תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
קרוסלה המציגה שלוש שקופיות בו זמנית.השתמש בלחצנים 'הקודם' וה'הבא' כדי לעבור בין שלוש שקופיות בכל פעם, או השתמש בלחצני המחוון שבקצה כדי לעבור בין שלוש שקופיות בכל פעם.
לאחרונה פותחה פלטפורמה אנטי-מיקרוביאלית נטולת כימיקלים המבוססת על ננוטכנולוגיה באמצעות ננו-מבנים מלאכותיים של מים (EWNS).ל-EWNS יש מטען משטח גבוה והם רוויים במיני חמצן תגובתיים (ROS) שיכולים לקיים אינטראקציה עם מספר מיקרואורגניזמים ולהשבית אותם, כולל פתוגנים הנישאים במזון.כאן הוכח שניתן לכוונן ולמטב את התכונות שלהם במהלך הסינתזה כדי לשפר עוד יותר את הפוטנציאל האנטיבקטריאלי שלהם.פלטפורמת המעבדה של EWNS תוכננה לכוונן עדין את המאפיינים של EWNS על ידי שינוי פרמטרי הסינתזה.אפיון מאפייני EWNS (טעינה, גודל ותכולה של ROS) בשיטות אנליטיות מודרניות.בנוסף, הם הוערכו עבור פוטנציאל האינאקטיבציה המיקרוביאלית שלהם כנגד מיקרואורגניזמים הנישאים במזון כגון Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum ו-Saccharomyces cerevisiae.התוצאות המוצגות כאן מדגימות שניתן לכוונן את המאפיינים של EWNS במהלך הסינתזה, וכתוצאה מכך לעלייה אקספוננציאלית ביעילות האינאקטיבציה.בפרט, מטען פני השטח גדל בפקטור של ארבע ומין החמצן התגובתי גדל.קצב הסרת החיידקים היה תלוי מיקרוביאלית ונע בין 1.0 ל-3.8 לוג לאחר חשיפה של 45 דקות למינון אירוסול של 40,000 #/cc EWNS.
זיהום מיקרוביאלי הוא הגורם העיקרי למחלות המועברות במזון הנגרמות על ידי בליעה של פתוגנים או רעלנים שלהם.בארצות הברית לבדה, מחלות הנישאות במזון גורמות לכ-76 מיליון מחלות, 325,000 אשפוזים ו-5,000 מקרי מוות בכל שנה1.בנוסף, משרד החקלאות של ארצות הברית (USDA) מעריך שצריכה מוגברת של תוצרת טרייה אחראית ל-48% מכלל המחלות המדווחות על ידי מזון בארה"ב2.העלות של מחלות ומוות הנגרמים על ידי פתוגנים הנישאים במזון בארצות הברית גבוהה מאוד, מוערכת על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) ביותר מ-15.6 מיליארד דולר לשנה3.
נכון לעכשיו, התערבויות אנטי-מיקרוביאליות כימיות4, קרינה5 ותרמיות6 להבטחת בטיחות המזון מתבצעות לרוב בנקודות בקרה קריטיות מוגבלות (CCPs) לאורך שרשרת הייצור (בדרך כלל לאחר הקציר ו/או במהלך האריזה) ולא באופן רציף.לפיכך, הם נוטים לזיהום צולב.7. שליטה טובה יותר במחלות הנישאות במזון ובקלקול מזון דורשת התערבויות אנטי-מיקרוביאליות שיכולות להיות מיושמות על פני הרצף של החווה לשולחן תוך הפחתת ההשפעה והעלויות הסביבתיות.
