Die Nährstoffaufnahme und -verteilung ist eng mit der Nahrungssuche und den Lebenszyklusmerkmalen von Insekten verknüpft. Um einen Mangel an bestimmten Nährstoffen in verschiedenen Lebensstadien auszugleichen, können Insekten diese Nährstoffe durch zusätzliche Nahrungsaufnahme gewinnen, beispielsweise durch das Aufsaugen von Wirbeltiersekreten in sogenannten „Pfützen“. Die Stechmücke Anopheles arabiensis scheint unterernährt zu sein und benötigt daher Nährstoffe sowohl für den Stoffwechsel als auch für die Fortpflanzung. Ziel dieser Studie war es, zu untersuchen, ob die Aufnahme von Nährstoffen durch das Aufsaugen von Kuhurin die Lebenszyklusmerkmale von An. arabiensis verbessert.
Stellen Sie sicher, dass es sicher ist. *Agave arabiensis* wurde vom Geruch frischen, 24, 72 und 168 Stunden alten Kuhurins angelockt. Wirtssuchende und blutgesaugte Weibchen (48 Stunden nach der Blutmahlzeit) wurden in einem Y-Rohr-Olfaktometer untersucht, und trächtige Weibchen wurden einem Laichtest unterzogen. Anschließend wurde eine kombinierte chemische und elektrophysiologische Analyse durchgeführt, um bioaktive Verbindungen im Kuhurin aller vier Altersklassen zu identifizieren. Synthetische Mischungen bioaktiver Verbindungen wurden in Y-Rohr- und Feldversuchen getestet. Um Kuhurin und seinen Hauptstickstoffbestandteil Harnstoff als potenzielle Ergänzungsnahrung für Malariavektoren zu untersuchen, wurden Fressparameter und Lebenszyklusmerkmale gemessen. Der Anteil weiblicher Mücken und die Menge des aufgenommenen Kuhurins und Harnstoffs wurden bestimmt. Nach der Nahrungsaufnahme wurden die Weibchen hinsichtlich Überleben, Flugfähigkeit und Reproduktion untersucht.
Sie suchen nach dem Blut und der Nahrung des Wirts. In Labor- und Feldstudien fühlten sich Araber vom natürlichen und synthetischen Geruch von frischem und gealtertem Kuhurin angezogen. Trächtige Weibchen reagierten an Laichplätzen gleichgültig auf Kuhurin. Wirtssuchende und blutsaugende Weibchen nehmen aktiv Kuhurin und Harnstoff auf und verteilen diese Ressourcen je nach physiologischem Zustand für Flucht, Überleben oder Fortpflanzung.
Anopheles arabinis nimmt Kuhurin auf und verteilt ihn, um seine Lebenszykluseigenschaften zu verbessern. Die zusätzliche Fütterung mit Kuhurin beeinflusst die Vektorkapazität direkt durch Erhöhung der täglichen Überlebensrate und der Vektordichte und indirekt durch Veränderung der Flugaktivität und sollte daher in zukünftigen Modellen berücksichtigt werden.
Die Nährstoffaufnahme und -verteilung ist eng mit der Nahrungssuche und den Lebenszyklusmerkmalen von Insekten verknüpft [1,2,3]. Insekten können Nahrung auswählen und aufnehmen sowie kompensatorische Nahrungsaufnahme betreiben, basierend auf Nahrungsverfügbarkeit und Nährstoffbedarf [1, 3]. Die Nährstoffverteilung hängt vom Lebenszyklus ab und kann in verschiedenen Entwicklungsstadien zu unterschiedlichen Anforderungen an Nahrungsqualität und -quantität führen [1, 2]. Um einen Mangel an bestimmten Nährstoffen auszugleichen, können Insekten diese durch zusätzliche Nahrungsaufnahme gewinnen, beispielsweise durch Schlamm, verschiedene Exkremente und Sekrete von Wirbeltieren sowie Aas – ein Vorgang, der als Wasserstellen bekannt ist [2]. Obwohl hauptsächlich verschiedene Schmetterlings- und Mottenarten beschrieben werden, kommen Wasserstellen auch bei anderen Insektenordnungen vor, und die Anlockung zu und die Nahrungsaufnahme an diesen Ressourcen kann erhebliche Auswirkungen auf die Gesundheit und andere Lebenszyklusmerkmale haben [2, 4, 5, 6, 7]. Die Malariamücke Anopheles gambiae sensu lato (sl) schlüpft als „unterernährtes“ adultes Tier [8]. Die Bewässerung könnte also eine wichtige Rolle für die Lebenszyklusmerkmale spielen, dieses Verhalten wurde jedoch bisher vernachlässigt. Der Einsatz von Bewegung zur Steigerung der Nährstoffaufnahme in diesem wichtigen Transportmittel verdient Beachtung, da dies wichtige epidemiologische Konsequenzen haben könnte.
Die Stickstoffaufnahme adulter weiblicher Anopheles-Mücken ist aufgrund geringer Kalorienreserven aus dem Larvenstadium und ineffizienter Verwertung der Blutmahlzeit begrenzt [9]. Weibliche Anopheles gambiae sl kompensieren dies typischerweise durch zusätzliche Blutmahlzeiten [10, 11], wodurch mehr Menschen dem Risiko einer Infektion ausgesetzt und die Mücken selbst einem höheren Prädationsrisiko ausgesetzt werden. Alternativ können Mücken, wie bei anderen Insekten gezeigt wurde [2], zusätzlich Wirbeltierexkremente aufnehmen, um Stickstoffverbindungen zu gewinnen, die ihre Anpassungsfähigkeit und Flugmanövrierfähigkeit verbessern. In diesem Zusammenhang ist die starke und deutliche Anziehungskraft von frischem und gealtertem Kuhurin durch eine der Schwesterarten des Anopheles-gambiae-sl-Artenkomplexes, Anopheles arabinis, interessant [12, 13, 14]. Anopheles arabinis ist opportunistisch in seiner Wirtswahl und ist dafür bekannt, sich mit Rindern zu assoziieren und sich von ihnen zu ernähren. Kuhurin ist reich an Stickstoffverbindungen, wobei Harnstoff 50–95 % ausmacht. Der Gesamtstickstoffgehalt im frischen Urin ist hoch [15, 16]. Mit zunehmendem Alter des Kuhurins nutzen Mikroorganismen diese Ressourcen, um die Komplexität der Stickstoffverbindungen innerhalb von 24 Stunden zu reduzieren [15]. Durch den raschen Anstieg des Ammoniaks, der mit einem Rückgang des organischen Stickstoffs einhergeht, vermehren sich alkaliphile Mikroorganismen (von denen viele für Mücken giftige Verbindungen produzieren) [15]. Weibliche Ann. arabiensis wird bevorzugt von Urin angezogen, der maximal 24 Stunden alt ist [13, 14].
In dieser Studie wurden Wirts- und blutgesaugte Anopheles arabiensis untersucht. Während ihres ersten Gonadotropinzyklus wurde die Aufnahme stickstoffhaltiger Verbindungen, einschließlich Harnstoff, durch Urinmischung bei Anopheles arabiensis untersucht. Anschließend wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um zu untersuchen, wie weibliche Stechmücken diese potenzielle Nährstoffquelle für verbessertes Überleben, Fortpflanzung und weitere Nahrungssuche nutzen. Schließlich wurde der Geruch von frischem und gealtertem Kuhurin untersucht, um festzustellen, ob dieser zuverlässige Hinweise für Wirts- und blutgesaugte Anopheles arabiensis liefert. Bei der Suche nach dieser potenziellen Nahrungsquelle entdeckte Anopheles arabiensis chemische Korrelationen, die der beobachteten unterschiedlichen Attraktivität zugrunde liegen. Synthetische Geruchsmischungen flüchtiger organischer Verbindungen (VOCs), die in 24 Stunden gealtertem Urin identifiziert wurden, wurden unter Feldbedingungen weiter untersucht. Dies erweiterte die unter Laborbedingungen erzielten Ergebnisse und zeigte die Wirkung des Kuhuringeruchs auf verschiedene physiologische Zustände und die Anlockwirkung auf Stechmücken. Die Ergebnisse bestätigen, dass Anopheles arabiensis… *Arabiensis* nimmt stickstoffhaltige Verbindungen aus dem Urin von Wirbeltieren auf und verteilt diese, um Lebenszyklusmerkmale zu beeinflussen. Diese Ergebnisse werden im Hinblick auf mögliche epidemiologische Konsequenzen und ihre Anwendungsmöglichkeiten zur Vektorüberwachung und -bekämpfung diskutiert.
