται κυρίως σε περιορισμένα κρίσιμα σημεία ελέγχου (CCP) κατά μήκος της αλυσίδας παραγωγής (συνήθως μετά τη συγκομιδή ή/και κατά τη συσκευασία) και όχι συνεχώς.Ως εκ τούτου, είναι επιρρεπείς σε διασταυρούμενη μόλυνση.7. Ο καλύτερος έλεγχος των τροφιμογενών ασθενειών και της αλλοίωσης των τροφίμων απαιτεί αντιμικροβιακές παρεμβάσεις που μπορούν δυνητικά να εφαρμοστούν σε όλη τη συνέχεια από το αγρόκτημα στο τραπέζι, μειώνοντας ταυτόχρονα τις περιβαλλοντικές επιπτώσεις και το κόστος.
Πρόσφατα, αναπτύχθηκε μια αντιμικροβιακή πλατφόρμα χωρίς χημικά, βασισμένη στη νανοτεχνολογία, η οποία μπορεί να αδρανοποιεί επιφανειακά και αερομεταφερόμενα βακτήρια χρησιμοποιώντας τεχνητές νανοδομές νερού (EWNS).Το EWNS συντέθηκε χρησιμοποιώντας δύο παράλληλες διαδικασίες, ηλεκτροψεκασμό και ιονισμό νερού (Εικ. 1α).Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το EWNS έχει ένα μοναδικό σύνολο φυσικών και βιολογικών ιδιοτήτων8,9,10.Το EWNS έχει κατά μέσο όρο 10 ηλεκτρόνια ανά δομή και μέσο μέγεθος νανοκλίμακας 25 nm (Εικ. 1b,c)8,9,10.Επιπλέον, ο συντονισμός σπιν ηλεκτρονίων (ESR) έδειξε ότι το EWNS περιέχει μεγάλη ποσότητα δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS), κυρίως ρίζες υδροξυλίου (OH•) και υπεροξειδίου (O2-) (Εικ. 1γ)8.Το EVNS βρίσκεται στον αέρα για μεγάλο χρονικό διάστημα και μπορεί να συγκρουστεί με μικροοργανισμούς που αιωρούνται στον αέρα και υπάρχουν στην επιφάνεια, μεταφέροντας το ωφέλιμο φορτίο ROS τους και προκαλώντας αδρανοποίηση μικροοργανισμών (Εικ. 1δ).Αυτές οι πρώτες μελέτες έδειξαν επίσης ότι το EWNS μπορεί να αλληλεπιδράσει και να αδρανοποιήσει διάφορα gram-αρνητικά και θετικά κατά Gram βακτήρια, συμπεριλαμβανομένων των μυκοβακτηρίων, σε επιφάνειες και στον αέρα.Η ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης έδειξε ότι η αδρανοποίηση προκλήθηκε από διάρρηξη της κυτταρικής μεμβράνης.Επιπλέον, μελέτες οξείας εισπνοής έχουν δείξει ότι οι υψηλές δόσεις EWNS δεν προκαλούν βλάβη στους πνεύμονες ή φλεγμονή 8 .
(α) Ο ηλεκτροψεκασμός συμβαίνει όταν εφαρμόζεται υψηλή τάση μεταξύ ενός τριχοειδούς σωλήνα που περιέχει υγρό και ενός αντίθετου ηλεκτροδίου.(β) Η εφαρμογή υψηλής πίεσης έχει ως αποτέλεσμα δύο διαφορετικά φαινόμενα: (i) ηλεκτροψεκασμό νερού και (ii) σχηματισμό ενεργών ειδών οξυγόνου (ιόντων) παγιδευμένων στο EWNS.(γ) Η μοναδική δομή του EWNS.(δ) Λόγω της φύσης τους σε νανοκλίμακα, τα EWNS είναι εξαιρετικά κινητά και μπορούν να αλληλεπιδράσουν με αερομεταφερόμενα παθογόνα.
Η ικανότητα της αντιμικροβιακής πλατφόρμας EWNS να αδρανοποιεί τροφιμογενείς μικροοργανισμούς στην επιφάνεια των φρέσκων τροφίμων έχει επίσης αποδειχθεί πρόσφατα.Έχει επίσης αποδειχθεί ότι το επιφανειακό φορτίο του EWNS σε συνδυασμό με ένα ηλεκτρικό πεδίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την επίτευξη στοχευμένης παροχής.Επιπλέον, τα προκαταρκτικά αποτελέσματα για τις βιολογικές ντομάτες μετά από έκθεση 90 λεπτών σε EWNS περίπου 50.000 #/cm3 ήταν ενθαρρυντικά, με διάφορους τροφιμογενείς μικροοργανισμούς όπως E. coli και Listeria 11 που παρατηρήθηκαν.Επιπλέον, οι προκαταρκτικές οργανοληπτικές δοκιμές δεν έδειξαν αισθητικά αποτελέσματα σε σύγκριση με τις ντομάτες ελέγχου.Αν και αυτά τα αρχικά αποτελέσματα αδρανοποίησης είναι ενθαρρυντικά για εφαρμογές ασφάλειας τροφίμων ακόμη και σε πολύ χαμηλές δόσεις EWNS των 50.000#/cc.Βλέπε, είναι σαφές ότι ένα υψηλότερο δυναμικό αδρανοποίησης θα ήταν πιο επωφελές για την περαιτέρω μείωση του κινδύνου μόλυνσης και αλλοίωσης.