לאחרונה פותחה פלטפורמה אנטי-מיקרוביאלית נטולת כימיקלים מבוססת ננוטכנולוגיה שיכולה להשבית חיידקים משטחים ואוויר באמצעות ננו-מבנים מלאכותיים של מים (EWNS).EWNS סונתז באמצעות שני תהליכים מקבילים, אלקטרוספריי ויינון מים (איור 1א).מחקרים קודמים הראו של-EWNS יש סט ייחודי של תכונות פיזיקליות וביולוגיות8,9,10.ל-EWNS יש ממוצע של 10 אלקטרונים למבנה וגודל ננומטרי ממוצע של 25 ננומטר (איור 1b,c)8,9,10.בנוסף, תהודה ספין אלקטרוני (ESR) הראתה ש-EWNS מכיל כמות גדולה של מיני חמצן תגובתיים (ROS), בעיקר רדיקלים הידרוקסיל (OH•) וסופראוקסיד (O2-) (איור 1c)8.EVNS נמצא באוויר במשך זמן רב ויכול להתנגש במיקרואורגניזמים התלויים באוויר ונוכחים על פני השטח, לספק את מטען ה-ROS שלהם ולגרום לחוסר הפעלה של מיקרואורגניזמים (איור 1ד).מחקרים מוקדמים אלה הראו גם ש-EWNS יכול לקיים אינטראקציה עם חיידקים גרם-שליליים וגרם-חיוביים שונים ולהשבית אותם, כולל מיקובקטריות, על משטחים ובאוויר.מיקרוסקופיה אלקטרונית העברה הראתה שהאי-אקטיבציה נגרמה משיבוש של קרום התא.בנוסף, מחקרי שאיפה חריפים הראו שמינונים גבוהים של EWNS אינם גורמים לנזק בריאות או לדלקת 8 .
(א) אלקטרוספרייז מתרחש כאשר מתח גבוה מופעל בין צינור נימי המכיל נוזל לבין אלקטרודה נגדית.(ב) הפעלת לחץ גבוה גורמת לשתי תופעות שונות: (i) התזת מים חשמלית ו-(ii) היווצרות מיני חמצן תגובתיים (יונים) הכלואים ב-EWNS.(ג) המבנה הייחודי של EWNS.(ד) בשל טבעם הננומטרי, EWNS ניידים מאוד ויכולים לקיים אינטראקציה עם פתוגנים הנישאים באוויר.
לאחרונה הוכחה גם היכולת של הפלטפורמה האנטי-מיקרוביאלית של EWNS להשבית מיקרואורגניזמים הנישאים במזון על פני השטח של מזון טרי.כמו כן, הוכח שניתן להשתמש במטען פני השטח של EWNS בשילוב עם שדה חשמלי להשגת מסירה ממוקדת.יתרה מכך, תוצאות ראשוניות עבור עגבניות אורגניות לאחר חשיפה של 90 דקות ב-EWNS של כ-50,000 #/cm3 היו מעודדות, עם מיקרואורגניזמים שונים הנישאים במזון כגון E. coli ו- Listeria 11.בנוסף, בדיקות אורגנולפטיות ראשוניות לא הראו השפעות תחושתיות בהשוואה לעגבניות ביקורת.למרות שתוצאות ההשבתה הראשוניות הללו מעודדות עבור יישומי בטיחות מזון אפילו במינונים נמוכים מאוד של EWNS של 50,000#/cc.ראה, ברור שפוטנציאל אינאקטיבציה גבוה יותר יהיה מועיל יותר כדי להפחית עוד יותר את הסיכון לזיהום ולקלקול.
כאן, נתמקד במחקר שלנו בפיתוח פלטפורמת יצירת EWNS כדי לאפשר כוונון עדין של פרמטרי סינתזה ואופטימיזציה של התכונות הפיזיקוכימיות של EWNS כדי לשפר את הפוטנציאל האנטיבקטריאלי שלהם.בפרט, האופטימיזציה התמקדה בהגדלת הטעינה השטחית שלהם (כדי לשפר אספקה ​​ממוקדת) ותכולת ROS (כדי לשפר את יעילות ההשבתה).אפיון תכונות פיסיקליות-כימיות אופטימליות (גודל, מטען ותכולת ROS) באמצעות שיטות אנליטיות מודרניות והשתמש במיקרואורגניזמים של מזון נפוצים כגון E. .
