Pemerolehan dan pengagihan nutrien menggabungkan ciri-ciri pencarian makanan serangga dan sejarah hidup. Untuk mengimbangi kekurangan nutrien tertentu pada peringkat hidup yang berbeza, serangga boleh mendapatkan nutrien ini melalui pemberian makanan tambahan, contohnya, dengan memakan rembesan vertebrata dalam proses yang dikenali sebagai lopak. Nyamuk Anopheles arabiani nampaknya kekurangan zat makanan dan oleh itu, memerlukan nutrien untuk metabolisme dan pembiakan. Tujuan kajian ini adalah untuk menilai sama ada pengadukan An. arabianensis pada air kencing lembu untuk pemerolehan nutrien meningkatkan ciri-ciri sejarah hidup.
Pastikan ia selamat. Arabiensis tertarik kepada bau air kencing lembu segar yang berumur 24 jam, 72 jam, dan 168 jam, dan betina yang mencari perumah dan diberi makan darah (48 jam selepas makan darah) diukur dalam olfactometer tiub-Y, dan betina bunting dinilai untuk ujian pemijahan. Analisis kimia dan elektrofisiologi gabungan kemudiannya digunakan untuk mengenal pasti sebatian bioaktif dalam air kencing lembu pada keempat-empat kelas umur. Campuran sintetik sebatian bioaktif dinilai dalam ujian tiub-Y dan ujian lapangan. Untuk mengkaji air kencing lembu dan urea sebatian utamanya yang mengandungi nitrogen sebagai diet tambahan yang berpotensi untuk vektor malaria, parameter pemakanan dan ciri-ciri sejarah hidup diukur. Perkadaran nyamuk betina dan jumlah air kencing lembu dan urea yang diserap dinilai. Selepas makan, betina dinilai untuk kemandirian, penerbangan tertambat, dan pembiakan.
Mencari darah dan khasiat perumah. Dalam kajian makmal dan lapangan, orang Arab tertarik kepada aroma semula jadi dan sintetik air kencing lembu segar dan tua. Betina yang hamil tidak peduli dengan tindak balas air kencing lembu di tempat pemijahan. Betina yang mencari perumah dan menghisap darah secara aktif menyerap air kencing lembu dan urea dan memperuntukkan sumber ini mengikut pertukaran sejarah hidup sebagai fungsi keadaan fisiologi untuk penerbangan, kemandirian atau pembiakan.
Pemerolehan dan pengedaran air kencing lembu Anopheles arabinis untuk ciri-ciri sejarah hidup yang lebih baik. Pemberian makanan tambahan air kencing lembu mempengaruhi kapasiti vektor secara langsung dengan meningkatkan kemandirian harian dan kepadatan vektor, dan secara tidak langsung dengan mengubah aktiviti penerbangan dan oleh itu harus dipertimbangkan dalam model masa hadapan.
Pemerolehan dan pengagihan nutrien menggabungkan ciri-ciri pencarian makanan serangga dan sejarah hidup [1,2,3]. Serangga dapat memilih dan memperoleh makanan serta melakukan pemberian makanan pampasan berdasarkan ketersediaan makanan dan keperluan nutrien [1, 3]. Pengagihan nutrien bergantung pada proses sejarah hidup dan boleh menyebabkan keperluan yang berbeza untuk kualiti dan kuantiti diet dalam peringkat hidup serangga yang berbeza [1, 2]. Untuk mengimbangi kekurangan nutrien tertentu, serangga boleh mendapatkan nutrien ini melalui pemberian makanan tambahan, seperti di atas lumpur, pelbagai najis dan rembesan vertebrata, dan bangkai, suatu proses yang dikenali sebagai lopak [2]. Walaupun pelbagai spesies rama-rama dan rama-rama terutamanya digambarkan, lubang berair juga berlaku dalam ordo serangga lain, dan tarikan kepada dan pemakanan pada jenis sumber ini boleh memberi kesan yang ketara terhadap kesihatan dan ciri-ciri sejarah hidup yang lain [2, 4, 5, 6],7]. Nyamuk malaria Anopheles gambiae sensu lato (sl) muncul sebagai dewasa yang 'kurang zat' [8], jadi penyiraman mungkin memainkan peranan penting dalam ciri-ciri sejarah hidup mereka, tetapi tingkah laku ini setakat ini telah diabaikan. Penggunaan pengadukan sebagai cara untuk meningkatkan pengambilan nutrien dalam bahan penting ini memerlukan perhatian kerana ini mungkin mempunyai akibat epidemiologi yang penting.
Pengambilan nitrogen dalam nyamuk Anopheles betina dewasa adalah terhad disebabkan oleh rizab kalori rendah yang dibawa dari peringkat larva dan penggunaan tepung darah yang tidak cekap [9]. Ann.gambiae sl betina biasanya mengimbangi perkara ini dengan menambah hidangan darah tambahan [10, 11], sekali gus meletakkan lebih ramai orang berisiko dijangkiti penyakit ini dan meletakkan nyamuk pada risiko pemangsa yang lebih besar. Sebagai alternatif, nyamuk boleh menggunakan makanan tambahan najis vertebrata untuk memperoleh sebatian nitrogen yang meningkatkan penyesuaian dan kebolehgerakan penerbangan, seperti yang ditunjukkan oleh serangga lain [2]. Dalam hal ini, tarikan yang kuat dan tersendiri bagi salah satu spesies adik-beradik dalam An. Kompleks spesies sl Gambia, Anopheles arabinis, air kencing lembu segar dan tua [12,13,14], adalah menarik. Anopheles arabinis bersifat oportunistik dalam pilihan perumahnya dan diketahui mengaitkan dan memakan lembu. Air kencing lembu merupakan sumber yang kaya dengan sebatian nitrogen, dengan urea menyumbang 50-95% daripada jumlah nitrogen dalam air kencing segar [15, 16]. Apabila air kencing lembu semakin tua, mikroorganisma menggunakan sumber-sumber ini untuk mengurangkan kerumitan sebatian nitrogen dalam masa 24 jam [15]. Dengan peningkatan ammonia yang pesat, yang dikaitkan dengan penurunan nitrogen organik, mikroorganisma alkalofilik (kebanyakannya menghasilkan sebatian toksik kepada nyamuk) berkembang maju [15], yang mungkin betina Ann.arabiensis lebih suka tertarik kepada air kencing yang berumur 24 jam atau kurang [13, 14].
Dalam kajian ini, An yang diberi makan darah dan perumah telah dicari. Semasa kitaran gonadotropin pertamanya, arabiensis telah dinilai untuk pemerolehan sebatian nitrogen, termasuk urea, melalui pencampuran air kencing. Seterusnya, satu siri eksperimen telah dijalankan untuk menilai bagaimana nyamuk betina memperuntukkan sumber nutrien yang berpotensi ini untuk meningkatkan kelangsungan hidup, pembiakan dan pencarian makanan selanjutnya. Akhir sekali, bau air kencing lembu segar dan tua telah dinilai untuk menentukan sama ada ini memberikan petunjuk yang boleh dipercayai untuk An yang diberi makan darah dan perumah. Dalam pencarian mereka untuk sumber nutrisi yang berpotensi ini, arabiensis menemui korelasi kimia di sebalik daya tarikan berbeza yang diperhatikan. Campuran bau sintetik sebatian organik meruap (VOC) yang dikenal pasti dalam air kencing yang telah dipelihara selama 24 jam telah dinilai selanjutnya di bawah keadaan lapangan, melanjutkan keputusan yang diperoleh di bawah keadaan makmal dan menunjukkan kesan bau air kencing lembu pada keadaan fisiologi yang berbeza. Tarikan nyamuk. Keputusan yang diperoleh mengesahkan bahawa An. arabiensis memperoleh dan mengedarkan sebatian nitrogen yang terdapat dalam air kencing vertebrata untuk mempengaruhi ciri-ciri sejarah hidup. Keputusan ini dibincangkan dalam konteks potensi akibat epidemiologi dan bagaimana ia boleh digunakan untuk pengawasan dan kawalan vektor.
