Pozyskiwanie i dystrybucja składników odżywczych integruje żerowanie owadów i cechy cyklu życiowego. Aby zrekompensować niedobory określonych składników odżywczych na różnych etapach życia, owady mogą pozyskiwać te składniki odżywcze poprzez dokarmianie, na przykład żywiąc się wydzielinami kręgowców w procesie znanym jako kałuże. Wydaje się, że komar Anopheles arabiani jest niedożywiony i w związku z tym potrzebuje składników odżywczych zarówno do metabolizmu, jak i rozmnażania. Celem tego badania była ocena, czy pobudzenie An. arabiensis moczem krowy w celu pozyskania składników odżywczych poprawia cechy cyklu życiowego.
Upewnij się, że jest bezpieczne. Arabiensis był przyciągany zapachem świeżego, 24-godzinnego, 72-godzinnego i 168-godzinnego moczu krowiego, a samice szukające żywiciela i karmione krwią (48 godzin po posiłku z krwią) mierzono w olfaktometrze z rurką w kształcie litery Y, a samice ciężarne oceniano pod kątem testu tarłowego. Następnie zastosowano połączoną analizę chemiczną i elektrofizjologiczną w celu identyfikacji związków bioaktywnych w moczu krów we wszystkich czterech klasach wiekowych. Syntetyczne mieszaniny związków bioaktywnych oceniano w rurce w kształcie litery Y i w badaniach terenowych. Aby zbadać mocz krowi i jego główny związek zawierający azot, mocznik, jako potencjalne uzupełniające diety dla wektorów malarii, mierzono parametry żywienia i cechy cyklu życiowego. Oceniono odsetek samic komarów oraz ilość wchłoniętego moczu krowiego i mocznika. Po karmieniu samice oceniano pod kątem przeżywalności, lotu na uwięzi i reprodukcji.
Poszukują krwi i składników odżywczych żywiciela. W badaniach laboratoryjnych i terenowych Arabowie byli przyciągani naturalnym i syntetycznym zapachem świeżego i starego moczu krowiego. Samice w ciąży nie reagowały na reakcje moczu krowiego w miejscach tarła. Samice poszukujące żywiciela i ssące jego krew aktywnie wchłaniają mocz krowi i mocznik, a następnie rozdzielają te zasoby zgodnie z kompromisami w historii życia, będącymi funkcją stanu fizjologicznego w kontekście lotu, przetrwania lub rozrodu.
Anopheles arabinis pozyskuje i rozprowadza mocz krowi w celu poprawy charakterystyki cyklu życiowego. Dodatkowe podawanie moczu krowiego wpływa bezpośrednio na zdolność wektorów, zwiększając dzienne przeżycie i zagęszczenie wektorów, a pośrednio, zmieniając aktywność lotu, dlatego też powinno być uwzględniane w przyszłych modelach.
Pozyskiwanie i dystrybucja składników odżywczych integruje żerowanie owadów i cechy cyklu życiowego [1,2,3]. Owady są w stanie wybierać i zdobywać pokarm oraz wykonywać kompensacyjne żerowanie w oparciu o dostępność pokarmu i wymagania żywieniowe [1,3]. Dystrybucja składników odżywczych zależy od procesu cyklu życiowego i może prowadzić do różnych wymagań co do jakości i ilości diety na różnych etapach życia owadów [1,2]. Aby zrekompensować niedobory określonych składników odżywczych, owady mogą uzyskać te składniki odżywcze poprzez uzupełniające karmienie, takie jak błoto, różne odchody i wydzieliny kręgowców oraz padlina, proces znany jako kałuże [2]. Chociaż opisano przede wszystkim wiele gatunków motyli i ćm, wodopoje występują również u innych rzędów owadów, a przyciąganie i żerowanie na tych rodzajach zasobów może mieć znaczący wpływ na zdrowie i inne cechy cyklu życiowego [2,4,5,6],7]. Komar malaryczny Anopheles gambiae sensu lato (sl) wyłania się jako „niedożywiony” dorosły [8], więc podlewanie może odgrywać ważną rolę w cechach cyklu życiowego, ale zachowanie to było dotychczas zaniedbywane. Zastosowanie mieszania jako sposobu na zwiększenie pobierania składników odżywczych w tym ważnym nośniku zasługuje na uwagę, ponieważ może mieć poważne konsekwencje epidemiologiczne.