EVNS סונתז על ידי ריסוס אלקטרוני ויינון בו-זמני של מים בטוהר גבוה (18 MΩ cm-1).הנבולייזר החשמלי 12 משמש בדרך כלל לפירוק נוזלים ולסינתזה של חלקיקי פולימר וקרמיקה 13 וסיבים 14 בגודל מבוקר.
כפי שפורט בפרסומים קודמים 8, 9, 10, 11, בניסוי טיפוסי, הופעל מתח גבוה בין נימי מתכת לבין אלקטרודה נגדית מוארקת.במהלך תהליך זה מתרחשות שתי תופעות שונות: i) ספריי אלקטרו ו-ii) יינון מים.שדה חשמלי חזק בין שתי האלקטרודות גורם להצטברות מטענים שליליים על פני המים המעובה, וכתוצאה מכך להיווצרות קונוסים של טיילור.כתוצאה מכך, נוצרות טיפות מים טעונות מאוד, שממשיכות להתפרק לחלקיקים קטנים יותר, כמו בתיאוריית ריילי16.במקביל, שדות חשמליים חזקים גורמים לחלק ממולקולות המים להתפצל ולהסיר אלקטרונים (מיונן), מה שמוביל ליצירת כמות גדולה של מיני חמצן תגובתיים (ROS)17.ROS18 שנוצר בו זמנית היה מובלע ב-EWNS (איור 1c).
על איור.2a מציגה את מערכת יצירת EWNS שפותחה והשתמשה בסינתזה של EWNS במחקר זה.מים מטוהרים שנאגרו בבקבוק סגור הוזנו דרך צינור טפלון (קוטר פנימי של 2 מ"מ) לתוך מחט נירוסטה 30G (נימי מתכת).זרימת המים נשלטת על ידי לחץ האוויר בתוך הבקבוק, כפי שמוצג באיור 2ב.המחט מותקנת על קונסולת טפלון וניתנת להתאמה ידנית למרחק מסוים מהאלקטרודה הנגדית.האלקטרודה הנגדית היא דיסק אלומיניום מלוטש עם חור במרכז לדגימה.מתחת לאלקטרודת הנגד נמצא משפך דגימה מאלומיניום, המחובר לשאר מערך הניסוי באמצעות יציאת דגימה (איור 2ב).כדי למנוע הצטברות מטען שעלולה לשבש את פעולת הדגימה, כל רכיבי הדגימה מקורקעים חשמלית.
(א) מערכת יצירת ננו-מבנה מים מהונדסת (EWNS).(ב) חתך רוחב של הדגימה והאלקטרוספריי, המציג את הפרמטרים החשובים ביותר.(ג) מערך ניסוי להשבתת חיידקים.
מערכת יצירת EWNS שתוארה לעיל מסוגלת לשנות פרמטרים הפעלה מרכזיים כדי להקל על כוונון עדין של מאפייני ה-EWNS.התאם את המתח המופעל (V), את המרחק בין המחט לאלקטרודת הנגד (L), ואת זרימת המים (φ) דרך הנימים כדי לכוונן את מאפייני ה-EWNS.סמל המשמש לייצג שילובים שונים: [V (kV), L (ס"מ)].התאם את זרימת המים כדי לקבל קונוס טיילור יציב של סט מסוים [V, L].למטרות מחקר זה, קוטר הצמצם של האלקטרודה הנגדית (D) נשמר על 0.5 אינץ' (1.29 ס"מ).
בשל הגיאומטריה והאסימטריה המוגבלת, לא ניתן לחשב את עוצמת השדה החשמלי מהעקרונות הראשונים.במקום זאת, תוכנת QuickField™ (Svendborg, דנמרק)19 שימשה לחישוב השדה החשמלי.השדה החשמלי אינו אחיד, ולכן ערך השדה החשמלי בקצה הנימים שימש כערך ייחוס לתצורות שונות.
במהלך המחקר, מספר שילובים של מתח ומרחק בין המחט לאלקטרודת הנגד הוערכו במונחים של היווצרות קונוס טיילור, יציבות קונוס טיילור, יציבות ייצור EWNS ויכולת שחזור.שילובים שונים מוצגים בטבלה משלימה S1.
