תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים כוללת תמיכה מוגבלת ב-CSS. לחוויית המשתמש הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נציג את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.
קרוסלה המציגה שלוש שקופיות בו זמנית. השתמשו בכפתורים הקודם והבא כדי לעבור בין שלוש שקופיות בו זמנית, או השתמשו בכפתורי המחוון בסוף כדי לעבור בין שלוש שקופיות בו זמנית.
לאחרונה פותחה פלטפורמה אנטי-מיקרוביאלית נטולת כימיקלים המבוססת על ננוטכנולוגיה המשתמשת בננו-מבנים מלאכותיים של מים (EWNS). ל-EWNS מטען פני השטח גבוה והם רוויים במיני חמצן ריאקטיביים (ROS) שיכולים לתקשר עם מספר מיקרואורגניזמים ולנטרל אותם, כולל פתוגנים הנישאים במזון. כאן מוכח כי ניתן לכוונן ולמטב את תכונותיהם במהלך הסינתזה כדי לשפר עוד יותר את הפוטנציאל האנטיבקטריאלי שלהם. פלטפורמת המעבדה של EWNS תוכננה לכוונן את תכונות ה-EWNS על ידי שינוי פרמטרי הסינתזה. אפיון תכונות EWNS (מטען, גודל ותכולת ROS) באמצעות שיטות אנליטיות מודרניות. בנוסף, הם הוערכו מבחינת פוטנציאל ההשבתה המיקרוביאלית שלהם כנגד מיקרואורגניזמים הנישאים במזון כגון Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum ו-Saccharomyces cerevisiae. התוצאות המוצגות כאן מראות כי ניתן לכוונן את תכונות ה-EWNS במהלך הסינתזה, וכתוצאה מכך לעלייה אקספוננציאלית ביעילות ההשבתה. בפרט, מטען פני השטח גדל פי ארבעה ומיני החמצן הריאקטיביים גדלו. קצב הסרת המיקרוביאלים היה תלוי מיקרוביאלית ונע בין 1.0 ל-3.8 לוגריתמים לאחר חשיפה של 45 דקות למינון אירוסול של 40,000 #/cc EWNS.
זיהום מיקרוביאלי הוא הגורם העיקרי למחלות הנישאות במזון הנגרמות על ידי בליעת פתוגנים או רעלנים שלהם. בארצות הברית לבדה, מחלות הנישאות במזון גורמות לכ-76 מיליון מחלות, 325,000 אשפוזים ו-5,000 מקרי מוות מדי שנה. בנוסף, משרד החקלאות של ארצות הברית (USDA) מעריך כי צריכה מוגברת של תוצרת טרייה אחראית ל-48% מכלל המחלות הנישאות במזון המדווחות בארצות הברית. עלות המחלות והמוות הנגרמים מפתוגנים הנישאים במזון בארצות הברית גבוהה מאוד, ומוערכת על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC) ביותר מ-15.6 מיליארד דולר בשנה.
נכון לעכשיו, התערבויות כימיות4, קרינה5 ותרמיות6 אנטי-מיקרוביאליות להבטחת בטיחות המזון מתבצעות בעיקר בנקודות בקרה קריטיות (CCP) מוגבלות לאורך שרשרת הייצור (בדרך כלל לאחר הקציר ו/או במהלך האריזה) ולא באופן רציף. לכן, הן נוטות לזיהום צולב. 7. שליטה טובה יותר במחלות הנישאות במזון ובקלקול מזון דורשת התערבויות אנטי-מיקרוביאליות שניתן ליישם אותן על פני כל הרצף מהחווה לשולחן, תוך הפחתת ההשפעה הסביבתית והעלויות.
