Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS. Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w programie Internet Explorer). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScript.
Karuzela pokazująca trzy slajdy jednocześnie. Użyj przycisków Poprzedni i Następny, aby przejść przez trzy slajdy na raz, lub użyj przycisków suwaka na końcu, aby przejść przez trzy slajdy na raz.
Niedawno opracowano wolną od chemikaliów platformę antybakteryjną opartą na nanotechnologii wykorzystującej sztuczne nanostruktury wodne (EWNS). EWNS mają wysoki ładunek powierzchniowy i są nasycone reaktywnymi formami tlenu (ROS), które mogą oddziaływać z wieloma mikroorganizmami i je inaktywować, w tym patogenami przenoszonymi przez żywność. Tutaj pokazano, że ich właściwości podczas syntezy można dostroić i zoptymalizować, aby jeszcze bardziej zwiększyć ich potencjał antybakteryjny. Platforma laboratoryjna EWNS została zaprojektowana w celu dostrojenia właściwości EWNS poprzez zmianę parametrów syntezy. Charakterystyka właściwości EWNS (ładunek, wielkość i zawartość ROS) przy użyciu nowoczesnych metod analitycznych. Ponadto oceniono je pod kątem ich potencjału inaktywacji mikrobiologicznej wobec mikroorganizmów przenoszonych przez żywność, takich jak Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum i Saccharomyces cerevisiae. Przedstawione tutaj wyniki pokazują, że właściwości EWNS można dostroić podczas syntezy, co skutkuje wykładniczym wzrostem wydajności inaktywacji. W szczególności ładunek powierzchniowy wzrósł czterokrotnie, a reaktywne formy tlenu wzrosły. Szybkość usuwania drobnoustrojów była zależna od drobnoustrojów i wahała się od 1,0 do 3,8 log po 45-minutowej ekspozycji na dawkę aerozolu 40 000 #/cc EWNS.
Zanieczyszczenie mikrobiologiczne jest główną przyczyną chorób przenoszonych drogą pokarmową, spowodowanych spożyciem patogenów lub ich toksyn. W samych Stanach Zjednoczonych choroby przenoszone drogą pokarmową powodują około 76 milionów zachorowań, 325 000 hospitalizacji i 5000 zgonów rocznie1. Ponadto Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) szacuje, że zwiększone spożycie świeżych produktów odpowiada za 48% wszystkich zgłoszonych chorób przenoszonych drogą pokarmową w Stanach Zjednoczonych2. Koszt chorób i zgonów spowodowanych patogenami przenoszonymi drogą pokarmową w Stanach Zjednoczonych jest bardzo wysoki, szacowany przez Centra Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC) na ponad 15,6 miliarda dolarów rocznie3.
Obecnie chemiczne4, radiacyjne5 i termiczne6 interwencje przeciwdrobnoustrojowe mające na celu zapewnienie bezpieczeństwa żywności są przeprowadzane głównie w ograniczonych krytycznych punktach kontroli (CCP) wzdłuż łańcucha produkcyjnego (zwykle po zbiorach i/lub podczas pakowania), a nie w sposób ciągły. W związku z tym są podatne na zanieczyszczenia krzyżowe. 7. Lepsza kontrola chorób przenoszonych drogą pokarmową i psucia się żywności wymaga interwencji przeciwdrobnoustrojowych, które potencjalnie można stosować w całym cyklu od gospodarstwa do stołu, jednocześnie zmniejszając wpływ na środowisko i koszty.
Niedawno opracowano wolną od chemikaliów, opartą na nanotechnologii platformę antybakteryjną, która może inaktywować bakterie powierzchniowe i unoszące się w powietrzu przy użyciu sztucznych nanostruktur wodnych (EWNS). EWNS zsyntetyzowano przy użyciu dwóch równoległych procesów, elektrosprayu i jonizacji wody (rys. 1a). Poprzednie badania wykazały, że EWNS mają unikalny zestaw właściwości fizycznych i biologicznych8,9,10. EWNS mają średnio 10 elektronów na strukturę i średni rozmiar w skali nano wynoszący 25 nm (rys. 1b,c)8,9,10. Ponadto rezonans spinowy elektronów (ESR) wykazał, że EWNS zawiera dużą ilość reaktywnych form tlenu (ROS), głównie rodników hydroksylowych (OH•) i ponadtlenkowych (O2-) (rys. 1c)8. EVNS jest w powietrzu przez długi czas i może zderzać się z mikroorganizmami zawieszonymi w powietrzu i obecnymi na powierzchni, dostarczając ładunek ROS i powodując inaktywację mikroorganizmów (rys. 1d). Te wczesne badania wykazały również, że EWNS może oddziaływać i inaktywować różne bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie, w tym prątki, na powierzchniach i w powietrzu. Transmisyjna mikroskopia elektronowa wykazała, że ​​inaktywacja była spowodowana przez zaburzenie błony komórkowej. Ponadto badania ostrej inhalacji wykazały, że wysokie dawki EWNS nie powodują uszkodzenia płuc ani stanu zapalnego 8 .