Anopheles arabicans (Stamm Dongola) wurden bei 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit und einem 12:12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Larven wurden in mit destilliertem Wasser gefüllten Plastikschalen (20 cm × 18 cm × 7 cm) aufgezogen und mit Tetramin®-Fischfutter (Tetra Werke, Melle, Deutschland) gefüttert. Die Puppen wurden in 30-ml-Bechern (Nolato Hertila, Åstorp, Schweden) gesammelt und anschließend in Bugdorm-Käfige (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taiwan) überführt, um das Schlüpfen der adulten Mücken zu ermöglichen. Die adulten Mücken erhielten bis zum vierten Tag nach dem Schlüpfen (dpe) ad libitum eine 10%ige Saccharoselösung. Anschließend wurde den wirtssuchenden Weibchen unmittelbar vor dem Experiment Futter angeboten oder sie wurden, wie beschrieben, über Nacht mit destilliertem Wasser gehungert. Die für die Flugröhrchenexperimente verwendeten Weibchen wurden nur 4–6 Stunden lang gehungert und erhielten Wasser ad libitum. Zur Vorbereitung der blutsaugenden Mücken für die nachfolgenden Bioassays wurden 4 Tage alte Weibchen mit defibrotischem Schafblut (Håtunalab, Bro, Schweden) mittels eines Membranfütterungssystems (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK) versorgt. Die vollständig mit Blut gefüllten Weibchen wurden anschließend in Einzelkäfige umgesetzt und entweder direkt, wie unten beschrieben, oder 3 Tage vor den unten beschriebenen Experimenten mit 10%iger Saccharoselösung ad libitum gefüttert. Letztere Weibchen wurden für die Flugröhrchen-Bioassays verwendet, ins Labor gebracht und erhielten dort 4–6 Stunden vor dem Experiment destilliertes Wasser ad libitum.
Fütterungsversuche wurden durchgeführt, um den Urin- und Harnstoffverbrauch adulter An.Arab-Weibchen zu quantifizieren. Wirtssuchende und blutgesaugte Weibchen erhielten 48 Stunden lang eine Diät, die 1 % verdünnten frischen und gealterten Kuhurin, verschiedene Harnstoffkonzentrationen sowie zwei Kontrollen (10 % Saccharose und Wasser) enthielt. Zusätzlich wurde der Diät Lebensmittelfarbe (1 mg/ml Xylencyanid FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, Schweden) zugesetzt. Die Diät wurde in einer 4 × 4-Matrix in 250 µl-Mikrozentrifugenröhrchen (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; Abb. 1A) bis zum Rand (~300 µl) gefüllt. Um Konkurrenz zwischen den Mücken und mögliche Auswirkungen der Farbstofffarbe zu vermeiden, wurden 10 Mücken in eine große Petrischale (12 cm Durchmesser und 6 cm Höhe; Semadeni, Östermundigen, CH; Abb. 1A) gegeben. Die Versuche wurden in völliger Dunkelheit bei 25 ± 2 °C und 65 ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit durchgeführt und 5 bis 10 Mal wiederholt. Nach der Fütterung wurden die Mücken bis zur weiteren Analyse bei -20 °C gelagert.
Untersucht wurde die Aufnahme von Rinderurin und Harnstoff durch den Wirt und blutsaugende weibliche Anopheles arabianus. Im Fütterungsversuch (A) erhielten weibliche Mücken eine Diät aus frischem und gealtertem Kuhurin, verschiedenen Harnstoffkonzentrationen, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H₂O). Wirtssuchende (B) und blutsaugende (C) Weibchen nahmen mehr Saccharose auf als bei jeder anderen getesteten Diät. Es ist zu beachten, dass wirtssuchende Weibchen 72 Stunden alten Kuhurin weniger aufnahmen als 168 Stunden alten Kuhurin (B). Der mittlere Gesamtstickstoffgehalt (± Standardabweichung) des Urins ist in der Abbildung dargestellt. Wirtssuchende (D, F) und blutsaugende (E, G) Weibchen nehmen Harnstoff dosisabhängig auf. Die mittleren inhalierten Volumina (D, E) mit unterschiedlichen Buchstabenbezeichnungen unterschieden sich signifikant voneinander (einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test; p < 0,05). Die Fehlerbalken geben den Standardfehler an. Der Mittelwert (BE). Die gestrichelte Linie stellt die logarithmisch-lineare Regressionsgerade dar (F, G).
Zur Freisetzung der aufgenommenen Nahrung wurden Mücken einzeln in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 230 µl destilliertem Wasser gegeben und das Gewebe mit einem Einweg-Pestel und einem Akkumotor (VWR International, Lund, Schweden) zerkleinert. Anschließend wurde 10 min bei 10.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand (200 µl) wurde in eine 96-Well-Mikrotiterplatte (Sigma-Aldrich) überführt und die Absorption (λ620 nm) mit einem Mikrotiterplatten-Spektralphotometer (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, Deutschland) bestimmt. Alternativ wurden die Mücken in 1 ml destilliertem Wasser homogenisiert, wovon 900 µl in eine Küvette für die spektrophotometrische Analyse (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, Schweden) überführt wurden. Zur Quantifizierung der Nahrungsaufnahme wurde eine Standardkurve durch serielle Verdünnung bis zu einer Konzentration von 0,2 µl erstellt. µl bis 2,4 µl einer 1 mg ml-1 Xylencyanidlösung. Anschließend wurde die optische Dichte bekannter Farbstoffkonzentrationen verwendet, um die von jeder Mücke aufgenommene Nahrungsmenge zu bestimmen.
Die Volumendaten wurden mittels einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Tukey-Post-hoc-Test für paarweise Vergleiche analysiert (JMP Pro, Version 14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1989–2007). Lineare Regressionsanalysen beschrieben die konzentrationsabhängige Harnstoffaufnahme und verglichen die Reaktionen zwischen wirtssuchenden und blutsaugenden Mücken (GraphPad Prism Version 8.0.0 für Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Etwa 20 µl Urinproben jeder Altersgruppe wurden an Chromosorb® W/AW (10 mg, 80/100 mesh, Sigma Aldrich) gebunden und in Zinnkapseln (8 mm × 5 mm) verkapselt. Die Kapseln wurden in die Brennkammer eines CHNS/O-Analysators (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) eingesetzt, um den Stickstoffgehalt in frischem und gealtertem Urin gemäß Herstellerprotokoll zu bestimmen. Der Gesamtstickstoff (g N l⁻¹) wurde anhand bekannter Harnstoffkonzentrationen als Standard quantifiziert.
