Získávání a distribuce živin integruje shánění potravy hmyzem a charakteristiky životního cyklu. Aby hmyz kompenzoval nedostatky specifických živin v různých fázích života, může tyto živiny získávat doplňkovým krmením, například krmením sekrety obratlovců procesem známým jako louže. Komár Anopheles arabiani se zdá být podvyživený, a proto potřebuje živiny jak pro metabolismus, tak pro reprodukci. Cílem této studie bylo posoudit, zda agitace An. arabiensis na kravské moči za účelem získávání živin zlepšuje charakteristiky životního cyklu.
Ujistěte se, že je to bezpečné. arabiensis byl přitahován vůní čerstvé, 24 hodin, 72 hodin a 168 hodin staré kravské moči a samice hledající hostitele a krmené krví (48 hodin po krevním jídle) byly měřeny v olfaktometru s Y-zkumavkou a březí samice byly vyhodnoceny pro test tření. Poté byla použita kombinovaná chemická a elektrofyziologická analýza k identifikaci bioaktivních sloučenin v kravské moči ve všech čtyřech věkových kategoriích. Syntetické směsi bioaktivních sloučenin byly vyhodnoceny v pokusech s Y-zkumavkou a v polních pokusech. Pro zkoumání kravské moči a její hlavní sloučeniny obsahující dusík, močoviny, jako potenciální doplňkové stravy pro přenašeče malárie byly měřeny parametry krmení a charakteristiky životního cyklu. Byl hodnocen podíl samic komárů a množství absorbované kravské moči a močoviny. Po krmení byly samice vyhodnoceny z hlediska přežití, letu na vázaném pásu a reprodukce.
Hledání krve a potravy hostitele. V laboratorních a terénních studiích Araby přitahovala přirozená a syntetická vůně čerstvé a zralé kravské moči. Březí samice byly k reakcím kravské moči na místech tření lhostejné. Samice hledající hostitele a sající krev aktivně absorbují kravskou moč a močovinu a alokují tyto zdroje podle kompromisů v životním cyklu jako funkce fyziologického stavu pro let, přežití nebo reprodukci.
Anopheles arabinis získává a distribuuje kravskou moč pro zlepšení charakteristik životního cyklu. Doplňkové krmení kravskou močí přímo ovlivňuje kapacitu vektorů zvýšením denního přežití a hustoty vektorů a nepřímo změnou letové aktivity, a proto by mělo být v budoucích modelech zváženo.
Získávání a distribuce živin integruje charakteristiky shánění potravy hmyzem a jeho životní cyklus [1,2,3]. Hmyz je schopen vybírat a získávat potravu a provádět kompenzační krmení na základě dostupnosti potravy a požadavků na živiny [1, 3]. Distribuce živin závisí na životním cyklu a může vést k různým požadavkům na kvalitu a kvantitu stravy v různých životních stádiích hmyzu [1, 2]. Aby hmyz kompenzoval nedostatky specifických živin, může je získávat doplňkovým krmením, například bahnem, různými exkrementy a sekrety obratlovců a mršinami, což je proces známý jako kaluže [2]. Ačkoli je primárně popsána řada druhů motýlů a můr, napajedla se vyskytují i ​​u jiných hmyzích řádů a přitahování těchto typů zdrojů a krmení se jimi může mít významný vliv na zdraví a další životní rysy [2, 4, 5, 6],7]. Malarický komár Anopheles gambiae sensu lato (sl) se jeví jako „podvyživený“ dospělý jedinec [8], takže zalévání může hrát důležitou roli v jeho životním cyklu, ale toto chování bylo dosud opomíjeno. Použití agitace jako prostředku ke zvýšení příjmu živin v tomto důležitém nástroji si zaslouží pozornost, protože může mít závažné epidemiologické důsledky.
Příjem dusíku u dospělých samic komárů rodu Anopheles je omezený kvůli nízkým kalorickým rezervám přenášeným z larválního stádia a neefektivnímu využití krevní moučky [9]. Samice Ann.gambiae sl to obvykle kompenzují doplňováním krevní moučky [10, 11], čímž vystavují více lidí riziku nákazy nemocí a komáry většímu riziku predace. Alternativně mohou komáři využívat doplňkové krmení výkaly obratlovců k získávání dusíkatých sloučenin, které zlepšují adaptaci a manévrovatelnost letu, jak demonstruje jiný hmyz [2]. V tomto ohledu je zajímavá silná a zřetelná přitažlivost jednoho z příbuzných druhů v rámci gambijského druhového komplexu An.Anopheles arabinis, čerstvé a zralé kravské moči [12,13,14]. Anopheles arabinis je oportunistický ve svých preferencích hostitele a je známo, že se stýká s dobytkem a živí se jím. Kravská moč je zdroj bohatý na dusíkaté sloučeniny, přičemž močovina tvoří 50–95 % celkového dusíku v čerstvé moči [15, 16]. Jak kravská moč stárne, Mikroorganismy využívají tyto zdroje ke snížení složitosti dusíkatých sloučenin do 24 hodin [15]. S rychlým nárůstem amoniaku, který je spojen s poklesem organického dusíku, se daří alkalofilním mikroorganismům (z nichž mnohé produkují sloučeniny toxické pro komáry) [15], což může být způsobeno tím, že samičky Ann.arabiensis jsou přednostně přitahovány močí starou 24 hodin nebo méně [13, 14].
V této studii byly hledány hostitelské a krví krmené An. Během svého prvního cyklu gonadotropinů byl arabiensis hodnocen z hlediska získávání dusíkatých sloučenin, včetně močoviny, smícháním moči. Následně byla provedena série experimentů s cílem posoudit, jak samice komárů alokují tento potenciální zdroj živin pro lepší přežití, reprodukci a další shánění potravy. Nakonec byl hodnocen zápach čerstvé a staré kravské moči, aby se zjistilo, zda tyto informace poskytují spolehlivé vodítka pro hostitelské a krví krmené An. Při hledání tohoto potenciálního zdroje živin arabiensis objevil chemické korelace, které stojí za pozorovanou rozdílnou atraktivitou. Syntetické směsi pachů těkavých organických sloučenin (VOC) identifikovaných v 24hodinové moči byly dále hodnoceny v polních podmínkách, čímž se rozšířily výsledky získané v laboratorních podmínkách a demonstroval se vliv zápachu bovinní moči na různé fyziologické stavy. Přitažlivost komárů. Získané výsledky potvrzují, že An. arabiensis získává a distribuuje dusíkaté sloučeniny nalezené v moči obratlovců, aby ovlivnil charakteristiky životního cyklu. Tyto výsledky jsou diskutovány v kontextu potenciálních epidemiologických důsledků a toho, jak je lze využít pro sledování a kontrolu vektorů.
