Besin alımı ve dağılımı, böceklerin beslenme ve yaşam döngüsü özelliklerini bütünleştirir. Böcekler, farklı yaşam evrelerinde belirli besin maddelerindeki eksiklikleri telafi etmek için, örneğin, "su birikintileri" olarak bilinen bir süreçte omurgalı salgılarını tüketerek ek beslenme yoluyla bu besinleri elde edebilirler. Anopheles arabiani sivrisineğinin yetersiz beslendiği ve bu nedenle hem metabolizma hem de üreme için besinlere ihtiyaç duyduğu görülmektedir. Bu çalışmanın amacı, An. arabiensis'in besin alımı için inek idrarı ile beslenmesinin yaşam döngüsü özelliklerini iyileştirip iyileştirmediğini değerlendirmektir.
Güvenli olduğundan emin olun. Arabiensis türü, taze, 24 saatlik, 72 saatlik ve 168 saatlik inek idrarının kokusuna çekildi ve konak arayan ve kanla beslenmiş (kan yemeğinden 48 saat sonra) dişiler bir Y-tüp olfaktometresinde ölçüldü ve hamile dişiler yumurtlama testi için değerlendirildi. Daha sonra, dört yaş sınıfının tamamında inek idrarındaki biyoaktif bileşikleri tanımlamak için birleşik kimyasal ve elektrofizyolojik analiz kullanıldı. Biyoaktif bileşiklerin sentetik karışımları Y-tüp ve saha denemelerinde değerlendirildi. Sıtma vektörleri için potansiyel ek besin olarak inek idrarını ve ana azot içeren bileşiği üreyi araştırmak için, beslenme parametreleri ve yaşam öyküsü özellikleri ölçüldü. Dişi sivrisineklerin oranı ve emilen inek idrarı ve üre miktarı değerlendirildi. Beslenmeden sonra, dişiler hayatta kalma, bağlı uçuş ve üreme açısından değerlendirildi.
Konakçının kanını ve besinini ararlar. Laboratuvar ve saha çalışmalarında, Araplar taze ve eski inek idrarının doğal ve sentetik kokusuna ilgi duymuşlardır. Hamile dişiler, yumurtlama alanlarında inek idrarına karşı kayıtsız kalmışlardır. Konakçı arayan ve kan emen dişiler, inek idrarını ve üreyi aktif olarak emerler ve bu kaynakları, fizyolojik durumlarına bağlı olarak uçuş, hayatta kalma veya üreme için yaşam döngüsü ödünleşmelerine göre tahsis ederler.
Anopheles arabinis sivrisineğinin yaşam döngüsü özelliklerini iyileştirmek için inek idrarının edinimi ve dağılımı. İnek idrarı ile ek besleme, günlük hayatta kalma oranını ve vektör yoğunluğunu artırarak vektör kapasitesini doğrudan, uçuş aktivitesini değiştirerek ise dolaylı olarak etkiler ve bu nedenle gelecekteki modellerde dikkate alınmalıdır.
Besin edinimi ve dağılımı, böceklerin beslenme ve yaşam öyküsü özelliklerini bütünleştirir [1,2,3]. Böcekler, besin bulunabilirliğine ve besin gereksinimlerine bağlı olarak besin seçebilir, edinebilir ve telafi edici beslenme gerçekleştirebilir [1, 3]. Besinlerin dağılımı, yaşam öyküsü sürecine bağlıdır ve böceklerin farklı yaşam evrelerinde diyet kalitesi ve miktarı için farklı gereksinimlere yol açabilir [1, 2]. Belirli besinlerdeki eksiklikleri telafi etmek için böcekler, çamur, çeşitli omurgalı dışkıları ve salgıları ve leş gibi ek beslenme yoluyla bu besinleri elde edebilir; bu süreç su birikintileri olarak bilinir [2]. Çeşitli kelebek ve güve türleri öncelikle tanımlanmış olsa da, su birikintileri diğer böcek takımlarında da bulunur ve bu tür kaynaklara çekilme ve bunlarla beslenme, sağlık ve diğer yaşam öyküsü özellikleri üzerinde önemli etkilere sahip olabilir [2, 4, 5, 6, 7]. Sıtma sivrisineği Anopheles gambiae sensu lato (sl), 'beslenme yetersizliği' olan bir yetişkin olarak ortaya çıkar [8], bu nedenle sulama önemli bir rol oynayabilir. Yaşam döngüsü özelliklerinde rol oynayan bu davranış, şimdiye kadar ihmal edilmiştir. Bu önemli taşıyıcıda besin alımını artırmak için çalkalama yönteminin kullanılması, önemli epidemiyolojik sonuçlar doğurabileceğinden dikkat çekmektedir.
Yetişkin dişi Anopheles sivrisineklerinde nitrojen alımı, larva evresinden taşınan düşük kalori rezervleri ve kan yemeğinin verimsiz kullanımı nedeniyle sınırlıdır [9]. Dişi Ann.gambiae sl, bunu genellikle ek kan yemekleriyle telafi eder [10, 11], böylece daha fazla insanı hastalığa yakalanma riskine ve sivrisinekleri daha büyük bir avlanma riskine maruz bırakır. Alternatif olarak, sivrisinekler, diğer böceklerde gösterildiği gibi, adaptasyonu ve uçuş manevra kabiliyetini artıran nitrojenli bileşikleri elde etmek için omurgalı dışkısıyla ek beslenmeyi kullanabilir [2]. Bu bağlamda, An. Gambiya sl tür kompleksi içindeki kardeş türlerden biri olan Anopheles arabinis'in taze ve yaşlanmış inek idrarına olan güçlü ve belirgin çekimi ilginçtir [12,13,14]. Anopheles arabinis, konak tercihlerinde fırsatçıdır ve sığırlarla ilişki kurduğu ve onlarla beslendiği bilinmektedir. İnek idrarı, toplam nitrojenin %50-95'ini oluşturan üre ile zengin bir nitrojenli bileşik kaynağıdır. Taze idrarda [15, 16]. İnek idrarı yaşlandıkça, mikroorganizmalar bu kaynakları kullanarak 24 saat içinde azotlu bileşiklerin karmaşıklığını azaltır [15]. Organik azotun azalmasıyla ilişkili olarak amonyağın hızla artmasıyla, alkalofilik mikroorganizmalar (çoğu sivrisinekler için zehirli bileşikler üreten) gelişir [15], bu da dişi Ann.arabiensis'in 24 saat veya daha az yaşlanmış idrara öncelikli olarak çekilmesine neden olabilir [13, 14].
Bu çalışmada, konakçı ve kanla beslenmiş Ans sivrisinekleri araştırıldı. İlk gonadotropin döngüsü sırasında, arabiensis'in idrar karışımı yoluyla üre de dahil olmak üzere azotlu bileşikleri edinmesi değerlendirildi. Daha sonra, dişi sivrisineklerin bu potansiyel besin kaynağını hayatta kalma, üreme ve daha fazla beslenme için nasıl tahsis ettiğini değerlendirmek üzere bir dizi deney yapıldı. Son olarak, taze ve yaşlanmış inek idrarının kokusu, bunların konakçı ve kanla beslenmiş An için güvenilir ipuçları sağlayıp sağlamadığını belirlemek için değerlendirildi. Bu potansiyel besin kaynağını ararken, arabiensis gözlemlenen farklı çekiciliğin ardındaki kimyasal korelasyonları keşfetti. 24 saat yaşlanmış idrarda tanımlanan uçucu organik bileşiklerin (VOC'ler) sentetik koku karışımları, laboratuvar koşullarında elde edilen sonuçları genişleterek ve inek idrarı kokusunun farklı fizyolojik durumlar üzerindeki etkisini göstererek saha koşullarında daha da değerlendirildi. Sivrisinek çekiciliği. Elde edilen sonuçlar, An. Arabiensis türü, omurgalıların idrarında bulunan azotlu bileşikleri edinir ve dağıtarak yaşam döngüsü özelliklerini etkiler. Bu sonuçlar, potansiyel epidemiyolojik sonuçlar ve vektör gözetimi ve kontrolü için nasıl kullanılabilecekleri bağlamında tartışılmaktadır.