(a) Elektrospray występuje, gdy pomiędzy rurką kapilarną zawierającą ciecz a elektrodą przeciwną przyłożone zostaje wysokie napięcie. (b) Zastosowanie wysokiego ciśnienia powoduje dwa różne zjawiska: (i) elektrospray wody oraz (ii) tworzenie się reaktywnych form tlenu (jonów) uwięzionych w EWNS. (c) Unikalna struktura EWNS. (d) Ze względu na swoją nanostrukturę EWNS są bardzo mobilne i mogą oddziaływać z patogenami unoszącymi się w powietrzu.
Niedawno wykazano również zdolność platformy antybakteryjnej EWNS do inaktywacji mikroorganizmów przenoszonych przez żywność na powierzchni świeżej żywności. Wykazano również, że ładunek powierzchniowy EWNS w połączeniu z polem elektrycznym można wykorzystać do osiągnięcia ukierunkowanej dostawy. Ponadto wstępne wyniki dla ekologicznych pomidorów po 90-minutowej ekspozycji przy EWNS wynoszącym około 50 000 #/cm3 były zachęcające, przy czym zaobserwowano różne mikroorganizmy przenoszone przez żywność, takie jak E. coli i Listeria 11. Ponadto wstępne testy organoleptyczne nie wykazały żadnych efektów sensorycznych w porównaniu z pomidorami kontrolnymi. Chociaż te wstępne wyniki inaktywacji są zachęcające do zastosowań w zakresie bezpieczeństwa żywności nawet przy bardzo niskich dawkach EWNS wynoszących 50 000#/cc. patrz, jasne jest, że wyższy potencjał inaktywacji byłby bardziej korzystny w celu dalszego zmniejszenia ryzyka infekcji i zepsucia.
Tutaj skupimy nasze badania na rozwoju platformy generacji EWNS, aby umożliwić dokładne dostrojenie parametrów syntezy i optymalizację właściwości fizykochemicznych EWNS w celu zwiększenia ich potencjału antybakteryjnego. W szczególności optymalizacja skupiła się na zwiększeniu ich ładunku powierzchniowego (w celu poprawy ukierunkowanego dostarczania) i zawartości ROS (w celu poprawy wydajności inaktywacji). Scharakteryzuj zoptymalizowane właściwości fizykochemiczne (rozmiar, ładunek i zawartość ROS) przy użyciu nowoczesnych metod analitycznych i wykorzystaj powszechne mikroorganizmy spożywcze, takie jak E. .
EVNS został zsyntetyzowany przez równoczesne elektrosprayowanie i jonizację wody o wysokiej czystości (18 MΩ cm–1). Elektryczny nebulizator 12 jest zwykle używany do atomizacji cieczy i syntezy polimerowych i ceramicznych cząstek 13 oraz włókien 14 o kontrolowanej wielkości.
Jak szczegółowo opisano w poprzednich publikacjach 8, 9, 10, 11, w typowym eksperymencie wysokie napięcie przyłożono między kapilarę metalową a uziemioną elektrodę przeciwną. Podczas tego procesu zachodzą dwa różne zjawiska: i) elektrorozpylanie i ii) jonizacja wody. Silne pole elektryczne między dwiema elektrodami powoduje gromadzenie się ładunków ujemnych na powierzchni skroplonej wody, co prowadzi do tworzenia stożków Taylora. W rezultacie powstają silnie naładowane krople wody, które nadal rozpadają się na mniejsze cząsteczki, jak w teorii Rayleigha16. Jednocześnie silne pola elektryczne powodują rozszczepienie się niektórych cząsteczek wody i oderwanie elektronów (jonizację), co prowadzi do powstania dużej ilości reaktywnych form tlenu (ROS)17. Jednocześnie wygenerowany ROS18 został zamknięty w EWNS (rys. 1c).