Anopheles arabicans (strain Dongola) dikekalkan pada suhu 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH dan kitaran terang:gelap 12:12 jam. Larva diternak dalam dulang plastik (20 cm × 18 cm × 7 cm) yang diisi dengan air suling dan diberi makanan ikan Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Pupa dikumpulkan dalam cawan 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE) dan kemudian dipindahkan ke sangkar Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) untuk membolehkan kemunculan dewasa. Ikan dewasa diberikan larutan sukrosa 10% ad libitum sehingga 4 hari selepas kemunculan (dpe), di mana ikan betina yang mencari perumah ditawarkan diet sejurus sebelum eksperimen, atau diberi makan semalaman dengan air suling sebelum eksperimen, seperti yang diterangkan di bawah. Ikan betina yang digunakan untuk eksperimen tiub penerbangan hanya diberi makan selama 4-6 jam. dengan air ad libitum. Untuk menyediakan nyamuk penghisap darah untuk ujian bio berikutnya, 4 ekor betina dpe diberikan darah biri-biri defibrotik (Håtunalab, Bro, SE) menggunakan sistem pemakanan membran (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Betina yang sesak sepenuhnya kemudian dipindahkan ke sangkar individu dan diberikan diet secara langsung, seperti yang diterangkan di bawah, atau 10% sukrosa ad libitum selama 3 hari sebelum eksperimen yang diterangkan di bawah. Betina yang terakhir digunakan untuk ujian bio tiub penerbangan dan dipindahkan ke makmal, dan kemudian diberi air suling ad libitum selama 4-6 jam sebelum eksperimen.
Ujian pemakanan telah digunakan untuk mengukur penggunaan air kencing dan urea pada betina An.Arab dewasa. Betina yang mencari perumah dan yang diberi makan darah diberi diet yang mengandungi 1% air kencing lembu segar dan tua yang dicairkan, pelbagai kepekatan urea, dan dua kawalan (10% sukrosa dan air) selama 48 jam. Di samping itu, pewarna makanan (1 mg ml-1 xilena sianida FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) telah ditambah ke dalam diet dan dibekalkan dalam matriks 4 × 4 dalam tiub mikroempar 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, US; Rajah 1A) Isi sehingga ke tepi (~300 µl). Untuk mengelakkan persaingan antara nyamuk dan potensi kesan warna pewarna, letakkan 10 ekor nyamuk dalam piring Petri yang besar (diameter 12 cm dan tinggi 6 cm; Semadeni, Ostermundigen, CH; Rajah 1A) dalam keadaan gelap sepenuhnya pada suhu 25 ± 2 cm °C dan kelembapan relatif 65 ± 5%. Eksperimen ini diulang 5 hingga 10 kali. Selepas terdedah kepada diet, nyamuk diletakkan pada suhu -20 °C sehingga analisis lanjut.
Cari air kencing lembu dan urea yang diserap oleh Anopheles arabianus betina perumah dan penghisap darah. Dalam percubaan pemberian makanan (A), nyamuk betina diberi diet yang terdiri daripada air kencing lembu segar dan tua, pelbagai kepekatan urea, sukrosa (10%), dan air suling (H2O). Betina pencari perumah (B) dan diberi makan darah (C) menyerap lebih banyak sukrosa daripada diet lain yang diuji. Perhatikan bahawa betina pencari perumah menyerap air kencing lembu 72 jam kurang daripada air kencing lembu 168 jam (B). Purata kandungan nitrogen keseluruhan (± sisihan piawai) air kencing diwakili dalam sisipan. Betina pencari perumah (D, F) dan penghisap darah (E, G) mengambil urea secara bergantung dos. Purata isipadu sedutan (D, E) dengan nama huruf yang berbeza adalah berbeza secara signifikan antara satu sama lain (ANOVA sehala menggunakan analisis post hoc Tukey; p < 0.05). Bar ralat mewakili ralat piawai min (BE). Garis putus-putus lurus mewakili garis regresi log-linear (F, G)
Untuk melepaskan makanan yang diserap, nyamuk diletakkan secara individu ke dalam tiub mikroempar 1.5 ml yang mengandungi 230 µl air suling dan tisu diganggu menggunakan alu pakai buang dan motor tanpa wayar (VWR International, Lund, SE), diikuti dengan sentrifugasi pada 10 krpm selama 10 minit. Supernatan (200 µl) dipindahkan ke plat mikro 96-telaga (Sigma-Aldrich) dan penyerapan (λ620) ditentukan menggunakan pembaca plat mikro berasaskan spektrofotometer (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Sebagai alternatif, nyamuk dikisar dalam 1 ml air suling, 900 µl daripadanya dipindahkan ke kuvet untuk analisis spektrofotometri (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Untuk mengukur pengambilan makanan, lengkung piawai disediakan melalui pencairan bersiri untuk menghasilkan 0.2 µl hingga 2.4 µl 1. mg ml-1 xilena sianida. Kemudian, ketumpatan optik bagi kepekatan pewarna yang diketahui telah digunakan untuk menentukan jumlah makanan yang dimakan oleh setiap nyamuk.
Data isipadu dianalisis menggunakan analisis varians sehala (ANOVA) diikuti dengan perbandingan berpasangan post hoc Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Analisis regresi linear menerangkan pengambilan urea yang bergantung kepada kepekatan dan membandingkan tindak balas antara nyamuk pencari perumah dan nyamuk penghisap darah (GraphPad Prism v8.0.0 untuk Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
Kira-kira 20 µl sampel air kencing daripada setiap kumpulan umur telah diikat pada Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) dan dikapsulkan dalam kapsul timah (8 mm × 5 mm). Kapsul telah dimasukkan ke dalam kebuk pembakaran penganalisis CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, US) untuk menentukan kandungan nitrogen dalam air kencing segar dan air kencing yang telah diawet mengikut protokol pengeluar. Jumlah nitrogen (g N l-1) telah diukur berdasarkan kepekatan urea yang diketahui digunakan sebagai standard.
