Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Karuzela wyświetlająca trzy slajdy jednocześnie. Użyj przycisków Poprzedni i Następny, aby przewijać trzy slajdy naraz, lub przycisków suwaka na końcu, aby przewijać trzy slajdy naraz.
Niedawno opracowano wolną od chemikaliów platformę antybakteryjną opartą na nanotechnologii wykorzystującej sztuczne nanostruktury wodne (EWNS). EWNS charakteryzują się wysokim ładunkiem powierzchniowym i są nasycone reaktywnymi formami tlenu (RFT), które mogą oddziaływać z wieloma mikroorganizmami, w tym patogenami przenoszonymi przez żywność, i je inaktywować. W pracy wykazano, że ich właściwości podczas syntezy można precyzyjnie dostroić i zoptymalizować, aby jeszcze bardziej zwiększyć ich potencjał antybakteryjny. Platforma laboratoryjna EWNS została zaprojektowana w celu precyzyjnego dostrojenia właściwości EWNS poprzez zmianę parametrów syntezy. Charakterystyka właściwości EWNS (ładunku, wielkości i zawartości RFT) przy użyciu nowoczesnych metod analitycznych. Ponadto oceniono ich potencjał inaktywacji mikrobiologicznej wobec mikroorganizmów przenoszonych przez żywność, takich jak Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum i Saccharomyces cerevisiae. Przedstawione wyniki dowodzą, że właściwości EWNS można precyzyjnie dostroić podczas syntezy, co skutkuje wykładniczym wzrostem wydajności inaktywacji. W szczególności ładunek powierzchniowy wzrósł czterokrotnie, a liczba reaktywnych form tlenu wzrosła. Szybkość usuwania drobnoustrojów była zależna od mikroorganizmów i wahała się od 1,0 do 3,8 log po 45-minutowej ekspozycji na dawkę aerozolu 40 000 #/cm3 EWNS.
Zanieczyszczenie mikrobiologiczne jest główną przyczyną chorób przenoszonych drogą pokarmową, spowodowanych spożyciem patogenów lub ich toksyn. W samych Stanach Zjednoczonych choroby przenoszone drogą pokarmową powodują około 76 milionów zachorowań, 325 000 hospitalizacji i 5000 zgonów rocznie1. Ponadto, Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) szacuje, że zwiększone spożycie świeżych produktów odpowiada za 48% wszystkich zgłoszonych chorób przenoszonych drogą pokarmową w Stanach Zjednoczonych2. Koszt chorób i zgonów spowodowanych patogenami przenoszonymi drogą pokarmową w Stanach Zjednoczonych jest bardzo wysoki, szacowany przez Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC) na ponad 15,6 miliarda dolarów rocznie3.
Obecnie chemiczne4, radiacyjne5 i termiczne6 interwencje przeciwdrobnoustrojowe mające na celu zapewnienie bezpieczeństwa żywności przeprowadza się głównie w ograniczonych krytycznych punktach kontroli (CCP) wzdłuż łańcucha produkcyjnego (zwykle po zbiorach i/lub w trakcie pakowania), a nie w sposób ciągły. W związku z tym są one podatne na zanieczyszczenia krzyżowe. 7. Lepsza kontrola chorób przenoszonych drogą pokarmową i psucia się żywności wymaga interwencji przeciwdrobnoustrojowych, które potencjalnie można stosować w całym cyklu od gospodarstwa do stołu, jednocześnie zmniejszając wpływ na środowisko i koszty.
Niedawno opracowano platformę antybakteryjną opartą na nanotechnologii, wolną od chemikaliów, która może inaktywować bakterie powierzchniowe i unoszące się w powietrzu za pomocą sztucznych nanostruktur wodnych (EWNS). EWNS zsyntetyzowano w dwóch równoległych procesach: elektrorozpylania i jonizacji wody (rys. 1a). Wcześniejsze badania wykazały, że EWNS posiadają unikalny zestaw właściwości fizycznych i biologicznych8,9,10. EWNS mają średnio 10 elektronów na strukturę i średni rozmiar w skali nano wynoszący 25 nm (rys. 1b,c)8,9,10. Ponadto rezonans spinów elektronowych (ESR) wykazał, że EWNS zawiera dużą ilość reaktywnych form tlenu (ROS), głównie rodników hydroksylowych (OH•) i ponadtlenkowych (O2-) (rys. 1c)8. EVNS utrzymuje się w powietrzu przez długi czas i może zderzać się z mikroorganizmami zawieszonymi w powietrzu i obecnymi na powierzchni, dostarczając ładunek ROS i powodując ich inaktywację (ryc. 1d). Te wczesne badania wykazały również, że EWNS może oddziaływać z różnymi bakteriami Gram-ujemnymi i Gram-dodatnimi, w tym prątkami, na powierzchniach i w powietrzu, i inaktywować je. Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała, że ​​inaktywacja była spowodowana uszkodzeniem błony komórkowej. Ponadto badania ostrej inhalacji wykazały, że wysokie dawki EWNS nie powodują uszkodzenia płuc ani stanu zapalnego8.