Ryby Anopheles arabicans (kmen Dongola) byly uchovávány při teplotě 25 ± 2 °C, relativní vlhkosti 65 ± 5 % a cyklu světlo:tma 12:12 hodin. Larvy byly chovány v plastových miskách (20 cm × 18 cm × 7 cm) naplněných destilovanou vodou a krmeny krmivem pro ryby Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Německo). Kukly byly odebrány do 30ml misek (Nolato Hertila, Åstorp, Švédsko) a poté přeneseny do klecí Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Tchaj-wan), aby se umožnilo vylíhnutí dospělých jedinců. Dospělým jedincům byl podáván 10% roztok sacharózy ad libitum až do 4 dnů po vylíhnutí (dpe), načež byla samicím hledajícím hostitele bezprostředně před experimentem nabídnuta strava nebo byly před experimentem přes noc hladovět s destilovanou vodou, jak je popsáno níže. Samice použité pro experimenty s letovou trubicí hladověly pouze 4-6 dní. hodiny s vodou ad libitum. Pro přípravu krev sajících komárů pro následné biologické testy byly 4 samice dpe podány defibrotickou ovčí krví (Håtunalab, Bro, SE) pomocí membránového krmného systému (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Plně přeplněné samice byly poté přemístěny do jednotlivých klecí a podávána jim je přímo strava, jak je popsáno níže, nebo 10% sacharóza ad libitum po dobu 3 dnů před níže popsanými experimenty. Tyto samice byly použity pro biologické testy v letových zkumavkách a přemístěny do laboratoře a poté jim byla po dobu 4-6 hodin před experimentem podána destilovaná voda ad libitum.
Pro kvantifikaci spotřeby moči a močoviny u dospělých samic plemene An.Arab byly použity krmné testy. Samice vyhledávající hostitele a krmené krví dostávaly po dobu 48 hodin dietu obsahující 1 % zředěné čerstvé a stárnoucí kravské moči, různé koncentrace močoviny a dvě kontroly (10 % sacharózy a vody). Dále bylo do diety přidáno potravinářské barvivo (1 mg ml-1 xylenkyanid FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) a dodáváno v matrici 4 × 4 v mikrocentrifugačních zkumavkách o objemu 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; obrázek 1A) naplněných po okraj (~300 µl). Aby se zabránilo konkurenci mezi komáry a potenciálním účinkům barviva, umístěte 10 komárů do velké Petriho misky (o průměru 12 cm a výšce 6 cm; Semadeni, Ostermundigen, CH; obrázek 1A) v úplné tmě při teplotě 25 ± 2 cm °C a relativní vlhkosti 65 ± 5 %. Tyto experimenty... byly opakovány 5 až 10krát. Po vystavení potravě byli komáři umístěni do teploty -20 °C do další analýzy.
Hledejte bovinní moč a močovinu absorbovanou hostitelem a krev sající samicí Anopheles arabianus. V krmné studii (A) byly samicím komárů podávány potravy sestávající z čerstvé a vyzrálé kravské moči, různých koncentrací močoviny, sacharózy (10 %) a destilované vody (H2O). Samice vyhledávající hostitele (B) a krev sající (C) absorbovaly více sacharózy než jakákoli jiná testovaná potrava. Všimněte si, že samice vyhledávající hostitele absorbovaly 72hodinovou kravskou moč méně než 168hodinovou kravskou moč (B). Průměrný celkový obsah dusíku (± směrodatná odchylka) v moči je znázorněn ve vloženém grafu. Samice vyhledávající hostitele (D, F) a krev sající (E, G) přijímají močovinu v závislosti na dávce. Průměrné vdechnuté objemy (D, E) s různými písmennými názvy se od sebe významně lišily (jednosměrná ANOVA s použitím Tukeyho post hoc analýzy; p < 0,05). Chybové úsečky představují směrodatnou chybu průměru (BE). Přerušovaná čára představuje logaritmickou regresní přímku (F, G).
Pro uvolnění absorbované potravy byli komáři jednotlivě umístěni do 1,5ml mikrozkumavek obsahujících 230 µl destilované vody a tkáň byla rozrušena pomocí jednorázového tloučku a bezdrátového motoru (VWR International, Lund, SE), následovala centrifugace při 10 krpm po dobu 10 minut. Supernatant (200 µl) byl přenesen na 96jamkovou mikrotitrační destičku (Sigma-Aldrich) a absorbance (λ620) byla stanovena pomocí spektrofotometrické čtečky mikrotitračních destiček (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) [2 nm]. Alternativně byli komáři rozemleti v 1 ml destilované vody, z níž bylo 900 µl přeneseno do kyvety pro spektrofotometrickou analýzu (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE]. Pro kvantifikaci příjmu potravy byla připravena standardní křivka sériovým ředěním, čímž se získalo 0,2 µl až 2,4 µl xylenu o koncentraci 1 mg ml-1. kyanid. Poté byla optická hustota známých koncentrací barviva použita k určení množství potravy, kterou každý komár spolkl.
Objemová data byla analyzována pomocí jednofaktorové analýzy rozptylu (ANOVA) s následným párovým srovnáním dle Tukeyho (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1989–2007). Lineární regresní analýzy popsaly koncentračně závislý příjem močoviny a porovnaly reakce mezi komáry vyhledávajícími hostitele a krev sajícími komáry (GraphPad Prism v8.0.0 pro Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Přibližně 20 µl vzorků moči z každé věkové skupiny bylo navázáno na Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) a zapouzdřeno do cínových kapslí (8 mm × 5 mm). Kapsle byly vloženy do spalovací komory analyzátoru CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) za účelem stanovení obsahu dusíku v čerstvé a stárnoucí moči podle protokolu výrobce. Celkový dusík (g N l-1) byl kvantifikován na základě známých koncentrací močoviny použitých jako standard.