Εδώ, θα εστιάσουμε την έρευνά μας στην ανάπτυξη μιας πλατφόρμας παραγωγής EWNS για να επιτρέψουμε τη λεπτή ρύθμιση των παραμέτρων σύνθεσης και τη βελτιστοποίηση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων του EWNS για να ενισχύσουμε το αντιβακτηριακό δυναμικό τους.Συγκεκριμένα, η βελτιστοποίηση έχει επικεντρωθεί στην αύξηση του επιφανειακού τους φορτίου (για τη βελτίωση της στοχευμένης παράδοσης) και του περιεχομένου ROS (για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της απενεργοποίησης).Χαρακτηρίστε τις βελτιστοποιημένες φυσικοχημικές ιδιότητες (μέγεθος, φορτίο και περιεκτικότητα σε ROS) χρησιμοποιώντας σύγχρονες αναλυτικές μεθόδους και χρησιμοποιήστε κοινούς μικροοργανισμούς τροφίμων όπως το E. .
Το EVNS συντέθηκε με ταυτόχρονο ηλεκτροψεκασμό και ιονισμό νερού υψηλής καθαρότητας (18 MΩ cm–1).Ο ηλεκτρικός νεφελοποιητής 12 χρησιμοποιείται τυπικά για τον ψεκασμό υγρών και τη σύνθεση πολυμερών και κεραμικών σωματιδίων 13 και ινών 14 ελεγχόμενου μεγέθους.
Όπως περιγράφεται λεπτομερώς στις προηγούμενες δημοσιεύσεις 8, 9, 10, 11, σε ένα τυπικό πείραμα, εφαρμόστηκε υψηλή τάση μεταξύ ενός μεταλλικού τριχοειδούς και ενός γειωμένου αντίθετου ηλεκτροδίου.Κατά τη διαδικασία αυτή συμβαίνουν δύο διαφορετικά φαινόμενα: i) ηλεκτροψεκασμός και ii) ιονισμός νερού.Ένα ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο μεταξύ των δύο ηλεκτροδίων προκαλεί τη συσσώρευση αρνητικών φορτίων στην επιφάνεια του συμπυκνωμένου νερού, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό κώνων Taylor.Ως αποτέλεσμα, σχηματίζονται πολύ φορτισμένα σταγονίδια νερού, τα οποία συνεχίζουν να διασπώνται σε μικρότερα σωματίδια, όπως στη θεωρία Rayleigh16.Ταυτόχρονα, τα ισχυρά ηλεκτρικά πεδία προκαλούν τη διάσπαση ορισμένων μορίων νερού και την απογύμνωση των ηλεκτρονίων (ιονισμό), γεγονός που οδηγεί στο σχηματισμό μιας μεγάλης ποσότητας ενεργών ειδών οξυγόνου (ROS)17.Το ROS18 που δημιουργήθηκε ταυτόχρονα ενθυλακώθηκε σε EWNS (Εικ. 1c).
Στο σχ.Το 2α δείχνει το σύστημα παραγωγής EWNS που αναπτύχθηκε και χρησιμοποιήθηκε στη σύνθεση EWNS σε αυτή τη μελέτη.Καθαρισμένο νερό αποθηκευμένο σε κλειστή φιάλη τροφοδοτήθηκε μέσω ενός σωλήνα τεφλόν (εσωτερική διάμετρος 2 mm) σε μια βελόνα από ανοξείδωτο χάλυβα 30 G (μεταλλικό τριχοειδές).Η ροή του νερού ελέγχεται από την πίεση του αέρα μέσα στο μπουκάλι, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2β.Η βελόνα είναι τοποθετημένη σε μια κονσόλα Teflon και μπορεί να ρυθμιστεί χειροκίνητα σε μια ορισμένη απόσταση από το αντίθετο ηλεκτρόδιο.Το αντίθετο ηλεκτρόδιο είναι ένας γυαλισμένος δίσκος αλουμινίου με μια οπή στο κέντρο για δειγματοληψία.Κάτω από το αντίθετο ηλεκτρόδιο υπάρχει μια χοάνη δειγματοληψίας αλουμινίου, η οποία συνδέεται με την υπόλοιπη πειραματική διάταξη μέσω μιας θύρας δειγματοληψίας (Εικ. 2β).Για να αποφευχθεί η συσσώρευση φορτίου που θα μπορούσε να διαταράξει τη λειτουργία του δειγματολήπτη, όλα τα εξαρτήματα του δειγματολήπτη είναι ηλεκτρικά γειωμένα.