Anopheles arabicans (Dongola suşu) 25 ± 2 °C, %65 ± 5 RH ve 12:12 saatlik aydınlık:karanlık döngüsünde tutuldu. Larvalar, damıtılmış suyla doldurulmuş plastik tepsilerde (20 cm × 18 cm × 7 cm) yetiştirildi ve Tetramin® balık yemi (Tetra Werke, Melle, DE) ile beslendi. Pupalar 30 ml'lik kaplarda (Nolato Hertila, Åstorp, SE) toplandı ve daha sonra yetişkinlerin ortaya çıkmasına izin vermek için Bugdorm kafeslerine (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Tayvan) aktarıldı. Yetişkinlere, ortaya çıkışlarından sonraki 4 güne kadar (dpe) %10'luk sakkaroz çözeltisi serbestçe verildi; bu noktada konak arayan dişilere deneyden hemen önce diyet sunuldu veya deneyden önce damıtılmış su ile bir gece boyunca aç bırakıldı, açıklandığı gibi. Aşağıda belirtildiği gibi, uçuş tüpü deneylerinde kullanılan dişi sivrisinekler, sadece 4-6 saat boyunca susuz bırakıldı. Kan emici sivrisinekleri daha sonraki biyolojik testlere hazırlamak için, 4 günlük dişi sivrisinekler, bir membran besleme sistemi (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, İngiltere) kullanılarak defibrotik koyun kanı (Håtunalab, Bro, SE) ile beslendi. Tamamen kanla dolmuş dişi sivrisinekler daha sonra ayrı kafeslere transfer edildi ve aşağıda açıklandığı gibi doğrudan diyetle veya aşağıda açıklanan deneylerden 3 gün önce %10 sakkaroz ile beslendi. Bu dişi sivrisinekler uçuş tüpü biyolojik testlerinde kullanıldı ve laboratuvara transfer edildi, ardından deneyden 4-6 saat önce damıtılmış su verildi.
Beslenme deneyleri, yetişkin An.Arab dişi sivrisineklerinde idrar ve üre tüketimini ölçmek için kullanıldı. Konak arayan ve kanla beslenen dişi sivrisineklere 48 saat boyunca %1 oranında seyreltilmiş taze ve yaşlanmış inek idrarı, çeşitli konsantrasyonlarda üre ve iki kontrol ( %10 sakkaroz ve su) içeren bir diyet verildi. Ayrıca, diyete gıda boyası (1 mg ml-1 ksilen siyanür FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) eklendi ve 250 µl'lik mikrosantrifüj tüplerinde (Axygen Scientific, Union City, CA, ABD; Şekil 1A) 4 × 4 matris halinde, kenarına kadar (~300 µl) doldurularak sağlandı. Sivrisinekler arasındaki rekabeti ve boya renginin olası etkilerini önlemek için, 10 sivrisinek büyük bir Petri kabına (12 cm çapında ve 6 cm yüksekliğinde; Semadeni, Ostermundigen, CH; Şekil 1A) tamamen karanlıkta yerleştirildi. 25 ± 2 cm °C ve %65 ± 5 bağıl nem. Bu deneyler 5 ila 10 kez tekrarlandı. Yemle beslendikten sonra sivrisinekler daha sonraki analizlere kadar -20 °C'de saklandı.
Konakçı ve kan emici dişi Anopheles arabianus tarafından emilen sığır idrarı ve üreyi inceleyin. Beslenme denemesinde (A), dişi sivrisineklere taze ve yaşlanmış sığır idrarı, çeşitli konsantrasyonlarda üre, sakaroz (%10) ve damıtılmış su (H2O) içeren bir diyet verildi. Konakçı arayan (B) ve kanla beslenen (C) dişiler, test edilen diğer diyetlerden daha fazla sakaroz emdi. Konakçı arayan dişilerin 72 saatlik sığır idrarını 168 saatlik sığır idrarından daha az emdiğine dikkat edin (B). İdrarın ortalama toplam nitrojen içeriği (± standart sapma) ekte gösterilmiştir. Konakçı arayan (D, F) ve kan emici (E, G) dişiler, doza bağlı olarak üre alırlar. Farklı harf adlarına sahip ortalama solunan hacimler (D, E) birbirinden önemli ölçüde farklıydı (Tukey'nin post hoc analizini kullanan tek yönlü ANOVA; p < 0,05). Hata çubukları, ortalama standart hatayı (BE) temsil eder. Düz kesikli çizgi, log-lineer regresyon çizgisini (F, G) temsil eder.
Emilen besinleri serbest bırakmak için, sivrisinekler tek tek 230 µl damıtılmış su içeren 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerine yerleştirildi ve doku, tek kullanımlık bir havan ve kablosuz motor (VWR International, Lund, SE) kullanılarak parçalandı, ardından 10 dakika boyunca 10 krpm'de santrifüj edildi. Süpernatant (200 µl) 96 kuyucuklu bir mikroplakaya (Sigma-Aldrich) aktarıldı ve absorbans (λ620), spektrofotometre tabanlı bir mikroplaka okuyucu (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) kullanılarak belirlendi (nm). Alternatif olarak, sivrisinekler 1 ml damıtılmış suda öğütüldü ve bunun 900 µl'si spektrofotometrik analiz için bir küvete aktarıldı (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Diyet alımını nicelleştirmek için, seri seyreltme yoluyla bir standart eğri hazırlandı. 0,2 µl ila 2,4 µl arasında 1 mg ml-1 ksilen siyanür kullanıldı. Daha sonra, bilinen boya konsantrasyonlarının optik yoğunluğu, her sivrisineğin tükettiği besin miktarını belirlemek için kullanıldı.
Hacim verileri, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin post hoc ikili karşılaştırmaları kullanılarak analiz edildi (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, ABD, 1989–2007). Doğrusal regresyon analizleri, konsantrasyona bağlı üre alımını tanımladı ve konak arayan ve kan emen sivrisinekler arasındaki yanıtları karşılaştırdı (GraphPad Prism v8.0.0 for Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, ABD).
Her yaş grubundan yaklaşık 20 µl idrar örneği, Chromosorb® W/AW'ye (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) bağlanarak kalay kapsüllere (8 mm × 5 mm) yerleştirildi. Kapsüller, üreticinin protokolüne göre taze ve yaşlanmış idrardaki azot içeriğini belirlemek için bir CHNS/O analiz cihazının (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) yanma odasına yerleştirildi. Toplam azot (g N l-1), standart olarak kullanılan bilinen üre konsantrasyonlarına göre ölçüldü.