Na rys. 2a przedstawiono system generacji EWNS opracowany i użyty w syntezie EWNS w tym badaniu. Oczyszczoną wodę przechowywaną w zamkniętej butelce podawano przez rurkę teflonową (średnica wewnętrzna 2 mm) do igły ze stali nierdzewnej 30G (metalowa kapilara). Przepływ wody jest kontrolowany przez ciśnienie powietrza wewnątrz butelki, jak pokazano na rys. 2b. Igła jest zamontowana na konsoli teflonowej i może być ręcznie regulowana do określonej odległości od przeciwelektrody. Przeciwelektroda jest polerowanym dyskiem aluminiowym z otworem w środku do pobierania próbek. Poniżej przeciwelektrody znajduje się aluminiowy lejek do pobierania próbek, który jest podłączony do reszty eksperymentalnej konfiguracji za pomocą portu pobierania próbek (rys. 2b). Aby uniknąć gromadzenia się ładunku, które mogłoby zakłócić działanie próbnika, wszystkie komponenty próbnika są uziemione elektrycznie.
(a) Inżynieryjny system generowania nanostruktury wody (EWNS). (b) Przekrój próbnika i elektrosprayu, pokazujący najważniejsze parametry. (c) Eksperymentalna konfiguracja do inaktywacji bakterii.
Opisany powyżej system generacji EWNS jest w stanie zmieniać kluczowe parametry operacyjne, aby ułatwić dokładne dostrojenie właściwości EWNS. Dostosuj przyłożone napięcie (V), odległość między igłą a przeciwelektrodą (L) i przepływ wody (φ) przez kapilarę, aby dokładnie dostroić charakterystyki EWNS. Symbol używany do reprezentowania różnych kombinacji: [V (kV), L (cm)]. Dostosuj przepływ wody, aby uzyskać stabilny stożek Taylora określonego zestawu [V, L]. Na potrzeby tego badania średnica otworu przeciwelektrody (D) została utrzymana na poziomie 0,5 cala (1,29 cm).
Ze względu na ograniczoną geometrię i asymetrię, natężenia pola elektrycznego nie można obliczyć na podstawie pierwszych zasad. Zamiast tego do obliczenia pola elektrycznego użyto oprogramowania QuickField™ (Svendborg, Dania)19. Pole elektryczne nie jest jednorodne, więc wartość pola elektrycznego na czubku kapilary została użyta jako wartość odniesienia dla różnych konfiguracji.
Podczas badania oceniono kilka kombinacji napięcia i odległości między igłą a przeciwelektrodą pod kątem formowania stożka Taylora, stabilności stożka Taylora, stabilności produkcji EWNS i powtarzalności. Różne kombinacje przedstawiono w tabeli uzupełniającej S1.
Wyjście systemu generacji EWNS zostało podłączone bezpośrednio do Scanning Mobility Particle Size Analyzer (SMPS, Model 3936, TSI, Shoreview, MN) w celu pomiaru stężenia cząstek, a także do Aerosol Faraday Electrometer (TSI, Model 3068B, Shoreview, MN). ) dla prądów aerozolu mierzono zgodnie z opisem w naszej poprzedniej publikacji. Zarówno SMPS, jak i elektrometr aerozolu pobierały próbki przy przepływie 0,5 l/min (całkowity przepływ próbki 1 l/min). Stężenie cząstek i przepływ aerozolu mierzono przez 120 sekund. Pomiar powtarzano 30 razy. Na podstawie pomiarów prądu obliczano całkowity ładunek aerozolu i szacowano średni ładunek EWNS dla danej całkowitej liczby wybranych cząstek EWNS. Średni koszt EWNS można obliczyć, korzystając z równania (1):
gdzie IEl to zmierzony prąd, NSMPS to cyfrowe stężenie mierzone za pomocą SMPS, a φEl to natężenie przepływu na elektrometr.
Ponieważ wilgotność względna (RH) wpływa na ładunek powierzchniowy, podczas całego eksperymentu utrzymywano stałą temperaturę i (RH) na poziomie odpowiednio 21°C i 45%.