(α) Μηχανικό Σύστημα Παραγωγής Νανοδομών Νερού (EWNS).(β) Διατομή του δειγματολήπτη και του ηλεκτροψεκασμού, που δείχνει τις σημαντικότερες παραμέτρους.(γ) Πειραματική ρύθμιση για την απενεργοποίηση βακτηρίων.
Το σύστημα παραγωγής EWNS που περιγράφεται παραπάνω είναι ικανό να αλλάζει βασικές παραμέτρους λειτουργίας για να διευκολύνει τη λεπτή ρύθμιση των ιδιοτήτων EWNS.Ρυθμίστε την εφαρμοζόμενη τάση (V), την απόσταση μεταξύ της βελόνας και του αντίθετου ηλεκτροδίου (L) και τη ροή του νερού (φ) μέσω του τριχοειδούς για να ρυθμίσετε με ακρίβεια τα χαρακτηριστικά EWNS.Σύμβολο που χρησιμοποιείται για την αναπαράσταση διαφορετικών συνδυασμών: [V (kV), L (cm)].Ρυθμίστε τη ροή του νερού για να λάβετε έναν σταθερό κώνο Taylor ενός συγκεκριμένου συνόλου [V, L].Για τους σκοπούς αυτής της μελέτης, η διάμετρος ανοίγματος του αντίθετου ηλεκτροδίου (D) διατηρήθηκε στις 0,5 ίντσες (1,29 cm).
Λόγω της περιορισμένης γεωμετρίας και ασυμμετρίας, η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου δεν μπορεί να υπολογιστεί από τις πρώτες αρχές.Αντίθετα, το λογισμικό QuickField™ (Svendborg, Δανία)19 χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του ηλεκτρικού πεδίου.Το ηλεκτρικό πεδίο δεν είναι ομοιόμορφο, επομένως η τιμή του ηλεκτρικού πεδίου στην άκρη του τριχοειδούς χρησιμοποιήθηκε ως τιμή αναφοράς για διάφορες διαμορφώσεις.
Κατά τη διάρκεια της μελέτης, αξιολογήθηκαν αρκετοί συνδυασμοί τάσης και απόστασης μεταξύ της βελόνας και του αντίθετου ηλεκτροδίου ως προς το σχηματισμό κώνου Taylor, τη σταθερότητα του κώνου Taylor, τη σταθερότητα παραγωγής EWNS και την αναπαραγωγιμότητα.Διάφοροι συνδυασμοί φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.
Η έξοδος του συστήματος παραγωγής EWNS συνδέθηκε απευθείας με έναν αναλυτή μεγέθους σωματιδίων Scanning Mobility (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) για μέτρηση συγκέντρωσης αριθμού σωματιδίων, καθώς και σε ένα Ηλεκτρόμετρο Faraday Aerosol (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN).) για τα ρεύματα αερολύματος μετρήθηκε όπως περιγράφεται στην προηγούμενη δημοσίευσή μας.Τόσο το SMPS όσο και το ηλεκτρόμετρο αερολύματος δειγματολήφθηκαν με ρυθμό ροής 0,5 L/min (συνολική ροή δείγματος 1 L/min).Η συγκέντρωση του αριθμού των σωματιδίων και η ροή του αερολύματος μετρήθηκαν για 120 δευτερόλεπτα.Η μέτρηση επαναλαμβάνεται 30 φορές.Με βάση τις τρέχουσες μετρήσεις, υπολογίζεται το συνολικό φορτίο αερολύματος και υπολογίζεται το μέσο φορτίο EWNS για έναν δεδομένο συνολικό αριθμό επιλεγμένων σωματιδίων EWNS.Το μέσο κόστος του EWNS μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας την Εξίσωση (1):
όπου IEl είναι το μετρούμενο ρεύμα, NSMPS είναι η ψηφιακή συγκέντρωση που μετράται με το SMPS και φEl είναι ο ρυθμός ροής ανά ηλεκτρόμετρο.
Επειδή η σχετική υγρασία (RH) επηρεάζει το επιφανειακό φορτίο, η θερμοκρασία και η (RH) διατηρήθηκαν σταθερές κατά τη διάρκεια του πειράματος στους 21°C και 45%, αντίστοιχα.