Diyetin konak arayan ve kan emen dişi sivrisineklerin hayatta kalması üzerindeki etkisini değerlendirmek için, sivrisinekler havalandırma ve besin temini için kapakta ağla kaplı bir delik (3 cm çapında) bulunan büyük Petri kaplarına (12 cm çapında ve 6 cm yüksekliğinde; Semadeni) tek tek yerleştirildi. Diyetler, 4 gün sonra doğrudan verildi ve %1 oranında seyreltilmiş taze ve yaşlanmış inek idrarı, dört farklı üre konsantrasyonu ve iki kontrol grubu olan %10 sakkaroz ve su içeriyordu. Her diyet, 5 ml'lik bir şırıngaya (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE) yerleştirilen bir diş tamponuna (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) pipetlendi, piston çıkarıldı ve bir Petri kabının üzerine yerleştirildi (Şekil 1A). Diyetinizi her gün değiştirin. Laboratuvarı yukarıda açıklandığı gibi muhafaza edin. Hayatta kalan sivrisinekler günde iki kez sayılırken, son sivrisinek ölene kadar ölü sivrisinekler atıldı (tedavi başına n = 40). Çeşitli diyetlerle beslenen sivrisineklerin hayatta kalma oranı... Diyetler arasındaki hayatta kalma dağılımı karşılaştırmaları için Kaplan-Meyer hayatta kalma eğrileri ve log-rank testleri kullanılarak istatistiksel analiz yapılmıştır (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Attisano ve ark.[17]'ye dayalı, ön ve arka panelleri olmayan 5 mm kalınlığında şeffaf akrilik panellerden (10 cm genişlik x 10 cm uzunluk x 10 cm yükseklik) yapılmış özel bir sivrisinek uçurma değirmeni (Şekil 3: üst). Uçları, 9 cm arayla yerleştirilmiş bir çift neodim mıknatıs arasına asılı bir böcek iğnesine yapıştırılmış, gaz kromatografi kolonundan (0,25 mm iç çap; 7,5 cm uzunluk) yapılmış dikey bir tüpe sahip bir pivot düzeneği. Aynı malzemeden yapılmış yatay bir tüp (6,5 cm uzunluk), bağlı bir kol ve ışığı kesen bir sinyal olarak küçük bir alüminyum folyo parçası taşıyan bir kol oluşturmak üzere dikey tüpü ikiye böler.
24 saat aç bırakılan dişi sivrisinekler, kısıtlama işleminden 30 dakika önce yukarıdaki diyetle beslendi. Tamamen beslenmiş dişi sivrisinekler daha sonra tek tek buz üzerinde 2-3 dakika süreyle uyuşturuldu ve balmumu (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) ile böcek iğnelerine tutturuldu ve ardından yatay tüplerin kollarına bağlandı. Uçuş Değirmeni. Uçuş başına devir sayısı, özel olarak üretilmiş bir veri kaydedici tarafından kaydedildi, ardından PC-Lab 2000™ yazılımı (v4.01; Velleman, Gavere, BE) kullanılarak saklandı ve görüntülendi. Uçuş değirmeni, iklim kontrollü bir odaya yerleştirildi (12 saat aydınlık: 12 saat karanlık, 25 ± 2 °C, %65 ± 5 bağıl nem).
Uçuş aktivitesi modelini görselleştirmek için, 24 saatlik bir süre boyunca saat başına toplam uçulan mesafe (m) ve ardışık uçuş aktivitesi sayısı hesaplandı. Ek olarak, bireysel dişilerin uçtuğu ortalama mesafeler, uygulamalar arasında karşılaştırıldı ve tek yönlü ANOVA ve Tukey'nin post hoc analizi (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) kullanılarak analiz edildi; burada ortalama mesafe bağımlı değişken, uygulama ise bağımsız faktör olarak kabul edildi. Ayrıca, ortalama tur sayısı 10 dakikalık artışlarla hesaplandı.
An. arabiensis'in üreme performansına diyetin etkisini değerlendirmek için, altı dişi (4 günlük) kan örnekleri alındıktan sonra doğrudan Bugdorm kafeslerine (30 cm × 30 cm × 30 cm) transfer edildi ve yukarıda açıklandığı gibi 48 saat boyunca deneysel diyetle beslendi. Daha sonra diyetler kaldırıldı ve üçüncü günde 48 saat boyunca her 24 saatte bir değiştirilerek 20 ml damıtılmış su ile doldurulmuş yumurtlama kapları (30 ml; Nolato Hertila) sağlandı. Her diyet rejimi 20-50 kez tekrarlandı. Her deneysel kafes için yumurtalar sayıldı ve kaydedildi. Yumurtaların alt örnekleri, Leica Camera (DFC) 320 R2 ile donatılmış bir Dialux-20 mikroskobu (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) kullanılarak bireysel yumurtaların ortalama boyut ve uzunluk varyasyonunu değerlendirmek için kullanıldı (diyet başına n ≥ 200). Leica Microsystems Ltd., DE). Geri kalan yumurtalar, 24 saat boyunca standart yetiştirme koşulları altında iklim kontrollü bir odada tutuldu ve yakın zamanda ortaya çıkan 1. evre larvaların bir alt örneği (diyet başına n ≥ 200) yukarıda açıklandığı gibi ölçüldü. Yumurta sayısı ve yumurta ve larvaların büyüklüğü, tek yönlü ANOVA ve Tukey'nin post hoc analizi kullanılarak tedaviler arasında karşılaştırıldı (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Arsi ırkı Zebu sığırlarından alınan örneklerden, taze (örneklemeden 1 saat sonra), 24 saat, 72 saat ve 168 saat bekletilmiş idrarın baş boşluğu uçucu bileşenleri toplandı. Kolaylık sağlamak amacıyla, idrar örnekleri inekler ahırda iken sabah erken saatlerde toplandı. 10 bireyden idrar örnekleri alındı ​​ve her bir örnekten 100-200 ml, 3 litrelik kapaklı poliamid plastik bidonlara (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) ayrı ayrı poliamid pişirme torbalarına aktarıldı. Her bir sığır idrar örneğinden baş boşluğu uçucu bileşenleri ya doğrudan (taze) ya da oda sıcaklığında 24 saat, 72 saat ve 168 saat olgunlaştırıldıktan sonra toplandı; yani her idrar örneği her yaş grubunu temsil ediyordu.
Başlık boşluğu uçucu maddelerinin toplanması için, diyaframlı vakum pompası (KNF Neuberger, Freiburg, DE) kullanılarak, aktif karbon filtreli gaz akımı (100 ml min-1) 2,5 saat boyunca bir poliamid torbadan adsorpsiyon kolonuna kapalı devre bir sistem aracılığıyla dolaştırıldı. Kontrol olarak, başlık boşluğu toplama işlemi boş bir poliamid torbadan gerçekleştirildi. Adsorpsiyon kolonu, cam yünü tıkaçlar arasına 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, ABD) içeren Teflon borudan (5,5 cm x 3 mm iç çap) yapılmıştır. Kullanımdan önce kolon, 1 ml yeniden damıtılmış n-heksan (Merck, Darmstadt, DE) ve 1 ml pentan (%99,0 saflıkta çözücü GC sınıfı, Sigma Aldrich) ile yıkandı. Adsorbe edilen uçucu maddeler 400 μl pentan ile elüe edildi. Başlık boşluğu toplama işlemleri birleştirildi ve daha sonra saklandı. -20°C'de, daha sonraki analizler için kullanılana kadar muhafaza edilmelidir.