לאחרונה פותחה פלטפורמה אנטי-מיקרוביאלית נטולת כימיקלים, מבוססת ננוטכנולוגיה, שיכולה להשבית חיידקים על פני השטח ובאוויר באמצעות ננו-מבנים מלאכותיים של מים (EWNS). EWNS סונתז באמצעות שני תהליכים מקבילים, אלקטרוספרייס ויינון מים (איור 1א'). מחקרים קודמים הראו כי ל-EWNS יש סט ייחודי של תכונות פיזיקליות וביולוגיות8,9,10. ל-EWNS יש בממוצע 10 אלקטרונים לכל מבנה וגודל ננומטרי ממוצע של 25 ננומטר (איור 1ב',ג')8,9,10. בנוסף, תהודה של ספין אלקטרונים (ESR) הראתה כי EWNS מכיל כמות גדולה של מיני חמצן ריאקטיביים (ROS), בעיקר רדיקלים של הידרוקסיל (OH•) וסופראוקסיד (O2-) (איור 1ג')8. EVNS נמצא באוויר במשך זמן רב ויכול להתנגש במיקרואורגניזמים התלויים באוויר ונמצאים על פני השטח, תוך אספקת מטען ה-ROS שלהם וגרימת להשביתה של מיקרואורגניזמים (איור 1ד'). מחקרים מוקדמים אלה הראו גם כי EWNS יכול לתקשר ולנטרל חיידקים שונים של גרם-שליליים וגרם-חיוביים, כולל מיקובקטריה, על משטחים ובאוויר. מיקרוסקופ אלקטרונים חודר הראתה כי ההשבתה נגרמה עקב שיבוש קרום התא. בנוסף, מחקרי שאיפה חריפה הראו כי מינונים גבוהים של EWNS אינם גורמים נזק לריאות או דלקת 8.
(א) אלקטרוספרייס מתרחש כאשר מופעל מתח גבוה בין צינור קפילרי המכיל נוזל לבין אלקטרודה נגדית. (ב) הפעלת לחץ גבוה גורמת לשתי תופעות שונות: (i) אלקטרוספרייס של מים ו-(ii) היווצרות של מיני חמצן ריאקטיביים (יונים) הלכודים בתוך ה-EWNS. (ג) המבנה הייחודי של EWNS. (ד) בשל אופיים הננומטרי, EWNS ניידים מאוד ויכולים לתקשר עם פתוגנים הנישאים באוויר.
לאחרונה הודגמה גם יכולתה של פלטפורמת האנטי-מיקרוביאלית EWNS להשבית מיקרואורגניזמים הנישאים במזון על פני השטח של מזון טרי. כמו כן, הוכח כי ניתן להשתמש במטען פני השטח של EWNS בשילוב עם שדה חשמלי כדי להשיג אספקה ​​ממוקדת. יתר על כן, תוצאות ראשוניות עבור עגבניות אורגניות לאחר חשיפה של 90 דקות ב-EWNS של כ-50,000 #/cm3 היו מעודדות, כאשר נצפו מיקרואורגניזמים שונים הנישאים במזון כגון E. coli ו- Listeria 11. בנוסף, בדיקות אורגנולפטיות ראשוניות לא הראו השפעות חושיות בהשוואה לעגבניות ביקורת. למרות שתוצאות ההשבתה הראשוניות הללו מעודדות עבור יישומי בטיחות מזון אפילו במינונים נמוכים מאוד של EWNS של 50,000 #/cc.2, ברור שפוטנציאל השבתה גבוה יותר יהיה מועיל יותר להפחתה נוספת של הסיכון לזיהום וקלקול.
כאן, נתמקד במחקר שלנו בפיתוח פלטפורמת יצירת EWNS שתאפשר כוונון עדין של פרמטרי הסינתזה ואופטימיזציה של התכונות הפיזיקוכימיות של EWNS כדי לשפר את הפוטנציאל האנטיבקטריאלי שלהם. בפרט, האופטימיזציה התמקדה בהגדלת מטען השטח שלהם (לשיפור המסירה הממוקדת) ותכולת ה-ROS (לשיפור יעילות ההשבתה). אפיון תכונות פיזיקוכימיות אופטימליות (גודל, מטען ותכולת ROS) באמצעות שיטות אנליטיות מודרניות ושימוש במיקרואורגניזמים נפוצים במזון כגון E. .
