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Recentemente, foi desenvolvida uma plataforma antimicrobiana livre de produtos químicos baseada em nanotecnologia usando nanoestruturas de água artificial (EWNS).EWNS têm uma alta carga de superfície e estão saturados com espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem interagir e inativar uma série de microorganismos, incluindo patógenos de origem alimentar.Aqui é mostrado que suas propriedades durante a síntese podem ser ajustadas e otimizadas para aumentar ainda mais seu potencial antibacteriano.A plataforma de laboratório EWNS foi projetada para ajustar as propriedades do EWNS alterando os parâmetros de síntese.Caracterização das propriedades EWNS (carga, tamanho e conteúdo de ROS) usando métodos analíticos modernos.Além disso, eles foram avaliados quanto ao seu potencial de inativação microbiana contra microrganismos de origem alimentar, como Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria inócua, Mycobacterium paraaccidentum e Saccharomyces cerevisiae.Os resultados aqui apresentados demonstram que as propriedades de EWNS podem ser ajustadas durante a síntese, resultando em um aumento exponencial na eficiência de inativação.Em particular, a carga de superfície aumentou por um fator de quatro e as espécies reativas de oxigênio aumentaram.A taxa de remoção microbiana foi microbiana dependente e variou de 1,0 a 3,8 log após uma exposição de 45 minutos a uma dose de aerossol de 40.000 #/cc EWNS.
A contaminação microbiana é a principal causa de doenças transmitidas por alimentos causadas pela ingestão de patógenos ou suas toxinas.Somente nos Estados Unidos, as doenças transmitidas por alimentos causam cerca de 76 milhões de doenças, 325.000 internações hospitalares e 5.000 mortes a cada ano1.Além disso, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) estima que o aumento do consumo de produtos frescos é responsável por 48% de todas as doenças transmitidas por alimentos relatadas nos Estados Unidos2.O custo das doenças e mortes causadas por patógenos transmitidos por alimentos nos Estados Unidos é muito alto, estimado pelo Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) em mais de US$ 15,6 bilhões por ano3.
Atualmente, as intervenções antimicrobianas químicas4, de radiação5 e térmicas6 para garantir a segurança alimentar são realizadas principalmente em pontos críticos de controle limitados (CCPs) ao longo da cadeia de produção (geralmente após a colheita e/ou durante a embalagem), em vez de continuamente.assim, eles são propensos a contaminação cruzada.7. Um melhor controle das doenças transmitidas por alimentos e da deterioração dos alimentos requer intervenções antimicrobianas que podem potencialmente ser aplicadas em todo o continuum da fazenda à mesa, reduzindo o impacto ambiental e os custos.
Recentemente, foi desenvolvida uma plataforma antimicrobiana livre de produtos químicos e baseada em nanotecnologia que pode inativar bactérias de superfície e transportadas pelo ar usando nanoestruturas artificiais de água (EWNS).EWNS foi sintetizado usando dois processos paralelos, eletrospray e ionização de água (Fig. 1a).Estudos anteriores mostraram que EWNS têm um conjunto único de propriedades físicas e biológicas8,9,10.EWNS tem uma média de 10 elétrons por estrutura e um tamanho médio em nanoescala de 25 nm (Fig. 1b,c)8,9,10.Além disso, a ressonância de spin eletrônico (ESR) mostrou que EWNS contém uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS), principalmente radicais hidroxila (OH•) e superóxido (O2-) (Fig. 1c)8.O EVNS fica no ar por muito tempo e pode colidir com microorganismos suspensos no ar e presentes na superfície, liberando sua carga útil de ROS e causando a inativação de microorganismos (Fig. 1d).Esses estudos iniciais também mostraram que o EWNS pode interagir e inativar várias bactérias gram-negativas e gram-positivas, incluindo micobactérias, em superfícies e no ar.A microscopia eletrônica de transmissão mostrou que a inativação foi causada pelo rompimento da membrana celular.Além disso, estudos de inalação aguda demonstraram que altas doses de EWNS não causam dano ou inflamação pulmonar 8 .
(a) Electrospray ocorre quando uma alta voltagem é aplicada entre um tubo capilar contendo líquido e um contra eletrodo.(b) A aplicação de alta pressão resulta em dois fenômenos diferentes: (i) eletropulverização de água e (ii) formação de espécies reativas de oxigênio (íons) aprisionadas no EWNS.(c) A estrutura única da EWNS.(d) Devido à sua natureza em nanoescala, EWNS são altamente móveis e podem interagir com patógenos transportados pelo ar.