Μικροσκόπιο ατομικής δύναμης (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, CA) και ανιχνευτής AC260T (Olympus, Τόκιο, Ιαπωνία) χρησιμοποιήθηκαν για τη μέτρηση του μεγέθους και της διάρκειας ζωής του EWNS.Η συχνότητα σάρωσης AFM ήταν 1 Hz, η περιοχή σάρωσης ήταν 5 μm × 5 μm και 256 γραμμές σάρωσης.Όλες οι εικόνες υποβλήθηκαν σε ευθυγράμμιση εικόνας 1ης τάξης χρησιμοποιώντας το λογισμικό Asylum (εύρος μάσκας 100 nm, κατώφλι 100 μ.μ.).
Η δοκιμαστική χοάνη αφαιρέθηκε και η επιφάνεια μαρμαρυγίας τοποθετήθηκε σε απόσταση 2,0 cm από το αντίθετο ηλεκτρόδιο για μέσο χρόνο 120 δευτερολέπτων για να αποφευχθεί η συσσωμάτωση σωματιδίων και ο σχηματισμός ακανόνιστων σταγονιδίων στην επιφάνεια της μαρμαρυγίας.Το EWNS ψεκάστηκε απευθείας στην επιφάνεια της φρεσκοκομμένης μαρμαρυγίας (Ted Pella, Redding, CA).Εικόνα της επιφάνειας της μαρμαρυγίας αμέσως μετά την εκτόξευση AFM.Η γωνία επαφής της επιφάνειας της φρεσκοκομμένης μη τροποποιημένης μαρμαρυγίας είναι κοντά στις 0°, επομένως το EVNS κατανέμεται στην επιφάνεια της μαρμαρυγίας με τη μορφή θόλου.Η διάμετρος (a) και το ύψος (h) των σταγονιδίων διάχυσης μετρήθηκαν απευθείας από την τοπογραφία AFM και χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του όγκου διάχυσης με θόλο EWNS χρησιμοποιώντας την προηγουμένως επικυρωμένη μέθοδο μας.Υποθέτοντας ότι τα ενσωματωμένα EWNS έχουν τον ίδιο όγκο, η ισοδύναμη διάμετρος μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας την Εξίσωση (2):
Με βάση τη μέθοδο που αναπτύχθηκε προηγουμένως, χρησιμοποιήθηκε μια παγίδα σπιν συντονισμού ηλεκτρονίων (ESR) για την ανίχνευση της παρουσίας βραχύβιων ριζικών ενδιάμεσων στο EWNS.Τα αερολύματα διοχετεύθηκαν μέσω ενός 650 μm Midget sparger (Ace Glass, Vineland, NJ) που περιείχε ένα διάλυμα 235 mM DEPMPO(5-(διαιθοξυφωσφορυλ)-5-μεθυλ-1-πυρρολινο-Ν-οξείδιο) (Oxis International Inc.).Πόρτλαντ, Όρεγκον).Όλες οι μετρήσεις ESR πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, ΜΑ, ΗΠΑ) και ένα κύτταρο επίπεδης οθόνης.Για τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, ΜΑ, ΗΠΑ).Ο προσδιορισμός των χαρακτηριστικών του ROS πραγματοποιήθηκε μόνο για ένα σύνολο συνθηκών λειτουργίας [-6,5 kV, 4,0 cm].Οι συγκεντρώσεις EWNS μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το SMPS αφού ληφθούν υπόψη οι απώλειες EWNS στο κρουστικό εκκρεμές.
Τα επίπεδα όζοντος παρακολουθήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Για όλες τις ιδιότητες EWNS, η μέση τιμή χρησιμοποιείται ως τιμή μέτρησης και η τυπική απόκλιση χρησιμοποιείται ως σφάλμα μέτρησης.Πραγματοποιήθηκαν δοκιμές T για να συγκριθούν οι τιμές των βελτιστοποιημένων χαρακτηριστικών EWNS με τις αντίστοιχες τιμές του βασικού EWNS.