Pobieranie azotu przez dorosłe samice komarów Anopheles jest ograniczone ze względu na niskie rezerwy kaloryczne przenoszone z larwalnego stadium i nieefektywne wykorzystanie mączki kostnej [9]. Samice Ann. gambiae sl zazwyczaj rekompensują to poprzez uzupełnianie diety mączką kostną [10, 11], narażając w ten sposób więcej osób na ryzyko zarażenia się chorobą, a komary na większe ryzyko drapieżnictwa. Alternatywnie komary mogą wykorzystywać uzupełniające karmienie odchodami kręgowców do pozyskiwania związków azotowych, które zwiększają adaptację i manewrowość lotu, co wykazały inne owady [2]. W tym względzie silne i wyraźne przyciąganie jednego z gatunków pokrewnych w obrębie An. Kompleks gatunków gambijskiego sl, Anopheles arabinis, świeży i stary mocz krowy [12,13,14], jest interesujące. Anopheles arabinis jest oportunistyczny w swoich preferencjach żywicieli i wiadomo, że łączy się z bydłem i żywi się nim. Mocz krowy jest bogatym źródłem związków azotowych, a mocznik stanowi dla 50-95% całkowitego azotu w świeżym moczu [15, 16]. W miarę starzenia się moczu krów mikroorganizmy wykorzystują te zasoby do redukcji złożoności związków azotowych w ciągu 24 godzin [15]. Wraz z szybkim wzrostem amoniaku, związanym ze spadkiem azotu organicznego, rozwijają się mikroorganizmy alkalofilne (wiele z nich produkuje związki toksyczne dla komarów) [15], które mogą być samicami Ann. arabiensis, które są preferencyjnie przyciągane do moczu w wieku 24 godzin lub krócej [13, 14].
W niniejszym badaniu poszukiwano żywicieli i osobników Ans karmionych krwią. Podczas pierwszego cyklu gonadotropinowego, u komara Arabiensis oceniano zdolność do pozyskiwania związków azotowych, w tym mocznika, poprzez mieszanie moczu. Następnie przeprowadzono serię eksperymentów, aby ocenić, jak samice komarów alokują ten potencjalny zasób składników odżywczych, zwiększając w ten sposób przeżywalność, reprodukcję i dalsze żerowanie. Na koniec oceniono zapach świeżego i starego moczu krów, aby ustalić, czy dostarcza on wiarygodnych wskazówek dotyczących żywicieli i osobników Ans karmionych krwią. Poszukując tego potencjalnego źródła składników odżywczych, Arabiensis odkrył korelacje chemiczne stojące za obserwowaną różnicą w atrakcyjności. Syntetyczne mieszanki zapachowe lotnych związków organicznych (LZO) zidentyfikowane w 24-godzinnym moczu poddano dalszej ocenie w warunkach terenowych, rozszerzając wyniki uzyskane w warunkach laboratoryjnych i wykazując wpływ zapachu moczu bydła na różne stany fizjologiczne. Przyciąganie komarów. Uzyskane wyniki potwierdzają, że An. arabiensis nabywa i dystrybuuje związki azotowe znajdujące się w moczu kręgowców, wpływając na cechy cyklu życiowego. Wyniki te omówiono w kontekście potencjalnych konsekwencji epidemiologicznych oraz tego, w jaki sposób można je wykorzystać do monitorowania i kontroli wektorów.