A capacidade da plataforma antimicrobiana EWNS de inativar microorganismos de origem alimentar na superfície de alimentos frescos também foi recentemente demonstrada.Também foi demonstrado que a carga de superfície de EWNS em combinação com um campo elétrico pode ser usada para atingir a entrega direcionada.Além disso, os resultados preliminares para tomates orgânicos após uma exposição de 90 minutos a um EWNS de cerca de 50.000 #/cm3 foram encorajadores, com vários microrganismos de origem alimentar, como E. coli e Listeria 11 observados.Além disso, os testes organolépticos preliminares não mostraram efeitos sensoriais em comparação com os tomates de controle.Embora esses resultados iniciais de inativação sejam encorajadores para aplicações de segurança alimentar, mesmo em doses muito baixas de EWNS de 50.000 #/cc.veja, é claro que um maior potencial de inativação seria mais benéfico para reduzir ainda mais o risco de infecção e deterioração.
Aqui, vamos concentrar nossa pesquisa no desenvolvimento de uma plataforma de geração de EWNS para permitir o ajuste fino dos parâmetros de síntese e otimização das propriedades físico-químicas de EWNS para aumentar seu potencial antibacteriano.Em particular, a otimização se concentrou em aumentar sua carga de superfície (para melhorar a entrega direcionada) e o conteúdo de ROS (para melhorar a eficiência de inativação).Caracterizar propriedades físico-químicas otimizadas (tamanho, carga e teor de ROS) usando métodos analíticos modernos e usar microorganismos alimentares comuns, como E. .
EVNS foi sintetizado por eletropulverização simultânea e ionização de água de alta pureza (18 MΩ cm–1).O nebulizador elétrico 12 é normalmente utilizado para a atomização de líquidos e a síntese de polímeros e partículas cerâmicas 13 e fibras 14 de tamanho controlado.
Conforme detalhado nas publicações anteriores 8, 9, 10, 11, em um experimento típico, uma alta tensão foi aplicada entre um capilar de metal e um contraeletrodo aterrado.Durante este processo, ocorrem dois fenômenos distintos: i) eletrospray e ii) ionização da água.Um forte campo elétrico entre os dois eletrodos faz com que cargas negativas se acumulem na superfície da água condensada, resultando na formação de cones de Taylor.Como resultado, formam-se gotículas de água altamente carregadas, que continuam a se decompor em partículas menores, como na teoria de Rayleigh16.Ao mesmo tempo, campos elétricos fortes fazem com que algumas moléculas de água se dividam e retirem elétrons (ionizem), o que leva à formação de uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS)17.O ROS18 gerado simultaneamente foi encapsulado em EWNS (Fig. 1c).
Na fig.2a mostra o sistema de geração de EWNS desenvolvido e utilizado na síntese de EWNS neste estudo.Água purificada armazenada em um frasco fechado foi alimentada através de um tubo de Teflon (2 mm de diâmetro interno) em uma agulha de aço inoxidável 30G (capilar de metal).O fluxo de água é controlado pela pressão do ar dentro da garrafa, conforme mostra a Figura 2b.A agulha é montada em um console de Teflon e pode ser ajustada manualmente a uma certa distância do contraeletrodo.O contraeletrodo é um disco de alumínio polido com um orifício no centro para amostragem.Abaixo do contraeletrodo está um funil de amostragem de alumínio, que é conectado ao restante da configuração experimental por meio de uma porta de amostragem (Fig. 2b).Para evitar acúmulo de carga que possa interromper a operação do amostrador, todos os componentes do amostrador são eletricamente aterrados.
(a) Sistema de geração de nanoestrutura de água projetada (EWNS).(b) Corte transversal do amostrador e eletrospray, mostrando os parâmetros mais importantes.(c) Configuração experimental para inativação de bactérias.