Το Σχήμα 2γ δείχνει ένα προηγουμένως αναπτυγμένο και χαρακτηρισμένο σύστημα ηλεκτροστατικής κατακρήμνισης (EPES) «έλξης» που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για στοχευμένη παροχή EWNS στην επιφάνεια.Το EPES χρησιμοποιεί φορτία EVNS που μπορούν να «καθοδηγηθούν» απευθείας στην επιφάνεια του στόχου υπό την επίδραση ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου.Λεπτομέρειες για το σύστημα EPES παρουσιάζονται σε πρόσφατη δημοσίευση των Pyrgiotakis et al.11 .Έτσι, το EPES αποτελείται από έναν τρισδιάστατο εκτυπωμένο θάλαμο PVC με κωνικά άκρα και περιέχει δύο παράλληλες μεταλλικές πλάκες από ανοξείδωτο χάλυβα (304 από ανοξείδωτο χάλυβα, με επίστρωση καθρέφτη) στο κέντρο σε απόσταση 15,24 cm μεταξύ τους.Οι πλακέτες ήταν συνδεδεμένες σε μια εξωτερική πηγή υψηλής τάσης (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), η κάτω πλάκα ήταν πάντα συνδεδεμένη με θετική τάση και η επάνω πλάκα ήταν πάντα συνδεδεμένη με τη γείωση (αιωρούμενη γείωση).Τα τοιχώματα του θαλάμου καλύπτονται με φύλλο αλουμινίου, το οποίο είναι ηλεκτρικά γειωμένο για να αποτρέπεται η απώλεια σωματιδίων.Ο θάλαμος έχει μια σφραγισμένη μπροστινή πόρτα φόρτωσης που επιτρέπει στις δοκιμαστικές επιφάνειες να τοποθετούνται σε πλαστικές βάσεις που τις ανυψώνουν πάνω από την κάτω μεταλλική πλάκα για να αποφευχθούν παρεμβολές υψηλής τάσης.
Η αποτελεσματικότητα εναπόθεσης του EWNS στο EPES υπολογίστηκε σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που αναπτύχθηκε προηγουμένως που περιγράφεται λεπτομερώς στο Συμπληρωματικό Σχήμα S111.
Ως θάλαμος ελέγχου, ένας δεύτερος κυλινδρικός θάλαμος ροής συνδέθηκε σε σειρά με το σύστημα EPES, στο οποίο χρησιμοποιήθηκε ένα ενδιάμεσο φίλτρο HEPA για την αφαίρεση του EWNS.Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2γ, το αεροζόλ EWNS αντλήθηκε μέσω δύο ενσωματωμένων θαλάμων.Το φίλτρο μεταξύ του δωματίου ελέγχου και του EPES αφαιρεί τυχόν εναπομείναντα EWNS με αποτέλεσμα την ίδια θερμοκρασία (T), σχετική υγρασία (RH) και επίπεδα όζοντος.
Σημαντικοί τροφιμογενείς μικροοργανισμοί έχουν βρεθεί ότι μολύνουν φρέσκα τρόφιμα όπως E. coli (ATCC #27325), δείκτης κοπράνων, Salmonella enterica (ATCC #53647), τροφιμογενής παθογόνος παράγοντας, Listeria αβλαβής (ATCC #33090), υποκατάστατο για παθογόνο Listeria monocytogenes, VAMavisac. CC #4098), ένα υποκατάστατο της μαγιάς αλλοίωσης και ένα πιο ανθεκτικό αδρανοποιημένο βακτήριο, το Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Αγοράστε τυχαία κουτιά με βιολογικές ντομάτες σταφυλιού από την τοπική αγορά και βάλτε το στο ψυγείο στους 4°C μέχρι τη χρήση (έως 3 ημέρες).Οι πειραματικές ντομάτες είχαν όλες το ίδιο μέγεθος, περίπου 1/2 ίντσας σε διάμετρο.
Τα πρωτόκολλα καλλιέργειας, εμβολιασμού, έκθεσης και καταμέτρησης αποικιών περιγράφονται λεπτομερώς στην προηγούμενη δημοσίευσή μας και περιγράφονται λεπτομερώς στα Συμπληρωματικά Δεδομένα.Η αποτελεσματικότητα του EWNS αξιολογήθηκε με έκθεση εμβολιασμένων ντοματών σε 40.000 #/cm3 για 45 λεπτά.Εν συντομία, τρεις ντομάτες χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση των επιζώντων μικροοργανισμών σε χρόνο t = 0 min.Τρεις ντομάτες τοποθετήθηκαν σε EPES και εκτέθηκαν σε EWNS στα 40.000 #/cc (εκτεθειμένες ντομάτες EWNS) και οι υπόλοιπες τρεις τοποθετήθηκαν στον θάλαμο ελέγχου (τομάτες ελέγχου).Δεν πραγματοποιήθηκε πρόσθετη επεξεργασία τομάτας και στις δύο ομάδες.Οι ντομάτες που εκτέθηκαν σε EWNS και οι ντομάτες ελέγχου αφαιρέθηκαν μετά από 45 λεπτά για να αξιολογηθεί η επίδραση του EWNS.
Κάθε πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.Η ανάλυση δεδομένων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται στα Συμπληρωματικά Δεδομένα.