Untuk menilai kesan diet terhadap kelangsungan hidup betina pencari perumah dan penghisap darah, nyamuk diletakkan secara individu dalam piring Petri yang besar (diameter 12 cm dan tinggi 6 cm; Semadeni) dengan lubang bertutup jaring pada penutupnya (diameter 3 cm) dengan Untuk pengudaraan dan bekalan makanan. Diet diberikan sejurus selepas 4 dpe dan termasuk 1% air kencing lembu segar dan tua yang dicairkan, empat kepekatan urea, dan dua kawalan, 10% sukrosa dan air. Setiap diet dipipet ke atas tampon pergigian (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) yang dimasukkan ke dalam picagari 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), pelocok dikeluarkan, dan diletakkan di atas piring petri (rajah 1).1A). Tukar diet anda setiap hari. Kekalkan makmal seperti yang diterangkan di atas. Nyamuk yang masih hidup dikira dua kali sehari, manakala nyamuk mati dibuang sehingga nyamuk terakhir mati (n = 40 setiap rawatan). Kelangsungan hidup nyamuk yang diberi pelbagai diet dianalisis secara statistik menggunakan lengkung kelangsungan hidup Kaplan-Meyer dan ujian log-rank untuk membandingkan perbandingan taburan survival antara diet (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Kilang terbang nyamuk tersuai berdasarkan Attisano et al.[17], diperbuat daripada panel akrilik jernih setebal 5 mm (10 cm lebar x 10 cm panjang x 10 cm tinggi) tanpa panel hadapan dan belakang (Rajah 3: atas). Perhimpunan pangsi dengan tiub menegak yang diperbuat daripada lajur kromatografi gas (0.25 mm lebar; 7.5 cm L) dengan hujungnya dilekatkan pada jarum serangga yang digantung di antara sepasang magnet neodymium yang berjarak 9 cm antara satu sama lain. Tiub mendatar yang diperbuat daripada bahan yang sama (6.5 cm L) membelah tiub menegak untuk membentuk lengan yang ditambat dan lengan yang membawa sekeping kecil kerajang aluminium sebagai isyarat gangguan cahaya.
Nyamuk betina yang kelaparan selama 24 jam diberi diet di atas selama 30 minit sebelum dikekang. Nyamuk betina yang diberi makan sepenuhnya kemudiannya dibius secara individu di atas ais selama 2-3 minit dan dilekatkan pada pin serangga dengan lilin lebah (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) dan kemudian diikat pada lengan tiub mendatar. Kilang Terbang. Putaran setiap penerbangan direkodkan oleh pembalak data yang dibina khas, kemudian disimpan dan dipaparkan menggunakan perisian PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Kilang penerbangan diletakkan di dalam bilik yang dikawal iklim (12 jam:12 jam, terang: gelap, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Untuk menggambarkan corak aktiviti penerbangan, jumlah jarak yang diterbangkan (m) dan jumlah bilangan aktiviti penerbangan berturut-turut dikira setiap jam dalam tempoh 24 jam. Di samping itu, purata jarak yang diterbangkan oleh individu betina dibandingkan merentasi rawatan dan dianalisis menggunakan ANOVA sehala dan analisis post hoc Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), di mana purata jarak dianggap sebagai pembolehubah bersandar, manakala rawatan adalah faktor bebas. Di samping itu, purata bilangan pusingan dikira dalam kenaikan 10 minit.
Untuk menilai kesan diet terhadap prestasi pembiakan An.arabiensis, enam ekor betina (4 dpe) dipindahkan terus ke sangkar Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) selepas pengumpulan darah dan kemudian diberikan diet eksperimen selama 48 jam seperti yang diterangkan di atas. Diet kemudian dikeluarkan dan cawan pemijahan (30 ml; Nolato Hertila) yang diisi dengan 20 ml air suling disediakan pada hari ketiga selama 48 jam, ditukar setiap 24 jam. Ulangi setiap rejimen diet sebanyak 20-50 kali. Telur dikira dan direkodkan untuk setiap sangkar eksperimen. Subsampel telur digunakan untuk menilai purata saiz dan variasi panjang telur individu (n ≥ 200 setiap diet) menggunakan mikroskop Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) yang dilengkapi dengan Kamera Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., DE). Telur yang tinggal disimpan di dalam bilik kawalan iklim di bawah keadaan pemeliharaan standard selama 24 jam, dan subsampel larva instar pertama yang baru muncul (n ≥ 200 setiap diet) diukur, seperti yang diterangkan di atas. Bilangan telur dan saiz telur dan larva dibandingkan antara rawatan dan menggunakan ANOVA sehala dan analisis post hoc Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Bahan meruap ruang kepala daripada air kencing segar (1 jam selepas persampelan), air kencing berumur 24 jam, 72 jam dan 168 jam telah dikumpulkan daripada sampel yang dikumpulkan daripada lembu Zebu, kaum Arsi. Untuk kemudahan, sampel air kencing dikumpulkan pada awal pagi semasa lembu masih di dalam kandang. Sampel air kencing dikumpulkan daripada 10 individu dan 100-200 ml setiap sampel dipindahkan ke dalam beg pembakar poliamida individu (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) dalam 3 liter poliamida bertutup dalam dram plastik vinil klorida. Bahan meruap ruang kepala daripada setiap sampel air kencing lembu dikumpulkan sama ada secara langsung (segar) atau selepas pematangan pada suhu bilik selama 24 jam, 72 jam dan 168 jam, iaitu setiap sampel air kencing mewakili setiap kumpulan umur.
Untuk pengumpulan bahan meruap ruang kepala, sistem gelung tertutup digunakan untuk mengedarkan aliran gas yang ditapis karbon aktif (100 ml min-1) melalui beg poliamida ke turus penjerapan selama 2.5 jam dengan menggunakan pam vakum diafragma (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Sebagai kawalan, pengumpulan ruang kepala dilakukan dari beg poliamida kosong. Turut penjerapan diperbuat daripada tiub Teflon (5.5 cm x 3 mm id) yang mengandungi 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, US) di antara palam bulu kaca. Sebelum digunakan, turus dibilas dengan 1 ml n-heksana sulingan semula (Merck, Darmstadt, DE) dan 1 ml pentana (99.0% pelarut tulen gred GC, Sigma Aldrich). Bahan meruap yang terserap dielusi dengan 400 μl pentana. Pengumpulan ruang kepala dikumpulkan dan kemudian disimpan pada suhu -20°C sehingga digunakan untuk analisis lanjut.
Respons tingkah laku An. Ekstrak meruap Headspace yang dikumpul daripada air kencing segar yang telah berusia 24 jam, 72 jam, dan 168 jam telah dianalisis untuk ekstrak meruap daripada nyamuk Arabidopsis menggunakan olfactometer tiub kaca lurus [18]. Eksperimen dijalankan semasa ZT 13-15, tempoh puncak aktiviti mencari rumah An. Arab [19]. Olfactometer tiub kaca (80 cm × 9.5 cm id) telah diterangi dengan 3 ± 1 lx cahaya merah dari atas. Aliran udara yang ditapis dan dilembapkan arang (25 ± 2 °C, kelembapan relatif 65 ± 2%) melepasi ujian bio pada 30 cm s-1. Udara dialirkan melalui satu siri skrin jejaring keluli tahan karat, menghasilkan aliran laminar dan struktur plume yang seragam. Dispenser tampon pergigian (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), digantung daripada gegelung 5 cm pada hujung olfactometer yang mengarah ke angin, dengan pertukaran perangsang setiap 5 minit. Untuk analisis, 10 μl setiap ekstrak ruang kepala, dicairkan 1:10, digunakan sebagai rangsangan. Jumlah pentana yang sama digunakan sebagai kawalan. Nyamuk pencari perumah atau penghisap darah individu diletakkan di dalam sangkar pelepasan individu 2-3 jam sebelum permulaan eksperimen. Sangkar pelepasan diletakkan di bahagian bawah olfactometer, dan nyamuk dibenarkan menyesuaikan diri selama 1 minit, dan kemudian injap rama-rama sangkar dibuka untuk dilepaskan. Tarikan kepada rawatan atau kawalan dianalisis sebagai perkadaran nyamuk yang bersentuhan dengan sumber dalam masa 5 minit selepas pelepasan. Setiap ekstrak meruap ruang kepala dan kawalan direplikasi sekurang-kurangnya 30 kali, dan untuk mengelakkan kesan mana-mana satu hari, bilangan rawatan dan kawalan yang sama diuji pada setiap hari eksperimen. Dapatkan respons daripada perumah dan yang diberi makan darah. Set ruang kepala Arab berbanding ruang kepala dianalisis menggunakan regresi logistik nominal diikuti dengan perbandingan berpasangan untuk nisbah ganjil (JMP Pro, v14.0.0, Institut SAS Inc.).