Konak arayan ve kan yiyen An'ın davranışsal tepkileri. Taze, 24 saat, 72 saat ve 168 saat bekletilmiş idrardan toplanan baş boşluğu uçucu özütleri, düz cam tüplü bir olfaktometre kullanılarak Arabidopsis sivrisineklerinden elde edilen uçucu özütler açısından analiz edildi [18]. Deneyler, An'ın ev arama aktivitesinin en yoğun olduğu dönem olan ZT 13-15 sırasında gerçekleştirildi. [19]. Bir cam tüplü olfaktometre (80 cm × 9,5 cm iç çap), yukarıdan 3 ± 1 lx kırmızı ışıkla aydınlatıldı. Kömür filtreli ve nemlendirilmiş hava akışı (25 ± 2 °C, %65 ± 2 bağıl nem), biyolojik testten 30 cm s-1 hızında geçti. Hava, bir dizi paslanmaz çelik ağ elekten geçirilerek laminer bir akış ve düzgün bir duman yapısı oluşturuldu. Diş tamponu dağıtıcısı (4 cm × 1 cm; U:Ç; DAB Dental AB), olfaktometrenin rüzgar alan ucundaki 5 cm'lik bir bobinden asılıydı ve uyarıcı her 5 dakikada bir değiştiriliyordu. Analiz için, her bir baş boşluğu ekstraktından 1:10 oranında seyreltilmiş 10 μl uyarıcı olarak kullanıldı. Eşit miktarda pentan kontrol olarak kullanıldı. Konak arayan veya kan emen sivrisinekler, deneyin başlamasından 2-3 saat önce ayrı ayrı salım kafeslerine yerleştirildi. Salım kafesi olfaktometrenin rüzgar altı tarafına yerleştirildi ve sivrisineklerin 1 dakika boyunca ortama alışmasına izin verildi, ardından kafesin kelebek vanası açılarak serbest bırakıldı. Tedaviye veya kontrole olan çekim, serbest bırakıldıktan sonraki 5 dakika içinde kaynakla temas eden sivrisineklerin oranı olarak analiz edildi. Her bir baş boşluğu uçucu ekstraktı ve kontrol en az 30 kez tekrarlandı ve herhangi bir günün etkilerinden kaçınmak için, her deney gününde aynı sayıda tedavi ve kontrol test edildi. Konak ve kan emen sivrisineklerden yanıt arama. Cevap: Arapça Nominal lojistik regresyon kullanılarak ve ardından olasılık oranları için ikili karşılaştırmalar yapılarak, boşluk setlerine karşı analizler gerçekleştirildi (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
An'ın yumurtlama tepkisi. Taze ve yaşlanmış inek idrarından elde edilen baş boşluğu özütleri, Bugdorm kafeslerinde (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science) analiz edildi. 20 mL damıtılmış su ile doldurulmuş plastik kaplar (30 mL; Nolato Hertila), yumurtlama substratı olarak kullanıldı ve kafesin karşılıklı köşelerine, 24 cm arayla yerleştirildi. Tedavi kaplarına, her bir baş boşluğu özütünden 1:10 oranında seyreltilmiş 10 μl eklendi. Kontrol kabına ise eşit miktarda pentan eklendi. Pozisyon etkilerini kontrol etmek için tedavi ve kontrol kapları her deney arasında değiştirildi. On adet kanla beslenmiş dişi, ZT 9-11'de deney kafeslerine bırakıldı ve kaplardaki yumurtalar 24 saat sonra sayıldı. Yumurtlama indeksini hesaplama formülü şöyledir: (tedavi kabında bırakılan yumurta sayısı – kontrol kabında bırakılan yumurta sayısı) / (toplam bırakılan yumurta sayısı). Her tedavi tekrarlandı. 8 kez.
Dişi An.arabiensis'in gaz kromatografik ve elektron anten deseni algılama (GC-EAD) analizi daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirildi [20]. Kısaca, taze başlık alanı uçucu özütleri, HP-5 kolonu (30 m × 0,25 mm iç çap, 0,25 μm film kalınlığı, Agilent Technologies) ile donatılmış bir Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, ABD) kullanılarak ayrıldı. ve yaşlanmış idrar. Hareketli faz olarak hidrojen kullanıldı ve ortalama doğrusal akış hızı 45 cm s-1 idi. Her örnek (2 μl), 225 °C giriş sıcaklığında, bölünmesiz modda 30 saniye boyunca enjekte edildi. GC fırın sıcaklığı, 35 °C'den (3 dakika bekleme) 300 °C'ye (10 dakika bekleme) 10 °C min-1 hızla programlandı. GC çıkış ayırıcısında, alev iyonizasyon dedektörü ile EAD arasında Gerstel 3D/2 düşük ölü hacimli çapraz bağlantıda (Gerstel, Mülheim, DE) 1:1 oranında 4 psi azot eklendi ve bölündü. EAD için GC çıkış kılcal borusu, GC fırın sıcaklığını artı 5 °C takip eden bir Gerstel ODP-2 transfer hattından geçirilerek bir cam tüpe (10 cm × 8 mm) aktarıldı ve burada karbon filtreli, nemlendirilmiş hava (1,5 l) ile karıştırıldı. (min−1). Anten, tüpün çıkışından 0,5 cm uzaklığa yerleştirildi. Her bir sivrisinek bir tekrara karşılık geldi ve konak arayan sivrisinekler için, her yaştaki idrar örneklerinde en az üç tekrar yapıldı.
Taze ve yaşlanmış sığır idrarının baş boşluğu koleksiyonlarında biyoaktif bileşiklerin tanımlanması, GC-EAD analizinde anten yanıtlarını ortaya çıkarmak için kombine bir GC ve kütle spektrometresi (GC-MS; 6890 GC ve 5975 MS; Agilent Technologies) kullanılarak, 70 eV'de elektron çarpma iyonizasyon modunda çalıştırılarak gerçekleştirilmiştir. GC, ortalama doğrusal akış hızı 35 cm s-1 olan helyumun hareketli faz olarak kullanıldığı bir HP-5MS UI kaplı kaynaşmış silika kılcal kolon (60 m × 0,25 mm iç çap, 0,25 μm film kalınlığı) ile donatılmıştır. GC-EAD analizi için kullanılan enjektör ayarları ve fırın sıcaklığıyla aynı şekilde 2 μl'lik bir numune enjekte edilmiştir. Bileşikler, tutma sürelerine (Kovát indeksi) ve kütle spektrumlarına göre özel kütüphane ve NIST14 kütüphanesi (Agilent) ile karşılaştırılarak tanımlanmıştır. Tanımlanan bileşikler, otantik standartların enjekte edilmesiyle doğrulanmıştır (Ek Dosya 1: Tablo S2). Nicelleştirme için, heptil asetat (10 ng, %99,8 kimyasal saflık, Aldrich) harici standart olarak enjekte edildi.