EVNS סונתז על ידי ריסוס אלקטרוני ויוניזציה בו-זמנית של מים בעלי טוהר גבוה (18 MΩ cm–1). המנבולייזר החשמלי 12 משמש בדרך כלל לאטומיזציה של נוזלים ולסינתזה של חלקיקים פולימריים וקרמיים 13 וסיבים 14 בגודל מבוקר.
כפי שפורט בפרסומים קודמים 8, 9, 10, 11, בניסוי טיפוסי, הוחל מתח גבוה בין נימי מתכת לאלקטרודה נגדית מוארקת. במהלך תהליך זה מתרחשות שתי תופעות שונות: i) אלקטרוספרייס ו-ii) יינון מים. שדה חשמלי חזק בין שתי האלקטרודות גורם להצטברות מטענים שליליים על פני המים המעובה, וכתוצאה מכך להיווצרות חרוטי טיילור. כתוצאה מכך, נוצרות טיפות מים טעונות מאוד, אשר ממשיכות להתפרק לחלקיקים קטנים יותר, כמו בתורת ריילי16. במקביל, שדות חשמליים חזקים גורמים לחלק מהמולקולות מים להתפצל ולקלוט אלקטרונים (ליינן), מה שמוביל להיווצרות כמות גדולה של מיני חמצן פעילים (ROS)17. ROS18 שנוצר בו זמנית נבלע ב-EWNS (איור 1c).
איור 2א' מציג את מערכת ייצור ה-EWNS שפותחה ושימשה בסינתזת ה-EWNS במחקר זה. מים מטוהרים המאוחסנים בבקבוק סגור הוזרמו דרך צינור טפלון (קוטר פנימי 2 מ"מ) לתוך מחט נירוסטה 30G (נימי מתכת). זרימת המים נשלטת על ידי לחץ האוויר בתוך הבקבוק, כפי שמוצג באיור 2ב'. המחט מורכבת על קונסולת טפלון וניתן לכוונן אותה ידנית למרחק מסוים מהאלקטרודה הנגדית. האלקטרודה הנגדית היא דיסק אלומיניום מלוטש עם חור במרכז לדגימה. מתחת לאלקטרודה הנגדית נמצא משפך דגימה מאלומיניום, המחובר לשאר מערך הניסוי באמצעות פתח דגימה (איור 2ב'). כדי למנוע הצטברות מטען שעלולה לשבש את פעולת הדוגם, כל רכיבי הדוגם מחוברים להארקה חשמלית.
(א) מערכת יצירת ננו-מבנים מהונדסת למים (EWNS). (ב) חתך רוחב של הדוגם והתרסיס האלקטרו-ספריי, המציג את הפרמטרים החשובים ביותר. (ג) מערך ניסויי לאינטאקטיבציה של חיידקים.
מערכת יצירת ה-EWNS שתוארה לעיל מסוגלת לשנות פרמטרי הפעלה מרכזיים כדי להקל על כוונון עדין של תכונות ה-EWNS. יש להתאים את המתח המופעל (V), את המרחק בין המחט לאלקטרודה הנגדית (L), ואת זרימת המים (φ) דרך הקפילר כדי לכוונן את מאפייני ה-EWNS. סמל המשמש לייצוג צירופים שונים: [V (kV), L (cm)]. יש להתאים את זרימת המים כדי לקבל חרוט טיילור יציב של קבוצה מסוימת [V, L]. למטרות מחקר זה, קוטר הפתח של האלקטרודה הנגדית (D) נשמר על 0.5 אינץ' (1.29 ס"מ).
בשל הגיאומטריה המוגבלת והאסימטריה, לא ניתן לחשב את עוצמת השדה החשמלי מעקרונות ראשוניים. במקום זאת, נעשה שימוש בתוכנת QuickField™ (סוונדבורג, דנמרק)19 לחישוב השדה החשמלי. השדה החשמלי אינו אחיד, ולכן ערך השדה החשמלי בקצה הקפילר שימש כערך ייחוס עבור תצורות שונות.