Tindak balas pemijahan An. Ekstrak ruang kepala daripada air kencing lembu segar dan tua dianalisis dalam sangkar Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Cawan plastik (30 mL; Nolato Hertila) yang diisi dengan 20 mL air suling menyediakan substrat pemijahan dan diletakkan di sudut bertentangan sangkar, dengan jarak 24 cm. Cawan rawatan dilaraskan dengan 10 μl setiap ekstrak ruang kepala pada pencairan 1:10. Jumlah pentana yang sama digunakan untuk melaraskan cawan kawalan. Cawan rawatan dan kawalan ditukar antara setiap eksperimen untuk kawalan bagi kesan kedudukan. Sepuluh betina yang diberi makan darah dilepaskan ke dalam sangkar eksperimen pada ZT 9-11 dan telur dalam cawan dikira 24 jam kemudian. Formula untuk mengira indeks pemijahan ialah: (bilangan telur yang diletakkan dalam cawan rawatan – bilangan telur yang diletakkan dalam cawan kawalan)/(jumlah telur yang diletakkan). Setiap rawatan diulang sebanyak 8 kali.
Analisis kromatografi gas dan pengesanan corak antena elektron (GC-EAD) An.arabiensis betina telah dilakukan seperti yang diterangkan sebelum ini [20]. Secara ringkasnya, ekstrak meruap ruang kepala segar telah diasingkan menggunakan Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, AS) yang dilengkapi dengan lajur HP-5 (30 m × 0.25 mm id, ketebalan filem 0.25 μm, Agilent Technologies). dan air kencing yang menua. Hidrogen digunakan sebagai fasa bergerak dengan kadar aliran linear purata 45 cm s-1. Setiap sampel (2 μl) disuntik selama 30 saat dalam mod tanpa belah dengan suhu masukan 225 °C. Suhu ketuhar GC diprogramkan dari 35 °C (tahan 3 minit) hingga 300 °C (tahan 10 minit) pada 10 °C min-1. Dalam pembahagi efluen GC, 4 psi nitrogen ditambah dan dibahagikan 1:1 dalam silang isipadu mati rendah Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) antara pengesan pengionan nyalaan dan EAD. Kapilari efluen GC untuk EAD dilalui melalui saluran pemindahan Gerstel ODP-2, yang menjejaki suhu ketuhar GC tambah 5 °C, ke dalam tiub kaca (10 cm × 8 mm), di mana ia dicampurkan dengan udara lembap yang ditapis karbon (1.5 l min−1). Antena diletakkan 0.5 cm dari saluran keluar tiub. Setiap nyamuk individu menyumbang satu replika, dan bagi nyamuk yang mencari perumah, sekurang-kurangnya tiga replika telah dilakukan pada sampel air kencing bagi setiap umur.
Pengenalpastian sebatian bioaktif dalam koleksi ruang kepala air kencing lembu segar dan tua menggunakan gabungan GC dan spektrometer jisim (GC-MS; 6890 GC dan 5975 MS; Agilent Technologies) untuk mendapatkan tindak balas antena dalam analisis GC-EAD, yang beroperasi dalam mod pengionan hentaman elektron pada 70 eV. GC dilengkapi dengan lajur kapilari silika terlakur bersalut HP-5MS UI (diameter dalaman 60 m × 0.25 mm, ketebalan filem 0.25 μm) menggunakan helium sebagai fasa bergerak dengan kadar aliran linear purata 35 cm s-1. Sampel 2 μl disuntik menggunakan tetapan penyuntik dan suhu ketuhar yang sama seperti untuk analisis GC-EAD. Sebatian dikenal pasti berdasarkan masa pengekalannya (indeks Kovát) dan spektrum jisim berbanding dengan perpustakaan tersuai dan perpustakaan NIST14 (Agilent). Sebatian yang dikenal pasti disahkan dengan menyuntik piawaian autentik (Fail Tambahan 1: Jadual S2). Untuk kuantifikasi, heptil asetat (10 ng, 99.8% ketulenan kimia, Aldrich) telah disuntik sebagai piawai luaran.
Menilai keberkesanan campuran bau sintetik yang terdiri daripada sebatian bioaktif yang dikenal pasti dalam air kencing segar dan yang telah dituai untuk menarik Ans.arabiensis yang mencari perumah dan penghisap darah, menggunakan olfactometer dan protokol yang sama seperti di atas. Campuran sintetik meniru komposisi dan perkadaran sebatian dalam ekstrak meruap ruang kepala campuran air kencing segar, yang telah dituai selama 24 jam, 48 jam, 72 jam, dan 168 jam (Rajah 5D-G; Fail Tambahan 1: Jadual S2). Untuk analisis, gunakan 10 μl pencairan 1:100 campuran sintetik sepenuhnya, dengan kadar pelepasan keseluruhan antara kira-kira 140-2400 ng h-1, untuk menilai daya tarikan kepada perumah dan nyamuk penghisap darah. Selepas itu, ujian dilakukan pada campuran lengkap, di mana campuran subtraktif sebatian tunggal campuran lengkap dikeluarkan. Mencari tindak balas daripada Ans. Arab vs campuran sintetik dan subtraktif dianalisis menggunakan regresi logistik nominal diikuti dengan perbandingan berpasangan untuk nisbah ganjil. (JMP Pro, v14.0.0, Institut SAS Inc.).