Taze ve yaşlanmış idrarda tanımlanan biyoaktif bileşiklerden oluşan sentetik bir koku karışımının, konak arayan ve kan emen Ans.arabiensis sivrisineklerini çekme etkinliğinin, yukarıdakiyle aynı olfaktometre ve protokol kullanılarak değerlendirilmesi. Sentetik karışımlar, taze, 24 saat, 48 saat, 72 saat ve 168 saat yaşlanmış idrarın karışık baş boşluğu uçucu özütlerindeki bileşiklerin bileşimini ve oranlarını taklit etti (Şekil 5D-G; Ek Dosya 1: Tablo S2). Analiz için, konak ve kan emen sivrisineklere çekiciliği değerlendirmek üzere, yaklaşık 140-2400 ng h-1 arasında değişen genel salınım hızına sahip, tamamen sentetik karışımın 1:100 seyreltisinin 10 μl'si kullanıldı. Daha sonra, test, tam karışımdaki tek bileşiklerin çıkarıldığı tam karışımlar üzerinde gerçekleştirildi. Konak ve kan emen Ans.arabiensis'ten sentetik ve çıkarılmış karışımlara karşı arama tepkileri. Nominal lojistik regresyon kullanılarak analiz edildi ve ardından olasılık oranları için ikili karşılaştırmalar yapıldı (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Sıtma sivrisinekleri için inek idrarının konak habitatı ipucu olarak işlev görüp görmediğini değerlendirmek amacıyla, yukarıda açıklandığı gibi toplanan taze ve eski inek idrarı ve su, 3 litrelik (100 ml) ağlı kovalara konuldu ve konak yem tuzaklarına yerleştirildi (BG-HDT versiyonu; BioGents, Regensburg, DE). On tuzak, köy yerleşiminden 400 m uzaklıkta (Silay, Etiyopya, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) ve sığır bulunmayan, kalıcı üreme alanlarında ve köylerde, 50 m aralıklarla yerleştirildi. Beş tuzak, konak varlığını simüle etmek için ısıtılırken, beş tuzak ısıtılmadan bırakıldı. Her uygulama yeri, toplam beş gece boyunca her gece değiştirildi. Farklı yaşlardaki idrarla yemlenmiş tuzaklarda yakalanan sivrisinek sayıları, beta binom dağılımına sahip lojistik regresyon kullanılarak karşılaştırıldı (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Etiyopya'nın Oromia bölgesindeki Maki kasabası yakınlarında, sıtmanın endemik olduğu bir köyde (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Şekil 6A). Çalışma, yıllık iç mekan kalıntı ilaçlamasından önce, uzun bir yağmur mevsimiyle birlikte, Ağustos ortası ile Eylül ortası arasında gerçekleştirildi. Çalışma için köyün dış kesimlerinde bulunan beş çift ev (20-50 m arayla) seçildi (Şekil 6A). Evlerin seçiminde kullanılan kriterler şunlardı: evde hayvan bulundurulmaması, iç mekanda yemek pişirilmesine (odun veya kömür yakılmasına) izin verilmemesi (en azından deneme süresi boyunca) ve evlerde en fazla iki kişinin yaşaması, böcek ilacı kullanılmaması. İşlem görmüş sivrisinek ağının altında. Etik onay, Dünya Tıp Birliği Helsinki Bildirgesi'nde belirtilen yönergelere uygun olarak, Addis Ababa Üniversitesi Doğa Bilimleri Fakültesi Kurumsal Araştırma Etik İnceleme Kurulu (CNS-IRB) tarafından verilmiştir. Her hane reisinden sağlık hizmetleri personeli yardımıyla onay alınmıştır. Tüm süreç, ilçe ve mahalle (kebele) düzeyindeki yerel yönetimler tarafından onaylanmıştır. Deneysel tasarım, sentetik karışımların ve kontrollerin ilk gece eşleştirilmiş evlere atandığı ve sonraki deney gecesinde evler arasında değiştirildiği 2 × 2 Latin kare tasarımını izlemiştir. Bu işlem on kez tekrarlanmıştır. Ayrıca, seçilen evlerdeki sivrisinek aktivitesini tahmin etmek için, CDC tuzakları, saha denemesinin başlangıcında, ortasında ve sonunda aynı saatte beş ardışık gece boyunca çalışacak şekilde ayarlanmıştır.
Altı biyoaktif bileşik içeren sentetik bir karışım heptanda (GC sınıfı %97,0 çözücü, Sigma Aldrich) çözüldü ve pamuk fitil dağıtıcı kullanılarak 140 ng h-1 hızında salındı ​​[20]. Fitil dağıtıcı, 12 saatlik deney boyunca tüm bileşiklerin sabit oranlarda salınmasına olanak sağladı. Heptan kontrol olarak kullanıldı. Şişe, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) ışık tuzağının (John W. Hock Company, Gainesville, FL, ABD; Şekil 6A) giriş noktasının yanına asıldı. Tuzaklar, yatağın ayak ucuna yakın, yerden 0,8 – 1 m yükseklikte asıldı ve bir gönüllü, işlenmemiş bir sivrisinek ağı altında uyudu ve 18:00 ile 06:30 arasında çalıştırıldı. Cinsiyete ve fizyolojik duruma (beslenmemiş, beslenmiş, yarı hamile ve hamile [21]) göre yakalanan sivrisinekler daha sonra, morfolojik olarak A. gambiae olarak tanımlanan türü belirlemek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) analizi kullanılarak tarandı. Kompleksin üyeleri [23]. Saha çalışmasında, eşleştirilmiş evlerin tuzaklanması, çekimin bağımlı değişken ve işlemin (sentetik karışım vs kontrol) sabit etki olduğu nominal lojistik uyum modeli kullanılarak analiz edildi (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Burada, olasılık oranı testinden elde edilen χ2 ve p-değerlerini rapor ediyoruz.
Güvenli olup olmadığını değerlendirin. Arabiensis, konak arayan ve kan emen dişi beslenme denemelerinden sonraki 4 gün boyunca (dpe) uygulamadan sonraki 48 saat içinde ana nitrojen kaynağı olan üreyi doğrudan beslenerek elde edebildi (Şekil 1A). Hem konak arayan hem de kan emen dişiler, diğer tüm diyetlerden veya sudan önemli ölçüde daha fazla sakaroz emdi (sırasıyla F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 ve F(5,299) = 56,00, p < 0,0001; Şekil 1B,C). Ayrıca, konak arayan dişiler 72 saatte 168 saate kıyasla daha az idrar tüketti (Şekil 1B). Üre içeren bir diyet sunulduğunda, konak arayan dişiler, diğer tüm konsantrasyonlara ve suya kıyasla 2,69 mM'de önemli ölçüde daha fazla üre emdi, ancak kan emen dişilerden ayırt edilemezdi. %10 sakaroz (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Şekil 1D). Bu, tipik olarak sudan önemli ölçüde daha fazla üre içeren diyetleri emen, ancak %10 sakarozdan önemli ölçüde daha az emen kanla beslenen dişilerin tepkisinin aksineydi (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Şekil 1E). Ayrıca, iki fizyolojik durum karşılaştırıldığında, flebotomi uygulanan dişiler en düşük konsantrasyonlarda konak arayan dişilerden daha fazla üre emdi ve bu dişiler daha yüksek konsantrasyonlarda benzer miktarda üre emdi (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Şekil 1F, G). Üre içeren bir diyetten alım optimal değerlere sahip gibi görünse de (Şekil 1D,E), her iki fizyolojik durumdaki dişiler de Üre konsantrasyonlarının tüm aralığı boyunca emilen üre miktarını logaritmik doğrusal bir şekilde düzenlerler (Şekil 1F,G). Benzer şekilde, sivrisinekler de idrardaki azot miktarının emilen miktara yansıması nedeniyle, emilen idrar miktarını düzenleyerek azot alımlarını kontrol ediyor gibi görünmektedir (Şekil 1B, C ve B ekleri).