Um den Einfluss der Ernährung auf das Überleben weiblich aktiver und blutsaugender Stechmücken zu untersuchen, wurden diese einzeln in große Petrischalen (12 cm Durchmesser, 6 cm Höhe; Semadeni) mit einem mit einem Sieb abgedeckten Loch im Deckel (3 cm Durchmesser) zur Belüftung und Nahrungsversorgung gesetzt. Die Ernährung erfolgte direkt nach 4 Tagen und umfasste 1 % verdünnten frischen und gealterten Kuhurin, vier Harnstoffkonzentrationen sowie zwei Kontrollen: 10 % Saccharose und Wasser. Jede Ernährung wurde auf einen Dentaltampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, Schweden) pipettiert, der in eine 5-ml-Spritze (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, Schweden) eingeführt, der Kolben entfernt und die Spritze auf eine Petrischale gestellt wurde (Abbildung 1A). Wechseln Sie die Ernährung täglich. Halten Sie die Laborbedingungen wie oben beschrieben ein. Überlebende Stechmücken wurden zweimal täglich gezählt, tote Stechmücken wurden aussortiert, bis die letzte Stechmücke starb (n = 40 pro Behandlung). Die Überlebenswahrscheinlichkeit von Mücken, die mit verschiedenen Nahrungen gefüttert wurden, wurde statistisch mit Hilfe von Kaplan-Meyer-Überlebenskurven und Log-Rank-Tests analysiert, um die Überlebensverteilungen zwischen den Nahrungen zu vergleichen (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Eine speziell angefertigte Mückenflugmühle nach Attisano et al. [17] besteht aus 5 mm dicken, transparenten Acrylplatten (10 cm breit x 10 cm lang x 10 cm hoch) ohne Vorder- und Rückwand (Abb. 3: oben). Eine Schwenkvorrichtung mit einem vertikalen Rohr aus einer Gaschromatographiesäule (0,25 mm Innendurchmesser; 7,5 cm Länge), dessen Enden an eine Insektennadel geklebt sind, die zwischen zwei 9 cm voneinander entfernten Neodym-Magneten aufgehängt ist. Ein horizontales Rohr aus demselben Material (6,5 cm Länge) halbiert das vertikale Rohr und bildet einen befestigten Arm sowie einen Arm, der ein kleines Stück Aluminiumfolie als Lichtunterbrechungssignal trägt.
Weibliche Mücken, die 24 Stunden lang gehungert hatten, erhielten die oben genannte Nahrung 30 Minuten vor ihrer Fixierung. Vollgesaugte weibliche Mücken wurden anschließend einzeln 2–3 Minuten lang auf Eis betäubt und mit Bienenwachs (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) an Insektennadeln befestigt und dann an den Armen der horizontalen Röhren festgebunden. Flugmühle: Die Umdrehungen pro Flug wurden mit einem eigens entwickelten Datenlogger aufgezeichnet und anschließend mit der Software PC-Lab 2000™ (Version 4.01; Velleman, Gavere, BE) gespeichert und angezeigt. Die Flugmühle befand sich in einem klimatisierten Raum (12 h:12 h, Licht:Dunkel, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relative Luftfeuchtigkeit).
Um das Flugaktivitätsmuster zu visualisieren, wurden die geflogene Gesamtstrecke (in Metern) und die Gesamtzahl aufeinanderfolgender Flugaktivitäten pro Stunde über einen Zeitraum von 24 Stunden berechnet. Zusätzlich wurden die durchschnittlichen Flugstrecken einzelner Weibchen über die verschiedenen Behandlungsgruppen hinweg verglichen und mittels einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und dem Tukey-Test (JMP Pro, Version 14.0.0, SAS Institute Inc.) analysiert. Dabei wurde die durchschnittliche Flugstrecke als abhängige Variable und die Behandlung als unabhängiger Faktor betrachtet. Die durchschnittliche Anzahl der Flugrunden wurde in 10-Minuten-Schritten berechnet.
Um den Einfluss der Ernährung auf die Reproduktionsleistung von An. arabiensis zu untersuchen, wurden sechs Weibchen (4 Tage nach der Eiablage) nach der Blutentnahme direkt in Bugdorm-Käfige (30 cm × 30 cm × 30 cm) überführt und anschließend 48 Stunden lang mit der oben beschriebenen Versuchsdiät gefüttert. Am dritten Tag wurde die Diät entfernt und Laichbecher (30 ml; Nolato Hertila) mit 20 ml destilliertem Wasser für 48 Stunden bereitgestellt, wobei das Wasser alle 24 Stunden gewechselt wurde. Jedes Fütterungsschema wurde 20-50 Mal wiederholt. Die Eier wurden für jeden Versuchskäfig gezählt und dokumentiert. Unterproben der Eier wurden verwendet, um die mittlere Größe und die Längenvariation einzelner Eier (n ≥ 200 pro Diät) mit einem Dialux-20-Mikroskop (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Deutschland), ausgestattet mit einer Leica-Kamera (DFC) 320 R2, zu bestimmen. Leica Microsystems Ltd., DE). Die restlichen Eier wurden 24 Stunden lang in einem klimatisierten Raum unter Standardaufzuchtbedingungen gehalten, und eine Unterprobe der kürzlich geschlüpften Larven des 1. Stadiums (n ≥ 200 pro Futtergruppe) wurde wie oben beschrieben vermessen. Die Anzahl der Eier sowie die Größe der Eier und Larven wurden zwischen den Behandlungen mittels einfaktorieller ANOVA und Tukey-Post-hoc-Test verglichen (JMP Pro, Version 14.0.0, SAS Institute Inc.).
Die flüchtigen Verbindungen im Headspace von frischem (1 Stunde nach der Probenahme) sowie 24, 72 und 168 Stunden gereiftem Urin wurden von Zebu-Rindern der Rasse Arsi gewonnen. Die Urinproben wurden aus praktischen Gründen früh morgens gesammelt, als sich die Kühe noch im Stall befanden. Von zehn Tieren wurden jeweils 100–200 ml Urin in einzelne Polyamid-Backbeutel (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH & Co., Minden, Deutschland) gefüllt und in 3-Liter-Polyamidfässern mit Deckel in Vinylchlorid-Kunststofffässern gelagert. Die flüchtigen Verbindungen im Headspace jeder Rinderurinprobe wurden entweder direkt (frisch) oder nach 24, 72 und 168 Stunden Reifung bei Raumtemperatur gewonnen, sodass jede Urinprobe repräsentativ für die jeweilige Altersgruppe war.
Zur Sammlung flüchtiger Verbindungen im Headspace wurde ein geschlossenes System verwendet, um einen mit Aktivkohle gefilterten Gasstrom (100 ml min⁻¹) mittels einer Membranvakuumpumpe (KNF Neuberger, Freiburg) über 2,5 h durch einen Polyamidbeutel zur Adsorptionssäule zu leiten. Als Kontrolle wurde die Headspace-Sammlung aus einem leeren Polyamidbeutel durchgeführt. Die Adsorptionssäule bestand aus Teflon-Schlauch (5,5 cm × 3 mm Innendurchmesser) und enthielt 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) zwischen Glaswollstopfen. Vor Gebrauch wurde die Säule mit 1 ml redestilliertem n-Hexan (Merck, Darmstadt) und 1 ml Pentan (99,0 % Reinheit, GC-Qualität, Sigma-Aldrich) gespült. Die adsorbierten flüchtigen Verbindungen wurden mit 400 μl Pentan eluiert. Die Headspace-Proben wurden vereinigt und bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert. zur weiteren Analyse.