Untuk menilai sama ada air kencing lembu boleh berfungsi sebagai petunjuk habitat perumah untuk nyamuk malaria, air kencing lembu segar dan tua, yang dikumpulkan seperti yang diterangkan di atas, dan air diletakkan di dalam baldi 3 liter (100 ml) yang dijaringkan dan diletakkan di dalam perangkap umpan perumah. (Versi BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Sepuluh perangkap diletakkan 50 m antara satu sama lain di padang rumput, 400 m dari komuniti kampung (Silay, Ethiopia, 5°53´24´´U, 37°29´24´´T) dan tiada lembu, di tempat pembiakan kekal dan kampung. Lima perangkap dipanaskan untuk mensimulasikan kehadiran perumah, manakala lima perangkap dibiarkan tidak dipanaskan. Setiap lokasi rawatan digilirkan setiap malam selama lima malam. Bilangan nyamuk yang ditangkap dalam perangkap yang diberi umpan air kencing daripada pelbagai umur telah dibandingkan menggunakan regresi logistik dengan taburan binomial beta (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Di sebuah perkampungan endemik malaria berhampiran bandar Maki, wilayah Oromia, Ethiopia (8° 11′ 08″ U, 38° 81′ 70″ E; Rajah 6A). Kajian ini dijalankan antara pertengahan Ogos dan pertengahan September sebelum penyemburan sisa dalaman tahunan, berserta musim hujan yang panjang. Lima pasang rumah (20–50 m jarak antara satu sama lain) yang terletak di pinggir kampung telah dipilih untuk kajian ini (Rajah 6A). Kriteria yang digunakan untuk memilih rumah adalah: haiwan tidak dibenarkan masuk ke dalam rumah, memasak di dalam rumah (mengambil kayu api atau arang) tidak dibenarkan (sekurang-kurangnya semasa tempoh percubaan), dan rumah dengan maksimum dua penghuni, tidur dalam keadaan tidak menggunakan racun serangga. di bawah kelambu yang dirawat. Kelulusan etika telah diberikan oleh Lembaga Semakan Etika Penyelidikan Institusi (IRB/022/2016) Fakulti Sains Semula Jadi (CNS-IRB), Universiti Addis Ababa, selaras dengan garis panduan yang ditetapkan oleh Deklarasi Persatuan Perubatan Sedunia Helsinki. Persetujuan daripada setiap ketua isi rumah diperoleh dengan bantuan kakitangan peluasan kesihatan. Keseluruhan proses ini disokong oleh pentadbiran tempatan di peringkat daerah dan wad ('kebele'). Reka bentuk eksperimen mengikuti reka bentuk segi empat sama Latin 2 × 2, di mana campuran dan kawalan sintetik diberikan kepada rumah berpasangan pada malam pertama dan ditukar antara rumah pada malam eksperimen seterusnya. Proses ini diulang sepuluh kali. Selain itu, untuk menganggarkan aktiviti nyamuk di rumah terpilih, perangkap CDC ditetapkan untuk dijalankan lima malam berturut-turut pada permulaan, pertengahan dan akhir percubaan lapangan pada waktu yang sama dalam sehari.
Campuran sintetik yang mengandungi enam sebatian bioaktif telah dilarutkan dalam heptana (97.0% pelarut gred GC, Sigma Aldrich) dan dibebaskan pada 140 ng h-1 menggunakan dispenser sumbu kapas [20]. Dispenser sumbu membenarkan semua sebatian dibebaskan dalam perkadaran yang tetap sepanjang eksperimen 12 jam. Heptana digunakan sebagai kawalan. Botol digantung di sebelah titik masuk perangkap cahaya Pusat Kawalan dan Pencegahan Penyakit (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, AS; Rajah 6A). Perangkap digantung 0.8 – 1 m di atas tanah, berhampiran kaki katil, dan seorang sukarelawan tidur di bawah kelambu yang tidak dirawat dan dikendalikan antara jam 18:00 dan 06:30. Nyamuk yang ditangkap mengikut jantina dan status fisiologi (tidak diberi makan, diberi makan, separa hamil, dan hamil [21] kemudiannya ditapis menggunakan analisis tindak balas rantai polimerase (PCR) untuk mengenal pasti spesies yang dikenal pasti secara morfologi sebagai A. gambiae sl. Ahli kompleks [23]. Di lapangan Dalam kajian ini, perangkap rumah berpasangan dianalisis menggunakan model padanan logistik nominal, di mana tarikan adalah pembolehubah bersandar dan rawatan (campuran sintetik vs kawalan) adalah kesan tetap (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Di sini, kami melaporkan nilai χ2 dan p daripada ujian nisbah kemungkinan.
Nilaikan sama ada ia selamat. Arabiensis dapat memperoleh air kencing, sumber nitrogen utamanya, urea, melalui pemberian makanan langsung, dalam tempoh 48 jam selepas pemberian selama 4 hari selepas (dpe) percubaan pemberian makanan betina pencari perumah dan pemberian darah (Rajah 1A). Kedua-dua betina pencari perumah dan penghisap darah menyerap lebih banyak sukrosa berbanding diet atau air lain (F(5,426) = 20.15, p < 0.0001 dan F(5,299) = 56.00, p < 0.0001, masing-masing; Rajah 1B,C). Tambahan pula, betina pencari perumah makan kurang dalam air kencing pada 72 jam berbanding air kencing pada 168 jam (Rajah 1B). Apabila ditawarkan diet yang mengandungi urea, betina pencari perumah menyerap jumlah urea yang jauh lebih besar pada 2.69 mM berbanding semua kepekatan dan air lain, manakala tidak dapat dibezakan daripada 10% sukrosa (F(10,813) = 15.72, p < 0.0001; Rajah 1D). Ini berbeza dengan tindak balas betina yang diberi makan darah, yang biasanya menyerap lebih banyak diet yang mengandungi urea berbanding air, walaupun kurang daripada 10% sukrosa (F(10,557) = 78.35, p < 0.0001; Rajah 1).1E). Tambahan pula, apabila membandingkan antara dua keadaan fisiologi, betina yang mengalami phlebotomi menyerap lebih banyak urea berbanding betina yang mencari hos pada kepekatan terendah, dan betina ini menyerap jumlah urea yang sama pada kepekatan yang lebih tinggi (F(1,953)= 78.82, p < 0.0001; Rajah 1F, G). Walaupun pengambilan daripada diet yang mengandungi urea kelihatan mempunyai nilai optimum (Rajah 1D,E), betina dalam kedua-dua keadaan fisiologi dapat memodulasi jumlah urea yang diserap ke atas keseluruhan julat kepekatan urea secara log-linear (Rajah 1F,G). Begitu juga, nyamuk kelihatan mengawal pengambilan nitrogen mereka dengan mengawal jumlah air kencing yang diserap, kerana jumlah nitrogen dalam air kencing tercermin dalam jumlah yang diserap (Rajah 1B, C dan B sisipan).
Untuk menilai kesan air kencing dan urea terhadap kemandirian nyamuk pencari perumah dan penghisap darah, betina diberi air kencing daripada keempat-empat umur (segar, 24 jam, 72 jam, dan 168 jam selepas pemendapan) dan pelbagai kepekatan urea, serta air suling dan 10% sukrosa berfungsi sebagai kawalan (Rajah 2A). Analisis kemandirian ini menunjukkan bahawa diet mempunyai kesan yang ketara terhadap kemandirian keseluruhan pada betina pencari perumah (air kencing: χ2 = 108.5, df = 5, p < 0.0001; urea: χ2 = 122.8, df = 5, p < 0.0001; Rajah 2B, C) dan betina yang diberi makan darah (air kencing: χ2 = 93.0, df = 5, p < 0.0001; urea: χ2 = 137.9, df = 5, p < 0.0001; Rajah 2D, E). Secara keseluruhannya Dalam eksperimen, betina yang diberi diet air kencing, urea dan air mempunyai kadar survival yang jauh lebih rendah berbanding betina yang diberi diet sukrosa (Rajah 2B-E). Betina yang mencari perumah yang diberi air kencing segar dan basi menunjukkan kadar survival yang berbeza, dengan mereka yang diberi air kencing basi selama 72 jam (p = 0.016) mempunyai kebarangkalian survival terendah (Rajah 2B). Tambahan pula, betina yang mencari perumah yang diberi 135 mM urea hidup lebih lama daripada kawalan air (p < 0.04) (Rajah 2C). Berbanding dengan air, wanita yang diberi air kencing segar dan air kencing 24 jam hidup lebih lama (p = 0.001 dan p = 0.012, masing-masing; Rajah 2D), manakala wanita yang diberi air kencing 72 jam hidup lebih lama daripada mereka yang diberi air kencing segar pendek dan air kencing lama selama 24 jam (p < 0.0001 dan p = 0.013, masing-masing; Rajah 2D). Apabila diberi 135 mM urea, betina yang diberi darah hidup lebih lama daripada semua kepekatan urea dan air yang lain (p < 0.013; Rajah 2E).