הפלט של מערכת ייצור ה-EWNS חובר ישירות ל-Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, דגם 3936, TSI, Shoreview, MN) למדידת ריכוזי מספר החלקיקים, וכן לאלטרומטר Aerosol Faraday (TSI, דגם 3068B, Shoreview, MN).) עבור זרמי אירוסול נמדד כפי שתואר בפרסום הקודם שלנו.הן ה- SMPS והן אלקטרומטר האירוסול נדגמו בקצב זרימה של 0.5 ליטר לדקה (זרימת דגימה כוללת 1 ליטר לדקה).מספר ריכוז החלקיקים וזרימת האירוסול נמדדו למשך 120 שניות.המדידה חוזרת על עצמה 30 פעמים.בהתבסס על מדידות נוכחיות, מטען האירוסול הכולל מחושב ומטען EWNS הממוצע מוערך עבור מספר כולל נתון של חלקיקי EWNS נבחרים.ניתן לחשב את העלות הממוצעת של EWNS באמצעות משוואה (1):
כאשר IEl הוא הזרם הנמדד, NSMPS הוא הריכוז הדיגיטלי הנמדד עם ה-SMPS, ו-φEl הוא קצב הזרימה לכל אלקטרומטר.
מכיוון שלחות יחסית (RH) משפיעה על מטען פני השטח, הטמפרטורה ו-(RH) נשמרו קבועים במהלך הניסוי ב-21°C ו-45%, בהתאמה.
מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, סנטה ברברה, קליפורניה) ובדיקה AC260T (Olympus, טוקיו, יפן) שימשו למדידת הגודל ואורך החיים של ה-EWNS.תדר הסריקה של AFM היה 1 הרץ, אזור הסריקה היה 5 מיקרומטר × 5 מיקרומטר, ו-256 קווי סריקה.כל התמונות עברו יישור תמונה מסדר 1 באמצעות תוכנת Asylum (טווח מסיכה 100 ננומטר, סף 100 אחה"צ).
משפך הבדיקה הוסר ומשטח הנציץ הונח במרחק של 2.0 ס"מ מהאלקטרודה הנגדית למשך זמן ממוצע של 120 שניות כדי למנוע הצטברות חלקיקים והיווצרות טיפות לא סדירות על פני הנציץ.EWNS רוסס ישירות על פני השטח של נציץ טרי חתוך (טד פלה, רדינג, קליפורניה).תמונה של משטח הנציץ מיד לאחר התזת AFM.זווית המגע של פני השטח של נציץ טרי חתוך ללא שינוי קרובה ל-0°, ולכן EVNS מופץ על פני הנציץ בצורה של כיפה.הקוטר (א) והגובה (ח) של הטיפות המתפזרות נמדדו ישירות מהטופוגרפיה של AFM ושימשו לחישוב נפח הדיפוזיה הכיפתית של EWNS באמצעות השיטה שאושרה בעבר.בהנחה של-EWNS המשולבים יש אותו נפח, ניתן לחשב את הקוטר המקביל באמצעות משוואה (2):
בהתבסס על השיטה שפותחה בעבר, נעשה שימוש במלכודת ספין של אלקטרונים (ESR) כדי לזהות נוכחות של תוצרי ביניים רדיקליים קצרי מועד ב-EWNS.אירוסולים הבעבעו דרך 650 מיקרומטר Midget Sparger (Ace Glass, Vineland, NJ) שהכיל תמיסה של 235 mM של DEPMPO(5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) (Oxis International Inc.).פורטלנד, אורגון).כל מדידות ESR בוצעו באמצעות ספקטרומטר Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ארה"ב) ותא שטוח.תוכנת Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, ארה"ב) שימשה לאיסוף ולנתח את הנתונים.קביעת המאפיינים של ה-ROS בוצעה רק עבור מערכת תנאי הפעלה [-6.5 קילו וולט, 4.0 ס"מ].ריכוזי EWNS נמדדו באמצעות SMPS לאחר התחשבות בהפסדי EWNS ב-impor.