במהלך המחקר, הוערכו מספר שילובים של מתח ומרחק בין המחט לאלקטרודה הנגדית במונחים של היווצרות חרוט טיילור, יציבות חרוט טיילור, יציבות ייצור EWNS ושחזור. שילובים שונים מוצגים בטבלה המשלימה S1.
הפלט של מערכת ייצור ה-EWNS חובר ישירות למנתח גודל חלקיקים Scanning Mobility (SMPS, דגם 3936, TSI, Shoreview, MN) למדידת ריכוז מספר החלקיקים, וכן למדידת אלקטרומטר פאראדיי אירוסול (TSI, דגם 3068B, Shoreview, MN). ) עבור זרמי אירוסול נמדד כמתואר בפרסום הקודם שלנו. גם ה-SMPS וגם האלקטרומטר האירוסול דגמו בקצב זרימה של 0.5 ליטר/דקה (סך זרימת הדגימה 1 ליטר/דקה). מספר ריכוז החלקיקים וזרימת האירוסול נמדדו במשך 120 שניות. המדידה חוזרת על עצמה 30 פעמים. בהתבסס על מדידות הזרם, מחושב מטען האירוסול הכולל ומטען ה-EWNS הממוצע מוערך עבור מספר כולל נתון של חלקיקי EWNS שנבחרו. ניתן לחשב את העלות הממוצעת של EWNS באמצעות משוואה (1):
כאשר IEl הוא הזרם הנמדד, NSMPS הוא הריכוז הדיגיטלי הנמדד באמצעות ה-SMPS, ו-φEl הוא קצב הזרימה לכל אלקטרומטר.
מכיוון שהלחות היחסית (RH) משפיעה על מטען פני השטח, הטמפרטורה וה-(RH) נשמרו קבועות במהלך הניסוי על 21°C ו-45%, בהתאמה.
מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM), ‏Asylum MFP-3D (Asylum Research, סנטה ברברה, קליפורניה) וגשש AC260T (Olympus, טוקיו, יפן) שימשו למדידת גודל ומשך החיים של ה-EWNS. תדר הסריקה של ה-AFM היה 1 הרץ, שטח הסריקה היה 5 מיקרומטר × 5 מיקרומטר, ו-256 קווי סריקה. כל התמונות עברו יישור תמונה מסדר ראשון באמצעות תוכנת Asylum (טווח מסכה 100 ננומטר, סף 100 מיקרומטר).
משפך הבדיקה הוסר ומשטח הנציץ הונח במרחק של 2.0 ס"מ מהאלקטרודה הנגדית למשך זמן ממוצע של 120 שניות כדי למנוע הצטברות חלקיקים והיווצרות טיפות לא סדירות על פני הנציץ. EWNS רוסס ישירות על פני השטח של נציץ טרי שנחתך (Ted Pella, Redding, CA). תמונה של פני השטח של הנציץ מיד לאחר התזה באמצעות AFM. זווית המגע של פני השטח של נציץ טרי שנחתך ולא עבר שינוי קרובה ל-0°, כך ש-EVNS מפוזר על פני השטח של הנציץ בצורת כיפה. הקוטר (a) והגובה (h) של הטיפות המפוזרות נמדדו ישירות מטופוגרפיית AFM ושימשו לחישוב נפח הדיפוזיה הכיפתי של EWNS באמצעות השיטה שאושרה בעבר. בהנחה של-EWNS המובנה יש נפח זהה, ניתן לחשב את הקוטר המקביל באמצעות משוואה (2):
בהתבסס על השיטה שפיתחנו בעבר, נעשה שימוש במלכודת ספין של תהודה ספין אלקטרונית (ESR) כדי לזהות נוכחות של תוצרי ביניים רדיקליים קצרי מועד ב-EWNS. אירוסולים הוזרקו דרך מתקן Midget בנפח 650 מיקרומטר (Ace Glass, Vineland, NJ) המכיל תמיסה של 235 mM של DEPMPO(5-(diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide) (Oxis International Inc.). פורטלנד, אורגון). כל מדידות ה-ESR בוצעו באמצעות ספקטרומטר Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) ותא שטוח. תוכנת Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) שימשה לאיסוף וניתוח הנתונים. קביעת מאפייני ה-ROS בוצעה רק עבור קבוצת תנאי הפעלה [-6.5 kV, 4.0 cm]. ריכוזי EWNS נמדדו באמצעות SMPS לאחר התחשבות בהפסדי EWNS במפקח.