Kemandirian nyamuk Anopheles arabinis betina perumah dan penghisap darah yang memakan air kencing lembu dan urea. Dalam ujian bio (A), nyamuk betina diberi diet yang terdiri daripada air kencing lembu segar dan tua, pelbagai kepekatan urea, sukrosa (10%) dan air suling (H2O). Kemandirian nyamuk pencari perumah (B, C) dan penghisap darah (D, E) direkodkan setiap 12 jam sehingga semua betina yang diberi air kencing (B, D) dan urea (C, E), dan kawalan, Sukrosa dan air, mati.
Jumlah jarak dan bilangan pusingan yang ditentukan dalam ujian kilang penerbangan sepanjang tempoh 24 jam adalah berbeza antara nyamuk pencari perumah dan nyamuk penghisap darah, yang menunjukkan kurang aktiviti penerbangan secara keseluruhan (Rajah 3). Nyamuk pencari perumah yang memberikan air kencing segar dan tua atau sukrosa dan air menunjukkan corak penerbangan yang berbeza (Rajah 3), dengan betina yang memakan air kencing segar lebih aktif pada waktu subuh, manakala nyamuk yang diberi makan air kencing berusia 24 dan 168 jam. Nyamuk yang memakan air kencing mempamerkan corak penerbangan yang berbeza dan terutamanya diurnal. Nyamuk betina yang memberikan sukrosa atau air kencing 72 jam menunjukkan aktiviti sepanjang tempoh 24 jam, manakala nyamuk betina yang menyediakan air lebih aktif semasa pertengahan tempoh. Nyamuk yang diberi makan sukrosa mempamerkan tahap aktiviti tertinggi pada lewat malam dan awal pagi, manakala nyamuk yang menelan air kencing berusia 72 jam mengalami penurunan aktiviti yang stabil selama 24 jam (Rajah 3).
Prestasi penerbangan Anopheles arabinis betina penghisap darah yang mencari pemburu yang memakan air kencing lembu dan urea. Dalam ujian kilang penerbangan, nyamuk betina yang diberi air kencing lembu segar dan tua, pelbagai kepekatan urea, sukrosa (10%), dan air suling (H2O) telah diikat pada lengan mendatar yang berputar bebas (atas). Bagi betina pencari perumah (kiri) dan penghisap darah (kanan), jumlah jarak dan bilangan penerbangan sejam untuk setiap diet dalam tempoh 24 jam telah direkodkan (gelap: kelabu; terang: putih). Purata jarak dan purata bilangan serangan ditunjukkan di sebelah kanan graf aktiviti sirkadian. Bar ralat mewakili ralat piawai min. Analisis statistik lihat teks
Secara amnya, aktiviti penerbangan keseluruhan nyamuk betina yang mencari perumah mengikuti corak yang serupa dengan jarak penerbangan dalam tempoh 24 jam. Purata jarak penerbangan terjejas dengan ketara oleh diet yang dimakan (F(5, 138) = 28.27, p < 0.0001), dan nyamuk betina yang mencari perumah yang mengambil air kencing selama 72 jam terbang dengan jarak yang jauh lebih jauh berbanding semua diet lain (p < 0.0001), dan nyamuk yang diberi makan sukrosa terbang lebih lama daripada nyamuk segar (p = 0.022) dan yang diberi makan air kencing berusia 24 jam (p = 0.022). Berbeza dengan corak aktiviti penerbangan yang diterangkan oleh diet air kencing, nyamuk betina yang diberi makan urea menunjukkan aktiviti penerbangan berterusan dalam tempoh 24 jam, memuncak semasa separuh kedua fasa gelap (Rajah 3). Walaupun corak aktiviti adalah serupa, nyamuk betina yang mencari perumah yang diberi makan urea meningkatkan jarak penerbangan purata dengan ketara bergantung pada kepekatan yang diserap (F(5, 138) = 1310.91, p < 0.0001). Mencari perumah betina yang diberi sebarang kepekatan urea terbang lebih lama daripada betina yang diberi sama ada air atau sukrosa (p < 0.03).
Aktiviti penerbangan keseluruhan nyamuk penghisap darah adalah stabil dan berterusan selama 24 jam merentasi semua diet, dengan peningkatan aktiviti air kencing semasa separuh kedua tempoh gelap untuk betina yang diberi air serta betina yang diberi makan segar dan berumur 24 jam (imej 3). Walaupun diet air kencing mempengaruhi jarak penerbangan purata dengan ketara pada betina yang diberi makan darah (F(5, 138) = 4.83, p = 0.0004), diet urea tidak (F(5, 138) = 1.36, p = 0.24) dengan diet air kencing dan kawalan lain (segar, p = 0.0091; 72 jam, p = 0.0022; 168 jam, p = 0.001; sukrosa, p = 0.0017; dH2O, p = 0.036).
Kesan pemberian air kencing dan urea terhadap parameter pembiakan telah dinilai dalam ujian biobertelur (Rajah 4A) dan telah dikaji mengikut bilangan telur yang diletakkan oleh setiap betina, saiz telur, dan larva instar pertama yang baru menetas. Bilangan telur yang diletakkan. Betina Arab yang diberi air kencing berbeza-beza mengikut diet (F(5,222) = 4.38, p = 0.0008; Rajah 4B). Betina yang diberi makan air kencing, darah selama 24 jam bertelur dengan lebih banyak berbanding betina yang diberi diet air kencing lain dan serupa dengan yang diberi sukrosa (Rajah 4B). Begitu juga, saiz telur yang diletakkan oleh betina yang diberi air kencing berbeza-beza mengikut diet (F(5, 209) = 12.85, p < 0.0001), dengan air kencing 24 jam dan betina yang diberi sukrosa bertelur dengan lebih besar berbanding betina yang diberi air, manakala telur betina yang diberi air kencing selama 168 jam adalah lebih kecil (Rajah 4C). Di samping itu, diet air kencing mempengaruhi saiz larva dengan ketara (F(5, 187) = 7.86, p < 0.0001), dengan larva yang jauh lebih besar muncul daripada telur yang diletakkan oleh betina berumur 24 dan 72 jam yang diberi makan air kencing berbanding telur yang diletakkan daripada larva telur. Betina yang diberi makan air dan 168 jam yang diberi makan air kencing (Rajah 4D).