Verhaltensreaktionen von wirtsuchenden und blutsaugenden Anopheles-Mücken. Flüchtige Extrakte aus dem Headspace von frischem, 24 h, 72 h und 168 h gealtertem Urin wurden mittels eines geraden Glasrohr-Olfaktometers auf flüchtige Extrakte von Arabidopsis-Mücken analysiert [18]. Die Experimente wurden während der Zeitzone ZT 13-15 durchgeführt, der Hauptphase der Wirtssuche von Anopheles-Mücken [19]. Ein Glasrohr-Olfaktometer (80 cm × 9,5 cm Innendurchmesser) wurde von oben mit 3 ± 1 lx rotem Licht beleuchtet. Ein mit Aktivkohle gefilterter und befeuchteter Luftstrom (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % relative Luftfeuchtigkeit) strömte mit 30 cm s⁻¹ durch den Bioassay. Die Luft wird durch eine Reihe von Edelstahlgewebesieben geleitet, wodurch eine laminare Strömung und eine gleichmäßige Rauchfahnenstruktur erzeugt wird. Ein Dentaltampon-Spender (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), an einer 5 cm langen Spule am windzugewandten Ende des Olfaktometers befestigt, wobei der Stimulator alle 5 Minuten gewechselt wurde. Für die Analyse wurden 10 μl jedes Headspace-Extrakts, 1:10 verdünnt, als Stimulus verwendet. Eine gleiche Menge Pentan diente als Kontrolle. Einzelne wirtssuchende oder blutsaugende Mücken wurden 2–3 Stunden vor Versuchsbeginn in einzelne Freisetzungskäfige gesetzt. Der Freisetzungskäfig wurde auf der windabgewandten Seite des Olfaktometers platziert, und die Mücken konnten sich 1 Minute lang akklimatisieren. Anschließend wurde das Ventil des Käfigs geöffnet, um die Mücken freizulassen. Die Anlockwirkung der Behandlung bzw. der Kontrolle wurde als Anteil der Mücken analysiert, die innerhalb von 5 Minuten nach der Freisetzung mit der Quelle in Kontakt kamen. Jeder flüchtige Headspace-Extrakt und jede Kontrolle wurde mindestens 30-mal wiederholt. Um den Einfluss einzelner Tage auszuschließen, wurde an jedem Versuchstag die gleiche Anzahl an Behandlungen und Kontrollen getestet. Suchreaktionen von Wirts- und blutsaugenden Mücken wurden untersucht. Die arabischen Datensätze wurden mit den Headspace-Datensätzen mittels nominaler logistischer Regression und anschließendem paarweisen Vergleich der Odds Ratios analysiert (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Die Laichreaktion von An wurde untersucht. Headspace-Extrakte aus frischem und gealtertem Kuhurin wurden in Bugdorm-Käfigen (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science) analysiert. Plastikbecher (30 ml; Nolato Hertila), gefüllt mit 20 ml destilliertem Wasser, dienten als Laichsubstrat und wurden in gegenüberliegenden Ecken des Käfigs im Abstand von 24 cm platziert. Die Behandlungsbecher wurden mit 10 μl jedes Headspace-Extrakts in einer 1:10-Verdünnung versetzt. Der Kontrollbecher wurde mit der gleichen Menge Pentan versetzt. Behandlungs- und Kontrollbecher wurden zwischen den einzelnen Experimenten ausgetauscht, um Positionseffekte zu kontrollieren. Zehn blutgesaugte Weibchen wurden zwischen 9 und 11 Uhr ZT in die Versuchskäfige gesetzt, und die Eier in den Bechern wurden 24 Stunden später gezählt. Die Formel zur Berechnung des Laichindex lautet: (Anzahl der im Behandlungsbecher abgelegten Eier – Anzahl der im Kontrollbecher abgelegten Eier) / (Gesamtzahl der abgelegten Eier). Jede Behandlung wurde 8 Mal wiederholt.
Die gaschromatographische Analyse und Elektronenantennenmusterdetektion (GC-EAD) von weiblichen An. arabiensis wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [20]. Kurz gesagt, wurden frische flüchtige Headspace-Extrakte mit einem Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, USA) getrennt, der mit einer HP-5-Säule (30 m × 0,25 mm Innendurchmesser, 0,25 μm Filmdicke, Agilent Technologies) ausgestattet war. und gealtertem Urin. Wasserstoff wurde als mobile Phase mit einer durchschnittlichen linearen Flussrate von 45 cm s⁻¹ verwendet. Jede Probe (2 μl) wurde 30 Sekunden lang im Splitless-Modus mit einer Einlasstemperatur von 225 °C injiziert. Die GC-Ofentemperatur wurde von 35 °C (3 Minuten Haltezeit) auf 300 °C (10 Minuten Haltezeit) mit einer Heizrate von 10 °C min⁻¹ programmiert. Im GC-Effluent-Splitter wurden 4 psi Stickstoff zugeführt und der Effluent im Verhältnis 1:1 in einem Gerstel 3D/2 Low-Tot-Volume-Kreuz (Gerstel, Mülheim, Deutschland) zwischen Flammenionisationsdetektor und EAD aufgeteilt. Die GC-Effluentkapillare für den EAD wurde durch eine Gerstel ODP-2 Transferleitung, die die GC-Ofentemperatur plus 5 °C nachführt, in ein Glasrohr (10 cm × 8 mm) geleitet, wo sie mit kohlenstoffgefilterter, befeuchteter Luft (1,5 l min⁻¹) vermischt wurde. Die Antenne wurde 0,5 cm vom Auslass des Röhrchens entfernt platziert. Jede einzelne Mücke bildete eine Wiederholung, und bei wirtssuchenden Mücken wurden mindestens drei Wiederholungen mit Urinproben jedes Alters durchgeführt.
Identifizierung bioaktiver Verbindungen in Headspace-Proben von frischem und gealtertem Rinderurin mittels eines kombinierten Gaschromatographen und Massenspektrometers (GC-MS; 6890 GC und 5975 MS; Agilent Technologies) zur Erzeugung von Antennenreaktionen in der GC-EAD-Analyse, betrieben im Elektronenstoßionisationsmodus bei 70 eV. Der GC war mit einer HP-5MS UI-beschichteten Quarzglaskapillarsäule (60 m × 0,25 mm Innendurchmesser, 0,25 μm Filmdicke) ausgestattet, wobei Helium als mobile Phase mit einer mittleren linearen Flussrate von 35 cm s⁻¹ verwendet wurde. Eine 2 μl Probe wurde mit denselben Injektoreinstellungen und Ofentemperatur wie für die GC-EAD-Analyse injiziert. Die Verbindungen wurden anhand ihrer Retentionszeit (Kovát-Index) und ihrer Massenspektren im Vergleich zur benutzerdefinierten Bibliothek und der NIST14-Bibliothek (Agilent) identifiziert. Die identifizierten Verbindungen wurden durch Injektion authentischer Standards bestätigt (Zusatzdatei). 1: Tabelle S2). Zur Quantifizierung wurde Heptylacetat (10 ng, 99,8 % chemische Reinheit, Aldrich) als externer Standard injiziert.