O sistema de geração EWNS descrito acima é capaz de alterar os principais parâmetros operacionais para facilitar o ajuste fino das propriedades EWNS.Ajuste a tensão aplicada (V), a distância entre a agulha e o contraeletrodo (L) e o fluxo de água (φ) através do capilar para ajustar as características EWNS.Símbolo usado para representar diferentes combinações: [V (kV), L (cm)].Ajuste o fluxo de água para obter um cone de Taylor estável de um determinado conjunto [V, L].Para os fins deste estudo, o diâmetro da abertura do contraeletrodo (D) foi mantido em 0,5 polegadas (1,29 cm).
Devido à geometria e assimetria limitadas, a intensidade do campo elétrico não pode ser calculada a partir dos primeiros princípios.Em vez disso, o software QuickField™ (Svendborg, Dinamarca)19 foi usado para calcular o campo elétrico.O campo elétrico não é uniforme, então o valor do campo elétrico na ponta do capilar foi usado como valor de referência para várias configurações.
Durante o estudo, várias combinações de voltagem e distância entre a agulha e o contraeletrodo foram avaliadas em termos de formação de cone de Taylor, estabilidade do cone de Taylor, estabilidade de produção de EWNS e reprodutibilidade.Várias combinações são mostradas na Tabela Suplementar S1.
A saída do sistema de geração EWNS foi conectada diretamente a um Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, Modelo 3936, TSI, Shoreview, MN) para medição da concentração do número de partículas, bem como a um Aerosol Faraday Electrometer (TSI, Modelo 3068B, Shoreview, MN).) para correntes de aerossol foi medida conforme descrito em nossa publicação anterior.Tanto o SMPS quanto o eletrômetro de aerossol coletaram amostras a uma taxa de fluxo de 0,5 L/min (fluxo total de amostra de 1 L/min).O número de concentração de partículas e o fluxo de aerossol foram medidos por 120 segundos.A medição é repetida 30 vezes.Com base nas medições atuais, a carga total do aerossol é calculada e a carga EWNS média é estimada para um determinado número total de partículas EWNS selecionadas.O custo médio do EWNS pode ser calculado usando a Equação (1):
onde IEl é a corrente medida, NSMPS é a concentração digital medida com o SMPS e φEl é a vazão por eletrômetro.
Como a umidade relativa (RH) afeta a carga da superfície, a temperatura e (RH) foram mantidas constantes durante o experimento a 21°C e 45%, respectivamente.
Microscopia de força atômica (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Bárbara, CA) e sonda AC260T (Olympus, Tóquio, Japão) foram usados ​​para medir o tamanho e a vida útil do EWNS.A frequência de varredura AFM foi de 1 Hz, a área de varredura foi de 5 μm × 5 μm e 256 linhas de varredura.Todas as imagens foram submetidas a alinhamento de imagem de 1ª ordem usando o software Asylum (faixa de máscara 100 nm, limiar 100 pm).
O funil de teste foi removido e a superfície de mica foi colocada a uma distância de 2,0 cm do contraeletrodo por um tempo médio de 120 s para evitar aglomeração de partículas e formação de gotas irregulares na superfície de mica.EWNS foi pulverizado diretamente sobre a superfície de mica recém-cortada (Ted Pella, Redding, CA).Imagem da superfície da mica imediatamente após a pulverização catódica AFM.O ângulo de contato da superfície da mica não modificada recém-cortada é próximo a 0°, então o EVNS é distribuído na superfície da mica na forma de uma cúpula.O diâmetro (a) e a altura (h) das gotículas de difusão foram medidos diretamente da topografia AFM e usados ​​para calcular o volume de difusão abobadado EWNS usando nosso método previamente validado.Supondo que o EWNS a bordo tenha o mesmo volume, o diâmetro equivalente pode ser calculado usando a Equação (2):
Com base em nosso método desenvolvido anteriormente, um spin trap de ressonância de spin eletrônico (ESR) foi usado para detectar a presença de intermediários radicais de vida curta em EWNS.Os aerossóis foram borbulhados através de um aspersor Midget de 650 μm (Ace Glass, Vineland, NJ) contendo uma solução 235 mM de DEPMPO(5-(dietoxifosforil)-5-metil-1-pirrolina-N-óxido) (Oxis International Inc.).Portland, Oregon).Todas as medições de ESR foram realizadas usando um espectrômetro Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) e uma célula de painel plano.O software Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, EUA) foi utilizado para coletar e analisar os dados.A determinação das características do ROS foi realizada apenas para um conjunto de condições operacionais [-6,5 kV, 4,0 cm].As concentrações de EWNS foram medidas usando o SMPS após contabilizar as perdas de EWNS no impactador.