İdrar ve ürenin konak arayan ve kan emen sivrisineklerin hayatta kalması üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, dişiler dört farklı yaştaki idrarla (taze, bırakıldıktan 24 saat, 72 saat ve 168 saat sonra) ve çeşitli üre konsantrasyonlarıyla beslendi; ayrıca kontrol olarak damıtılmış su ve %10 sakkaroz kullanıldı (Şekil 2A). Bu hayatta kalma analizi, diyetin konak arayan dişilerde (idrar: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; üre: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Şekil 2B, C) ve kan emen dişilerde (idrar: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; üre: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001) genel hayatta kalma üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğunu gösterdi. 0.0001; Şekil 2D,E). Tüm deneylerde, idrar, üre ve su ile beslenen dişilerin hayatta kalma oranları, sukroz diyetiyle beslenen dişilere kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü (Şekil 2B-E). Konak arayan dişiler, taze ve bayat idrarla beslendiklerinde farklı hayatta kalma oranları sergilediler; 72 saatlik bayat idrarla beslenenlerin hayatta kalma olasılığı en düşüktü (p = 0.016) (Şekil 2B). Ayrıca, 135 mM üre ile beslenen konak arayan dişiler, su kontrollerine göre daha uzun süre hayatta kaldı (p < 0.04) (Şekil 2C). Su ile karşılaştırıldığında, taze idrar ve 24 saatlik idrarla beslenen dişiler daha uzun süre hayatta kaldı (sırasıyla p = 0.001 ve p = 0.012; Şekil 2D), 72 saatlik idrarla beslenen dişiler ise taze idrar ve 24 saatlik bayat idrarla beslenen dişilere göre daha uzun süre hayatta kaldı (p < 0.0001 ve p = 0.013, (Şekil 2D). 135 mM üre ile beslendiğinde, kanla beslenen dişiler diğer tüm üre ve su konsantrasyonlarına göre daha uzun süre hayatta kaldı (p < 0,013; Şekil 2E).
İnek idrarı ve üre ile beslenen konak arayan ve kan emen dişi Anopheles arabinis sivrisineklerinin hayatta kalma oranı. Biyoanalizde (A), dişi sivrisineklere taze ve eski inek idrarı, çeşitli konsantrasyonlarda üre, sakkaroz (%10) ve damıtılmış su (H2O) içeren bir diyet verildi. Konak arayan (B, C) ve kan emen (D, E) sivrisineklerin hayatta kalma oranı, idrar (B, D) ve üre (C, E) ile beslenen tüm dişiler ve kontrol grubu olan sakkaroz ve su ile beslenenler ölene kadar her 12 saatte bir kaydedildi.
24 saatlik bir süre boyunca uçuş değirmeni testinde belirlenen toplam mesafe ve tur sayısı, konak arayan ve kan emen sivrisinekler arasında farklılık gösterdi; kan emen sivrisinekler genel olarak daha az uçuş aktivitesi gösterdi (Şekil 3). Taze ve eski idrar veya sakkaroz ve su verilen konak arayan sivrisinekler farklı uçuş modelleri sergiledi (Şekil 3); taze idrarla beslenen dişiler şafakta daha aktifti, 24 ve 168 saat eski idrarla beslenenler ise daha aktifti. İdrarla beslenen sivrisinekler farklı uçuş modelleri sergiledi ve esas olarak gündüz aktifti. Sakkaroz veya 72 saatlik idrar verilen dişi sivrisinekler 24 saatlik süre boyunca aktivite gösterirken, su verilen dişiler orta dönemde daha aktifti. Sakkarozla beslenen sivrisinekler gece geç saatlerde ve sabah erken saatlerde en yüksek aktivite seviyelerini gösterirken, 72 saat eski idrarı tüketenler 24 saat boyunca aktivitede sürekli bir düşüş yaşadı (Şekil 3).
İnek idrarı ve üre ile beslenen, av arayan kan emici dişi Anopheles arabinis sivrisineklerinin uçuş performansı. Uçuş değirmeni testinde, taze ve eski inek idrarı, çeşitli konsantrasyonlarda üre, sakaroz (%10) ve damıtılmış su (H2O) ile beslenen dişi sivrisinekler, yatay, serbestçe dönen kollara (yukarıda) bağlanmıştır. Konak arayan (solda) ve kan emici (sağda) dişiler için, 24 saatlik bir süre boyunca her diyet için toplam mesafe ve saat başına uçuş sayısı kaydedilmiştir (koyu: gri; açık: beyaz). Ortalama mesafe ve ortalama uçuş sayısı, sirkadiyen aktivite grafiğinin sağında gösterilmiştir. Hata çubukları, ortalama standart hatayı temsil eder. İstatistiksel analiz için metne bakınız.
Genel olarak, konak arayan dişi sivrisineklerin genel uçuş aktivitesi, 24 saatlik bir süre boyunca uçuş mesafesine benzer bir örüntü izledi. Ortalama uçuş mesafesi, tüketilen diyetten önemli ölçüde etkilendi (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001) ve 72 saatlik idrar tüketen konak arayan dişi sivrisinekler, diğer tüm diyetlere kıyasla önemli ölçüde daha uzun mesafeler uçtu (p < 0,0001) ve sukrozla beslenen sivrisinekler, taze (p = 0,022) ve 24 saatlik yaşlandırılmış idrarla (p = 0,022) beslenen sivrisineklerden daha uzun süre uçtu. İdrar diyetiyle tanımlanan uçuş aktivitesi örüntüsünün aksine, üre ile beslenen konak arayan dişi sivrisinekler, 24 saatlik bir süre boyunca sürekli uçuş aktivitesi sergiledi ve karanlık fazın ikinci yarısında zirveye ulaştı (Şekil 3). Aktivite örüntüleri benzer olmasına rağmen, üre ile beslenen konak arayan dişi sivrisinekler, emilen konsantrasyona bağlı olarak ortalama uçuş mesafesini önemli ölçüde artırdı (F(5, 138) = 1310.91, p < 0.0001). Konak arayan dişiler, herhangi bir konsantrasyonda üre ile beslendiklerinde, su veya sakaroz ile beslenen dişilerden daha uzun süre uçtular (p < 0.03).
Kan emici sivrisineklerin genel uçuş aktivitesi, tüm diyetlerde 24 saat boyunca istikrarlı ve sürdürülebilirdi; suyla beslenen dişilerde ve taze ve 24 saatlik idrarla beslenen dişilerde karanlık dönemin ikinci yarısında idrar aktivitesinde artış gözlendi (resim 3). İdrar diyeti, kanla beslenen dişilerde ortalama uçuş mesafesini önemli ölçüde etkilerken (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), üre diyeti etkilemedi (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24). Diğer idrar ve kontrol diyetleriyle karşılaştırıldığında (taze, p = 0,0091; 72 saat, p = 0,0022; 168 saat, p = 0,001; sakkaroz, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
İdrar ve üre ile beslenmenin üreme parametreleri üzerindeki etkileri, yumurtlama biyoanalizlerinde değerlendirildi (Şekil 4A) ve her dişi tarafından bırakılan yumurta sayısı, yumurta boyutu ve yeni çıkan birinci evre larvalara göre incelendi. İdrarla beslenen Arap dişilerinin bıraktığı yumurta sayısı diyete göre değişti (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Şekil 4B). 24 saatlik idrar ve kan yemeği ile beslenen dişiler, diğer idrar diyetleriyle beslenen dişilerden önemli ölçüde daha fazla yumurta bıraktı ve sukrozla beslenenlerle benzerdi (Şekil 4B). Benzer şekilde, idrarla beslenen dişilerin bıraktığı yumurtaların boyutu diyete göre değişti (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), 24 saatlik idrar ve sukrozla beslenen dişiler, suyla beslenen dişilerden önemli ölçüde daha büyük yumurtalar bıraktı, oysa 168 saatlik idrarla beslenen dişilerin yumurtaları önemli ölçüde daha küçüktü (Şekil 4B). 4C).Ayrıca, idrar diyeti larva boyutunu önemli ölçüde etkiledi (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), 24 ve 72 saatlik idrarla beslenen dişilerin bıraktığı yumurtalardan çıkan larvalar, suyla beslenen ve 168 saatlik idrarla beslenen dişilerin bıraktığı yumurtalardan çıkan larvalardan önemli ölçüde daha büyüktü (Şekil 4D).