Pro posouzení vlivu stravy na přežití samic vyhledávajících hostitele a sajících krev byli komáři jednotlivě umístěni do velkých Petriho misek (o průměru 12 cm a výšce 6 cm; Semadeni) s otvorem ve víku (průměr 3 cm) zakrytým síťkou. Pro ventilaci a zásobování potravou byli komáři jednotlivě umístěni do velkých Petriho misek a zahrnovali 1% zředěnou čerstvou a vyzrálou kravskou moč, čtyři koncentrace močoviny a dvě kontroly, 10% sacharózu a vodu. Každá strava byla pipetou nanesena na zubní tampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) vložený do 5ml stříkačky (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), píst byl odstraněn a umístěn na Petriho misku (obrázek 1).1A). Stravu měňte každý den. Udržujte laboratoř dle výše popsaného postupu. Přeživší komáři byli počítáni dvakrát denně, zatímco mrtví komáři byli vyhazováni, dokud neumřel poslední komár (n = 40 na ošetření). Přežití komárů krmených různými stravami bylo statisticky analyzováno pomocí Kaplan-Meyerových křivek přežití a log-rank testů. porovnat distribuci přežití mezi různými dietami (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Zakázkový létající mlýn na komáry podle Attisana a kol.[17], vyrobený z 5 mm silných průhledných akrylových panelů (10 cm šířka x 10 cm délka x 10 cm výška) bez předního a zadního panelu (obr. 3: nahoře). Otočná sestava s vertikální trubicí vyrobenou z plynové chromatografické kolony (vnitřní průměr 0,25 mm; délka 7,5 cm) s konci přilepenými k jehle proti hmyzu zavěšené mezi dvojicí neodymových magnetů vzdálených od sebe 9 cm. Horizontální trubice vyrobená ze stejného materiálu (délka 6,5 ​​cm) rozdělovala vertikální trubici a tvořila uvázané rameno a rameno, které neslo malý kousek hliníkové fólie jako signál přerušující světlo.
Samice hladovějící 24 hodin dostávaly výše uvedenou dietu po dobu 30 minut před znehybněním. Plně krmené samičky komárů byly poté jednotlivě anestetizovány na ledu po dobu 2–3 minut a připevněny k hmyzím špendlíkům včelím voskem (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) a poté přivázány k ramenům horizontálních trubic. Letící mlýn. Otáčky za let byly zaznamenávány pomocí speciálně vyrobeného datového záznamníku, poté uloženy a zobrazeny pomocí softwaru PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Letící mlýn byl umístěn v místnosti s regulovanou teplotou (12 h:12 h, světlo:tma, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relativní vlhkosti).
Pro vizualizaci vzorce letové aktivity byla vypočítána celková uletěná vzdálenost (m) a celkový počet po sobě jdoucích letových aktivit za hodinu během 24hodinového období. Kromě toho byly průměrné uletěné vzdálenosti jednotlivých samic porovnány napříč různými terapiemi a analyzovány pomocí jednocestné ANOVA a Tukeyho post hoc analýzy (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), kde průměrná vzdálenost byla považována za závislou proměnnou, zatímco terapie je nezávislým faktorem. Průměrný počet kol se navíc vypočítává v 10minutových krocích.
Pro posouzení vlivu stravy na reprodukční výkonnost An.arabiensis bylo šest samic (4 dpe) po odběru krve přemístěno přímo do klecí Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) a poté jim byla po dobu 48 hodin poskytována experimentální strava, jak je popsáno výše. Strava byla poté vyjmuta a třetí den byly na 48 hodin poskytnuty třavé misky (30 ml; Nolato Hertila) naplněné 20 ml destilované vody, které se měnily každých 24 hodin. Každý dietní režim opakujte 20–50krát. Vajíčka byla spočítána a zaznamenána pro každou experimentální klec. Dílčí vzorky vajec byly použity k posouzení průměrné velikosti a délkové variability jednotlivých vajec (n ≥ 200 na stravu) za použití mikroskopu Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Německo) vybaveného kamerou Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Německo). Zbývající vajíčka byla uchovávána v klimatizované místnosti za standardních chovných podmínek po dobu 24 hodin a byl změřen podvzorek nedávno vylíhlých larev 1. instaru (n ≥ 200 na potravu), jak je popsáno výše. Počet vajíček a velikost vajíček a larev byly porovnány mezi jednotlivými experimenty pomocí jednofaktorové ANOVA a Tukeyho post hoc analýzy (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Z vzorků odebraných od skotu plemene Zebu a Arsi byly odebrány těkavé látky z čerstvé moči (1 hodinu po odběru), 24 hodin, 72 hodin a 168 hodin stárnuté moči. Pro usnadnění byly vzorky moči odebrány brzy ráno, když byly krávy ještě ve stáji. Vzorky moči byly odebrány od 10 jedinců a 100–200 ml každého vzorku bylo přeneseno do jednotlivých polyamidových pekařských sáčků (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Německo) v 3litrových polyamidových sudech s víkem z vinylchloridu. Těkavé látky z každého vzorku moči skotu byly odebrány buď přímo (čerstvé), nebo po zrání při pokojové teplotě po dobu 24 hodin, 72 hodin a 168 hodin, tj. každý vzorek moči byl reprezentativní pro každou věkovou skupinu.
Pro sběr těkavých látek z headspace byl použit uzavřený systém, který cirkuloval proud plynu filtrovaného přes aktivní uhlí (100 ml min-1) přes polyamidový sáček do adsorpční kolony po dobu 2,5 hodiny za použití membránové vakuové pumpy (KNF Neuberger, Freiburg, Německo). Jako kontrola byl proveden sběr z headspace z prázdného polyamidového sáčku. Adsorpční kolona byla vyrobena z teflonových trubic (5,5 cm x 3 mm vnitřek) obsahujících 35 mg Porapaku Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) mezi zátkami ze skleněné vaty. Před použitím byla kolona propláchnuta 1 ml redestilovaného n-hexanu (Merck, Darmstadt, Německo) a 1 ml pentanu (99,0% čistota, rozpouštědlo, stupeň GC, Sigma Aldrich). Adsorbované těkavé látky byly eluovány 400 μl pentanu. Sběry z headspace byly sloučeny a poté uloženy při teplotě -20 °C do další analýzy.