(a) Elektrospray występuje, gdy między rurką kapilarną zawierającą ciecz a elektrodą przeciwną przyłożone zostaje wysokie napięcie. (b) Zastosowanie wysokiego ciśnienia powoduje dwa różne zjawiska: (i) elektrospray wody oraz (ii) powstawanie reaktywnych form tlenu (jonów) uwięzionych w sieciach EWNS. (c) Unikalna struktura sieci EWNS. (d) Ze względu na swoją nanostrukturę sieci EWNS są one bardzo mobilne i mogą oddziaływać z patogenami unoszącymi się w powietrzu.
Niedawno wykazano również zdolność platformy antybakteryjnej EWNS do inaktywacji mikroorganizmów przenoszonych przez żywność na powierzchni świeżej żywności. Wykazano również, że ładunek powierzchniowy EWNS w połączeniu z polem elektrycznym może być wykorzystany do ukierunkowanego dostarczania. Co więcej, wstępne wyniki dla pomidorów ekologicznych po 90-minutowej ekspozycji na EWNS wynoszący około 50 000 #/cm³ były zachęcające, z zaobserwowaniem różnych mikroorganizmów przenoszonych przez żywność, takich jak E. coli i Listeria 11. Co więcej, wstępne testy organoleptyczne nie wykazały żadnych efektów sensorycznych w porównaniu z pomidorami kontrolnymi. Chociaż te wstępne wyniki inaktywacji są zachęcające dla zastosowań w zakresie bezpieczeństwa żywności, nawet przy bardzo niskich dawkach EWNS wynoszących 50 000 #/cm³, oczywiste jest, że wyższy potencjał inaktywacji byłby bardziej korzystny dla dalszego zmniejszenia ryzyka infekcji i psucia się żywności.
W niniejszym artykule skupimy się na opracowaniu platformy generacji EWNS, która umożliwi precyzyjne dostrojenie parametrów syntezy i optymalizację właściwości fizykochemicznych EWNS w celu zwiększenia ich potencjału antybakteryjnego. W szczególności optymalizacja koncentruje się na zwiększeniu ich ładunku powierzchniowego (w celu poprawy ukierunkowanego dostarczania) oraz zawartości ROS (w celu poprawy wydajności inaktywacji). Zoptymalizowane właściwości fizykochemiczne (rozmiar, ładunek i zawartość ROS) zostaną scharakteryzowane przy użyciu nowoczesnych metod analitycznych i wykorzystają popularne mikroorganizmy spożywcze, takie jak E.
Syntezę EVNS uzyskano poprzez jednoczesne elektrorozpylanie i jonizację wody o wysokiej czystości (18 MΩ cm–1). Nebulizator elektryczny 12 jest zazwyczaj używany do atomizacji cieczy oraz syntezy cząstek polimerowych i ceramicznych 13 oraz włókien 14 o kontrolowanej wielkości.
Jak szczegółowo opisano w poprzednich publikacjach 8, 9, 10, 11, w typowym eksperymencie przyłożono wysokie napięcie między metalową kapilarę a uziemioną przeciwelektrodę. Podczas tego procesu zachodzą dwa różne zjawiska: i) elektrorozpylanie i ii) jonizacja wody. Silne pole elektryczne między dwiema elektrodami powoduje gromadzenie się ładunków ujemnych na powierzchni skroplonej wody, co skutkuje tworzeniem się stożków Taylora. W rezultacie powstają silnie naładowane krople wody, które nadal rozpadają się na mniejsze cząsteczki, jak w teorii Rayleigha16. Jednocześnie silne pola elektryczne powodują rozszczepienie niektórych cząsteczek wody i oderwanie elektronów (jonizację), co prowadzi do powstania dużej ilości reaktywnych form tlenu (ROS)17. Jednocześnie wygenerowany ROS18 został zamknięty w EWNS (rys. 1c).