רמות האוזון נוטרו באמצעות צג 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
עבור כל מאפייני EWNS, הערך הממוצע משמש כערך המדידה, וסטיית התקן משמשת כשגיאת המדידה.בדיקות T בוצעו כדי להשוות את הערכים של תכונות ה-EWNS הממוטבות עם הערכים המקבילים של ה-EWNS הבסיסי.
איור 2c מציג מערכת "משיכה" של משקעים אלקטרוסטטיים (EPES) שפותחו ומאופיינים בעבר, שיכולה לשמש לאספקה ​​ממוקדת של EWNS על פני השטח.EPES משתמש במטענים EVNS שניתן "להוביל" ישירות אל פני השטח של המטרה בהשפעת שדה חשמלי חזק.פרטים על מערכת EPES מוצגים בפרסום עדכני של Pyrgiotakis et al.11 .לפיכך, EPES מורכב מתא PVC מודפס בתלת מימד עם קצוות מחודדים ומכיל שני לוחות מתכת מקבילים מנירוסטה (304 נירוסטה, מצופה מראה) במרכז במרחק של 15.24 ס"מ זה מזה.הלוחות היו מחוברים למקור מתח גבוה חיצוני (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), הלוח התחתונה תמיד היה מחובר למתח חיובי, והלוח העליון היה מחובר תמיד לאדמה (אדמה צפה).קירות החדר מכוסים ברדיד אלומיניום, אשר מקורקע חשמלית כדי למנוע אובדן חלקיקים.לתא יש דלת טעינה קדמית אטומה המאפשרת להציב משטחי בדיקה על מעמדי פלסטיק שמעלים אותם מעל לוחית המתכת התחתונה כדי למנוע הפרעות מתח גבוה.
יעילות התצהיר של EWNS ב-EPES חושבה על פי פרוטוקול שפותח בעבר המפורט באיור משלים S111.
כתא בקרה, תא זרימה גלילי שני חובר בסדרה למערכת EPES, בה נעשה שימוש במסנן HEPA ביניים להסרת EWNS.כפי שמוצג באיור 2c, אירוסול EWNS נשאב דרך שני תאים מובנים.המסנן בין חדר הבקרה ל-EPES מסיר כל EWNS שנותר וכתוצאה מכך אותה טמפרטורה (T), לחות יחסית (RH) ורמות אוזון.
נמצא כי מיקרואורגניזמים חשובים הנישאים במזון מזהמים מזונות טריים כגון E. coli (ATCC #27325), אינדיקטור צואה, Salmonella enterica (ATCC #53647), פתוגן הנישא במזון, ליסטריה לא מזיקה (ATCC #33090), פונדקאית ל-Listeria monocytogenes פתוגנית, (CCC)ATCAT (CCC) 4098), תחליף לשמרים מקלקלים, וחיידק מומת עמיד יותר, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
קנה קופסאות אקראיות של עגבניות ענבים אורגניות מהשוק המקומי שלך ומקרר ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש (עד 3 ימים).העגבניות הניסיוניות היו כולן באותו גודל, בקוטר של כ-1/2 אינץ'.
פרוטוקולי התרבות, החיסון, החשיפה וספירת המושבות מפורטים בפרסום הקודם שלנו ומפורטים בנתונים המשלימים.היעילות של EWNS הוערכה על ידי חשיפת עגבניות מחוסנות ל-40,000 #/cm3 למשך 45 דקות.בקצרה, שלוש עגבניות שימשו להערכת המיקרואורגניזמים ששרדו בזמן t = 0 דקות.שלוש עגבניות הונחו ב-EPES ונחשפו ל-EWNS ב-40,000 #/cc (EWNS exposed tomatoes) ושלושת הנותרים הונחו בתא הבקרה (עגבניות בקרה).עיבוד נוסף של עגבניות בשתי הקבוצות לא בוצע.עגבניות שנחשפו ל-EWNS ועגבניות בקרה הוסרו לאחר 45 דקות כדי להעריך את ההשפעה של EWNS.