Behaviorální reakce komárů rodu Arabidopsis vyhledávajících hostitele a živících se krví. Těkavé extrakty z headspace odebrané z čerstvé, 24hodinové, 72hodinové a 168hodinové moči byly analyzovány na těkavé extrakty z komárů Arabidopsis pomocí rovné skleněné trubice olfaktometru [18]. Experimenty byly provedeny během ZT 13-15, což je vrcholné období aktivity komárů rodu An při hledání domova. Arab [19]. Skleněná trubice olfaktometru (80 cm × 9,5 cm vnitřní průměr) byla osvětlena 3 ± 1 lx červeného světla shora. Proud vzduchu filtrovaného přes aktivní uhlí a zvlhčeného vzduchu (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % relativní vlhkost) prošel biotestem rychlostí 30 cm s-1. Vzduch prochází řadou sít z nerezové oceli, čímž vzniká laminární proudění a rovnoměrná struktura oblaku. Dávkovač dentálních tamponů (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), zavěšený na 5cm cívce na návětrném konci olfaktometr se změnou stimulátoru každých 5 minut. Pro analýzu bylo jako stimul použito 10 μl každého extraktu z headspace, zředěného 1:10. Jako kontrola bylo použito stejné množství pentanu. Jednotliví komáři vyhledávající hostitele nebo sající krev byli 2–3 hodiny před zahájením experimentu umístěni do individuálních klecí pro uvolnění. Klec pro uvolnění byla umístěna na návětrnou stranu olfaktometru a komáři se nechali 1 minutu aklimatizovat, poté byl otevřen motýlkový ventil klece pro uvolnění. Přitažlivost k ošetření nebo kontrole byla analyzována jako podíl komárů, kteří přišli do kontaktu se zdrojem do 5 minut od uvolnění. Každý těkavý extrakt z headspace a kontrola byly replikovány alespoň 30krát a aby se zabránilo účinkům kteréhokoli jednoho dne, byl v každý experimentální den testován stejný počet ošetření a kontrol. Odpovědi Seek od hostitele a krví krmených Ans. Arabské versus headspace soubory byly analyzovány pomocí nominální logistické regrese následované párovým srovnáním poměrů lichých (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Anova reakce na tření. Extrakty z čerstvé a staré kravské moči byly analyzovány v klecích Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastové kelímky (30 ml; Nolato Hertila) naplněné 20 ml destilované vody sloužily jako substrát pro tření a byly umístěny v protilehlých rozích klece, vzdálených od sebe 24 cm. Extrahované kelímky byly upraveny 10 μl každého extraktu z headspace v ředění 1:10. K úpravě kontrolního kelímku bylo použito stejné množství pentanu. Extrahované a kontrolní kelímky byly mezi jednotlivými experimenty vyměněny za účelem kontroly vlivu polohy. Deset krví krmených samic bylo vypuštěno do experimentálních klecí v čase ZT 9-11 a vajíčka v kelímcích byla spočítána o 24 hodin později. Vzorec pro výpočet indexu tření je: (počet vajíček nakladených do extraktového kelímku – počet vajíček nakladených do kontrolního kelímku) / (celkový počet vajíček nakladených). Každá procedura byla opakována 8krát.
Analýza samičích organismů An.arabiensis pomocí plynové chromatografie a detekce elektronového anténního diagramu (GC-EAD) byla provedena dle dříve popsaného postupu [20]. Stručně řečeno, čerstvé těkavé extrakty z headspace byly separovány za použití plynového chromatografu Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, USA) vybaveného kolonou HP-5 (30 m × 0,25 mm vnitřní průměr, tloušťka filmu 0,25 μm, Agilent Technologies). a stárnoucí moč. Jako mobilní fáze byl použit vodík s průměrným lineárním průtokem 45 cm s-1. Každý vzorek (2 μl) byl vstřikován po dobu 30 sekund v bezdělicím režimu se vstupní teplotou 225 °C. Teplota plynové chromatografické pece byla naprogramována od 35 °C (3minutová výdrž) do 300 °C (10minutová výdrž) při 10 °C min-1. Do děliče výtoku z plynového chromatografu byl přidán dusík pod tlakem 4 psi a rozdělen v poměru 1:1 v křížovém přístroji Gerstel 3D/2 s nízkým mrtvým objemem (Gerstel, Mülheim, Německo) mezi plamenným ionizačním detektorem a EAD. Kapilára výtoku z plynového chromatografu pro EAD byla vedena přenosovou linkou Gerstel ODP-2, která sleduje teplotu plynové chromatografické pece plus 5 °C, do skleněné trubice (10 cm × 8 mm), kde byl smíchán s zvlhčeným vzduchem filtrovaným přes uhlík (1,5 l min-1). Anténa byla umístěna 0,5 cm od výstup zkumavky. Každý jednotlivý komár představoval jednu replikaci a u komárů hledajících hostitele byly provedeny alespoň tři replikace na vzorcích moči každého stáří.
Identifikace bioaktivních sloučenin v headspace sbírkách čerstvé a stárnoucí bovinní moči za použití kombinovaného plynového chromatografu (GC-MS; 6890 GC a 5975 MS; Agilent Technologies) k vyvolání anténních odpovědí v GC-EAD analýze, pracující v režimu ionizace elektronovým nárazem při 70 eV. GC byl vybaven kapilární kolonou z taveného oxidu křemičitého s povlakem HP-5MS UI (vnitřní průměr 60 m × 0,25 mm, tloušťka filmu 0,25 μm) s použitím helia jako mobilní fáze s průměrnou lineární rychlostí průtoku 35 cm s-1. Vzorek o objemu 2 μl byl injektován za použití stejného nastavení injektoru a teploty pece jako pro GC-EAD analýzu. Sloučeniny byly identifikovány na základě jejich retenčního času (Kovátův index) a hmotnostních spekter ve srovnání s vlastní knihovnou a knihovnou NIST14 (Agilent). Identifikované sloučeniny byly potvrzeny injektováním autentických standardů (Dodatečný soubor 1: Tabulka S2). Pro kvantifikaci byl použit heptylacetát (10 ng, Jako externí standard byl injektován roztok (chemická čistota 99,8 %, Aldrich).