Na rys. 2a przedstawiono system generowania EWNS opracowany i zastosowany w syntezie EWNS w niniejszym badaniu. Oczyszczoną wodę przechowywaną w zamkniętej butelce wprowadzono przez teflonową rurkę (o średnicy wewnętrznej 2 mm) do igły ze stali nierdzewnej 30G (metalowej kapilary). Przepływ wody jest kontrolowany ciśnieniem powietrza wewnątrz butli, jak pokazano na rys. 2b. Igła jest zamontowana na teflonowej konsoli i można ją ręcznie ustawić w określonej odległości od przeciwelektrody. Przeciwelektroda to polerowany aluminiowy dysk z otworem pośrodku do pobierania próbek. Poniżej przeciwelektrody znajduje się aluminiowy lejek do pobierania próbek, który jest połączony z resztą układu eksperymentalnego za pomocą portu do pobierania próbek (rys. 2b). Aby uniknąć gromadzenia się ładunku, które mogłoby zakłócić działanie próbnika, wszystkie jego elementy są uziemione elektrycznie.
(a) System generowania nanostruktury wody (EWNS). (b) Przekrój próbnika i elektrosprayu, pokazujący najważniejsze parametry. (c) Układ eksperymentalny do inaktywacji bakterii.
Opisany powyżej system generacji EWNS umożliwia zmianę kluczowych parametrów operacyjnych, co ułatwia precyzyjne dostrojenie właściwości EWNS. Aby precyzyjnie dostroić charakterystykę EWNS, należy dostosować przyłożone napięcie (V), odległość między igłą a przeciwelektrodą (L) oraz przepływ wody (φ) przez kapilarę. Symbole używane do reprezentowania różnych kombinacji: [V (kV), L (cm)]. Dostosuj przepływ wody, aby uzyskać stabilny stożek Taylora o określonym kącie [V, L]. Na potrzeby niniejszego badania średnicę otworu przeciwelektrody (D) utrzymywano na poziomie 0,5 cala (1,29 cm).
Ze względu na ograniczoną geometrię i asymetrię, natężenia pola elektrycznego nie można obliczyć metodą teoretyczną. Zamiast tego do obliczenia pola elektrycznego wykorzystano oprogramowanie QuickField™ (Svendborg, Dania)19. Pole elektryczne nie jest jednorodne, dlatego wartość pola elektrycznego na końcu kapilary została wykorzystana jako wartość odniesienia dla różnych konfiguracji.
W trakcie badania oceniono kilka kombinacji napięcia i odległości między igłą a przeciwelektrodą pod kątem formowania stożka Taylora, jego stabilności, stabilności wytwarzania EWNS oraz powtarzalności. Różne kombinacje przedstawiono w tabeli uzupełniającej S1.
Wyjście systemu generacji EWNS zostało podłączone bezpośrednio do analizatora wielkości cząstek Scanning Mobility (SMPS, model 3936, TSI, Shoreview, MN) w celu pomiaru stężenia cząstek, a także do elektrometru Faradaya Aerosol (TSI, model 3068B, Shoreview, MN). ) do pomiaru prądów aerozolu mierzono zgodnie z opisem w naszej poprzedniej publikacji. Zarówno SMPS, jak i elektrometr aerozolu pobierały próbki z szybkością przepływu 0,5 l/min (całkowity przepływ próbki 1 l/min). Stężenie cząstek i przepływ aerozolu mierzono przez 120 sekund. Pomiar powtarzano 30 razy. Na podstawie pomiarów prądu obliczano całkowity ładunek aerozolu i szacowano średni ładunek EWNS dla danej całkowitej liczby wybranych cząstek EWNS. Średni koszt EWNS można obliczyć za pomocą równania (1):
gdzie IEl to zmierzony prąd, NSMPS to cyfrowe stężenie mierzone za pomocą SMPS, a φEl to natężenie przepływu na elektrometr.
Ponieważ wilgotność względna (RH) ma wpływ na ładunek powierzchniowy, podczas całego eksperymentu utrzymywano stałą temperaturę i wilgotność względną (RH) na poziomie odpowiednio 21°C i 45%.