Prestasi pembiakan Anopheles arabinis betina yang memakan air kencing lembu dan urea. Nyamuk betina yang diberi makan darah diberi diet yang terdiri daripada air kencing lembu segar dan tua, pelbagai kepekatan urea, sukrosa (10%), dan air suling (H2O) selama 48 jam sebelum dimasukkan ke dalam ujian bio dan mendapatkan substrat bertelur 48 jam (A). Bilangan telur (B, E), saiz telur (C, F) dan saiz larva (D, G) terjejas dengan ketara oleh diet yang diberikan (air kencing lembu: BD; urea: EG). Min bagi setiap parameter yang diukur menggunakan nama huruf yang berbeza adalah berbeza dengan ketara antara satu sama lain (ANOVA sehala menggunakan analisis post hoc Tukey; p < 0.05). Bar ralat mewakili ralat piawai min
Sebagai komponen nitrogen utama dalam air kencing, urea, apabila diberikan sebagai diet kepada betina yang diberi makan darah, mempengaruhi parameter pembiakan dengan ketara dalam semua kajian. Bilangan telur yang diletakkan oleh betina yang diberi makan urea, selepas makan darah, bergantung pada kepekatan urea (F(11, 360) = 4.69; p < 0.0001), betina yang diberi makan kepekatan urea antara 134 µM dan 1.34 mM bertelur lebih banyak (Rajah 4E). Betina yang diberi makan kepekatan urea 134 µM atau lebih bertelur lebih besar daripada betina yang diberi makan air (F(10, 4245) = 36.7; p < 0.0001; Rajah 4F), dan saiz larva, walaupun dipengaruhi oleh kepekatan urea yang serupa pada ibu (F(10, 3305) = 37.9; p < 0.0001) adalah lebih berubah-ubah (Rajah 4G).
Daya tarikan keseluruhan terhadap ekstrak meruap ruang kepala air kencing lembu yang mencari perumah. Arabiensis yang dinilai dalam olfactometer tiub kaca (Rajah 5A) terjejas dengan ketara oleh umur air kencing (χ2 = 15.9, df = 4, p = 0.0032; Rajah 5B). Analisis post hoc menunjukkan bahawa bau air kencing yang basi pada 24 jam menyebabkan tahap daya tarikan yang jauh lebih tinggi berbanding semua rawatan lain (72 jam: p = 0.0060, 168 jam: p = 0.012, pentana: p = 0.00070), Kecuali bau air kencing segar (p = 0.13; Rajah 5B). Walaupun tarikan keseluruhan nyamuk penghisap darah terhadap bau air kencing tidak berbeza dengan ketara (χ2 = 8.78, df = 4, p = 0.067; Rajah 5C), nyamuk betina ini didapati jauh lebih menarik terhadap ekstrak meruap ruang kepala berbanding air kencing yang telah berusia 72 jam berbanding kawalan (p = 0.0066; Rajah 5C).
Tindak balas tingkah laku terhadap bau air kencing lembu semula jadi dan sintetik dalam pencarian perumah dan Anopheles arabianus yang diberi makan darah. Skematik olfactometer tiub kaca (A). Tarikan ekstrak meruap ruang kepala daripada air kencing lembu segar dan tua kepada perumah (B) dan nyamuk penghisap darah (C). Cari tindak balas tentakel Lord An. Ekstrak ruang kepala yang diasingkan daripada air kencing lembu segar (D), 24 jam (E), 72 jam (F), dan 168 jam (G) yang tua ditunjukkan. Jejak pengesanan antena elektron (EAD) menunjukkan perubahan voltan sebagai tindak balas kepada sebatian bioaktif dalam ruang kepala yang dielusi daripada kromatografi gas dan dikesan oleh pengesan pengionan nyalaan (FID). Bar skala mewakili amplitud tindak balas (mV) berbanding masa pengekalan (s). Sifat dan kadar pelepasan (µg h-1) sebatian aktif secara biologi ditunjukkan. Asterisk tunggal (*) menunjukkan tindak balas amplitud rendah yang konsisten. Asterisk berganda (**) menunjukkan tindak balas yang tidak boleh dihasilkan semula. Cari perumah (H) dan An.arabiensis penghisap darah (I) mempunyai daya tarikan yang berbeza terhadap campuran sintetik bau air kencing lembu segar dan tua. Perkadaran purata nyamuk yang tertarik kepada nama huruf yang berbeza adalah berbeza secara signifikan antara satu sama lain (ANOVA sehala menggunakan analisis post hoc Tukey; p < 0.05). Bar ralat mewakili ralat piawai skala
Ann.arabiensis betina, 72 jam dan 120 jam selepas pengambilan darah, semasa pemijahan, tiada keutamaan ditunjukkan untuk ekstrak meruap ruang kepala daripada air kencing lembu segar dan tua berbanding kawalan pentana (χ2 = 3.07, p > 0.05; Fail tambahan 1: Rajah S1).
Bagi Ann.arabiensis betina, analisis GC-EAD dan GC-MS mengenal pasti lapan, enam, tiga dan tiga sebatian bioaktif (Rajah 5D-G). Walaupun perbezaan bilangan sebatian yang menimbulkan tindak balas elektrofisiologi diperhatikan, kebanyakan sebatian ini terdapat dalam setiap ekstrak meruap ruang kepala yang dikumpulkan daripada air kencing segar dan air kencing yang telah lama digunakan. Oleh itu, bagi setiap ekstrak, hanya sebatian yang menghasilkan tindak balas fisiologi daripada antena betina di atas ambang dimasukkan dalam analisis selanjutnya.
Kadar pelepasan meruap keseluruhan sebatian bioaktif dalam koleksi ruang kepala meningkat daripada 29 µg h-1 dalam air kencing segar kepada 242 µg h-1 dalam air kencing yang telah dipelihara selama 168 jam, terutamanya disebabkan oleh peningkatan p-kresol dan m-formaldehid Fenol serta fenol. Sebaliknya, kadar pelepasan sebatian lain, seperti 2-sikloheksen-1-on dan dekanal, menurun dengan peningkatan usia air kencing, yang berkorelasi dengan penurunan keamatan isyarat (kelimpahan) yang diperhatikan dalam kromatogram (Rajah 5D)-G panel kiri) dan tindak balas fisiologi terhadap sebatian ini (Rajah 5D-G panel kanan).
Secara keseluruhan, campuran sintetik mempunyai nisbah semula jadi sebatian bioaktif yang serupa yang dikenal pasti dalam ekstrak meruap ruang kepala air kencing segar dan tua (Rajah 5D–G) dan nampaknya tidak menarik minat yang ketara dalam pencarian perumah (χ2 = 8.15, df = 4, p = 0.083; Rajah 5H) atau nyamuk penghisap darah (χ2 = 4.91, df = 4, p = 0.30; Rajah 5I). Walau bagaimanapun, perbandingan berpasangan post hoc antara rawatan menunjukkan bahawa nyamuk pencari perumah sangat menarik kepada campuran sintetik air kencing yang telah tua selama 24 jam berbanding dengan kawalan pentana (p = 0.0086; Rajah 5H).