Vyhodnocení účinnosti syntetické směsi pachů sestávající z bioaktivních sloučenin identifikovaných v čerstvé a zralé moči k přilákání hostitele vyhledávajících a krev sajících Ans.arabiensis za použití stejného olfaktometru a protokolu jako výše. Syntetické směsi napodobovaly složení a poměry sloučenin ve směsných těkavých extraktech z čerstvé, 24hodinové, 48hodinové, 72hodinové a 168hodinové moči (obrázek 5D-G; Další soubor 1: Tabulka S2). Pro analýzu se použije 10 μl ředění 1:100 plně syntetické směsi s celkovou rychlostí uvolňování v rozmezí přibližně 140-2400 ng h-1 pro posouzení atraktivity pro hostitele a krev sající komáry. Poté se test provede na kompletních směsích, ve kterých se odstraní subtraktivní směsi jednotlivých sloučenin z kompletní směsi. Hledání odpovědí od hostitele a krev krmených Ans. Arab vs. syntetické a subtraktivní směsi byly analyzovány pomocí nominální logistické regrese následované párovým srovnáním poměrů lichých čísel (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Aby se posoudilo, zda by kravská moč mohla sloužit jako vodítko pro hostitelské prostředí pro komáry způsobující malárii, byla čerstvá a vyzrálá kravská moč, odebraná výše popsaným způsobem, a voda umístěny do sítových třílitrových kbelíků (100 ml) a vsazeny do pastí s návnadou na hostitele. (verze BG-HDT; BioGents, Regensburg, Německo). Deset pastí bylo umístěno 50 m od sebe na pastvině, 400 m od vesnické komunity (Silay, Etiopie, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) a bez skotu, na trvalých hnízdištích a vesnicích. Pět pastí bylo vyhříváno, aby se simulovala přítomnost hostitele, zatímco pět pastí bylo ponecháno nevyhřívaných. Každé ošetřené místo se každou noc střídá po dobu celkem pěti nocí. Počty komárů zachycených v pastvích s návnadou na moč různého stáří byly porovnány pomocí logistické regrese s beta binominovým rozdělením (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
V vesnici s endemickým výskytem malárie poblíž města Maki v regionu Oromia v Etiopii (8° 11′ 08″ s. š., 38° 81′ 70″ v. d.; obrázek 6A). Studie byla provedena mezi polovinou srpna a polovinou září před každoročním postřikem zbytkovými látkami v interiéru, spolu s dlouhým obdobím dešťů. Pro studii bylo vybráno pět párů domů (vzdálených 20–50 m) nacházejících se na okraji vesnice (obr. 6A). Kritéria použitá pro výběr domů byla: v domě nebyl povolen vstup zvířat, vaření v interiéru (tažení palivového dřeva nebo dřevěného uhlí) nebylo povoleno (alespoň během zkušební doby) a domy s maximálně dvěma obyvateli, které spí v neinsekticidními insekticidy. pod ošetřenou moskytiérou. Etické schválení udělila Etická komise pro výzkum (IRB/022/2016) Fakulty přírodních věd (CNS-IRB) Univerzity v Addis Abebě v souladu s pokyny stanovenými Helsinskou deklarací Světové lékařské asociace. Souhlas od každé osoby v čele domácnosti byl získán za pomoci zdravotnického personálu. Celý proces je schválen místními samosprávami na úrovni okresů a okrsků („kebele“). Experimentální design se řídil latinským čtvercem 2 × 2, ve kterém byly syntetické směsi a kontroly přiřazeny do párových domů první noc a následující experimentální noc byly mezi domy vyměněny. Tento proces byl desetkrát opakován. Pro odhad aktivity komárů ve vybraných domech byly pasti CDC nastaveny tak, aby běžely pět po sobě jdoucích nocí na začátku, uprostřed a na konci polního pokusu ve stejnou denní dobu.
Syntetická směs obsahující šest bioaktivních sloučenin byla rozpuštěna v heptanu (97,0% rozpouštědlo, stupeň GC, Sigma Aldrich) a uvolňována rychlostí 140 ng h-1 pomocí dávkovače s bavlněným knotem [20]. Dávkovač s knotem umožňoval uvolňování všech sloučenin v konstantním poměru po celou dobu 12hodinového experimentu. Heptan byl použit jako kontrola. Lahvička byla zavěšena vedle vstupního bodu světelné pasti Centra pro kontrolu a prevenci nemocí (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; obrázek 6A). Pasti byly zavěšeny 0,8–1 m nad zemí, v blízkosti nohou postele, a dobrovolník spal pod neošetřenou moskytiérou a byl v provozu mezi 18:00 a 6:30. Komáři odchycení podle pohlaví a fyziologického stavu (nekrmení, krmení, polobřezí a březí [21]) byli následně vyšetřeni pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) za účelem identifikace druhu morfologicky identifikovaného jako A. gambiae sl. Členové komplexu [23]. V terénu V této studii byl analyzován systém zachycování párových domů pomocí nominálního logistického modelu, kde přitažlivost byla závislou proměnnou a úprava (syntetická směs vs. kontrola) byla fixním efektem (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Zde uvádíme hodnoty χ2 a p z testu poměru pravděpodobnosti.
Zhodnoťte, zda je to bezpečné. Kmen arabiensis byl schopen získat moč, svůj hlavní zdroj dusíku, močovinu, přímým krmením, do 48 hodin po podání po dobu 4 dnů po (dpe) krmných pokusech u samic vyhledávajících hostitele a krmených krví (obr. 1A). Samice vyhledávající hostitele i samice sající krev absorbovaly významně více sacharózy než jakoukoli jinou stravu nebo vodu (F(5 426) = 20,15, p < 0,0001 a F(5 299) = 56,00, p < 0,0001; obr. 1B,C). Dále samice vyhledávající hostitele snědly méně moči po 72 hodinách ve srovnání s močí po 168 hodinách (obr. 1B). Když jim byla nabídnuta strava obsahující močovinu, samice vyhledávající hostitele absorbovaly významně větší množství močoviny v koncentraci 2,69 mM ve srovnání se všemi ostatními koncentracemi a vodou, zatímco od 10% sacharózy bylo nerozeznatelné (F(10 813) = 15,72, p < 0,0001; Obrázek 1D). To bylo v kontrastu s reakcí samic krmených krví, které typicky absorbovaly významně více stravy obsahující močovinu než vody, i když významně méně než 10 % sacharózy (F(10 557) = 78,35, p < 0,0001; Obrázek 1).1E). Dále, při porovnání mezi těmito dvěma fyziologickými stavy, flebotomizované samice absorbovaly více močoviny než samice hledající hostitele při nejnižších koncentracích a tyto samice absorbovaly podobné množství močoviny při vyšších koncentracích (F(1 953) = 78,82, p < 0,0001; Obr. 1F, G). Zatímco příjem z potravy obsahující močovinu se zdál mít optimální hodnoty (Obr. 1D, E), samice v obou fyziologických stavech byly schopny modulovat množství absorbované močoviny v celém rozsahu koncentrací močoviny logaritmicky lineárním způsobem (Obr. 1F, G). ). Podobně se zdá, že komáři regulují příjem dusíku regulací množství absorbované moči, protože množství dusíku v moči se odráží v absorbovaném množství (obrázek 1B, C a B v vložených obrázcích).