Dişi Anopheles arabinis sivrisineklerinin inek idrarı ve üre ile beslenmesinin üreme performansı. Kanla beslenen dişi sivrisinekler, biyolojik testlere yerleştirilmeden ve yumurtlama substratları elde edilmeden önce 48 saat boyunca taze ve yaşlanmış inek idrarı, çeşitli konsantrasyonlarda üre, sakaroz (%10) ve damıtılmış su (H2O) içeren diyetlerle beslendi (A). Yumurta sayısı (B, E), yumurta boyutu (C, F) ve larva boyutu (D, G), verilen diyetten (inek idrarı: BD; üre: EG) önemli ölçüde etkilendi. Farklı harf adları kullanılarak ölçülen her parametre için ortalamalar birbirinden önemli ölçüde farklıydı (Tukey'nin post hoc analizini kullanan tek yönlü ANOVA; p < 0,05). Hata çubukları, ortalama standart hatayı temsil eder.
İdrarın ana azotlu bileşeni olan üre, kanla beslenen dişilere diyet olarak verildiğinde, tüm çalışmalarda üreme parametrelerini önemli ölçüde etkiledi. Üre ile beslenen dişilerin kan yemeğinden sonra bıraktığı yumurta sayısı, üre konsantrasyonuna bağlı olarak (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001) 134 µM ile 1,34 mM arasında üre konsantrasyonuyla beslenen dişiler daha fazla yumurta bıraktı (Şekil 4E). 134 µM veya üzeri üre konsantrasyonuyla beslenen dişiler, suyla beslenen dişilerden daha büyük yumurtalar bıraktı (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Şekil 4F) ve larva boyutu, annelerde benzer üre konsantrasyonlarından etkilenmesine rağmen (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) daha değişkendi (Şekil 4G).
Konak arayan sığır idrarı baş boşluğu uçucu özütlerine genel çekicilik. Cam tüp olfaktometresinde değerlendirilen arabiensis türü, idrar yaşına göre önemli ölçüde etkilendi (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Şekil 5B). Post hoc analiz, 24 saatlik bayat idrar kokusunun, diğer tüm uygulamalara kıyasla (72 saat: p = 0,0060, 168 saat: p = 0,012, pentan: p = 0,00070) önemli ölçüde daha yüksek çekicilik seviyelerine neden olduğunu gösterdi, taze idrar kokusu hariç (p = 0,13; Şekil 5B). Kan emici sivrisineklerin idrar kokusuna genel çekiciliği önemli ölçüde farklı olmasa da (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Şekil 5C), bu dişilerin baş boşluğu uçucu özütlerine kıyasla önemli ölçüde daha çekici olduğu bulundu. 72 saat bekletilmiş idrar, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı farklılık göstermiştir (p = 0,0066; Şekil 5C).
Konakçı ve kan emen Anopheles arabianus sivrisineğini ararken doğal ve sentetik inek idrarı kokularına karşı davranışsal tepkiler. Cam tüp olfaktometrenin şematik gösterimi (A). Taze ve yaşlanmış inek idrarından elde edilen uçucu özütlerin konakçı (B) ve kan emen (C) sivrisineklere çekimi. Lord An'ın dokunaç tepkisini bulun. Taze (D), 24 saat (E), 72 saat (F) ve 168 saat (G) yaşlanmış inek idrarından izole edilen uçucu özütler gösterilmiştir. Elektron anten dedektörü (EAD) izleri, gaz kromatografından elüe edilen ve alev iyonizasyon dedektörü (FID) tarafından algılanan uçucu bileşiklere yanıt olarak voltaj değişikliklerini göstermektedir. Ölçek çubuğu, yanıt genliğini (mV) tutma süresine (s) karşı temsil eder. Biyolojik olarak aktif bileşiklerin özellikleri ve salınım hızları (µg h-1) gösterilmiştir. Tek bir yıldız (*) tutarlı düşük genlikli bir yanıtı gösterir. Çift yıldız (**) tekrarlanamayan yanıtları gösterir. Konakçı (H) ve kan emici (I) An.arabiensis'i bulun. An.arabiensis, taze ve eski inek idrarı kokularının sentetik karışımlarına farklı çekicilik gösterir. Farklı harf adlarına çekilen sivrisineklerin ortalama oranları birbirlerinden önemli ölçüde farklıydı (Tukey'nin post hoc analizini kullanan tek yönlü ANOVA; p < 0,05). Hata çubukları ölçeğin standart hatasını temsil eder.
Dişi Ann.arabiensis'te, kan emme işleminden 72 ve 120 saat sonra, yumurtlama sırasında, taze ve yaşlanmış inek idrarından elde edilen uçucu özütler ile pentan kontrolleri arasında herhangi bir tercih gözlemlenmedi (χ2 = 3.07, p > 0.05; Ek dosya 1: Şekil S1).
Dişi Ann.arabiensis için GC-EAD ve GC-MS analizleri sırasıyla sekiz, altı, üç ve üç biyoaktif bileşik tanımladı (Şekil 5D-G). Elektrofizyolojik yanıtları tetikleyen bileşik sayısında farklılıklar gözlemlenmesine rağmen, bu bileşiklerin çoğu taze ve yaşlanmış idrardan toplanan her bir uçucu ekstraktta mevcuttu. Bu nedenle, her ekstrakt için, yalnızca dişi antenlerinden eşik değerin üzerinde fizyolojik bir yanıt üreten bileşikler daha ileri analizlere dahil edildi.
Baş boşluğunda toplanan biyoaktif bileşiklerin toplam uçucu salınım hızı, taze idrarda 29 µg h-1'den 168 saat bekletilmiş idrarda 242 µg h-1'e yükselmiştir; bu artış esas olarak p-kresol ve m-formaldehitin yanı sıra fenolün de artışından kaynaklanmaktadır. Buna karşılık, 2-sikloheksen-1-on ve dekanal gibi diğer bileşiklerin salınım hızları, idrar yaşı arttıkça azalmıştır; bu durum, kromatogramda (Şekil 5D-G sol panel) gözlemlenen sinyal yoğunluğundaki (bolluk) azalma ve bu bileşiklere verilen fizyolojik yanıtlarla (Şekil 5D-G sağ panel) ilişkilidir.
Genel olarak, sentetik karışım, taze ve yaşlanmış idrarın uçucu özütlerinde tanımlanan biyoaktif bileşiklerin benzer doğal oranına sahipti (Şekil 5D–G) ve konak arayışında (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Şekil 5H) veya kan emici sivrisineklerde (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Şekil 5I) önemli bir çekicilik uyandırmadı. Bununla birlikte, tedaviler arasındaki post hoc ikili karşılaştırmalar, konak arayan sivrisineklerin pentan kontrollerine kıyasla 24 saat yaşlanmış idrarın sentetik karışımına önemli ölçüde çekici olduğunu gösterdi (p = 0,0086; Şekil 5H).