Die Wirksamkeit einer synthetischen Duftstoffmischung, bestehend aus bioaktiven Verbindungen aus frischem und gealtertem Urin, zur Anlockung wirtssuchender und blutsaugender An. arabiensis wurde mit demselben Olfaktometer und Protokoll wie oben beschrieben untersucht. Die synthetischen Mischungen ahmten die Zusammensetzung und die Anteile der Verbindungen in gemischten Headspace-Extrakten von frischem sowie 24, 48, 72 und 168 Stunden gealtertem Urin nach (Abbildung 5D-G; Zusatzdatei 1: Tabelle S2). Zur Analyse wurden 10 μl einer 1:100-Verdünnung der vollständig synthetischen Mischung mit einer Freisetzungsrate von ca. 140–2400 ng h⁻¹ verwendet, um die Attraktivität für Wirts- und blutsaugende Mücken zu bestimmen. Anschließend wurde der Test mit vollständigen Mischungen durchgeführt, aus denen subtraktive Mischungen einzelner Verbindungen der vollständigen Mischung entfernt wurden. Die Suchreaktionen von Wirts- und blutgesaugten An. arabiensis im Vergleich zu synthetischen und subtraktiven Mischungen wurden untersucht. Die Analyse erfolgte mittels nominaler logistischer Regression mit anschließendem paarweisen Vergleich der Odds Ratios (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Um zu untersuchen, ob Kuhurin als Hinweis auf einen Wirtshabitat für Malariamücken dienen kann, wurden frischer und gealterter Kuhurin (wie oben beschrieben gesammelt) sowie Wasser in 3-Liter-Eimer (100 ml) mit Maschengewebe gefüllt und in Köderfallen (BG-HDT-Version; BioGents, Regensburg, Deutschland) platziert. Zehn Fallen wurden im Abstand von 50 m auf einer Weide, 400 m von einem Dorf (Silay, Äthiopien, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) entfernt, aufgestellt. Die Fallen befanden sich in permanenten Brutgebieten und in der Nähe von Dörfern und wurden ohne Rinderhaltung platziert. Fünf Fallen wurden beheizt, um die Anwesenheit eines Wirts zu simulieren, während fünf Fallen unbeheizt blieben. Die Versuchsstandorte wurden fünf Nächte lang jede Nacht gewechselt. Die Anzahl der in den mit Urin unterschiedlichen Alters beköderten Fallen gefangenen Mücken wurde mittels logistischer Regression mit einer Beta-Binomialverteilung verglichen (JMP Pro, Version 14.0.0, SAS Institute Inc.).
In einem Malaria-endemischen Dorf nahe der Stadt Maki in der Region Oromia, Äthiopien (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ O; Abb. 6A), wurde die Studie zwischen Mitte August und Mitte September, also vor der jährlichen Innenraumspritzung und während der langen Regenzeit, durchgeführt. Fünf Hauspaare (20–50 m Abstand) am Dorfrand wurden für die Studie ausgewählt (Abb. 6A). Die Auswahlkriterien waren: keine Tiere im Haus, kein Kochen im Haus (mit Brennholz oder Holzkohle) (zumindest während des Untersuchungszeitraums) und maximal zwei Bewohner, die in nicht insektizidbehandelten Räumen schliefen. Unter dem imprägnierten Moskitonetz. Die ethische Genehmigung wurde vom Ethikkomitee der Fakultät für Naturwissenschaften (CNS-IRB) der Universität Addis Abeba (IRB/022/2016) gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki des Weltärztebundes erteilt. Die Einwilligung jedes Haushaltsvorstands wurde mit Unterstützung von Gesundheitspersonal eingeholt. Der gesamte Prozess wurde von den lokalen Verwaltungen auf Bezirks- und Gemeindeebene („Kebele“) unterstützt. Das Versuchsdesign folgte einem 2 × 2 Lateinischen Quadrat, in dem synthetische Mischungen und Kontrolllösungen in der ersten Nacht jeweils zwei Häusern zugeordnet und in der folgenden Versuchsnacht zwischen den Häusern getauscht wurden. Dieser Vorgang wurde zehnmal wiederholt. Um die Mückenaktivität in ausgewählten Häusern zu erfassen, wurden die CDC-Fallen zu Beginn, in der Mitte und am Ende des Feldversuchs fünf Nächte hintereinander zur gleichen Tageszeit aufgestellt.
Eine synthetische Mischung aus sechs bioaktiven Verbindungen wurde in Heptan (97,0 % Lösungsmittel, GC-Qualität, Sigma Aldrich) gelöst und mit einem Baumwolldocht-Dispenser [20] mit einer Rate von 140 ng/h freigesetzt. Der Docht-Dispenser gewährleistete die Freisetzung aller Verbindungen in konstanten Anteilen während des gesamten 12-stündigen Experiments. Heptan diente als Kontrolle. Das Fläschchen wurde neben dem Eintrittspunkt der Lichtfalle der Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; Abb. 6A) aufgehängt. Die Fallen wurden 0,8–1 m über dem Boden, nahe dem Fußende des Bettes, angebracht. Ein Freiwilliger schlief unter einem unbehandelten Moskitonetz und bediente die Fallen zwischen 18:00 und 06:30 Uhr. Die gefangenen Mücken wurden nach Geschlecht und physiologischem Zustand (ungesättigt, gesättigt, halbträchtig und trächtig [21]) klassifiziert und anschließend mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf die morphologisch als A. gambiae identifizierte Art untersucht. Mitglieder des Komplexes [23]. In der Feldstudie wurde der Fang von paarweise angeordneten Häusern mithilfe eines nominalen logistischen Regressionsmodells analysiert, wobei die Anlockung die abhängige Variable und die Behandlung (synthetische Mischung vs. Kontrolle) der feste Effekt war (JMP® 14.0.0, SAS Institute Inc.). Hier berichten wir die χ²- und p-Werte aus dem Likelihood-Ratio-Test.
Es wurde geprüft, ob die Fütterung sicher ist. *Agave arabiensis* konnte innerhalb von 48 Stunden nach Verabreichung von Urin, seiner Hauptstickstoffquelle Harnstoff, durch direkte Fütterung gewinnen. Dies wurde in viertägigen Fütterungsversuchen mit wirtsuchenden und blutsaugenden Weibchen beobachtet (Abb. 1A). Sowohl wirtsuchende als auch blutsaugende Weibchen nahmen signifikant mehr Saccharose auf als bei jeder anderen Nahrung oder Wasser (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 bzw. F(5,299) = 56,00, p < 0,0001; Abb. 1B,C). Darüber hinaus nahmen wirtsuchende Weibchen nach 72 Stunden weniger Urin auf als nach 168 Stunden (Abb. 1B). Bei Angebot einer harnstoffhaltigen Nahrung nahmen wirtsuchende Weibchen bei einer Harnstoffkonzentration von 2,69 mM signifikant mehr Harnstoff auf als bei allen anderen Konzentrationen und Wasser, während die Aufnahme von Harnstoff bei blutsaugenden Weibchen nicht signifikant unterschiedlich war. 10 % Saccharose (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Abb. 1D). Dies stand im Gegensatz zur Reaktion blutgesaugter Weibchen, die typischerweise deutlich mehr harnstoffhaltige Nahrung als Wasser aufnahmen, wenn auch deutlich weniger als 10 % Saccharose (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Abb. 1E). Im Vergleich der beiden physiologischen Zustände nahmen ahlebotomierte Weibchen bei den niedrigsten Harnstoffkonzentrationen mehr Harnstoff auf als wirtssuchende Weibchen, während diese bei höheren Konzentrationen ähnliche Mengen aufnahmen (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Abb. 1F, G). Obwohl die Aufnahme über eine harnstoffhaltige Nahrung optimale Werte zu haben schien (Abb. 1D, E), waren Weibchen in beiden physiologischen Zuständen in der Lage, Die Menge des absorbierten Harnstoffs wird über den gesamten Bereich der Harnstoffkonzentrationen logarithmisch-linear moduliert (Abb. 1F,G). Auch Mücken scheinen ihre Stickstoffaufnahme durch Regulierung der absorbierten Urinmenge zu steuern, da sich die Stickstoffmenge im Urin in der absorbierten Menge widerspiegelt (Abbildung 1B, C und B-Einsätze).