Os níveis de ozônio foram monitorados usando um 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Para todas as propriedades EWNS, o valor médio é usado como valor de medição e o desvio padrão é usado como erro de medição.Testes t foram realizados para comparar os valores dos atributos otimizados do EWNS com os valores correspondentes do EWNS base.
A Figura 2c mostra um sistema de "puxar" de precipitação eletrostática (EPES) previamente desenvolvido e caracterizado que pode ser usado para entrega direcionada de EWNS na superfície.O EPES usa cargas EVNS que podem ser “guiadas” diretamente para a superfície do alvo sob a influência de um forte campo elétrico.Detalhes do sistema EPES são apresentados em uma publicação recente de Pyrgiotakis et al.11 .Assim, o EPES consiste em uma câmara de PVC impressa em 3D com extremidades cônicas e contém duas placas metálicas paralelas de aço inoxidável (aço inoxidável 304, revestido de espelho) no centro com 15,24 cm de distância.As placas foram conectadas a uma fonte externa de alta tensão (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), a placa inferior sempre conectada à tensão positiva e a placa superior sempre conectada ao terra (terra flutuante).As paredes da câmara são cobertas com papel alumínio, que é eletricamente aterrado para evitar a perda de partículas.A câmara tem uma porta de carregamento frontal selada que permite que as superfícies de teste sejam colocadas em suportes de plástico que as elevem acima da placa de metal inferior para evitar interferência de alta voltagem.
A eficiência de deposição de EWNS em EPES foi calculada de acordo com um protocolo previamente desenvolvido detalhado na Figura Suplementar S111.
Como câmara de controle, uma segunda câmara de fluxo cilíndrica foi conectada em série ao sistema EPES, na qual um filtro HEPA intermediário foi utilizado para remover EWNS.Conforme mostrado na Figura 2c, o aerossol EWNS foi bombeado através de duas câmaras embutidas.O filtro entre a sala de controle e o EPES remove qualquer EWNS restante, resultando na mesma temperatura (T), umidade relativa (RH) e níveis de ozônio.
Verificou-se que importantes microorganismos de origem alimentar contaminam alimentos frescos, como E. coli (ATCC #27325), indicador fecal, Salmonella enterica (ATCC #53647), patógeno de origem alimentar, Listeria harmless (ATCC #33090), substituto para Listeria monocytogenes patogênica, derivada de ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), um substituto para levedura de deterioração e um mais resistente bactéria inativada, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Compre caixas aleatórias de tomates uva orgânicos no mercado local e leve à geladeira a 4°C até o uso (até 3 dias).Os tomates experimentais eram todos do mesmo tamanho, com cerca de 1/2 polegada de diâmetro.
Os protocolos de cultura, inoculação, exposição e contagem de colônias são detalhados em nossa publicação anterior e detalhados nos Dados Suplementares.A eficácia do EWNS foi avaliada expondo tomates inoculados a 40.000 #/cm3 por 45 minutos.Resumidamente, três tomates foram usados ​​para avaliar os microorganismos sobreviventes no tempo t = 0 min.Três tomates foram colocados em EPES e expostos a EWNS a 40.000 #/cc (tomates expostos a EWNS) e os três restantes foram colocados na câmara de controle (tomates de controle).Processamento adicional de tomates em ambos os grupos não foi realizado.Tomates expostos a EWNS e tomates de controle foram removidos após 45 minutos para avaliar o efeito de EWNS.
Cada experiemento foi realizado em triplicidade.A análise dos dados foi realizada de acordo com o protocolo descrito em Dados Suplementares.
Os mecanismos de inativação foram avaliados por sedimentação de amostras expostas de EWNS (45 min a 40.000 #/cm3 de concentração de aerossol de EWNS) e amostras não irradiadas de bactérias inofensivas E. coli, Salmonella enterica e Lactobacillus.As partículas foram fixadas em glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído 1,25% e ácido pícrico 0,03% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,4) por 2 horas em temperatura ambiente.Após a lavagem, pós-fixar com tetróxido de ósmio a 1% (OsO4)/ferrocianeto de potássio a 1,5% (KFeCN6) por 2 horas, lavar 3 vezes em água e incubar em acetato de uranila 1% por 1 hora, depois lavar duas vezes em água e desidratar por 10 minutos em álcool 50%, 70%, 90%, 100%.As amostras foram então colocadas em óxido de propileno por 1 hora e impregnadas com uma mistura 1:1 de óxido de propileno e TAAP Epon (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA).As amostras foram embebidas em TAAB Epon e polimerizadas a 60°C por 48 horas.A resina granular curada foi cortada e visualizada por TEM usando um microscópio eletrônico de transmissão convencional JEOL 1200EX (JEOL, Tóquio, Japão) equipado com uma câmera AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, EUA).