רמות האוזון נוטרו באמצעות מכשיר מדידת אוזון 205 Dual Beam™ (2B Technologies, בולדר, קולורדו)8,9,10.
עבור כל מאפייני ה-EWNS, הערך הממוצע משמש כערך המדידה, וסטיית התקן משמשת כשגיאת המדידה. בוצעו מבחני T כדי להשוות את ערכי מאפייני ה-EWNS המותאמים לערכים המתאימים של ה-EWNS הבסיסי.
איור 2c מציג מערכת "משיכה" של משקעים אלקטרוסטטיים (EPES) שפותחה ואופיינה בעבר, שניתן להשתמש בה לצורך אספקה ​​ממוקדת של EWNS אל פני השטח. EPES משתמש במטענים של EVNS שניתן "להדריך" ישירות אל פני השטח של המטרה תחת השפעת שדה חשמלי חזק. פרטים על מערכת EPES מוצגים בפרסום שפורסם לאחרונה על ידי Pyrgiotakis et al. 11. לפיכך, EPES מורכבת מתא PVC מודפס בתלת-ממד עם קצוות מחודדים ומכיל שתי לוחות מתכת מקבילים מפלדת אל-חלד (פלדת אל-חלד 304, מצופה מראה) במרכז, במרחק של 15.24 ס"מ זו מזו. הלוחות חוברו למקור מתח גבוה חיצוני (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), הלוח התחתון היה מחובר תמיד למתח חיובי, והלוח העליון היה מחובר תמיד לאדמה (קרקע צפה). דפנות התא מכוסות בנייר אלומיניום, המקורקע חשמלית כדי למנוע אובדן חלקיקים. לתא דלת טעינה קדמית אטומה המאפשרת להניח את משטחי הבדיקה על מעמדים מפלסטיק המגביהים אותם מעל לוח המתכת התחתון כדי למנוע הפרעות מתח גבוה.
יעילות השיקוע של EWNS ב-EPES חושבה לפי פרוטוקול שפותח קודם לכן, המפורט באיור המשלים S111.
כתא בקרה, תא זרימה גלילי שני חובר בטור למערכת EPES, שבו נעשה שימוש במסנן HEPA ביניים להסרת EWNS. כפי שמוצג באיור 2c, תרסיס ה-EWNS נשאב דרך שני תאים מובנים. המסנן בין חדר הבקרה ל-EPES מסיר כל EWNS שנותר, וכתוצאה מכך רמות הטמפרטורה (T), הלחות היחסית (RH) ורמות האוזון זהות.
נמצא כי מיקרואורגניזמים חשובים הנישאים במזון מזהמים מזונות טריים כגון E. coli (ATCC #27325), אינדיקטור צואה, סלמונלה enterica (ATCC #53647), פתוגן הנישא במזון, Listeria harmless (ATCC #33090), תחליף ל- Listeria monocytogenes הפתוגנית, שמקורו ב- Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098) ב-ATCC (Manassas, VA), תחליף לשמרים מקלקלים, וחיידק מומת עמיד יותר, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
קנו קופסאות אקראיות של עגבניות שרי אורגניות מהשוק המקומי שלכם ושמרו במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש (עד 3 ימים). כל העגבניות הניסיוניות היו באותו גודל, בקוטר של כ-1.5 ס"מ.
פרוטוקולי התרבית, ההזרקה, החשיפה וספירת המושבות מפורטים בפרסום הקודם שלנו ומפורטים בנתונים המשלימים. יעילות ה-EWNS הוערכה על ידי חשיפת עגבניות מחוסנות ל-40,000 #/cm3 למשך 45 דקות. בקצרה, שלוש עגבניות שימשו להערכת המיקרואורגניזמים ששרדו בזמן t = 0 דקות. שלוש עגבניות הונחו ב-EPES ונחשפו ל-EWNS ב-40,000 #/cc (עגבניות שנחשפו ל-EWNS) ושלוש הנותרות הונחו בתא הבקרה (עגבניות הבקרה). עיבוד נוסף של העגבניות בשתי הקבוצות לא בוצע. עגבניות שנחשפו ל-EWNS ועגבניות הבקרה הוסרו לאחר 45 דקות כדי להעריך את השפעת ה-EWNS.