Do pomiaru wielkości i czasu życia EWNS wykorzystano mikroskopię sił atomowych (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornia) oraz sondę AC260T (Olympus, Tokio, Japonia). Częstotliwość skanowania AFM wynosiła 1 Hz, obszar skanowania 5 μm × 5 μm, a liczba linii skanowania wynosiła 256. Wszystkie obrazy poddano wyrównaniu obrazu pierwszego rzędu za pomocą oprogramowania Asylum (zakres maski 100 nm, próg 100 pm).
Lejek testowy został usunięty, a powierzchnia miki została umieszczona w odległości 2,0 cm od elektrody przeciwnej na czas uśredniania 120 s, aby uniknąć aglomeracji cząstek i tworzenia się nieregularnych kropel na powierzchni miki. EWNS został natryskiwany bezpośrednio na powierzchnię świeżo przeciętej miki (Ted Pella, Redding, Kalifornia). Zdjęcie powierzchni miki bezpośrednio po napyleniu AFM. Kąt zwilżania powierzchni świeżo przeciętej niemodyfikowanej miki jest bliski 0°, więc EVNS jest rozprowadzany na powierzchni miki w formie kopuły. Średnicę (a) i wysokość (h) dyfuzyjnych kropel zmierzono bezpośrednio z topografii AFM i wykorzystano do obliczenia objętości dyfuzyjnej kopuły EWNS za pomocą naszej wcześniej zweryfikowanej metody. Zakładając, że pokładowe EWNS mają tę samą objętość, średnicę równoważną można obliczyć za pomocą równania (2):
W oparciu o naszą wcześniej opracowaną metodę, pułapka spinowa rezonansu spinowego elektronów (ESR) została użyta do wykrycia obecności krótkożyciowych rodników pośrednich w EWNS. Aerozole przepuszczano przez 650 μm Midget sparger (Ace Glass, Vineland, NJ) zawierający 235 mM roztwór DEPMPO(5-(dietoksyfosforylo)-5-metylo-1-pirolino-N-tlenku) (Oxis International Inc., Portland, Oregon). Wszystkie pomiary ESR przeprowadzono przy użyciu spektrometru Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) i płaskiej kuwety. Oprogramowanie Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) zostało użyte do zebrania i analizy danych. Określenie charakterystyki ROS przeprowadzono tylko dla zestawu warunków pracy [-6,5 kV, 4,0 cm]. Stężenia EWNS mierzono przy użyciu SMPS po uwzględnieniu strat EWNS w uderzeniu.
Poziom ozonu monitorowano przy użyciu monitora ozonu Dual Beam Ozone Monitor™ 205 (2B Technologies, Boulder, Kolorado)8,9,10.
Dla wszystkich właściwości EWNS, wartość średnia jest używana jako wartość pomiaru, a odchylenie standardowe jako błąd pomiaru. Przeprowadzono testy t w celu porównania wartości zoptymalizowanych atrybutów EWNS z odpowiadającymi im wartościami bazowego EWNS.
Rysunek 2c przedstawia wcześniej opracowany i scharakteryzowany system „przyciągania” elektrostatycznego wytrącania (EPES), który może być używany do ukierunkowanego dostarczania EWNS na powierzchnię. EPES wykorzystuje ładunki EVNS, które mogą być „kierowane” bezpośrednio na powierzchnię celu pod wpływem silnego pola elektrycznego. Szczegóły systemu EPES przedstawiono w niedawnej publikacji Pyrgiotakisa i in. 11 . EPES składa się z drukowanej w 3D komory z PVC o zwężających się końcach i zawiera dwie równoległe metalowe płyty ze stali nierdzewnej (stal nierdzewna 304, powlekana lustrzanym połyskiem) w środku w odległości 15,24 cm od siebie. Płyty zostały podłączone do zewnętrznego źródła wysokiego napięcia (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), dolna płyta była zawsze podłączona do napięcia dodatniego, a górna płyta była zawsze podłączona do uziemienia (uziemienia pływającego). Ściany komory są pokryte folią aluminiową, która jest uziemiona elektrycznie, aby zapobiec utracie cząstek. Komora wyposażona jest w uszczelnione przednie drzwi załadowcze, które umożliwiają umieszczenie powierzchni testowych na plastikowych podstawkach podnoszących je ponad dolną płytę metalową, co zapobiega zakłóceniom wysokiego napięcia.