24 saat bekletilmiş idrarın sentetik karışımlarındaki bireysel bileşenlerin rolünü değerlendirmek için, bireysel bileşiklerin çıkarıldığı Y-tüp deneyinde altı çıkarıcı karışım, tam karışımlara karşı değerlendirildi. Konak arayan sivrisinekler için, tam karışımdan bireysel bileşiklerin çıkarılması davranışsal tepkiler üzerinde önemli bir etkiye sahipti (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Ek Dosya 1: Şekil S2A), tüm çıkarıcı karışımlar tam karışıma göre daha çekiciydi. Buna karşılık, tam sentetik karışımdan bireysel bileşiklerin çıkarılması, kan emici sivrisineklerin davranışsal tepkilerini etkilemedi (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), ancak dekanal, tam karışıma kıyasla daha düşük seviyelerde çekiciliğe neden oldu (p = 0,022; Ek Dosya 1: Şekil S2B).
Etiyopya'da sıtmanın endemik olduğu bir köyde, saha koşullarında sivrisinekleri çekmede 24 saatlik inek idrarından oluşan sentetik bir karışımın etkinliği on gece boyunca değerlendirildi (Şekil 6A). Toplam 4.861 sivrisinek yakalandı ve tanımlandı; bunların %45,7'si Anthropus gambiae sl, %18,9'u Anopheles pharoensis ve %35,4'ü Culex spp. idi (Ek dosya 1: Tablo S1). Anopheles arabinis, PCR analizi ile tanımlanan An.Gambian tür kompleksinin tek üyesidir. Ortalama olarak, gece başına 320 sivrisinek yakalandı; bu süre zarfında sentetik karışım yemli tuzaklar, karışım içermeyen eşleştirilmiş tuzaklara göre daha fazla sivrisinek yakaladı (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Yem içermeyen tuzaklar, beş kontrol gecesinin her birinde başlangıçta, ortada ve sonda kuruldu. Deneme süresince her tuzak çiftinde benzer sayıda sivrisinek yakalandı; bu da evler arasında bir sapma olmadığını (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) ve çalışma süresi boyunca popülasyonda bir azalma olmadığını gösteriyor. Kontrol tuzaklarıyla karşılaştırıldığında, sentetik karışım içeren tuzaklarda yakalanan sivrisinek sayısı önemli ölçüde arttı: konak arayan (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), yakın zamanda kan emen (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) ve gebelik (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Ek dosya 1: Tablo S1). Bu durum, yakalanan toplam sivrisinek sayısına da yansıyor: konak arayan > kan emen > gebe > yarı gebe > erkek.
24 saatlik sentetik inek idrarı kokusu karışımının etkinliğinin saha değerlendirmesi. Saha denemeleri, Etiyopya'nın güney-orta kesiminde (harita), Maki kasabası yakınlarında (ek), Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) ışık tuzağı (sağda) kullanılarak, Latin kare tasarımına sahip çift evlerde (havadan görüntü) (A) gerçekleştirildi. Sentetik koku yemli CDC fototuzakları, dişi Anopheles arabesques'i (B) cezbeder ve yakalar, ancak Anopheles farroes'i (C) farklı bir şekilde, fizyolojik duruma bağlı bir etkiyle cezbetmez ve yakalamaz. Ek olarak, bu tuzaklar, konakçı Culex sivrisineklerinin sayısını önemli ölçüde artırdı. (D) Kontrol ile karşılaştırıldığında. Soldaki çubuklar, koku yemli (yeşil) ve kontrol (açık) tuzak çiftlerinde yakalanan sivrisineklerin ortalama seçim indeksini (N = 10) temsil ederken, sağdaki çubuklar kontrol tuzak çiftlerinde (açık; N = 5) ortalama seçim indeksini temsil eder. Yıldız işaretleri istatistiksel anlamlılık düzeylerini gösterir (*p = 0,01 ve ***p < 0,0001).
Üç tür, sentetik karışımlar içeren tuzaklarda farklı şekillerde yakalandı. Konak arayan (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), kan emen (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) ve hamile kalan (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) bir Pharoensis, sentetik karışımı salan tuzakta yakalandı (Şekil 6B), ancak An miktarı farklılık göstermedi. Farklı fizyolojik durumlarda Pharoensis bulundu (Şekil 6C). Culex için, kontrol tuzaklarıyla karşılaştırıldığında, sentetik karışımla yemlenmiş tuzaklarda sadece konak arayan sivrisinek sayısında anlamlı bir artış bulundu (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Şekil 6D).
Etiyopya'da üreme alanları ve kırsal topluluklar arasında potansiyel konakçıların dışında yerleştirilen konakçı yem tuzakları, sıtma sivrisineklerinin inek idrarı kokusunu konakçı habitat ipucu olarak kullanıp kullanmadığını değerlendirmek için kullanıldı. Konakçı ipuçlarının yokluğunda, ısıda ve inek idrarı kokusunun varlığında veya yokluğunda hiçbir sivrisinek yakalanmadı (Ek Dosya 1: Şekil S3). Bununla birlikte, yüksek sıcaklık ve inek idrarı kokusunun varlığında, dişi sıtma sivrisinekleri çekildi ve yakalandı, ancak sayıları azdı ve idrarın yaşına bağlı değildi (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Ek Dosya 1: Şekil S3). Buna karşılık, su kontrollerinde yüksek sıcaklıklarda sıtma sivrisineği yakalanmadı (Ek Dosya 1: Şekil S3).
Sıtma sivrisinekleri, diğer böceklere benzer şekilde yaşam öyküsü özelliklerini geliştirmek için inek idrarı (yani su birikintileri) ile telafi edici beslenme yoluyla azot içeren bileşikleri edinir ve dağıtır [2, 4, 24, 25, 26]. İnek idrarı, sıtma vektörleri için dinlenme yerleriyle yakından ilişkili, kolayca bulunabilen yenilenebilir bir kaynaktır; bunlar arasında ahırlar ve kırsal evlerin ve yumurtlama alanlarının yakınındaki uzun bitki örtüsü bulunur. Dişi sivrisinekler bu kaynağı koku yoluyla bulur ve idrardaki azotlu bileşiklerin, özellikle idrardaki ana azotlu bileşen olan ürenin alımını düzenleyebilir [15, 16]. Dişi sivrisineğin fizyolojik durumuna bağlı olarak, idrardaki besinler, konak arayan dişi sivrisineklerin uçuş aktivitesini ve hayatta kalmasını, ayrıca ilk gonadotropik döngü sırasında kanla beslenen bireylerin hayatta kalma ve üreme özelliklerini geliştirmek için tahsis edilir. Bu nedenle, idrar karışımı, yetersiz beslenmiş yetişkinler gibi kapalı olan sıtma vektörleri için önemli bir beslenme rolü oynar [8], çünkü dişi sivrisineklere önemli azotlu bileşikleri edinme yeteneği sağlar. Düşük riskli beslenme. Bu bulgunun önemli epidemiyolojik sonuçları vardır, çünkü dişiler yaşam sürelerini, aktivitelerini ve üreme verimliliklerini artırırlar ve bunların hepsi vektör kapasitesini etkiler. Dahası, bu davranış gelecekteki vektör yönetimi programlarının hedefi olabilir.