Pro posouzení vlivu moči a močoviny na přežití komárů vyhledávajících hostitele a sajících krev byly samice krmeny močí všech čtyř věkových kategorií (čerstvá, 24 hodin, 72 hodin a 168 hodin po depozici) a jako kontrola sloužily různé koncentrace močoviny, stejně jako destilovaná voda a 10% sacharóza (obrázek 2A). Tato analýza přežití ukázala, že strava měla významný vliv na celkové přežití u samic vyhledávajících hostitele (moč: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; močovina: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; obr. 2B, C) a samic krmených krví (moč: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; močovina: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001;). Obrázek 2D,E). Ve všech experimentech měly samice krmené močí, močovinou a vodou významně nižší míru přežití ve srovnání se samicemi krmenými sacharózovou dietou (obrázek 2B-E). Samice vyhledávající hostitele krmené čerstvou a zatuchlou močí vykazovaly odlišnou míru přežití, přičemž samice krmené 72hodinovou zatuchlou močí (p = 0,016) měly nejnižší pravděpodobnost přežití (obr. 2B). Dále samice vyhledávající hostitele krmené 135 mM močovinou přežily déle než kontrolní skupina s vodou (p < 0,04) (obr. 2C). Ve srovnání s vodou přežily ženy krmené čerstvou močí a 24hodinovou močí déle (p = 0,001 a p = 0,012; obrázek 2D), zatímco ženy krmené 72hodinovou močí přežily déle než ženy krmené krátkou čerstvou močí a 24hodinovou močí (p < 0,0001 a p = 0,013; obrázek 2D). Při krmení 135 mM močovinou, Samice krmené krví přežívaly déle než samice při všech ostatních koncentracích močoviny a vody (p < 0,013; obrázek 2E).
Přežití hostitele a krev sajících samic Anopheles arabinis, které se živí kravskou močí a močovinou. V biologickém testu (A) dostávaly samičky komárů stravu sestávající z čerstvé a vyzrálé kravské moči, různých koncentrací močoviny, sacharózy (10 %) a destilované vody (H2O). Přežití komárů vyhledávajících hostitele (B, C) a krev sajících (D, E) bylo zaznamenáváno každých 12 hodin, dokud všechny samice krmené močí (B, D) a močovinou (C, E) a kontrolní samice, sacharóza a voda, neuhynuly.
Celková vzdálenost a počet kol stanovených v testu letového mlýna během 24 hodin se lišily u komárů vyhledávajících hostitele a krev sajících komárů, kteří celkově vykazovali menší letovou aktivitu (obr. 3). Komáři vyhledávající hostitele, kteří poskytovali čerstvou a vyzrálou moč nebo sacharózu a vodu, vykazovali odlišné letové vzorce (obr. 3), přičemž samice krmené čerstvou močí byly aktivnější za úsvitu, zatímco ty, které se živily 24 a 168 hodin starou močí. Komáři, kteří se živili močí, vykazovali odlišné letové vzorce a byli primárně denní. Samice komárů, které poskytovaly sacharózu nebo 72hodinovou moč, vykazovaly aktivitu po celou dobu 24 hodin, zatímco samice, které poskytovaly vodu, byly aktivnější v polovině období. Komáři krmení sacharózou vykazovali nejvyšší úroveň aktivity pozdě v noci a brzy ráno, zatímco ti, kteří požili 72 hodin starou moč, zaznamenali stálý pokles aktivity během 24 hodin (obrázek 3).
Letové výkony krev sajících samic Anopheles arabinis, které se živí kravskou močí a močovinou. V testu letového mlýna byly samice komárů, které se živily čerstvou a vyzrálou kravskou močí, různými koncentracemi močoviny, sacharózy (10 %) a destilované vody (H2O), přivázány k horizontálním, volně rotujícím ramenům (nahoře). U samic hledajících hostitele (vlevo) a krev sajících (vpravo) byla zaznamenána celková vzdálenost a počet letů za hodinu pro každou stravu během 24hodinového období (tmavě: šedá; světle: bílá). Průměrná vzdálenost a průměrný počet letů jsou zobrazeny napravo od grafu cirkadiánní aktivity. Chybové úsečky představují standardní chybu průměru. Statistická analýza viz text.
Obecně se celková letová aktivita samic hledajících hostitele podobala letové aktivitě za 24 hodin. Průměrná letová vzdálenost byla významně ovlivněna přijatou stravou (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001) a samice hledající hostitele, které požily 72 hodin moči, uletěly výrazně delší vzdálenosti ve srovnání se všemi ostatními druhy stravy (p < 0,0001) a komáři krmení sacharózou létali déle než komáři krmení čerstvou (p = 0,022) a 24 hodin starou močí (p = 0,022). Na rozdíl od letové aktivity popsané močovou stravou vykazovaly samice hledající hostitele krmené močovinou přetrvávající letovou aktivitu po dobu 24 hodin, která vrcholila v druhé polovině fáze tmy (obr. 3). Ačkoli byly vzorce aktivity podobné, samice hledající hostitele krmené močovinou významně zvýšily průměrnou letovou vzdálenost v závislosti na absorbované koncentraci (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Samice hledající hostitele krmené jakoukoli koncentrací močoviny létaly déle než samice krmené buď vodou, nebo sacharózou (p < 0,03).
Celková letová aktivita krevsajících komárů byla stabilní a trvalá po dobu 24 hodin napříč všemi druhy stravy, se zvýšenou aktivitou moči během druhé poloviny období tmy u samic krmených vodou, stejně jako u samic krmených čerstvou a 24 hodin starou vodou (obrázek 3). Zatímco močová strava významně ovlivnila průměrnou letovou vzdálenost u samic krmených krví (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), močovinová strava nikoli (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) u ostatních druhů moči a kontrolní stravy (čerstvá, p = 0,0091; 72 hodin, p = 0,0022; 168 hodin, p = 0,001; sacharóza, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Vlivy krmení močí a močovinou na reprodukční parametry byly hodnoceny v biologických testech kladení vajec (obrázek 4A) a byly zkoumány podle počtu vajec nakládaných každou samicí, velikosti vajec a nově vylíhnutých larev prvního instaru. Počet nakládaných vajec. Arabské samice krmené močí se lišily v závislosti na potravě (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; obr. 4B). Samice krmené 24hodinovou močí a krevní moučkou nakládly významně více vajec než samice krmené jinou močovou dietou a byly podobné těm, které krmily sacharózou (obr. 4B). Podobně se velikost vajec nakládaných samicemi krmenými močí lišila v závislosti na potravě (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001), přičemž samice krmené 24hodinovou močí a sacharózou kladly významně větší vajíčka než samice krmené vodou, zatímco vajíčka samic krmených 168 hodinami moči byla významně menší (obr. 4C). Kromě toho močová dieta významně ovlivnila velikost larev (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), přičemž z vajíček nakladených 24 a 72 hodin starými samicemi krmenými močí se vylíhly výrazně větší larvy než z vajíček nakladených larvami samic. Samice krmené vodou a 168 hodin močí (obrázek 4D).