Wydajność depozycji EWNS w EPES została obliczona zgodnie z opracowanym wcześniej protokołem szczegółowo opisanym na rysunku uzupełniającym S111.
Jako komora kontrolna, druga cylindryczna komora przepływowa została podłączona szeregowo do systemu EPES, w którym zastosowano pośredni filtr HEPA do usuwania EWNS. Jak pokazano na rysunku 2c, aerozol EWNS był pompowany przez dwie wbudowane komory. Filtr między pomieszczeniem kontrolnym a systemem EPES usuwa wszelkie pozostałości EWNS, co skutkuje utrzymaniem tej samej temperatury (T), wilgotności względnej (RH) i poziomu ozonu.
Stwierdzono, że ważne mikroorganizmy przenoszone przez żywność zanieczyszczają świeżą żywność, takie jak E. coli (ATCC #27325), wskaźnik kałowy, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen przenoszony przez żywność, Listeria harmless (ATCC #33090), substytut patogennej Listeria monocytogenes, uzyskany z ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), substytut drożdży powodujących psucie się żywności i bardziej odporna inaktywowana bakteria, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Kup losowe opakowania ekologicznych pomidorków koktajlowych w lokalnym markecie i przechowuj w lodówce w temperaturze 4°C do momentu spożycia (do 3 dni). Wszystkie pomidory eksperymentalne były tej samej wielkości, o średnicy około 1,25 cm.
Protokoły dotyczące hodowli, inokulacji, ekspozycji i zliczania kolonii są szczegółowo opisane w naszej poprzedniej publikacji oraz w Danych uzupełniających. Skuteczność EWNS oceniano poprzez ekspozycję zaszczepionych pomidorów na 40 000 #/cm3 przez 45 minut. Krótko mówiąc, trzy pomidory użyto do oceny mikroorganizmów, które przeżyły w czasie t = 0 min. Trzy pomidory umieszczono w komorze EPES i wystawiono na EWNS w stężeniu 40 000 #/cm3 (pomidory wystawione na EWNS), a pozostałe trzy umieszczono w komorze kontrolnej (pomidory kontrolne). Nie przeprowadzono dodatkowej obróbki pomidorów w obu grupach. Pomidory wystawione na EWNS i pomidory kontrolne usunięto po 45 minutach w celu oceny skuteczności EWNS.
Każdy eksperyment przeprowadzono trzykrotnie. Analizę danych przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym w Danych uzupełniających.
Mechanizmy inaktywacji oceniano poprzez sedymentację wystawionych próbek EWNS (45 min przy stężeniu aerozolu EWNS 40 000 #/cm3) oraz nienapromieniowanych próbek nieszkodliwych bakterii E. coli, Salmonella enterica i Lactobacillus. Cząsteczki utrwalano w 2,5% glutaraldehydu, 1,25% paraformaldehydu i 0,03% kwasu pikrynowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po przemyciu, utrwalano w 1% tetratlenku osmu (OsO4)/1,5% żelazocyjanku potasu (KFeCN6) przez 2 godziny, przemywano 3 razy w wodzie i inkubowano w 1% octanie uranylu przez 1 godzinę, następnie przemywano dwukrotnie w wodzie, a następnie odwadniano przez 10 minut w 50%, 70%, 90%, 100% alkoholu. Następnie próbki umieszczono w tlenku propylenu na 1 godzinę i zaimpregnowano mieszaniną tlenku propylenu i żywicy TAAP Epon w stosunku 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, Kalifornia). Próbki zatopiono w żywicy TAAB Epon i polimeryzowano w temperaturze 60°C przez 48 godzin. Utwardzoną żywicę granulowaną pocięto i uwidoczniono za pomocą mikroskopii elektronowej (TEM) za pomocą konwencjonalnego transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japonia) wyposażonego w kamerę AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono trzykrotnie. Dla każdego punktu czasowego płukanki bakteryjne posiewano trzykrotnie, co dało łącznie dziewięć punktów danych na punkt, z których średnia została wykorzystana jako stężenie bakterii dla danego mikroorganizmu. Odchylenie standardowe zostało użyte jako błąd pomiaru. Wszystkie punkty są brane pod uwagę.
Logarytm spadku stężenia bakterii w porównaniu do t = 0 min obliczono według następującego wzoru:
gdzie C0 oznacza stężenie bakterii w próbce kontrolnej w czasie 0 (czyli po wyschnięciu powierzchni, ale przed umieszczeniem jej w komorze), a Cn oznacza stężenie bakterii na powierzchni po n minutach ekspozycji.