Mikroskopia sił atomowych (AFM), Asylum MFP-3D (Asylum Research, Santa Barbara, Kalifornia) i sonda AC260T (Olympus, Tokio, Japonia) zostały użyte do pomiaru rozmiaru i czasu życia EWNS. Częstotliwość skanowania AFM wynosiła 1 Hz, obszar skanowania wynosił 5 μm × 5 μm, a 256 linii skanowania. Wszystkie obrazy poddano wyrównaniu obrazu pierwszego rzędu przy użyciu oprogramowania Asylum (zakres maski 100 nm, próg 100 pm).
Lejek testowy został usunięty, a powierzchnia miki została umieszczona w odległości 2,0 cm od elektrody przeciwnej na czas uśredniania 120 s, aby uniknąć aglomeracji cząstek i tworzenia się nieregularnych kropel na powierzchni miki. EWNS został rozpylony bezpośrednio na powierzchnię świeżo ciętej miki (Ted Pella, Redding, Kalifornia). Obraz powierzchni miki bezpośrednio po rozpylaniu AFM. Kąt zwilżania powierzchni świeżo ciętej niemodyfikowanej miki jest bliski 0°, więc EVNS jest rozprowadzany na powierzchni miki w formie kopuły. Średnicę (a) i wysokość (h) dyfuzyjnych kropel mierzono bezpośrednio z topografii AFM i użyto do obliczenia objętości dyfuzji kopuły EWNS przy użyciu naszej wcześniej sprawdzonej metody. Zakładając, że pokładowe EWNS mają taką samą objętość, średnicę równoważną można obliczyć przy użyciu równania (2):
W oparciu o naszą wcześniej opracowaną metodę, pułapka spinowa rezonansu spinowego elektronów (ESR) została użyta do wykrycia obecności krótkotrwałych pośrednich rodników w EWNS. Aerozole były przepuszczane przez 650 μm Midget sparger (Ace Glass, Vineland, NJ) zawierający 235 mM roztwór DEPMPO(5-(dietoksyfosforyl)-5-metylo-1-pirolino-N-tlenku) (Oxis International Inc.). Portland, Oregon). Wszystkie pomiary ESR zostały wykonane przy użyciu spektrometru Bruker EMX (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) i płaskiej komory. Oprogramowanie Acquisit (Bruker Instruments Inc. Billerica, MA, USA) zostało użyte do zebrania i analizy danych. Określenie charakterystyki ROS przeprowadzono tylko dla zestawu warunków pracy [-6,5 kV, 4,0 cm]. Stężenia EWNS mierzono przy użyciu SMPS po uwzględnieniu strat EWNS w uderzeniu.
Poziom ozonu monitorowano przy użyciu dwuwiązkowego monitora ozonu 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Boulder, Co)8,9,10.
Dla wszystkich właściwości EWNS średnia wartość jest używana jako wartość pomiaru, a odchylenie standardowe jest używane jako błąd pomiaru. Wykonano testy T, aby porównać wartości zoptymalizowanych atrybutów EWNS z odpowiadającymi im wartościami bazowej właściwości EWNS.
Rysunek 2c przedstawia wcześniej opracowany i scharakteryzowany system „wytrącania” elektrostatycznego (EPES), który może być używany do ukierunkowanego dostarczania EWNS na powierzchnię. EPES wykorzystuje ładunki EVNS, które mogą być „kierowane” bezpośrednio na powierzchnię celu pod wpływem silnego pola elektrycznego. Szczegóły systemu EPES przedstawiono w niedawnej publikacji Pyrgiotakisa i in. 11 . EPES składa się zatem z komory z PVC drukowanej w technologii 3D ze zwężającymi się końcami i zawiera dwie równoległe płyty metalowe ze stali nierdzewnej (stal nierdzewna 304, powlekana lustrzanym odbiciem) w środku w odległości 15,24 cm od siebie. Płyty zostały podłączone do zewnętrznego źródła wysokiego napięcia (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), dolna płyta była zawsze podłączona do napięcia dodatniego, a górna płyta była zawsze podłączona do uziemienia (uziemienie pływające). Ściany komory są pokryte folią aluminiową, która jest uziemiona elektrycznie, aby zapobiec utracie cząstek. Komora wyposażona jest w uszczelnione przednie drzwi załadowcze, które umożliwiają umieszczenie powierzchni testowych na plastikowych podstawkach podnoszących je ponad dolną płytę metalową, co zapobiega zakłóceniom wysokiego napięcia.