Οι μηχανισμοί αδρανοποίησης αξιολογήθηκαν με καθίζηση εκτεθειμένων δειγμάτων EWNS (45 λεπτά σε συγκέντρωση αερολύματος EWNS 40.000 #/cm3) και μη ακτινοβολημένων δειγμάτων αβλαβών βακτηρίων E. coli, Salmonella enterica και Lactobacillus.Τα σωματίδια σταθεροποιήθηκαν σε 2,5% γλουταραλδεΰδη, 1,25% παραφορμαλδεΰδη και 0,03% πικρικό οξύ σε ρυθμιστικό διάλυμα κακοδυλικού νατρίου 0,1 Μ (ρΗ 7,4) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου.Μετά το πλύσιμο, μεταστειρώστε με 1% τετροξείδιο του οσμίου (OsO4)/1,5% σιδηροκυανιούχο κάλιο (KFeCN6) για 2 ώρες, πλύνετέ 3 φορές σε νερό και επωάστε σε 1% οξικό ουρανύλιο για 1 ώρα, στη συνέχεια πλύνετέ δύο φορές σε νερό και μετά αφυδατώστε 50%, 0,0% σε αλκοόλη για 10 λεπτά.Τα δείγματα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε οξείδιο προπυλενίου για 1 ώρα και εμποτίστηκαν με ένα μίγμα 1:1 προπυλενοξειδίου και TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA).Τα δείγματα ενσωματώθηκαν σε TAAB Epon και πολυμερίστηκαν στους 60°C για 48 ώρες.Η σκληρυμένη κοκκώδης ρητίνη κόπηκε και οπτικοποιήθηκε με TEM χρησιμοποιώντας ένα συμβατικό ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης JEOL 1200EX (JEOL, Τόκιο, Ιαπωνία) εξοπλισμένο με κάμερα CCD 2k AMT (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.Για κάθε χρονικό σημείο, οι βακτηριακές πλύσεις σπάρθηκαν εις τριπλούν, με αποτέλεσμα συνολικά εννέα σημεία δεδομένων ανά σημείο, ο μέσος όρος των οποίων χρησιμοποιήθηκε ως η βακτηριακή συγκέντρωση για τον συγκεκριμένο μικροοργανισμό.Ως σφάλμα μέτρησης χρησιμοποιήθηκε η τυπική απόκλιση.Όλοι οι πόντοι μετράνε.
Ο λογάριθμος της μείωσης της συγκέντρωσης των βακτηρίων σε σύγκριση με t = 0 min υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο:
όπου C0 είναι η συγκέντρωση βακτηρίων στο δείγμα ελέγχου τη στιγμή 0 (δηλαδή μετά την ξήρανση της επιφάνειας αλλά πριν τοποθετηθεί στον θάλαμο) και Cn είναι η συγκέντρωση βακτηρίων στην επιφάνεια μετά από n λεπτά έκθεσης.
Για να ληφθεί υπόψη η φυσική αποικοδόμηση των βακτηρίων κατά τη διάρκεια της έκθεσης 45 λεπτών, η μείωση του ημερολογίου σε σύγκριση με τον έλεγχο μετά από 45 λεπτά υπολογίστηκε επίσης ως εξής:
όπου Cn είναι η συγκέντρωση βακτηρίων στο δείγμα ελέγχου τη στιγμή n και Cn-Control είναι η συγκέντρωση βακτηρίων ελέγχου τη στιγμή n.Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μείωση καταγραφής σε σύγκριση με τον έλεγχο (χωρίς έκθεση EWNS).
Κατά τη διάρκεια της μελέτης, αξιολογήθηκαν αρκετοί συνδυασμοί τάσης και απόστασης μεταξύ της βελόνας και του αντίθετου ηλεκτροδίου ως προς το σχηματισμό κώνου Taylor, τη σταθερότητα του κώνου Taylor, τη σταθερότητα παραγωγής EWNS και την αναπαραγωγιμότητα.Διάφοροι συνδυασμοί φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1.Δύο περιπτώσεις που έδειχναν σταθερές και αναπαραγώγιμες ιδιότητες (κώνος Taylor, δημιουργία EWNS και σταθερότητα με την πάροδο του χρόνου) επιλέχθηκαν για ολοκληρωμένη μελέτη.Στο σχ.Το Σχήμα 3 δείχνει τα αποτελέσματα για τη χρέωση, το μέγεθος και το περιεχόμενο του ROS και στις δύο περιπτώσεις.Τα αποτελέσματα φαίνονται επίσης στον Πίνακα 1. Για αναφορά, τόσο το Σχήμα 3 όσο και ο Πίνακας 1 περιλαμβάνουν τις ιδιότητες του προηγουμένως συντεθέντος μη βελτιστοποιημένου EWNS8, 9, 10, 11 (βασική γραμμή-EWNS).Οι υπολογισμοί στατιστικής σημαντικότητας που χρησιμοποιούν ένα τεστ t δύο ουρών αναδημοσιεύονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2.Επιπλέον, τα πρόσθετα δεδομένα περιλαμβάνουν μελέτες της επίδρασης της διαμέτρου οπής δειγματοληψίας αντίθετου ηλεκτροδίου (D) και της απόστασης μεταξύ του ηλεκτροδίου γείωσης και του άκρου (L) (Συμπληρωματικά σχήματα S2 και S3).