כל ניסוי בוצע בשלושה עותקים.ניתוח הנתונים בוצע על פי הפרוטוקול המתואר בנתונים משלימים.
מנגנוני אי-אקטיבציה הוערכו על ידי שקיעה של דגימות EWNS חשופות (45 דקות בריכוז של 40,000 #/cm3 EWNS אירוסול) ודגימות לא מוקרנות של חיידקים לא מזיקים E. coli, Salmonella enterica ו-Lactobacillus.החלקיקים נקבעו ב-2.5% גלוטאראלדהיד, 1.25% פאראפורמלדהיד ו-0.03% חומצה פיקרית במאגר 0.1 M נתרן קקודילט (pH 7.4) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר הכביסה, לאחר תיקון עם 1% אוסמיום טטרוקסיד (OsO4)/1.5% אשלגן ferrocyanide (KFeCN6) למשך שעתיים, שטפו 3 פעמים במים ודגרו ב- 1% אורניל אצטט למשך שעה, לאחר מכן שטפו פעמיים במים, ולאחר מכן ייבשו פנימה למשך 10%, 0% אלכוהול, 10% אלכוהול, 10%, 0,05 דקות.הדגימות הונחו לאחר מכן בפרופילן אוקסיד למשך שעה אחת והוספו בתערובת 1:1 של תחמוצת פרופילן ו-TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA).הדגימות הוטמעו ב-TAAB Epon ופורמלו ב-60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.השרף הגרגירי שנרפא נחתך והוצג על ידי TEM באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור קונבנציונלי JEOL 1200EX (JEOL, טוקיו, יפן) מצויד במצלמת AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, מסצ'וסטס, ארה"ב).
כל הניסויים בוצעו בשלושה עותקים.עבור כל נקודת זמן, שטיפות חיידקים נזרעו בשלושה עותקים, והביאו לסך של תשע נקודות נתונים לנקודה, שהממוצע שלהן שימש כריכוז החיידקים עבור אותו מיקרואורגניזם מסוים.סטיית התקן שימשה כשגיאת המדידה.כל הנקודות נחשבות.
הלוגריתם של הירידה בריכוז החיידקים בהשוואה ל-t = 0 דקות חושב באמצעות הנוסחה הבאה:
כאשר C0 הוא ריכוז החיידקים בדגימת הבקרה בזמן 0 (כלומר לאחר שהמשטח התייבש אך לפני הנחתם בתא) ו-Cn הוא ריכוז החיידקים על פני השטח לאחר n דקות של חשיפה.
כדי להסביר את השפלה הטבעית של חיידקים במהלך החשיפה של 45 דקות, הפחתה ביומן בהשוואה לבקרה לאחר 45 דקות חושבה גם כך:
כאשר Cn הוא ריכוז החיידקים בדגימת הבקרה בזמן n ו-Cn-Control הוא ריכוז חיידקי הבקרה בזמן n.הנתונים מוצגים כהפחתת יומן בהשוואה לבקרה (ללא חשיפה ל-EWNS).
במהלך המחקר, מספר שילובים של מתח ומרחק בין המחט לאלקטרודת הנגד הוערכו במונחים של היווצרות קונוס טיילור, יציבות קונוס טיילור, יציבות ייצור EWNS ויכולת שחזור.שילובים שונים מוצגים בטבלה משלימה S1.שני מקרים המראים תכונות יציבות וניתנות לשחזור (קונוס טיילור, דור EWNS ויציבות לאורך זמן) נבחרו למחקר מקיף.על איור.איור 3 מציג את התוצאות עבור הטעינה, הגודל והתוכן של ROS בשני המקרים.התוצאות מוצגות גם בטבלה 1. להתייחסות, הן איור 3 והן טבלה 1 כוללות את המאפיינים של ה-EWNS8, 9, 10, 11 (baseline-EWNS) שאינם ממוטבים בעבר.חישובי מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t דו-זנב מתפרסמים מחדש בטבלה משלימה S2.בנוסף, נתונים נוספים כוללים מחקרים על ההשפעה של קוטר חור דגימת אלקטרודה נגדית (D) והמרחק בין אלקטרודת הארקה לקצה (L) (איורים משלימים S2 ו-S3).