Todas as experiências foram realizadas em triplicado.Para cada ponto de tempo, as lavagens bacterianas foram semeadas em triplicado, resultando em um total de nove pontos de dados por ponto, cuja média foi usada como concentração bacteriana para aquele microrganismo específico.O desvio padrão foi utilizado como erro de medida.Todos os pontos contam.
O logaritmo da diminuição da concentração de bactérias em comparação com t = 0 min foi calculado usando a seguinte fórmula:
onde C0 é a concentração de bactérias na amostra de controle no tempo 0 (ou seja, após a secagem da superfície, mas antes de ser colocada na câmara) e Cn é a concentração de bactérias na superfície após n minutos de exposição.
Para contabilizar a degradação natural das bactérias durante a exposição de 45 minutos, a redução de log em comparação com o controle após 45 minutos também foi calculada da seguinte forma:
onde Cn é a concentração de bactérias na amostra de controle no tempo n e Cn-Control é a concentração de bactérias de controle no tempo n.Os dados são apresentados como uma redução logarítmica em comparação com o controle (sem exposição a EWNS).
Durante o estudo, várias combinações de voltagem e distância entre a agulha e o contraeletrodo foram avaliadas em termos de formação de cone de Taylor, estabilidade do cone de Taylor, estabilidade de produção de EWNS e reprodutibilidade.Várias combinações são mostradas na Tabela Suplementar S1.Dois casos mostrando propriedades estáveis ​​e reprodutíveis (cone de Taylor, geração de EWNS e estabilidade ao longo do tempo) foram selecionados para estudo abrangente.Na fig.A Figura 3 mostra os resultados para carga, tamanho e conteúdo de ROS em ambos os casos.Os resultados também são mostrados na Tabela 1. Para referência, tanto a Figura 3 quanto a Tabela 1 incluem as propriedades do EWNS8, 9, 10, 11 não otimizado sintetizado anteriormente (linha de base EWNS).Cálculos de significância estatística usando um teste t bicaudal são republicados na Tabela Suplementar S2.Além disso, dados adicionais incluem estudos do efeito do diâmetro do orifício de amostragem do contraeletrodo (D) e da distância entre o eletrodo de aterramento e a ponta (L) (Figuras complementares S2 e S3).
(ac) Distribuição de tamanho medida por AFM.(df) Característica de carga de superfície.(g) caracterização ROS do EPR.
Também é importante observar que, para todas as condições acima, a corrente de ionização medida estava entre 2 e 6 μA e a tensão entre -3,8 e -6,5 kV, resultando em um consumo de energia inferior a 50 mW para este único módulo de contato de geração EWNS.Embora o EWNS tenha sido sintetizado sob alta pressão, os níveis de ozônio eram muito baixos, nunca ultrapassando 60 ppb.
A Figura Complementar S4 mostra os campos elétricos simulados para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente.Para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], os cálculos de campo são 2 × 105 V/m e 4,7 × 105 V/m, respectivamente.Isso é esperado, pois no segundo caso a relação tensão-distância é muito maior.
Na fig.3a,b mostra o diâmetro EWNS medido com o AFM8.Os diâmetros EWNS médios calculados foram 27 nm e 19 nm para os esquemas [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente.Para os cenários [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], os desvios padrão geométricos das distribuições são 1,41 e 1,45, respectivamente, indicando uma distribuição de tamanho estreito.Tanto o tamanho médio quanto o desvio padrão geométrico estão muito próximos da linha de base EWNS, em 25 nm e 1,41, respectivamente.Na fig.3c mostra a distribuição de tamanho do EWNS base medido usando o mesmo método nas mesmas condições.