Um die Auswirkungen von Urin und Harnstoff auf das Überleben von wirtsuchenden und blutsaugenden Mücken zu untersuchen, wurden Weibchen mit Urin in vier verschiedenen Altersstufen (frisch, 24 h, 72 h und 168 h nach der Ablage) und unterschiedlichen Harnstoffkonzentrationen gefüttert. Destilliertes Wasser und 10%ige Saccharoselösung dienten als Kontrollen (Abbildung 2A). Die Überlebensanalyse zeigte, dass die Ernährung einen signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben von wirtsuchenden Weibchen (Urin: χ² = 108,5, df = 5, p < 0,0001; Harnstoff: χ² = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Abb. 2B, C) und von blutsaugenden Weibchen (Urin: χ² = 93,0, df = 5, p < 0,0001; Harnstoff: χ² = 137,9, df = 5, p < 0,0001) hatte. = 5, p < 0,0001; Abb. 2D,E). In allen Experimenten wiesen Weibchen, die mit Urin, Harnstoff und Wasser gefüttert wurden, signifikant niedrigere Überlebensraten auf als Weibchen, die mit Saccharose gefüttert wurden (Abb. 2B–E). Wirtssuchende Weibchen, die mit frischem und abgestandenem Urin gefüttert wurden, zeigten unterschiedliche Überlebensraten, wobei diejenigen, die 72 Stunden alten Urin erhielten (p = 0,016), die geringste Überlebenswahrscheinlichkeit aufwiesen (Abb. 2B). Darüber hinaus überlebten wirtssuchende Weibchen, die mit 135 mM Harnstoff gefüttert wurden, länger als die Wasserkontrollen (p < 0,04) (Abb. 2C). Im Vergleich zu Wasser überlebten Weibchen, die mit frischem Urin und 24 Stunden altem Urin gefüttert wurden, länger (p = 0,001 bzw. p = 0,012; Abb. 2D), während Weibchen, die mit 72 Stunden altem Urin gefüttert wurden, länger überlebten als diejenigen, die mit frischem Urin und 24 Stunden altem Urin gefüttert wurden (p < 0,0001). 0,0001 bzw. p = 0,013; Abbildung 2D). Bei Fütterung mit 135 mM Harnstoff überlebten blutgesaugte Weibchen länger als bei allen anderen Harnstoffkonzentrationen und Wasser (p < 0,013; Abbildung 2E).
Überleben von Wirts- und blutsaugenden weiblichen Anopheles arabinis nach Fütterung mit Kuhurin und Harnstoff. Im Bioassay (A) erhielten weibliche Stechmücken eine Diät aus frischem und gealtertem Kuhurin, verschiedenen Harnstoffkonzentrationen, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H₂O). Das Überleben von wirtssuchenden (B, C) und blutsaugenden (D, E) Stechmücken wurde alle 12 Stunden erfasst, bis alle Weibchen, die sich von Urin (B, D) und Harnstoff (C, E) ernährt hatten, sowie die Kontrollgruppe (Saccharose und Wasser) tot waren.
Die im Flugmühlentest über einen Zeitraum von 24 Stunden ermittelte Gesamtstrecke und Anzahl der Flugrunden unterschieden sich zwischen wirtssuchenden und blutsaugenden Mücken, die insgesamt eine geringere Flugaktivität aufwiesen (Abb. 3). Wirtssuchende Mücken, die frischen und gealterten Urin oder Saccharose und Wasser anboten, zeigten unterschiedliche Flugmuster (Abb. 3). Weibchen, die sich von frischem Urin ernährten, waren in der Morgendämmerung aktiver, während diejenigen, die 24 bzw. 168 Stunden alten Urin aufnahmen, andere Flugmuster zeigten und vorwiegend tagaktiv waren. Weibliche Mücken, die Saccharose oder 72 Stunden alten Urin anboten, waren über den gesamten 24-Stunden-Zeitraum aktiv, während Weibchen, die Wasser anboten, in der Mitte des Zeitraums aktiver waren. Mücken, die sich von Saccharose ernährten, zeigten die höchste Aktivität spät in der Nacht und früh am Morgen, während die Aktivität derjenigen, die 72 Stunden alten Urin aufnahmen, über 24 Stunden stetig abnahm (Abb. 3).
Flugverhalten von blutsaugenden Anopheles arabinis-Weibchen auf der Jagd nach Wirten bei Fütterung mit Kuhurin und Harnstoff. Im Flugmühlentest wurden weibliche Stechmücken, die mit frischem und gealtertem Kuhurin, verschiedenen Harnstoffkonzentrationen, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H₂O) gefüttert wurden, an horizontalen, frei rotierenden Armen befestigt (siehe oben). Für weibssuchende (links) und blutsaugende (rechts) Weibchen wurden die Gesamtstrecke und die Anzahl der Flüge pro Stunde für jede Nahrung über einen Zeitraum von 24 Stunden aufgezeichnet (dunkel: grau; hell: weiß). Die durchschnittliche Flugstrecke und die durchschnittliche Anzahl der Flugphasen sind rechts neben dem Diagramm der zirkadianen Aktivität dargestellt. Die Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts an. Statistische Analyse siehe Text.
Im Allgemeinen folgte die Flugaktivität wirtsuchender Weibchen einem ähnlichen Muster wie die Flugdistanz über einen Zeitraum von 24 Stunden. Die mittlere Flugdistanz wurde signifikant von der aufgenommenen Nahrung beeinflusst (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001). Wirtsuchende Weibchen, die 72 Stunden alten Urin aufnahmen, flogen signifikant längere Strecken als alle anderen Nahrungsquellen (p < 0,0001). Mit Saccharose gefütterte Mücken flogen weiter als solche, die mit frischem (p = 0,022) oder 24 Stunden altem Urin (p = 0,022) gefüttert wurden. Im Gegensatz zum durch die Urinnahrung beschriebenen Flugaktivitätsmuster zeigten wirtsuchende Weibchen, die mit Harnstoff gefüttert wurden, eine anhaltende Flugaktivität über 24 Stunden mit einem Höhepunkt in der zweiten Hälfte der Dunkelphase (Abb. 3). Obwohl die Aktivitätsmuster ähnlich waren, erhöhte sich die mittlere Flugdistanz wirtsuchender Weibchen, die mit Harnstoff gefüttert wurden, signifikant in Abhängigkeit von der absorbierten Harnstoffkonzentration. (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Wirtssuchende Weibchen, die mit Harnstoff in beliebiger Konzentration gefüttert wurden, flogen länger als Weibchen, die entweder mit Wasser oder mit Saccharose gefüttert wurden (p < 0,03).
Die Flugaktivität der blutsaugenden Mücken blieb über 24 Stunden bei allen Nahrungsarten stabil und anhaltend. Bei Weibchen, die mit Wasser gefüttert wurden, sowie bei Weibchen, die mit frischem oder 24 Stunden altem Urin gefüttert wurden, war die Urinaktivität in der zweiten Hälfte der Dunkelphase erhöht (Abbildung 3). Während die Urinnahrung die mittlere Flugdistanz blutgesaugter Weibchen signifikant beeinflusste (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), hatte die Harnstoffnahrung keinen signifikanten Einfluss (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24). Im Vergleich zu anderen Urinnahrungen und der Kontrollgruppe (frisch, p = 0,0091; 72 Stunden, p = 0,0022; 168 Stunden, p = 0,001; Saccharose, p = 0,0017; dH₂O, p = 0,036) ergaben sich keine signifikanten Unterschiede.
Die Auswirkungen von Urin- und Harnstofffütterung auf Reproduktionsparameter wurden in Eiablage-Bioassays untersucht (Abbildung 4A). Dabei wurden die Anzahl der von jedem Weibchen gelegten Eier, die Eigröße und die Anzahl der frisch geschlüpften Larven im ersten Larvenstadium analysiert. Die Anzahl der gelegten Eier variierte bei mit Urin gefütterten arabischen Weibchen je nach Fütterung (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; Abb. 4B). Weibchen, die 24 Stunden lang mit Urin und anschließend mit Blut gefüttert wurden, legten signifikant mehr Eier als Weibchen, die andere Urindiäten erhielten, und wiesen eine ähnliche Anzahl an Eiern auf wie Weibchen, die mit Saccharose gefüttert wurden (Abb. 4B). Auch die Größe der von mit Urin gefütterten Weibchen gelegten Eier variierte je nach Fütterung (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001). Weibchen, die 24 Stunden lang mit Urin oder Saccharose gefüttert wurden, legten signifikant größere Eier als mit Wasser gefütterte Weibchen, während die Eier von Weibchen, die 168 Stunden lang mit Urin und anschließend mit Blut gefüttert wurden, signifikant größer waren. Die Larven waren im Urin deutlich kleiner (Abb. 4C). Darüber hinaus beeinflusste die Urinfütterung die Larvengröße signifikant (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), wobei aus Eiern von 24 und 72 Stunden alten, mit Urin gefütterten Weibchen signifikant größere Larven schlüpften als aus Eiern von Weibchen, die mit Wasser bzw. 168 Stunden lang mit Urin gefüttert wurden (Abb. 4D).