Aby uwzględnić naturalną degradację bakterii podczas 45-minutowej ekspozycji, obliczono również logarytm redukcji w porównaniu do grupy kontrolnej po 45 minutach w następujący sposób:
gdzie Cn to stężenie bakterii w próbce kontrolnej w czasie n, a Cn-Kontrola to stężenie bakterii kontrolnych w czasie n. Dane przedstawiono jako redukcję logarytmiczną w porównaniu z próbką kontrolną (bez narażenia na EWNS).
W trakcie badania oceniono kilka kombinacji napięcia i odległości między igłą a przeciwelektrodą pod kątem formowania stożka Taylora, stabilności stożka Taylora, stabilności wytwarzania EWNS oraz powtarzalności. Różne kombinacje przedstawiono w Tabeli Uzupełniającej S1. Do kompleksowych badań wybrano dwa przypadki wykazujące stabilne i powtarzalne właściwości (stożek Taylora, generowanie EWNS i stabilność w czasie). Na rys. Rysunek 3 przedstawia wyniki dotyczące ładunku, rozmiaru i zawartości ROS w obu przypadkach. Wyniki przedstawiono również w Tabeli 1. Dla porównania, zarówno Rysunek 3, jak i Tabela 1 zawierają właściwości wcześniej zsyntetyzowanego, niezoptymalizowanego EWNS8, 9, 10, 11 (EWNS bazowy). Obliczenia istotności statystycznej z wykorzystaniem dwustronnego testu t opublikowano ponownie w Tabeli Uzupełniającej S2. Ponadto, dodatkowe dane obejmują badania wpływu średnicy otworu próbkującego przeciwelektrody (D) oraz odległości między elektrodą uziemiającą a końcówką (L) (Rysunki Uzupełniające S2 i S3).
(ac) Dystrybucja wielkości mierzona metodą AFM. (df) Charakterystyka ładunku powierzchniowego. (g) Charakterystyka ROS w EPR.
Należy również zauważyć, że we wszystkich powyższych warunkach zmierzony prąd jonizacji wynosił od 2 do 6 μA, a napięcie od -3,8 do -6,5 kV, co skutkowało poborem mocy mniejszym niż 50 mW dla tego pojedynczego modułu kontaktowego generacji EWNS. Chociaż EWNS syntezowano pod wysokim ciśnieniem, poziom ozonu był bardzo niski i nigdy nie przekraczał 60 ppb.
Rysunek uzupełniający S4 przedstawia symulowane pola elektryczne odpowiednio dla scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Dla scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] obliczenia pola wynoszą odpowiednio 2 × 105 V/m i 4,7 × 105 V/m. Jest to oczekiwane, ponieważ w drugim przypadku stosunek napięcia do odległości jest znacznie wyższy.
Na rys. 3a i b przedstawiono średnicę EWNS zmierzoną za pomocą AFM8. Obliczone średnie średnice EWNS wyniosły odpowiednio 27 nm i 19 nm dla schematów [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Dla scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] geometryczne odchylenia standardowe rozkładów wynoszą odpowiednio 1,41 i 1,45, co wskazuje na wąski rozkład wielkości. Zarówno średni rozmiar, jak i geometryczne odchylenie standardowe są bardzo zbliżone do bazowego EWNS, odpowiednio przy 25 nm i 1,41. Na rys. 3c przedstawiono rozkład wielkości bazowego EWNS zmierzonego tą samą metodą w tych samych warunkach.
Na rys. 3d i e przedstawiono wyniki charakterystyki ładunku. Dane stanowią średnie pomiary 30 jednoczesnych pomiarów stężenia (#/cm3) i natężenia (I). Analiza pokazuje, że średni ładunek na EWNS wynosi odpowiednio 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- dla [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Mają one znacznie wyższe ładunki powierzchniowe w porównaniu z bazowym EWNS (10 ± 2 e-), dwukrotnie większe niż w scenariuszu [-6,5 kV, 4,0 cm] i czterokrotnie większe niż w scenariuszu [-3,8 kV, 0,5 cm]. Rysunek 3f przedstawia dane dotyczące ładunku dla bazowego EWNS.