Na fig.3d,e mostra os resultados da caracterização da carga.Os dados são medições médias de 30 medições simultâneas de concentração (#/cm3) e corrente (I).A análise mostra que a carga média no EWNS é de 22 ± 6 e- e 44 ± 6 e- para [-6,5 kV, 4,0 cm] e [-3,8 kV, 0,5 cm], respectivamente.Eles têm cargas de superfície significativamente maiores em comparação com a linha de base EWNS (10 ± 2 e-), duas vezes maiores que o cenário [-6,5 kV, 4,0 cm] e quatro vezes maiores que o [-3,8 kV, 0,5 cm].A Figura 3f mostra a carga.dados para linha de base-EWNS.
A partir dos mapas de concentração do número EWNS (Figuras complementares S5 e S6), pode-se ver que o cenário [-6,5 kV, 4,0 cm] tem significativamente mais partículas do que o cenário [-3,8 kV, 0,5 cm].Também é importante notar que a concentração do número EWNS foi monitorada até 4 horas (Figuras complementares S5 e S6), onde a estabilidade da geração EWNS mostrou os mesmos níveis de concentração do número de partículas em ambos os casos.
Na fig.3g mostra o espectro EPR após a subtração do controle EWNS otimizado (fundo) em [-6,5 kV, 4,0 cm].Os espectros ROS também foram comparados com o cenário Baseline-EWNS em um trabalho publicado anteriormente.O número de EWNS reagindo com spin traps foi calculado em 7,5 × 104 EWNS/s, o que é semelhante ao Baseline-EWNS8 publicado anteriormente.Os espectros de EPR mostraram claramente a presença de dois tipos de ROS, sendo O2- a espécie predominante e OH• sendo a menos abundante.Além disso, uma comparação direta das intensidades de pico mostrou que o EWNS otimizado tinha um conteúdo de ROS significativamente maior em comparação com o EWNS de linha de base.
Na fig.4 mostra a eficiência de deposição de EWNS em EPES.Os dados também estão resumidos na Tabela I e comparados com os dados originais do EWNS.Para ambos os casos de EUNS, a deposição é próxima de 100% mesmo em baixa tensão de 3,0 kV.Normalmente, 3,0 kV é suficiente para 100% de deposição, independentemente da alteração da carga superficial.Nas mesmas condições, a eficiência de deposição do Baseline-EWNS foi de apenas 56% devido à sua carga mais baixa (média de 10 elétrons por EWNS).
Na fig.5 e na tabela.2 resume o valor de inativação de microrganismos inoculados na superfície de tomates após exposição a cerca de 40.000 #/cm3 EWNS por 45 minutos no modo ideal [-6,5 kV, 4,0 cm].E. coli e Lactobacillus inoculados inócuos apresentaram uma redução significativa de 3,8 logs durante os 45 minutos de exposição.Nas mesmas condições, S. enterica teve uma diminuição de 2,2 log, enquanto S. cerevisiae e M. parafortutum tiveram uma diminuição de 1,0 log.
As micrografias eletrônicas (Figura 6) mostram as alterações físicas induzidas por EWNS em células inofensivas de Escherichia coli, Streptococcus e Lactobacillus levando à sua inativação.As bactérias de controle tinham membranas celulares intactas, enquanto as bactérias expostas tinham membranas externas danificadas.
Imagens de microscopia eletrônica de controle e bactérias expostas revelaram danos na membrana.
Os dados sobre as propriedades físico-químicas do EWNS otimizado mostram coletivamente que as propriedades (carga de superfície e conteúdo de ROS) do EWNS foram significativamente melhoradas em comparação com os dados de linha de base do EWNS publicados anteriormente8,9,10,11.Por outro lado, seu tamanho permaneceu na faixa do nanômetro, muito semelhante aos resultados relatados anteriormente, permitindo que permanecessem no ar por longos períodos de tempo.A polidispersão observada pode ser explicada por mudanças de carga de superfície que determinam o tamanho de EWNS, a aleatoriedade do efeito Rayleigh e coalescência potencial.No entanto, conforme detalhado por Nielsen et al.22, a alta carga de superfície reduz a evaporação aumentando efetivamente a energia/tensão de superfície da gota de água.Em nossa publicação anterior8, essa teoria foi confirmada experimentalmente para microgotículas 22 e EWNS.A perda de carga durante horas extras também pode afetar o tamanho e contribuir para a distribuição de tamanho observada.