Reproduktionsleistung weiblicher Anopheles arabinis nach Fütterung mit Kuhurin und Harnstoff. Blutgesaugte weibliche Stechmücken wurden 48 Stunden lang mit frischem und gealtertem Kuhurin, verschiedenen Harnstoffkonzentrationen, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H₂O) gefüttert, bevor sie in Bioassays eingesetzt und zur Eiablage verwendet wurden (A). Eizahl (B, E), Eigröße (C, F) und Larvengröße (D, G) wurden signifikant durch die Fütterung beeinflusst (Kuhurin: BD; Harnstoff: EG). Die Mittelwerte der einzelnen Parameter, gemessen mit unterschiedlichen Buchstabenbezeichnungen, unterschieden sich signifikant voneinander (einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test; p < 0,05). Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar.
Da Harnstoff der Hauptstickstoffbestandteil des Urins ist, beeinflusste er, wenn er blutgesaugten Weibchen als Nahrung verabreicht wurde, die Reproduktionsparameter in allen Studien signifikant. Die Anzahl der von den mit Harnstoff gefütterten Weibchen nach einer Blutmahlzeit gelegten Eier hing von der Harnstoffkonzentration ab (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001). Weibchen, die Harnstoffkonzentrationen zwischen 134 µM und 1,34 mM erhielten, legten mehr Eier (Abb. 4E). Weibchen, die mit Harnstoffkonzentrationen von 134 µM oder höher gefüttert wurden, legten größere Eier als Weibchen, die Wasser erhielten (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Abb. 4F). Die Larvengröße, die zwar von ähnlichen Harnstoffkonzentrationen bei den Muttertieren beeinflusst wurde (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), war variabler (Abb. 4G).
Die allgemeine Attraktivität flüchtiger Extrakte aus dem Headspace von Rinderurin für wirtssuchende Mücken wurde untersucht. Die Attraktivität der Art *Arabiensis* wurde im Glasrohr-Olfaktometer (Abb. 5A) signifikant vom Alter des Urins beeinflusst (χ² = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Abb. 5B). Die Post-hoc-Analyse zeigte, dass der Geruch von 24 Stunden altem Urin im Vergleich zu allen anderen Behandlungen (72 Stunden: p = 0,0060, 168 Stunden: p = 0,012, Pentan: p = 0,00070) signifikant höher war, mit Ausnahme des Geruchs von frischem Urin (p = 0,13; Abb. 5B). Obwohl die allgemeine Attraktivität des Uringeruchs für blutsaugende Mücken nicht signifikant unterschiedlich war (χ² = 8,78, df = 4, p = 0,067; Abb. 5C), reagierten diese Weibchen signifikant stärker auf flüchtige Extrakte aus dem Headspace. Extrakte im Vergleich zu 72 Stunden altem Urin im Vergleich zu Kontrollen (p = 0,0066; Abbildung 5C).
Verhaltensreaktionen auf natürliche und synthetische Kuhurin-Gerüche bei der Suche nach Wirten und blutgesaugten Anopheles arabianus. Schematische Darstellung des Glasrohr-Olfaktometers (A). Anlockwirkung flüchtiger Headspace-Extrakte aus frischem und gealtertem Kuhurin auf Wirte (B) und blutsaugende (C) Mücken. Bestimmen Sie die Tentakelreaktion des Lord An. Headspace-Extrakte aus frischem (D), 24 Stunden (E), 72 Stunden (F) und 168 Stunden (G) gealtertem Kuhurin sind dargestellt. Die EAD-Spuren (Elektronenantennendetektion) zeigen Spannungsänderungen als Reaktion auf bioaktive Verbindungen im Headspace, die aus dem Gaschromatographen eluiert und mit einem Flammenionisationsdetektor (FID) detektiert wurden. Die Skalenleiste stellt die Antwortamplitude (mV) über der Retentionszeit (s) dar. Die Eigenschaften und Freisetzungsraten (µg h⁻¹) der biologisch aktiven Verbindungen sind angegeben. Ein einzelnes Sternchen (*) kennzeichnet eine konstant niedrige Antwortamplitude. Zwei Sternchen (**) Nicht reproduzierbare Ergebnisse deuten auf Abweichungen hin. Finden Sie den Wirt (H) und den blutsaugenden (I) An. arabiensis. An. arabiensis reagiert unterschiedlich auf synthetische Mischungen aus frischem und gealtertem Kuhurin. Die mittleren Anteile der von verschiedenen Buchstabennamen angelockten Mücken unterschieden sich signifikant voneinander (einfaktorielle ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test; p < 0,05). Die Fehlerbalken stellen den Standardfehler der Skala dar.
Bei weiblichen Ann. arabiensis zeigte sich 72 h und 120 h nach der Blutmahlzeit während des Laichens keine Präferenz für flüchtige Headspace-Extrakte aus frischem und gealtertem Kuhurin im Vergleich zu Pentan-Kontrollen (χ2 = 3,07, p > 0,05; Zusatzdatei 1: Abb. S1).
Bei weiblichen Ann. arabiensis wurden mittels GC-EAD- und GC-MS-Analysen acht, sechs, drei bzw. drei bioaktive Verbindungen identifiziert (Abbildung 5D–G). Obwohl Unterschiede in der Anzahl der Verbindungen beobachtet wurden, die elektrophysiologische Reaktionen auslösten, waren die meisten dieser Verbindungen in jedem aus frischem und gealtertem Urin gewonnenen Headspace-Extrakt vorhanden. Daher wurden für jeden Extrakt nur Verbindungen, die eine physiologische Reaktion der weiblichen Antennen oberhalb des Schwellenwerts hervorriefen, in die weiteren Analysen einbezogen.
Die Gesamtfreisetzungsrate flüchtiger bioaktiver Verbindungen in der Headspace-Probe stieg von 29 µg h⁻¹ in frischem Urin auf 242 µg h⁻¹ in 168 Stunden gealtertem Urin, hauptsächlich aufgrund erhöhter Konzentrationen von p-Kresol und m-Formaldehyd sowie Phenol. Im Gegensatz dazu sanken die Freisetzungsraten anderer Verbindungen, wie z. B. 2-Cyclohexen-1-on und Decanal, mit zunehmendem Alter des Urins. Dies korrelierte mit der beobachteten Abnahme der Signalintensität (Häufigkeit) im Chromatogramm (Abb. 5D-G, linke Abbildung) und den physiologischen Reaktionen auf diese Verbindungen (Abb. 5D-G, rechte Abbildung).
Insgesamt wies die synthetische Mischung ein ähnliches natürliches Verhältnis der in flüchtigen Extrakten aus frischem und gealtertem Urin identifizierten bioaktiven Verbindungen auf (Abb. 5D–G) und schien weder bei der Wirtssuche (χ² = 8,15, df = 4, p = 0,083; Abb. 5H) noch bei blutsaugenden Mücken (χ² = 4,91, df = 4, p = 0,30; Abb. 5I) eine signifikante Anziehungskraft auszuüben. Post-hoc-Paarvergleiche zwischen den Behandlungen zeigten jedoch, dass wirtssuchende Mücken von der synthetischen Mischung aus 24 Stunden gealtertem Urin im Vergleich zu den Pentan-Kontrollen signifikant angezogen wurden (p = 0,0086; Abb. 5H).