(א) התפלגות גודל נמדדת לפי AFM.(df) מאפיין מטען פני השטח.(ז) אפיון ROS של ה-EPR.
חשוב גם לציין כי עבור כל התנאים הנ"ל, זרם היינון הנמדד היה בין 2 ל-6 מיקרומטר ומתח בין -3.8 ל-6.5 קילוואט, וכתוצאה מכך צריכת חשמל של פחות מ-50 mW עבור מודול מגע יחיד זה מדור EWNS.למרות ש-EWNS סונתז בלחץ גבוה, רמות האוזון היו נמוכות מאוד, מעולם לא עלו על 60 ppb.
איור משלים S4 מציג את השדות החשמליים המדומים עבור התרחישים [-6.5 קילו וולט, 4.0 ס"מ] ו-[3.8 קילו וולט, 0.5 ס"מ], בהתאמה.עבור התרחישים [-6.5 קילו וולט, 4.0 ס"מ] ו-[-3.8 קילו וולט, 0.5 ס"מ], חישובי השדה הם 2 × 105 וולט/מ"ר ו-4.7 × 105 וולט/מ"ר, בהתאמה.זה צפוי, מכיוון שבמקרה השני יחס המתח-מרחק גבוה בהרבה.
על איור.3a,b מציג את קוטר EWNS שנמדד עם AFM8.קוטרי ה-EWNS הממוצעים המחושבים היו 27 ננומטר ו-19 ננומטר עבור הסכמות [-6.5 קילו וולט, 4.0 ס"מ] ו-[3.8 קילו וולט, 0.5 ס"מ], בהתאמה.עבור התרחישים [-6.5 קילו וולט, 4.0 ס"מ] ו-[-3.8 קילו וולט, 0.5 ס"מ], סטיות התקן הגיאומטריות של ההתפלגות הן 1.41 ו-1.45, בהתאמה, מה שמצביע על התפלגות גודל צרה.גם הגודל הממוצע וגם סטיית התקן הגיאומטרית קרובים מאוד לקו הבסיס של EWNS, ב-25 ננומטר ו-1.41, בהתאמה.על איור.3c מציג את התפלגות הגודל של הבסיס EWNS שנמדד באותה שיטה באותם תנאים.
על איור.3d,e מציג את התוצאות של אפיון מטען.הנתונים הם מדידות ממוצעות של 30 מדידות בו זמנית של ריכוז (#/cm3) וזרם (I).הניתוח מראה שהטעינה הממוצעת ב-EWNS היא 22 ± 6 e- ו-44 ± 6 e- עבור [-6.5 קילו וולט, 4.0 ס"מ] ו-[-3.8 קילו וולט, 0.5 ס"מ], בהתאמה.יש להם מטענים משטחים גבוהים משמעותית בהשוואה ל-EWNS קו הבסיס (10 ± 2 e-), פי שניים מתרחיש [-6.5 קילו וולט, 4.0 ס"מ] ופי ארבעה מהתרחיש של [-3 .8 קילו וולט, 0.5 ס"מ].איור 3f מציג את המטען.נתונים עבור Baseline-EWNS.
ממפות הריכוז של מספר ה-EWNS (איורים משלימים S5 ו-S6), ניתן לראות שבתרחיש [-6.5 קילו וולט, 4.0 ס"מ] יש הרבה יותר חלקיקים מאשר בתרחיש [-3.8 קילו וולט, 0.5 ס"מ].ראוי גם לציין שריכוז מספר ה-EWNS נוטר עד 4 שעות (איורים משלימים S5 ו-S6), כאשר יציבות יצירת ה-EWNS הראתה את אותן רמות של ריכוז מספר החלקיקים בשני המקרים.