Reprodukční výkonnost samic druhu Anopheles arabinis, které se živí kravskou močí a močovinou. Samičky komárů krmené krví byly krmeny stravou sestávající z čerstvé a vyzrálé kravské moči, různých koncentrací močoviny, sacharózy (10 %) a destilované vody (H2O) po dobu 48 hodin před umístěním do biologických testů a získáním substrátů pro kladení vajíček (A). Počet vajec (B, E), velikost vajec (C, F) a velikost larev (D, G) byly významně ovlivněny poskytnutou stravou (kravská moč: BD; močovina: EG). Průměry pro každý parametr měřený pomocí různých písmenných názvů se od sebe významně lišily (jednosměrná ANOVA s použitím Tukeyho post hoc analýzy; p < 0,05). Chybové úsečky představují standardní chybu průměru.
Močovina, jakožto hlavní dusíkatá složka moči, byla podávána jako potrava samic krmených krví a významně ovlivňovala reprodukční parametry ve všech studiích. Počet vajec nakladených samicemi krmenými močovinou po krevním moučení v závislosti na koncentraci močoviny (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001). Samice krmené koncentrací močoviny mezi 134 µM a 1,34 mM nakladly více vajec (obrázek 4E). Samice krmené koncentrací močoviny 134 µM nebo vyšší kladly větší vajíčka než samice krmené vodou (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; obrázek 4F) a velikost larev, i když byla ovlivněna podobnými koncentracemi močoviny u matek (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), byla variabilnější (obr. 4G).
Celková atraktivita pro těkavé extrakty z headspace hovězí moči hledající hostitele. U druhu *arabiensis* hodnoceného ve skleněném olfaktometru (obr. 5A) byl významně ovlivněn věkem moči (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; obr. 5B). Post hoc analýza ukázala, že zápach zatuchlé moči po 24 hodinách způsobil významně vyšší úroveň atraktivity ve srovnání se všemi ostatními ošetřeními (72 hodin: p = 0,0060, 168 hodin: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), s výjimkou zápachu čerstvé moči (p = 0,13; obrázek 5B). Ačkoli celková atraktivita krevsajících komárů k zápachu moči nebyla významně odlišná (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; obr. 5C), bylo zjištěno, že tyto samice jsou významně atraktivnější pro těkavé extrakty z headspace ve srovnání s močí po 72 hodinách ve srovnání s kontrolami (p = 0,0066; obrázek 5C).
Behaviorální reakce na pachy přirozené a syntetické kravské moči při hledání hostitele a krví krmených komárů Anopheles arabianus. Schéma skleněné trubice olfaktometru (A). Přitažlivost těkavých extraktů z headspace čerstvé a staré kravské moči na hostitele (B) a krev sající (C) komáry. Najděte chapadlovou reakci Lorda An. Jsou zobrazeny headspace extrakty izolované z čerstvé (D), 24hodinové (E), 72hodinové (F) a 168hodinové (G) kravské moči. Záznamy detekce elektronové antény (EAD) ukazují změny napětí v reakci na bioaktivní sloučeniny v headspace eluované z plynového chromatografu a detekované plamenovým ionizačním detektorem (FID). Měřítko představuje amplitudu odezvy (mV) versus retenční čas (s). Jsou zobrazeny vlastnosti a rychlosti uvolňování (µg h-1) biologicky aktivních sloučenin. Jedna hvězdička (*) označuje konzistentní odezvu s nízkou amplitudou. Dvojité hvězdičky (**) označují nereprodukovatelné odezvy. Najděte hostitele (H) a krev sající komáry. (I) An.arabiensis má odlišnou přitažlivost k syntetickým směsím pachů čerstvé a staré kravské moči. Průměrné podíly komárů přitahovaných různými názvy písmen se od sebe významně lišily (jednocestná ANOVA s použitím Tukeyho post hoc analýzy; p < 0,05). Chybové úsečky představují standardní chybu stupnice.
Samice Ann.arabiensis, 72 hodin a 120 hodin po krevní moučce, během tření, neprokázala žádnou preferenci pro těkavé extrakty z čerstvé a vyzrálé kravské moči v porovnání s kontrolami s pentanem (χ2 = 3,07, p > 0,05; Další soubor 1: Obr. S1).
U samic druhu Ann.arabiensis identifikovaly analýzy GC-EAD a GC-MS osm, šest, tři a tři bioaktivní sloučeniny (obrázek 5D-G). Přestože byly pozorovány rozdíly v počtu sloučenin, které vyvolaly elektrofyziologické reakce, většina těchto sloučenin byla přítomna v každém těkavém extraktu z prostoru nad zemní hladinou, odebraném z čerstvé a zralé moči. Proto byly do dalších analýz zahrnuty u každého extraktu pouze sloučeniny, které vyvolaly fyziologickou reakci samic tykadel nad prahovou hodnotou.
Celková rychlost uvolňování těkavých bioaktivních sloučenin v headspace vzorku se zvýšila z 29 µg h-1 v čerstvé moči na 242 µg h-1 v moči stárnuté 168 hodin, zejména v důsledku p-kresolu a m-formaldehydu. Zvyšuje se i obsah fenolu. Naproti tomu rychlost uvolňování jiných sloučenin, jako je 2-cyklohexen-1-on a dekanal, se s rostoucím věkem moči snižovala, což korelovalo s pozorovaným poklesem intenzity (množství) signálu v chromatogramu (obr. 5D)-G levý panel) a fyziologickými reakcemi na tyto sloučeniny (obr. 5D-G pravý panel).
Celkově měla syntetická směs podobný přirozený poměr bioaktivních sloučenin identifikovaných v těkavých extraktech z čerstvé a zralé moči (obr. 5D–G) a nezdálo se, že by vyvolávala významnou přitažlivost při hledání hostitele (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; obr. 5H) ani krev sajících komárů (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; obr. 5I). Nicméně post hoc párová srovnání mezi jednotlivými ošetřeními ukázala, že komáři hledající hostitele byli pro syntetickou směs 24 hodin zralé moči významně atraktivní ve srovnání s kontrolami s pentanem (p = 0,0086; obrázek 5H).