Um die Rolle einzelner Komponenten in synthetischen Mischungen aus 24 Stunden gealtertem Urin zu untersuchen, wurden sechs Teilmischungen im Y-Röhrchen-Test mit vollständigen Mischungen verglichen, bei denen einzelne Verbindungen entfernt wurden. Bei brutsuchenden Stechmücken hatte die Entfernung einzelner Verbindungen aus der vollständigen Mischung einen signifikanten Einfluss auf das Verhalten (χ² = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Zusatzdatei 1: Abbildung S2A). Alle Teilmischungen waren attraktiver als die vollständig gemischten. Im Gegensatz dazu beeinflusste die Entfernung einzelner Verbindungen aus der vollständig synthetischen Mischung das Verhalten blutsaugender Stechmücken nicht (χ² = 11,38, df = 6, p = 0,077), mit Ausnahme von Decanal, dessen Attraktivität im Vergleich zur vollständigen Mischung geringer ausfiel (p = 0,022; Zusatzdatei 1: Abbildung S2B).
In einem Malaria-endemischen Dorf in Äthiopien wurde die Wirksamkeit einer synthetischen Mischung aus 24 Stunden altem Kuhurin zur Anlockung von Moskitos unter Feldbedingungen über zehn Nächte hinweg untersucht (Abb. 6A). Insgesamt wurden 4.861 Moskitos gefangen und identifiziert, davon 45,7 % Anthropus gambiae sl., 18,9 % Anopheles pharoensis und 35,4 % Culex spp. (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Anopheles arabinis ist das einzige mittels PCR-Analyse identifizierte Mitglied des An.gambiae-Artenkomplexes. Im Durchschnitt wurden 320 Moskitos pro Nacht gefangen. Fallen mit der synthetischen Ködermischung fingen dabei mehr Moskitos als die Kontrollfallen ohne Ködermischung (χ²(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). An jeder der fünf Kontrollnächte wurden zu Beginn, in der Mitte und am Ende des Untersuchungszeitraums Fallen ohne Köder aufgestellt. In der Studie wurden in jedem Fallenpaar ähnliche Mückenzahlen gefangen, was darauf hindeutet, dass es keine systematische Verzerrung zwischen den Haushalten gab (χ²(0, 1665) = 9 × 10⁻¹³, ​​p > 0,05) und die Population während des Untersuchungszeitraums nicht zurückging. Im Vergleich zu den Kontrollfallen war die Anzahl der in den Fallen mit der synthetischen Mischung gefangenen Mücken signifikant erhöht: Wirtssuche (χ²(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), kürzliche Blutmahlzeit (χ²(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) und Trächtigkeit (χ²(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; siehe auch Tabelle S1 in der Zusatzdatei 1). Dies spiegelt sich auch in der Gesamtzahl der gefangenen Mücken wider: Wirtssuche > blutsaugende Mücken > trächtige Mücken > halbträchtige Mücken > Männchen.
Feldstudie zur Wirksamkeit einer 24-stündigen Mischung aus synthetischem Kuhurin-Geruch. Feldversuche wurden im südlichen Zentraläthiopien (Karte) nahe der Stadt Maki (Einsatz) durchgeführt. Dabei kamen Lichtfallen der Centers for Disease Control (CDC) (rechts) in paarweise angeordneten Häusern zum Einsatz, die einem lateinischen Quadrat nachempfunden waren (Luftbild) (A). Mit synthetischem Duftstoff bestückte CDC-Lichtfallen locken und fangen weibliche Anopheles arabesques (B), nicht aber Anopheles farroes (C). Der Effekt ist physiologisch abhängig. Zusätzlich fingen diese Fallen signifikant mehr Wirtsmücken der Gattung Culex (D) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Balken links zeigen den durchschnittlichen Selektionsindex der in Duftstoffköder- (grün) und Kontrollfallen (offen) gefangenen Mücken (N = 10), die Balken rechts den durchschnittlichen Selektionsindex in Kontrollfallen (offen; N = 5). Sternchen kennzeichnen statistische Signifikanzniveaus (*p = 0,01 und ***p < 0,0001).
Die drei Arten wurden in Fallen mit synthetischen Ködern unterschiedlich gefangen. Bei der Suche nach einem Wirt (χ²(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), der Blutmahlzeit (χ²(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) und der Trächtigkeit (χ²(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) wurde eine *Anopheles arabiensis* in der Falle mit dem synthetischen Köder gefangen (Abb. 6B), während die Anzahl der *Anopheles pharoensis*-Mücken in verschiedenen physiologischen Zuständen unverändert blieb. Bei *Culex* zeigte sich lediglich in den mit dem synthetischen Köder bestückten Fallen ein signifikanter Anstieg der Anzahl wirtssuchender Mücken (χ²(1, 1319) = 12,6, p = 0,0004; Abb. 6D) im Vergleich zu den Kontrollfallen.
Um zu untersuchen, ob Malariamücken Kuhuringeruch als Hinweis auf einen geeigneten Wirt nutzen, wurden Köderfallen außerhalb potenzieller Wirte zwischen Brutstätten und ländlichen Gemeinden in Äthiopien aufgestellt. Ohne Wirtsreize, bei Hitze und mit oder ohne Kuhuringeruch wurden keine Mücken gefangen (Zusatzdatei 1: Abbildung S3). Bei hohen Temperaturen und Kuhuringeruch wurden jedoch weibliche Malariamücken angelockt und gefangen, wenn auch in geringer Anzahl, unabhängig vom Alter des Urins (χ²(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Zusatzdatei 1: Abbildung S3). Im Gegensatz dazu wurden in den Wasserkontrollen bei hohen Temperaturen keine Malariamücken gefangen (Zusatzdatei 1: Abbildung S3).
Malariamücken nehmen stickstoffhaltige Verbindungen auf und verteilen sie durch kompensatorische Nahrungsaufnahme von Kuhurin (z. B. aus Pfützen), um ihre Lebenszyklusmerkmale zu verbessern, ähnlich wie andere Insekten [2, 4, 24, 25, 26]. Kuhurin ist eine leicht verfügbare, erneuerbare Ressource, die eng mit Ruheplätzen von Malariavektoren wie Kuhställen und hoher Vegetation in der Nähe von ländlichen Häusern und Brutstätten verbunden ist. Weibliche Mücken finden diese Ressource durch ihren Geruchssinn und können die Aufnahme stickstoffhaltiger Verbindungen im Urin, einschließlich Harnstoff, dem Hauptstickstoffbestandteil im Urin, regulieren [15, 16]. Abhängig vom physiologischen Zustand der weiblichen Mücke werden die Nährstoffe im Urin so verteilt, dass sie die Flugaktivität und das Überleben von wirtssuchenden weiblichen Mücken sowie das Überleben und die Fortpflanzungsmerkmale von blutgesaugten Individuen während des ersten Gonadotropinzyklus verbessern. Daher spielt die Vermischung von Urin eine wichtige Rolle für die Ernährung von Malariavektoren, die wie unterernährte adulte Mücken [8], da sie weiblichen Mücken die Möglichkeit gibt, wichtige stickstoffhaltige Verbindungen aufzunehmen. Durch die Aufnahme risikoarmer Nahrungsaufnahme. Diese Erkenntnis hat bedeutende epidemiologische Konsequenzen, da Weibchen dadurch ihre Lebenserwartung, Aktivität und Reproduktionsrate erhöhen, was sich alles auf die Vektorkapazität auswirkt. Darüber hinaus könnte dieses Verhalten Ziel zukünftiger Vektormanagementprogramme sein.