(γ) Κατανομή μεγέθους μετρούμενη με AFM.(δστ) Χαρακτηριστικό επιφανειακής φόρτισης.(ζ) Χαρακτηρισμός ROS του EPR.
Είναι επίσης σημαντικό να σημειωθεί ότι για όλες τις παραπάνω συνθήκες, το μετρούμενο ρεύμα ιονισμού ήταν μεταξύ 2 και 6 μA και η τάση μεταξύ -3,8 και -6,5 kV, με αποτέλεσμα κατανάλωση ισχύος μικρότερη από 50 mW για αυτή τη μονάδα επαφής μεμονωμένης παραγωγής EWNS.Αν και το EWNS συντέθηκε υπό υψηλή πίεση, τα επίπεδα του όζοντος ήταν πολύ χαμηλά, ποτέ δεν ξεπερνούσαν τα 60 ppb.
Το συμπληρωματικό σχήμα S4 δείχνει τα προσομοιωμένα ηλεκτρικά πεδία για τα σενάρια [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], αντίστοιχα.Για τα σενάρια [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], οι υπολογισμοί πεδίου είναι 2 × 105 V/m και 4,7 × 105 V/m, αντίστοιχα.Αυτό είναι αναμενόμενο, αφού στη δεύτερη περίπτωση ο λόγος τάσης-απόστασης είναι πολύ μεγαλύτερος.
Στο σχ.Τα σχήματα 3a,b δείχνουν τη διάμετρο EWNS που μετρήθηκε με το AFM8.Οι υπολογισμένες μέσες διάμετροι EWNS ήταν 27 nm και 19 nm για τα σχήματα [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], αντίστοιχα.Για τα σενάρια [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], οι γεωμετρικές τυπικές αποκλίσεις των κατανομών είναι 1,41 και 1,45, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας μια περιορισμένη κατανομή μεγέθους.Τόσο το μέσο μέγεθος όσο και η γεωμετρική τυπική απόκλιση είναι πολύ κοντά στη βασική γραμμή EWNS, στα 25 nm και 1,41, αντίστοιχα.Στο σχ.Το 3c δείχνει την κατανομή μεγέθους του βασικού EWNS που μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο υπό τις ίδιες συνθήκες.
Στο σχ.Το 3d,e δείχνει τα αποτελέσματα του χαρακτηρισμού φορτίου.Τα δεδομένα είναι μέσες μετρήσεις 30 ταυτόχρονων μετρήσεων συγκέντρωσης (#/cm3) και ρεύματος (I).Η ανάλυση δείχνει ότι η μέση φόρτιση στο EWNS είναι 22 ± 6 e- και 44 ± 6 e- για [-6,5 kV, 4,0 cm] και [-3,8 kV, 0,5 cm], αντίστοιχα.Έχουν σημαντικά υψηλότερα επιφανειακά φορτία σε σύγκριση με το βασικό EWNS (10 ± 2 e-), δύο φορές μεγαλύτερο από το σενάριο [-6,5 kV, 4,0 cm] και τέσσερις φορές μεγαλύτερο από το [-3 ,8 kV, 0,5 cm].Το σχήμα 3στ δείχνει τη χρέωση.δεδομένα για Baseline-EWNS.
Από τους χάρτες συγκέντρωσης του αριθμού EWNS (Συμπληρωματικά Σχήματα S5 και S6), μπορεί να φανεί ότι το σενάριο [-6,5 kV, 4,0 cm] έχει σημαντικά περισσότερα σωματίδια από το σενάριο [-3,8 kV, 0,5 cm].Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι η συγκέντρωση του αριθμού EWNS παρακολουθήθηκε έως και 4 ώρες (Συμπληρωματικά Σχήματα S5 και S6), όπου η σταθερότητα παραγωγής EWNS έδειξε τα ίδια επίπεδα συγκέντρωσης αριθμού σωματιδίων και στις δύο περιπτώσεις.