כל ניסוי בוצע בשלושה עותקים. ניתוח הנתונים בוצע בהתאם לפרוטוקול המתואר בנתונים המשלימים.
מנגנוני השבתה הוערכו על ידי שקיעת דגימות EWNS חשופות (45 דקות בריכוז אירוסול EWNS של 40,000 #/cm³) ודגימות לא מוקרנות של חיידקים לא מזיקים E. coli, סלמונלה אנטריקה ולקטובצילוס. החלקיקים קובעו ב-2.5% גלוטראלדהיד, 1.25% פאראפורמלדהיד ו-0.03% חומצה פיקרית בבופר נתרן קקודילאט 0.1 M (pH 7.4) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר. לאחר השטיפה, קובעו לאחר מכן עם 1% אוסמיום טטרוקסיד (OsO4)/1.5% אשלגן פרוציאניד (KFeCN6) למשך שעתיים, שטפו 3 פעמים במים ודגרו ב-1% אורניל אצטט למשך שעה, לאחר מכן שטפו פעמיים במים, ולאחר מכן התייבשו למשך 10 דקות ב-50%, 70%, 90%, 100% אלכוהול. לאחר מכן הונחו הדגימות בפרופילן אוקסיד למשך שעה אחת והוספגו בתערובת ביחס של 1:1 של פרופילן אוקסיד ו-TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). הדגימות הוטבעו ב-TAAB Epon ועברו פולימריזציה ב-60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. השרף הגרגירי שהוקשה נחתך והוצג באמצעות TEM באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר קונבנציונלי JEOL 1200EX (JEOL, טוקיו, יפן) המצויד במצלמת CCD AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
כל הניסויים בוצעו בשלושה עותקים. עבור כל נקודת זמן, שטיפות חיידקים נזרעו בשלושה עותקים, וכתוצאה מכך נתקבלו תשע נקודות נתונים בסך הכל לכל נקודה, כאשר הממוצע שלהן שימש כריכוז החיידקים עבור אותו מיקרואורגניזם מסוים. סטיית התקן שימשה כטעות המדידה. כל הנקודות נחשבות.
הלוגריתם של הירידה בריכוז החיידקים בהשוואה ל-t = 0 דקות חושב באמצעות הנוסחה הבאה:
כאשר C0 הוא ריכוז החיידקים בדגימת הביקורת בזמן 0 (כלומר, לאחר שהמשטח התייבש אך לפני הכנסתו לתא) ו-Cn הוא ריכוז החיידקים על פני השטח לאחר n דקות של חשיפה.
כדי להתחשב בפירוק הטבעי של חיידקים במהלך החשיפה של 45 דקות, חושבה גם הפחתת הלוגריתם בהשוואה לקבוצת הביקורת לאחר 45 דקות באופן הבא:
כאשר Cn הוא ריכוז החיידקים בדגימת הבקרה בזמן n ו-Cn-Control הוא ריכוז חיידקי הבקרה בזמן n. הנתונים מוצגים כהפחתה לוגריתמית בהשוואה לביקורת (ללא חשיפה ל-EWNS).