Z map stężeń liczby EWNS (rysunki uzupełniające S5 i S6) wynika, że ​​scenariusz [-6,5 kV, 4,0 cm] charakteryzuje się znacznie większą liczbą cząstek niż scenariusz [-3,8 kV, 0,5 cm]. Warto również zauważyć, że stężenie liczby EWNS monitorowano do 4 godzin (rysunki uzupełniające S5 i S6), gdzie stabilność generacji EWNS wykazała ten sam poziom stężenia liczby cząstek w obu przypadkach.
Na rys. 3g przedstawiono widmo EPR po odjęciu zoptymalizowanej kontroli EWNS (tło) przy [-6,5 kV, 4,0 cm]. Widma ROS porównano również ze scenariuszem Baseline-EWNS w opublikowanej wcześniej pracy. Liczbę EWNS reagujących z pułapkami spinowymi obliczono na 7,5 × 104 EWNS/s, co jest wartością podobną do wcześniej opublikowanej wersji Baseline-EWNS8. Widma EPR wyraźnie wykazały obecność dwóch rodzajów ROS, przy czym O2- był dominującą formą, a OH• był mniej liczny. Ponadto bezpośrednie porównanie intensywności pików wykazało, że zoptymalizowany EWNS miał znacznie wyższą zawartość ROS w porównaniu ze scenariuszem bazowym EWNS.
Na rys. 4 przedstawiono wydajność osadzania EWNS w EPES. Dane podsumowano również w tabeli I i porównano z oryginalnymi danymi EWNS. W obu przypadkach EUNS, osadzanie jest bliskie 100%, nawet przy niskim napięciu 3,0 kV. Zazwyczaj napięcie 3,0 kV wystarcza do 100% osadzania, niezależnie od zmiany ładunku powierzchniowego. W tych samych warunkach, wydajność osadzania Baseline-EWNS wyniosła zaledwie 56% ze względu na ich niższy ładunek (średnio 10 elektronów na EWNS).
Na rys. 5 oraz w tabeli 2 podsumowano wartość inaktywacji mikroorganizmów zaszczepionych na powierzchni pomidorów po ekspozycji na około 40 000 #/cm3 EWNS przez 45 minut w trybie optymalnym [-6,5 kV, 4,0 cm]. Zaszczepione bakterie E. coli i Lactobacillus innocuous wykazały istotną redukcję o 3,8 log podczas 45-minutowej ekspozycji. W tych samych warunkach S. enterica odnotowała spadek o 2,2 log, podczas gdy S. cerevisiae i M. parafortutum odnotowały spadek o 1,0 log.
Zdjęcia z mikroskopu elektronowego (ryc. 6) przedstawiają zmiany fizyczne wywołane przez EWNS w nieszkodliwych komórkach Escherichia coli, Streptococcus i Lactobacillus, prowadzące do ich inaktywacji. Bakterie kontrolne miały nienaruszone błony komórkowe, podczas gdy bakterie wystawione na działanie EWNS miały uszkodzone błony zewnętrzne.
Obrazowanie mikroskopowe pod mikroskopem elektronowym bakterii kontrolnych i wystawionych na działanie czynników zewnętrznych ujawniło uszkodzenie błony komórkowej.
Dane dotyczące właściwości fizykochemicznych zoptymalizowanego EWNS łącznie pokazują, że właściwości (ładunek powierzchniowy i zawartość ROS) EWNS uległy znacznej poprawie w porównaniu z wcześniej opublikowanymi danymi bazowymi EWNS8,9,10,11. Z drugiej strony, ich rozmiar pozostał w zakresie nanometrów, bardzo podobnym do wyników zgłoszonych wcześniej, co pozwoliło im pozostać w powietrzu przez długi czas. Obserwowaną polidyspersyjność można wyjaśnić zmianami ładunku powierzchniowego, które determinują rozmiar EWNS, losowością efektu Rayleigha i potencjalną koalescencją. Jednakże, jak szczegółowo opisali Nielsen i in. 22, wysoki ładunek powierzchniowy zmniejsza parowanie poprzez efektywne zwiększenie energii/napięcia powierzchniowego kropli wody. W naszej poprzedniej publikacji8 teoria ta została eksperymentalnie potwierdzona dla mikrokropli 22 i EWNS. Utrata ładunku w czasie może również wpływać na rozmiar i przyczyniać się do obserwowanego rozkładu wielkości.