Anopheles arabicans (szczep Dongola) utrzymywano w temperaturze 25 ± 2 °C, wilgotności względnej 65 ± 5% i cyklu światło:ciemność 12:12 h. Larwy hodowano w plastikowych tackach (20 cm × 18 cm × 7 cm) wypełnionych wodą destylowaną i karmiono pokarmem dla ryb Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Poczwarki zbierano do kubków o pojemności 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE), a następnie przenoszono do klatek Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Tajwan), aby umożliwić wyłonienie się osobników dorosłych. Dorosłym osobnikom podawano 10% roztwór sacharozy ad libitum do 4 dni po wykluciu (dpe), po czym samicom poszukującym żywiciela oferowano dietę bezpośrednio przed eksperymentem lub głodzono przez noc wodą destylowaną przed do eksperymentu, jak opisano poniżej.Samice użyte do eksperymentów w rurach do lotu głodzono przez zaledwie 4-6 godzin, mając dostęp do wody ad libitum.Aby przygotować krwiopijne komary do kolejnych biotestów, 4 samicom dpe podano defibrotyzującą krew owczą (Håtunalab, Bro, SE) za pomocą systemu karmienia membranowego (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK).W pełni przekrwione samice przeniesiono następnie do indywidualnych klatek i podawano im bezpośrednio dietę, jak opisano poniżej, lub 10% sacharozę ad libitum przez 3 dni przed eksperymentami opisanymi poniżej.Te ostatnie samice wykorzystano do biotestów w rurach do lotu i przeniesiono do laboratorium, gdzie podawano im wodę destylowaną ad libitum przez 4-6 godzin przed eksperymentem.
Do ilościowego określenia spożycia moczu i mocznika przez dorosłe samice rasy An.Arab zastosowano testy żywieniowe. Samice poszukujące żywiciela i karmione krwią otrzymywały dietę zawierającą 1% rozcieńczonego świeżego i starego moczu krowiego, różne stężenia mocznika oraz dwie kontrole (10% sacharozy i wody) przez 48 godzin. Dodatkowo do diety dodano barwnik spożywczy (1 mg ml-1 cyjanku ksylenu FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Sztokholm, SE) i podawano w matrycy 4 × 4 w 250 µl probówkach mikrocentrifugowych (Axygen Scientific, Union City, CA, US; Rysunek 1A). Napełnić do krawędzi (~300 µl). Aby uniknąć konkurencji między komarami i potencjalnych efektów koloru barwnika, umieścić 10 komarów w dużej szalce Petriego (o średnicy 12 cm i wysokości 6 cm; Semadeni, Ostermundigen, CH; Rysunek 1A) w całkowitej ciemności w temperaturze 25 ± 2 cm °C i przy wilgotności względnej 65 ± 5%. Eksperymenty te powtórzono 5 do 10 razy. Po wystawieniu na działanie diety komary umieszczono w temperaturze -20 °C do czasu dalszej analizy.
Poszukaj moczu bydlęcego i mocznika wchłoniętych przez żywiciela i krwiopijną samicę Anopheles arabianus. W próbie karmienia (A) samicom komarów podawano dietę składającą się ze świeżego i starego moczu krowiego, mocznika o różnym stężeniu, sacharozy (10%) i wody destylowanej (H2O). Samice poszukujące żywiciela (B) i karmione krwią (C) wchłonęły więcej sacharozy niż jakakolwiek inna testowana dieta. Należy zauważyć, że samice poszukujące żywiciela wchłonęły 72-godzinny mocz krowi mniej niż 168-godzinny mocz krowi (B). Średnia całkowita zawartość azotu (± odchylenie standardowe) w moczu jest przedstawiona we wstawce. Samice poszukujące żywiciela (D, F) i krwiopijne (E, G) wchłaniają mocznik w sposób zależny od dawki. Średnie wdychane objętości (D, E) o różnych nazwach literowych istotnie różniły się od siebie (jednokierunkowa analiza wariancji przy użyciu analizy post hoc Tukeya; p < 0,05). Słupki błędów oznaczają standardowe błąd średniej (BE). Linia przerywana przedstawia linię regresji logarytmiczno-liniowej (F, G)
Aby uwolnić wchłonięty pokarm, komary umieszczano pojedynczo w 1,5 ml probówkach mikrocentrifugowych zawierających 230 µl wody destylowanej, a tkankę rozrywano za pomocą jednorazowego tłuczka i bezprzewodowego silnika (VWR International, Lund, SE), a następnie wirowano z prędkością 10 krpm przez 10 min. Supernatant (200 µl) przenoszono do 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej (Sigma-Aldrich), a absorbancję (λ620) określano za pomocą czytnika płytek mikrotitracyjnych opartego na spektrofotometrze (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternatywnie komary zmielono w 1 ml wody destylowanej, z której 900 µl przeniesiono do kuwety w celu analizy spektrofotometrycznej (λ 620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Aby określić ilościowo spożycie pokarmu, przygotowano krzywą standardową. poprzez seryjne rozcieńczenia, aby uzyskać od 0,2 µl do 2,4 µl ksylenu w stężeniu 1 mg ml-1. Następnie gęstość optyczna znanych stężeń barwników została wykorzystana do określenia ilości pokarmu spożytego przez każdego komara.