במהלך המחקר, הוערכו מספר שילובים של מתח ומרחק בין המחט לאלקטרודת הנגד מבחינת היווצרות חרוט טיילור, יציבות חרוט טיילור, יציבות ייצור EWNS ושחזור. שילובים שונים מוצגים בטבלה המשלימה S1. שני מקרים המציגים תכונות יציבות ושחזוריות (חרוט טיילור, יצירת EWNS ויציבות לאורך זמן) נבחרו למחקר מקיף. באיור 3, איור 3 מציג את התוצאות עבור המטען, הגודל ותכולת ה-ROS בשני המקרים. התוצאות מוצגות גם בטבלה 1. לעיון, גם איור 3 וגם טבלה 1 כוללים את התכונות של EWNS8, 9, 10, 11 שסונתזו בעבר ולא אופטימליים (EWNS בסיסי). חישובי מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן t דו-צדדי מתפרסמים מחדש בטבלה המשלימה S2. בנוסף, נתונים נוספים כוללים מחקרים על השפעת קוטר חור הדגימה של אלקטרודת הנגד (D) והמרחק בין אלקטרודת ההארקה לקצה (L) (איורים משלימים S2 ו-S3).
(ac) התפלגות גודל שנמדדה על ידי AFM. (df) מאפיין מטען פני השטח. (g) אפיון ROS של ה-EPR.
חשוב גם לציין כי עבור כל התנאים הנ"ל, זרם היינון שנמדד היה בין 2 ל-6 מיקרואמפר והמתח בין -3.8 ל- -6.5 קילו-וולט, וכתוצאה מכך צריכת חשמל של פחות מ-50 מיליוואט עבור מודול מגע יחיד זה של EWNS. למרות ש-EWNS סונתז בלחץ גבוה, רמות האוזון היו נמוכות מאוד, ומעולם לא עברו את 60 ppb.
איור משלים S4 מציג את השדות החשמליים המדומים עבור התרחישים [-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ] ו-[-3.8 קילו-וולט, 0.5 ס"מ], בהתאמה. עבור התרחישים [-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ] ו-[-3.8 קילו-וולט, 0.5 ס"מ], חישובי השדה הם 2 × 105 וולט/מטר ו-4.7 × 105 וולט/מטר, בהתאמה. זה צפוי, שכן במקרה השני יחס המתח-מרחק גבוה בהרבה.
איור 3א', 3ב' מציג את קוטר ה-EWNS שנמדד באמצעות ה-AFM8. קוטרי ה-EWNS הממוצעים המחושבים היו 27 ננומטר ו-19 ננומטר עבור התרחישים [-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ] ו-[-3.8 קילו-וולט, 0.5 ס"מ], בהתאמה. עבור התרחישים [-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ] ו-[-3.8 קילו-וולט, 0.5 ס"מ], סטיית התקן הגיאומטרית של ההתפלגויות הן 1.41 ו-1.45, בהתאמה, דבר המצביע על התפלגות גודל צר. גם הגודל הממוצע וגם סטיית התקן הגיאומטרית קרובים מאוד ל-EWNS הבסיסי, ב-25 ננומטר ו-1.41, בהתאמה. איור 3ג' מציג את התפלגות הגודל של ה-EWNS הבסיסי שנמדד באותה שיטה באותם תנאים.
באיור 3ד', ה' מציגים את תוצאות אפיון המטען. הנתונים הם מדידות ממוצעות של 30 מדידות בו-זמניות של ריכוז (#/cm3) וזרם (I). הניתוח מראה כי המטען הממוצע על ה-EWNS הוא 22 ± 6 e- ו-44 ± 6 e- עבור [-6.5 kV, 4.0 cm] ו-[-3.8 kV, 0.5 cm], בהתאמה. יש להם מטענים גבוהים משמעותית על פני השטח בהשוואה ל-EWNS בסיסיים (10 ± 2 e-), פי שניים מתרחיש [-6.5 kV, 4.0 cm] ופי ארבעה מתרחיש [-3.8 kV, 0.5 cm]. איור 3ו' מציג את נתוני המטען עבור EWNS בסיסיים.
ממפות הריכוזים של מספר ה-EWNS (איורים משלימים S5 ו-S6), ניתן לראות כי בתרחיש [-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ] יש יותר חלקיקים באופן משמעותי מאשר בתרחיש [-3.8 קילו-וולט, 0.5 ס"מ]. כמו כן, ראוי לציין כי ריכוז מספר ה-EWNS נוטר עד 4 שעות (איורים משלימים S5 ו-S6), כאשר יציבות יצירת ה-EWNS הראתה את אותן רמות של ריכוז מספר חלקיקים בשני המקרים.