Untuk menilai peranan komponen individu dalam campuran sintetik air kencing yang berumur 24 jam, enam campuran subtraktif telah dinilai terhadap campuran lengkap dalam ujian tiub-Y, di mana sebatian individu telah disingkirkan. Bagi nyamuk yang mencari perumah, penolakan sebatian individu daripada campuran lengkap mempunyai kesan yang ketara terhadap tindak balas tingkah laku (χ2 = 19.63, df = 6, p = 0.0032; Fail tambahan 1: Rajah S2A), semua campuran subtraktif adalah lebih menarik daripada yang lebih kecil daripada yang bercampur sepenuhnya. Sebaliknya, penyingkiran sebatian individu daripada campuran sintetik sepenuhnya tidak menjejaskan tindak balas tingkah laku nyamuk penghisap darah (χ2 = 11.38, df = 6, p = 0.077), kecuali dekanal, yang menghasilkan tahap yang lebih rendah berbanding Tarikan campuran lengkap (p = 0.022; Fail Tambahan 1: Rajah S2B).
Di sebuah perkampungan endemik malaria di Ethiopia, keberkesanan campuran sintetik air kencing lembu 24 jam dalam menarik nyamuk di bawah keadaan lapangan telah dinilai selama sepuluh malam (Rajah 6A). Sebanyak 4,861 nyamuk telah ditangkap dan dikenal pasti, di mana 45.7% adalah Anthropus.gambiae sl, 18.9% adalah Anopheles pharoensis dan 35.4% adalah Culex spp. (Fail tambahan 1: Jadual S1). Anopheles arabinis adalah satu-satunya ahli kompleks spesies An.Gambia yang dikenal pasti melalui analisis PCR. Secara purata, 320 nyamuk telah ditangkap setiap malam, di mana perangkap masa dengan umpan campuran sintetik menangkap lebih banyak nyamuk daripada perangkap berpasangan tanpa campuran (χ2(0, 3196) = 170.0, p < 0.0001). Perangkap tanpa umpan telah dipasang pada setiap lima malam kawalan pada permulaan, pertengahan dan akhir percubaan. Bilangan nyamuk yang serupa telah ditangkap dalam setiap pasangan. perangkap, menunjukkan tiada bias antara rumah (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0.05) dan tiada penurunan populasi semasa tempoh kajian. Berbanding dengan perangkap kawalan, bilangan nyamuk yang ditangkap dalam perangkap yang mengandungi campuran sintetik meningkat dengan ketara: pencarian perumah (χ2(0, 2107) = 138.7, p < 0.0001), pemberian darah baru-baru ini (χ2(0, 650) = 32.2, p < 0.0001) dan kehamilan (χ2(0, 228) = 6.27, p = 0.0123; Fail tambahan 1: Jadual S1). Ini juga tercermin dalam jumlah bilangan nyamuk yang ditangkap: pencarian perumah > penghisap darah > hamil > separa hamil > jantan.
Penilaian lapangan terhadap keberkesanan campuran bau air kencing lembu sintetik selama 24 jam. Percubaan lapangan dijalankan di selatan-tengah Ethiopia (peta), berhampiran bandar Maki (sisipan), menggunakan perangkap cahaya Pusat Kawalan Penyakit (CDC) (kanan) di rumah berpasangan, dengan reka bentuk segi empat sama Latin (imej udara) (A). Fototrap CDC berumpan bau sintetik menarik dan menangkap Anopheles arabesque betina (B), tetapi bukan Anopheles farroes (C), dengan cara yang berbeza, kesan bergantung keadaan fisiologi. Di samping itu, perangkap ini menangkap bilangan nyamuk Culex perumah yang meningkat dengan ketara. (D) Berbanding dengan kawalan. Bar di sebelah kiri mewakili indeks pemilihan purata nyamuk yang ditangkap dalam pasangan perangkap umpan bau (hijau) dan kawalan (terbuka) (N = 10), manakala bar di sebelah kanan mewakili indeks pemilihan purata dalam pasangan perangkap kawalan (terbuka; N = 5). Asterisk menunjukkan tahap kepentingan statistik (*p = 0.01 dan ***p < 0.0001)
Ketiga-tiga spesies telah ditangkap secara berbeza dalam perangkap yang mengandungi campuran sintetik. Mencari perumah (χ2(1, 1345) = 71.7, p < 0.0001), pengambilan darah (χ2(1, 517) = 16.7, p < 0.0001) dan kehamilan (χ2(1, 180) = 6.11, p = 0.0134) a .arabiensis telah terperangkap dalam perangkap dan melepaskan campuran sintetik (Rajah 6B), manakala jumlah An tidak berbeza. Pharoensis dalam keadaan fisiologi yang berbeza telah ditemui (Rajah 6C). Bagi Culex, hanya peningkatan ketara dalam bilangan nyamuk yang mencari perumah ditemui dalam perangkap yang diberi umpan dengan campuran sintetik (χ2(1,1319) = 12.6, p = 0.0004; Rajah 6D), berbanding dengan perangkap kawalan.
Perangkap umpan perumah yang terletak di luar perumah yang berpotensi antara tapak pembiakan dan komuniti luar bandar di Ethiopia telah digunakan untuk menilai sama ada nyamuk malaria menggunakan bau air kencing lembu sebagai petunjuk habitat perumah. Dengan ketiadaan petunjuk perumah, haba, dan dengan atau tanpa kehadiran bau air kencing lembu, tiada nyamuk yang ditangkap (Fail Tambahan 1: Rajah S3). Walau bagaimanapun, dengan kehadiran suhu tinggi dan bau air kencing lembu, nyamuk malaria betina tertarik dan ditangkap, walaupun dalam bilangan yang kecil, tanpa mengira usia air kencing (χ2(5, 25) = 2.29, p = 0.13; Fail Tambahan 1: Rajah S3). Sebaliknya, kawalan air tidak menangkap nyamuk malaria pada suhu tinggi (Fail Tambahan 1: Rajah S3).
Nyamuk malaria memperoleh dan mengedarkan sebatian yang mengandungi nitrogen melalui pemberian pampasan pada air kencing lembu (iaitu, lopak) untuk meningkatkan ciri-ciri sejarah hidup, sama seperti serangga lain [2, 4, 24, 25, 26]. Air kencing lembu merupakan sumber boleh diperbaharui yang mudah didapati dan berkait rapat dengan tempat rehat bagi vektor malaria, seperti kandang lembu dan tumbuh-tumbuhan tinggi berhampiran rumah luar bandar dan tempat pembiakan. Nyamuk betina mengesan sumber ini melalui bau dan mampu mengawal selia pengambilan sebatian nitrogen dalam air kencing, termasuk urea, komponen nitrogen utama dalam air kencing [15, 16]. Bergantung pada keadaan fisiologi nyamuk betina, nutrien dalam air kencing diperuntukkan untuk meningkatkan aktiviti penerbangan dan kemandirian nyamuk betina yang mencari perumah, serta ciri-ciri kemandirian dan pembiakan individu yang diberi makan darah semasa kitaran gonadotropik pertama. Oleh itu, pencampuran air kencing memainkan peranan pemakanan yang penting untuk vektor malaria yang tertutup seperti orang dewasa yang kekurangan zat makanan [8], kerana ia menyediakan nyamuk betina dengan keupayaan untuk memperoleh sebatian nitrogen penting dengan terlibat dalam pemberian makanan berisiko rendah. Penemuan ini mempunyai akibat epidemiologi yang ketara, kerana nyamuk betina meningkatkan jangka hayat, aktiviti dan output pembiakan, yang semuanya mempengaruhi kapasiti vektor. Tambahan pula, tingkah laku ini mungkin menjadi sasaran program pengurusan vektor masa hadapan.