Wydajność osadzania EWNS w EPES obliczono zgodnie z opracowanym wcześniej protokołem szczegółowo opisanym na rysunku uzupełniającym S111.
Jako komora kontrolna, druga cylindryczna komora przepływowa została podłączona szeregowo do systemu EPES, w którym pośredni filtr HEPA został użyty do usunięcia EWNS. Jak pokazano na rysunku 2c, aerozol EWNS został przepompowany przez dwie wbudowane komory. Filtr między pomieszczeniem kontrolnym a EPES usuwa wszelkie pozostałe EWNS, co skutkuje taką samą temperaturą (T), wilgotnością względną (RH) i poziomem ozonu.
Stwierdzono, że ważne mikroorganizmy przenoszone przez żywność zanieczyszczają świeżą żywność, takie jak E. coli (ATCC #27325), wskaźnik kałowy, Salmonella enterica (ATCC #53647), patogen przenoszony przez żywność, Listeria harmless (ATCC #33090), substytut patogennej Listeria monocytogenes, uzyskany z ATCC (Manassas, VA) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), substytut drożdży powodujących psucie się żywności i bardziej odporna inaktywowana bakteria, Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Kup losowe pudełka organicznych pomidorów winogronowych w lokalnym markecie i przechowuj w lodówce w temperaturze 4°C do momentu użycia (do 3 dni). Eksperymentalne pomidory były tej samej wielkości, około 1/2 cala średnicy.
Protokoły dotyczące hodowli, inokulacji, ekspozycji i liczenia kolonii są szczegółowo opisane w naszej poprzedniej publikacji i szczegółowo opisane w danych uzupełniających. Skuteczność EWNS oceniano poprzez ekspozycję zaszczepionych pomidorów na 40 000 #/cm3 przez 45 minut. Krótko mówiąc, trzy pomidory użyto do oceny przeżywających mikroorganizmów w czasie t = 0 min. Trzy pomidory umieszczono w EPES i wystawiono na EWNS w stężeniu 40 000 #/cc (pomidory wystawione na EWNS), a pozostałe trzy umieszczono w komorze kontrolnej (pomidory kontrolne). Nie przeprowadzono dodatkowego przetwarzania pomidorów w obu grupach. Pomidory wystawione na EWNS i pomidory kontrolne usunięto po 45 minutach w celu oceny wpływu EWNS.
Każdy eksperyment przeprowadzono trzykrotnie. Analizę danych przeprowadzono zgodnie z protokołem opisanym w danych uzupełniających.
Mechanizmy inaktywacji oceniano poprzez sedymentację wystawionych próbek EWNS (45 min przy stężeniu aerozolu EWNS 40 000 #/cm3) i nienapromieniowanych próbek nieszkodliwych bakterii E. coli, Salmonella enterica i Lactobacillus. Cząsteczki utrwalano w 2,5% glutaraldehydu, 1,25% paraformaldehydu i 0,03% kwasu pikrynowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,4) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po przemyciu, utrwalano za pomocą 1% czterotlenku osmu (OsO4)/1,5% żelazocyjanku potasu (KFeCN6) przez 2 godziny, przemywano 3 razy w wodzie i inkubowano w 1% octanie uranylu przez 1 godzinę, następnie przemywano dwukrotnie w wodzie, a następnie odwadniano przez 10 minut w 50%, 70%, 90%, 100% alkoholu. Następnie próbki umieszczono w tlenku propylenu na 1 godzinę i zaimpregnowano mieszaniną tlenku propylenu i TAAP Epon w stosunku 1:1 (Marivac Canada Inc. St. Laurent, CA). Próbki zatopiono w TAAB Epon i polimeryzowano w temperaturze 60°C przez 48 godzin. Utwardzoną żywicę granulowaną pocięto i uwidoczniono za pomocą TEM przy użyciu konwencjonalnego transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEOL 1200EX (JEOL, Tokio, Japonia) wyposażonego w kamerę AMT 2k CCD (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Woburn, Massachusetts, USA).
Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Dla każdego punktu czasowego płukanki bakteryjne były zasiewane w trzech powtórzeniach, co dało łącznie dziewięć punktów danych na punkt, z których średnia została użyta jako stężenie bakterii dla danego mikroorganizmu. Odchylenie standardowe zostało użyte jako błąd pomiaru. Wszystkie punkty się liczą.