איור 3g מציג את ספקטרום ה-EPR לאחר חיסור בקרת ה-EWNS הממוטבת (רקע) ב-[-6.5 קילו-וולט, 4.0 ס"מ]. ספקטרום ה-ROS הושווה גם לתרחיש Baseline-EWNS בעבודה שפורסמה בעבר. מספר ה-EWNS המגיבים עם מלכודות ספין חושב כ-7.5 × 104 EWNS/s, בדומה ל-Baseline-EWNS8 שפורסם בעבר. ספקטרום ה-EPR הראה בבירור את נוכחותם של שני סוגים של ROS, כאשר O2- הוא המין השולט ו-OH• פחות שופע. בנוסף, השוואה ישירה של עוצמות השיא הראתה כי ל-EWNS הממוטבת הייתה תכולת ROS גבוהה משמעותית בהשוואה ל-EWNS הבסיסי.
איור 4 מציג את יעילות השיקוע של EWNS ב-EPES. הנתונים מסוכמים גם בטבלה I ומושווים לנתוני EWNS המקוריים. עבור שני המקרים של EUNS, השיקוע קרוב ל-100% אפילו במתח נמוך של 3.0 קילו-וולט. בדרך כלל, 3.0 קילו-וולט מספיקים לשיקוע של 100%, ללא קשר לשינוי מטען פני השטח. באותם תנאים, יעילות השיקוע של Baseline-EWNS הייתה רק 56% עקב המטען הנמוך יותר שלהם (ממוצע של 10 אלקטרונים לכל EWNS).
באיור 5 ובטבלה 2 מסכם את ערך האינאקטיבציה של מיקרואורגניזמים שהוזרקו על פני השטח של עגבניות לאחר חשיפה לכ-40,000 #/cm3 EWNS למשך 45 דקות במצב אופטימלי [-6.5 kV, 4.0 cm]. חיידקי E. coli ו-Lactobacillus innocuous שהוזרקו הראו ירידה משמעותית של 3.8 log במהלך חשיפה של 45 דקות. באותם תנאים, ל-S. enterica הייתה ירידה של 2.2 log, בעוד של-S. cerevisiae ו-M. parafortutum הייתה ירידה של 1.0 log.
מיקרוסקופי האלקטרונים (איור 6) מתארים את השינויים הפיזיים שנגרמו על ידי EWNS על תאי Escherichia coli, Streptococcus ו-Lactobacillus בלתי מזיקים, מה שגרם להשבתתם. לחיידקי הביקורת היו קרומי תאים שלמים, בעוד שלחיידקים שנחשפו היו קרומים חיצוניים פגומים.
הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים של חיידקי בקרה וחיידקים שנחשפו גילתה נזק לממברנה.
הנתונים על התכונות הפיזיקוכימיות של טיפות המים האופטימליות (EWNS) מראים יחד כי התכונות (מטען פני השטח ותכולת ROS) של ה-EWNS השתפרו משמעותית בהשוואה לנתוני הבסיס של ה-EWNS שפורסמו בעבר8,9,10,11. מצד שני, גודלם נותר בטווח הננומטרי, בדומה מאוד לתוצאות שדווחו בעבר, מה שאפשר להם להישאר באוויר לפרקי זמן ארוכים. ניתן להסביר את הפיבריזיות הנצפית על ידי שינויים במטען פני השטח הקובעים את גודל ה-EWNS, האקראיות של אפקט ריילי ופוטנציאל ההתלכדות. עם זאת, כפי שפורט על ידי נילסן ואחרים.22, מטען פני השטח גבוה מפחית אידוי על ידי הגדלה יעילה של אנרגיית/מתח פני השטח של טיפת המים. בפרסום הקודם שלנו8 תיאוריה זו אושרה בניסוי עבור מיקרו-טיפות22 ו-EWNS. אובדן מטען במהלך זמן נוסף יכול גם להשפיע על הגודל ולתרום להתפלגות הגודל הנצפית.