Pro posouzení role jednotlivých složek v syntetických směsích 24 hodin stárnuté moči bylo šest subtraktivních směsí vyhodnoceno oproti kompletním směsím v testu s Y-zkumavkou, ve kterém byly jednotlivé sloučeniny odstraněny. U komárů hledajících hostitele mělo odečtení jednotlivých sloučenin z kompletní směsi významný vliv na behaviorální reakce (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Další soubor 1: Obrázek S2A), přičemž všechny subtraktivní směsi byly menší než plně smíchané. Naproti tomu odstranění jednotlivých sloučenin z plně syntetické směsi neovlivnilo behaviorální reakce krev sajících komárů (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), s výjimkou dekanalu, který vedl k nižším hladinám přitažlivosti ve srovnání s kompletní směsí (p = 0,022; Další soubor 1: Obrázek S2B).
V etiopské vesnici s endemickým výskytem malárie byla po dobu deseti nocí hodnocena účinnost syntetické směsi 24hodinové kravské moči při lákání komárů v polních podmínkách (obr. 6A). Celkem bylo odchyceno a identifikováno 4 861 komárů, z nichž 45,7 % tvořili Anthropus.gambiae sl, 18,9 % Anopheles pharoensis a 35,4 % Culex spp. (Dodatečný soubor 1: Tabulka S1). Anopheles arabinis je jediný člen druhového komplexu An.Gambia identifikovaný pomocí PCR analýzy. V průměru bylo za noc odchyceno 320 komárů, přičemž během této doby pasti se syntetickou směsí návnad chytily více komárů než párové pasti bez směsi (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Pasti bez návnady byly nastaveny na každou z pěti kontrolních nocí na začátku, uprostřed a na konci pokusu. V každém páru pastí byl odchycen podobný počet komárů, což naznačuje... žádná odchylka mezi domy (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) a žádný pokles populace během sledovaného období. Ve srovnání s kontrolními pastmi se počet komárů odchycených v pastích obsahujících syntetickou směs významně zvýšil: vyhledávání hostitele (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nedávné krmení krví (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) a březost (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Další soubor 1: Tabulka S1). To se také odráží v celkovém počtu odchycených komárů: vyhledávání hostitele > sající krev > březí > polobřezí > samec.
Terénní hodnocení účinnosti 24hodinové syntetické směsi pachu kravské moči. Terénní pokusy byly provedeny v jiho-centrální Etiopii (mapa), poblíž města Maki (vložka), s použitím světelné pasti Centra pro kontrolu a prevenci nemocí (CDC) (vpravo) v párových domech s latinským čtvercovým designem (letecký snímek) (A). Syntetické fotopasti CDC s pachovou návnadou přitahují a zachycují samičky druhu Anopheles arabesques (B), ale nikoli Anopheles farroes (C), jiným způsobem, což je efekt závislý na fyziologickém stavu. Kromě toho tyto pasti zachytily významně vyšší počet hostitelských komárů rodu Culex. (D) Ve srovnání s kontrolou. Sloupce vlevo představují průměrný selekční index komárů odchycených v párech pastí s odorantovou návnadou (zelená) a kontrolních (otevřených) pastí (N = 10), zatímco sloupce vpravo představují průměrný selekční index v párech kontrolních pastí (otevřené; N = 5). Hvězdičky označují hladiny statistické významnosti (*p = 0,01 a ***p < 0,0001).
Tyto tři druhy byly v pastích obsahujících syntetické směsi odchyceny odlišně. Hledání hostitele (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), krmení krví (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) a březost (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) - druh .arabiensis byl odchycen v pasti a uvolnil syntetickou směs (obr. 6B), zatímco množství An se nelišilo. Byly nalezeny komáry Pharaoensis v různých fyziologických stavech (obr. 6C). U druhu Culex byl v pastích s návnadou ze syntetické směsi zjištěn pouze významný nárůst počtu komárů hledajících hostitele (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; obr. 6D) ve srovnání s kontrolními pastmi.
K posouzení, zda malaričtí komáři využívají zápach kravské moči jako signál pro stanoviště hostitele, byly použity pasti s návnadou na hostitele umístěné mimo potenciální hostitele mezi hnízdišti a venkovskými komunitami v Etiopii. V nepřítomnosti hostitelských signálů, tepla a s přítomností či bez přítomnosti zápachu kravské moči nebyli žádní komáři odchyceni (Doplňkový soubor 1: Obrázek S3). Nicméně v přítomnosti vysoké teploty a zápachu kravské moči byly samice malarických komárů přitahovány a odchyceny, i když v malém počtu, nezávisle na stáří moči (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Doplňkový soubor 1: Obrázek S3). Naproti tomu kontrolní vzorky s vodou malarické komáry při vysokých teplotách nechytily (Doplňkový soubor 1: Obrázek S3).
Komáři způsobující malárii získávají a distribuují sloučeniny obsahující dusík kompenzačním krmením kravskou močí (tj. kalužemi), aby zlepšili charakteristiky životního cyklu, podobně jako jiný hmyz [2, 4, 24, 25, 26]. Kravská moč je snadno dostupný obnovitelný zdroj úzce spjatý s místy odpočinku přenašečů malárie, jako jsou kravíny a vysoká vegetace v blízkosti venkovských domů a míst tření. Samičky komárů lokalizují tento zdroj čichem a jsou schopny regulovat příjem dusíkatých sloučenin v moči, včetně močoviny, hlavní dusíkaté složky moči [15, 16]. V závislosti na fyziologickém stavu samičky komára jsou živiny v moči přidělovány ke zvýšení letové aktivity a přežití samic komárů hledajících hostitele, stejně jako k přežití a reprodukčním charakteristikám jedinců krmených krví během prvního gonadotropního cyklu. Míchání moči proto hraje důležitou nutriční roli pro přenašeče malárie, kteří jsou uzavření jako podvyživení dospělí jedinci [8], protože poskytuje samicím komárů schopnost získávat důležité dusíkaté sloučeniny zapojením se do krmení s nízkým rizikem. Toto zjištění má významné epidemiologické důsledky, protože samice prodlužují svou délku života, aktivita a reprodukční výkon, což vše ovlivňuje kapacitu přenašečů. Toto chování by navíc mohlo být cílem budoucích programů pro řízení přenašečů.