Logarytm spadku stężenia bakterii w porównaniu do t = 0 min obliczono według następującego wzoru:
gdzie C0 oznacza stężenie bakterii w próbce kontrolnej w czasie 0 (czyli po wyschnięciu powierzchni, ale przed umieszczeniem jej w komorze), a Cn oznacza stężenie bakterii na powierzchni po n minutach ekspozycji.
Aby uwzględnić naturalny rozkład bakterii podczas 45-minutowej ekspozycji, obliczono również logarytmiczną redukcję po 45 minutach w porównaniu do grupy kontrolnej w następujący sposób:
gdzie Cn jest stężeniem bakterii w próbce kontrolnej w czasie n, a Cn-Kontrola jest stężeniem bakterii kontrolnych w czasie n. Dane przedstawiono jako redukcję logarytmiczną w porównaniu z próbką kontrolną (bez narażenia na EWNS).
Podczas badania oceniono kilka kombinacji napięcia i odległości między igłą a przeciwelektrodą pod kątem formowania stożka Taylora, stabilności stożka Taylora, stabilności produkcji EWNS i powtarzalności. Różne kombinacje przedstawiono w Tabeli uzupełniającej S1. Do kompleksowego badania wybrano dwa przypadki wykazujące stabilne i powtarzalne właściwości (stożek Taylora, generowanie EWNS i stabilność w czasie). Na rys. Rysunek 3 przedstawia wyniki dotyczące ładunku, rozmiaru i zawartości ROS w obu przypadkach. Wyniki przedstawiono również w Tabeli 1. Dla porównania, zarówno Rysunek 3, jak i Tabela 1 obejmują właściwości wcześniej zsyntetyzowanego niezoptymalizowanego EWNS8, 9, 10, 11 (EWNS bazowy). Obliczenia istotności statystycznej przy użyciu dwustronnego testu t zostały ponownie opublikowane w Tabeli uzupełniającej S2. Ponadto dodatkowe dane obejmują badania wpływu średnicy otworu próbkującego przeciwelektrody (D) i odległości między elektrodą uziemiającą a końcówką (L) (Rysunki uzupełniające S2 i S3).
(ac) Dystrybucja wielkości mierzona metodą AFM. (df) Charakterystyka ładunku powierzchniowego. (g) Charakterystyka ROS w EPR.
Ważne jest również, aby zauważyć, że dla wszystkich powyższych warunków zmierzony prąd jonizacji wynosił od 2 do 6 μA, a napięcie od -3,8 do -6,5 kV, co skutkowało poborem mocy mniejszym niż 50 mW dla tego pojedynczego modułu kontaktowego generacji EWNS. Chociaż EWNS był syntetyzowany pod wysokim ciśnieniem, poziomy ozonu były bardzo niskie, nigdy nie przekraczając 60 ppb.
Rysunek uzupełniający S4 przedstawia symulowane pola elektryczne dla scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Dla scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] obliczenia pola wynoszą odpowiednio 2 × 105 V/m i 4,7 × 105 V/m. Jest to oczekiwane, ponieważ w drugim przypadku stosunek napięcia do odległości jest znacznie wyższy.
Na rys. 3a,b pokazano średnicę EWNS zmierzoną za pomocą AFM8. Obliczone średnie średnice EWNS wyniosły odpowiednio 27 nm i 19 nm dla schematów [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm]. Dla scenariuszy [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm] geometryczne odchylenia standardowe rozkładów wynoszą odpowiednio 1,41 i 1,45, co wskazuje na wąski rozkład wielkości. Zarówno średni rozmiar, jak i geometryczne odchylenie standardowe są bardzo zbliżone do bazowego EWNS, odpowiednio przy 25 nm i 1,41. Na rys. 3c pokazano rozkład wielkości bazowego EWNS zmierzonego tą samą metodą w tych samych warunkach.
Na rys. 3d,e przedstawiono wyniki charakterystyki ładunku. Dane są średnimi pomiarami 30 równoczesnych pomiarów stężenia (#/cm3) i prądu (I). Analiza pokazuje, że średni ładunek na EWNS wynosi 22 ± 6 e- i 44 ± 6 e- dla [-6,5 kV, 4,0 cm] i [-3,8 kV, 0,5 cm], odpowiednio. Mają one znacznie wyższe ładunki powierzchniowe w porównaniu do bazowego EWNS (10 ± 2 e-), dwa razy większe niż scenariusz [-6,5 kV, 4,0 cm] i cztery razy większe niż [-3,8 kV, 0,5 cm]. Rysunek 3f przedstawia dane dotyczące ładunku dla bazowego-EWNS.