על איור.3g מציג את ספקטרום ה-EPR לאחר חיסור של בקרת ה-EWNS האופטימלית (רקע) ב-[-6.5 קילו וולט, 4.0 ס"מ].ספקטרום ROS הושוו גם עם תרחיש Baseline-EWNS בעבודה שפורסמה בעבר.מספר ה-EWNS המגיבים עם מלכודות ספין חושב להיות 7.5 × 104 EWNS/s, אשר דומה ל-Baseline-EWNS8 שפורסם בעבר.ספקטרום ה-EPR הראה בבירור נוכחות של שני סוגים של ROS, כאשר O2- הוא המין השולט ו-OH• נמצא פחות בשפע.בנוסף, השוואה ישירה של עוצמות השיא הראתה של-EWNS המותאם היה תכולת ROS גבוהה משמעותית בהשוואה ל-EWNS הבסיסי.
על איור.4 מציג את יעילות התצהיר של EWNS ב-EPES.הנתונים מסוכמים גם בטבלה I ומשווים לנתוני EWNS המקוריים.בשני המקרים של EUNS, התצהיר קרוב ל-100% אפילו במתח נמוך של 3.0 קילו וולט.בדרך כלל, 3.0 קילו וולט מספיקים לתצהיר של 100%, ללא קשר לשינוי מטען פני השטח.באותם תנאים, יעילות השקיעה של Baseline-EWNS הייתה רק 56% בשל המטען הנמוך שלהם (ממוצע 10 אלקטרונים לכל EWNS).
על איור.5 ובטבלה.2 מסכם את ערך האינאקטיבציה של מיקרואורגניזמים שחוסנו על פני השטח של עגבניות לאחר חשיפה לכ-40,000 #/cm3 EWNS למשך 45 דקות במצב האופטימלי [-6.5 קילו וולט, 4.0 ס"מ].E. coli ו-Lactobacillus innocuous מחוסנים הראו הפחתה משמעותית של 3.8 לוגים במהלך החשיפה של 45 דקות.באותם תנאים, ל-S. enterica הייתה ירידה של 2.2 לוג, בעוד של-S. cerevisiae ו-M. parafortutum הייתה ירידה של 1.0 לוג.
מיקרוגרפי האלקטרונים (איור 6) מתארים את השינויים הפיזיים שנגרמו על ידי EWNS על תאי Escherichia coli, Streptococcus ו-Lactobacillus שאינם מזיקים המובילים לביטולם.לחיידקי הביקורת היו קרומי תאים שלמים, בעוד שהחיידקים שנחשפו פגעו בממברנות החיצוניות.
הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונית של בקרה וחיידקים חשופים גילתה נזק לממברנה.
הנתונים על המאפיינים הפיזיקו-כימיים של ה-EWNS האופטימליים מראים יחד כי המאפיינים (מטען פני השטח ותכולת ROS) של ה-EWNS שופרו משמעותית בהשוואה לנתוני הבסיס של EWNS שפורסמו בעבר8,9,10,11.מצד שני, הגודל שלהם נשאר בטווח הננומטר, דומה מאוד לתוצאות שדווחו בעבר, מה שמאפשר להם להישאר באוויר לפרקי זמן ארוכים.ניתן להסביר את הפיזור הפולידי שנצפה על ידי שינויים במטען פני השטח שקובעים את גודל ה-EWNS, האקראיות של אפקט ריילי והתלכדות פוטנציאלית.עם זאת, כפי שפורט על ידי Nielsen et al.22, מטען פני שטח גבוה מפחית את האידוי על ידי הגדלת יעילה של אנרגיית פני השטח/מתח של טיפת המים.בפרסום הקודם שלנו8 תיאוריה זו אושרה ניסיוני עבור מיקרוטיפות 22 ו-EWNS.אובדן מטען במהלך שעות נוספות יכול גם להשפיע על הגודל ולתרום להתפלגות הגדלים הנצפית.