Στο σχ.Το 3g δείχνει το φάσμα EPR μετά την αφαίρεση του βελτιστοποιημένου ελέγχου EWNS (φόντο) στα [-6,5 kV, 4,0 cm].Τα φάσματα ROS συγκρίθηκαν επίσης με το σενάριο Baseline-EWNS σε μια εργασία που δημοσιεύτηκε στο παρελθόν.Ο αριθμός των EWNS που αντιδρούν με παγίδες περιστροφής υπολογίστηκε ότι είναι 7,5 × 104 EWNS/s, που είναι παρόμοιος με τον προηγουμένως δημοσιευμένο Baseline-EWNS8.Τα φάσματα EPR έδειξαν ξεκάθαρα την παρουσία δύο τύπων ROS, με το O2- να είναι το κυρίαρχο είδος και το OH• να είναι λιγότερο άφθονο.Επιπλέον, μια άμεση σύγκριση των εντάσεων κορυφής έδειξε ότι το βελτιστοποιημένο EWNS είχε σημαντικά υψηλότερο περιεχόμενο ROS σε σύγκριση με το βασικό EWNS.
Στο σχ.Το σχήμα 4 δείχνει την αποτελεσματικότητα εναπόθεσης του EWNS σε EPES.Τα δεδομένα συνοψίζονται επίσης στον Πίνακα I και συγκρίνονται με τα αρχικά δεδομένα EWNS.Και για τις δύο περιπτώσεις EUNS, η εναπόθεση είναι κοντά στο 100% ακόμη και σε χαμηλή τάση 3,0 kV.Τυπικά, τα 3,0 kV είναι επαρκή για 100% εναπόθεση, ανεξάρτητα από την αλλαγή του επιφανειακού φορτίου.Υπό τις ίδιες συνθήκες, η απόδοση εναπόθεσης του Baseline-EWNS ήταν μόνο 56% λόγω του χαμηλότερου φορτίου τους (μέσος όρος 10 ηλεκτρόνια ανά EWNS).
Στο σχ.5 και στον πίνακα.2 συνοψίζει την τιμή αδρανοποίησης των μικροοργανισμών που εμβολιάστηκαν στην επιφάνεια της τομάτας μετά από έκθεση σε περίπου 40.000 #/cm3 EWNS για 45 λεπτά στη βέλτιστη λειτουργία [-6,5 kV, 4,0 cm].Τα εμβολιασμένα E. coli και Lactobacillus innocuous έδειξαν σημαντική μείωση 3,8 logs κατά τη διάρκεια της 45λεπτης έκθεσης.Υπό τις ίδιες συνθήκες, το S. enterica παρουσίασε μείωση 2,2 log, ενώ το S. cerevisiae και το M. parafortutum παρουσίασαν μείωση 1,0 log.
Οι ηλεκτρονικές μικρογραφίες (Εικόνα 6) απεικονίζουν τις φυσικές αλλαγές που προκαλούνται από το EWNS σε αβλαβή κύτταρα Escherichia coli, Streptococcus και Lactobacillus που οδηγούν στην αδρανοποίησή τους.Τα βακτήρια ελέγχου είχαν άθικτες κυτταρικές μεμβράνες, ενώ τα εκτεθειμένα βακτήρια είχαν κατεστραμμένες εξωτερικές μεμβράνες.
Η ηλεκτρονική μικροσκοπική απεικόνιση του ελέγχου και των εκτεθειμένων βακτηρίων αποκάλυψε βλάβη στη μεμβράνη.
Τα δεδομένα για τις φυσικοχημικές ιδιότητες του βελτιστοποιημένου EWNS συλλογικά δείχνουν ότι οι ιδιότητες (επιφανειακό φορτίο και περιεχόμενο ROS) του EWNS βελτιώθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τα προηγούμενα δημοσιευμένα βασικά δεδομένα EWNS8,9,10,11.Από την άλλη πλευρά, το μέγεθός τους παρέμεινε στο εύρος των νανομέτρων, πολύ παρόμοιο με τα αποτελέσματα που αναφέρθηκαν προηγουμένως, επιτρέποντάς τους να παραμένουν στον αέρα για μεγάλα χρονικά διαστήματα.Η παρατηρούμενη πολυδιασπορά μπορεί να εξηγηθεί από αλλαγές επιφανειακών φορτίων που καθορίζουν το μέγεθος του EWNS, την τυχαιότητα του φαινομένου Rayleigh και τη δυνητική συνένωση.Ωστόσο, όπως περιγράφεται λεπτομερώς από τους Nielsen et al.22, το υψηλό επιφανειακό φορτίο μειώνει την εξάτμιση αυξάνοντας αποτελεσματικά την επιφανειακή ενέργεια/τάση της σταγόνας νερού.Στην προηγούμενη δημοσίευσή μας8 αυτή η θεωρία επιβεβαιώθηκε πειραματικά για μικροσταγονίδια 22 και EWNS.Η απώλεια χρέωσης κατά την υπερωρία μπορεί επίσης να επηρεάσει το μέγεθος και να συμβάλει στην παρατηρούμενη κατανομή μεγέθους.