Z map stężeń liczby EWNS (rysunki uzupełniające S5 i S6) widać, że scenariusz [-6,5 kV, 4,0 cm] ma znacznie więcej cząstek niż scenariusz [-3,8 kV, 0,5 cm]. Warto również zauważyć, że stężenie liczby EWNS monitorowano do 4 godzin (rysunki uzupełniające S5 i S6), gdzie stabilność generacji EWNS wykazała takie same poziomy stężenia liczby cząstek w obu przypadkach.
Na rys. 3g pokazano widmo EPR po odjęciu zoptymalizowanej kontroli EWNS (tło) przy [-6,5 kV, 4,0 cm]. Widma ROS porównano również ze scenariuszem Baseline-EWNS w poprzednio opublikowanej pracy. Liczbę EWNS reagujących z pułapkami spinowymi obliczono na 7,5 × 104 EWNS/s, co jest podobne do poprzednio opublikowanego Baseline-EWNS8. Widma EPR wyraźnie wykazały obecność dwóch typów ROS, przy czym O2- był dominującym gatunkiem, a OH• był mniej obfity. Ponadto bezpośrednie porównanie intensywności szczytów wykazało, że zoptymalizowany EWNS miał znacznie wyższą zawartość ROS w porównaniu ze scenariuszem bazowym EWNS.
Na rys. 4 przedstawiono wydajność osadzania EWNS w EPES. Dane podsumowano również w Tabeli I i porównano z oryginalnymi danymi EWNS. W obu przypadkach EUNS osadzanie jest bliskie 100% nawet przy niskim napięciu 3,0 kV. Zazwyczaj 3,0 kV wystarcza do 100% osadzania, niezależnie od zmiany ładunku powierzchniowego. W tych samych warunkach wydajność osadzania Baseline-EWNS wynosiła tylko 56% ze względu na ich niższy ładunek (średnio 10 elektronów na EWNS).
Na rys. 5 i w tabeli 2 podsumowano wartość inaktywacji mikroorganizmów zaszczepionych na powierzchni pomidorów po narażeniu na około 40 000 #/cm3 EWNS przez 45 minut w optymalnym trybie [-6,5 kV, 4,0 cm]. Zaszczepione E. coli i Lactobacillus innocuous wykazały znaczącą redukcję o 3,8 log podczas 45-minutowej ekspozycji. W tych samych warunkach S. enterica miała spadek o 2,2 log, podczas gdy S. cerevisiae i M. parafortutum miały spadek o 1,0 log.
Mikrofotografie elektronowe (Rysunek 6) przedstawiają zmiany fizyczne wywołane przez EWNS w nieszkodliwych komórkach Escherichia coli, Streptococcus i Lactobacillus, prowadzące do ich inaktywacji. Bakterie kontrolne miały nienaruszone błony komórkowe, podczas gdy bakterie wystawione na działanie miały uszkodzone błony zewnętrzne.
Badanie mikroskopowe bakterii kontrolnych i wystawionych na działanie promieni słonecznych ujawniło uszkodzenie błony komórkowej.
Dane dotyczące właściwości fizykochemicznych zoptymalizowanego EWNS łącznie pokazują, że właściwości (ładunek powierzchniowy i zawartość ROS) EWNS zostały znacząco poprawione w porównaniu z poprzednio opublikowanymi danymi bazowymi EWNS8,9,10,11. Z drugiej strony ich rozmiar pozostał w zakresie nanometrów, bardzo podobnie do wyników zgłoszonych wcześniej, co pozwoliło im pozostać w powietrzu przez długi czas. Obserwowaną polidyspersyjność można wyjaśnić zmianami ładunku powierzchniowego, które określają rozmiar EWNS, losowością efektu Rayleigha i potencjalną koalescencją. Jednak, jak szczegółowo opisali Nielsen i in. 22, wysoki ładunek powierzchniowy zmniejsza parowanie poprzez skuteczne zwiększenie energii powierzchniowej/napięcia kropli wody. W naszej poprzedniej publikacji8 teoria ta została eksperymentalnie potwierdzona dla mikrokropli 22 i EWNS. Utrata ładunku w czasie może również wpływać na rozmiar i przyczyniać się do obserwowanego rozkładu wielkości.