Dane dotyczące objętości analizowano przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie porównań parami post hoc Tukeya (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1989–2007). Analizy regresji liniowej opisywały zależne od stężenia spożycie mocznika i porównywały reakcje między komarami polującymi na żywiciela a komarami żywiącymi się krwią (GraphPad Prism v8.0.0 dla komputerów Mac, GraphPad Software, San Diego, Kalifornia, USA).
Około 20 µl próbek moczu z każdej grupy wiekowej związano na Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) i umieszczono w kapsułkach cynowych (8 mm × 5 mm). Kapsułki umieszczono w komorze spalania analizatora CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) w celu określenia zawartości azotu w świeżym i leżakowanym moczu zgodnie z protokołem producenta. Całkowity azot (g N l-1) określono ilościowo na podstawie znanych stężeń mocznika stosowanych jako standard.
Aby ocenić wpływ diety na przeżywalność samic szukających żywiciela i ssących krew, komary umieszczano pojedynczo w dużych szalkach Petriego (o średnicy 12 cm i wysokości 6 cm; Semadeni) z otworem pokrytym siateczką w pokrywce (o średnicy 3 cm) w celu wentylacji i zaopatrzenia w pokarm. Diety podawano bezpośrednio po 4 dniach od zakażenia i zawierały one 1% rozcieńczonego świeżego i starego moczu krowiego, cztery stężenia mocznika oraz dwie kontrole, 10% sacharozy i wodę. Każdą dietę pipetowano na tampon dentystyczny (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) włożony do 5 ml strzykawki (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), usunięto tłok i umieszczono na szalce Petriego (ryc. 1).1A). Zmieniaj dietę każdego dnia. Utrzymuj laboratorium tak, jak opisano powyżej. Komary, które przeżyły, liczono dwa razy dziennie, natomiast martwe komary usuwano, aż do śmierci ostatniego komara (n = 40 na zabieg). Przeżycie Analizę statystyczną przeżywalności komarów karmionych różnymi dietami przeprowadzono przy użyciu krzywych przeżycia Kaplana-Meyera i testów log-rank w celu porównania rozkładu przeżywalności pomiędzy dietami (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Niestandardowy latający młyn na komary, opracowany przez Attisano i in. [17], wykonany z przezroczystych paneli akrylowych o grubości 5 mm (szerokość 10 cm x długość 10 cm x wysokość 10 cm) bez przedniego i tylnego panelu (rys. 3: góra). Zespół obrotowy z pionową rurą wykonaną z kolumny chromatografii gazowej (średnica wewnętrzna 0,25 mm; długość 7,5 cm) z końcami przyklejonymi do igły owada zawieszonej pomiędzy parą magnesów neodymowych oddalonych od siebie o 9 cm. Pozioma rura wykonana z tego samego materiału (długość 6,5 cm) przecinała pionową rurę, tworząc ramię przymocowane oraz ramię, które przenosiło mały kawałek folii aluminiowej jako sygnał przerywający światło.
Samice komarów głodzone przez 24 godziny otrzymywały powyższą dietę przez 30 minut przed unieruchomieniem. W pełni nakarmione samice komarów znieczulano następnie pojedynczo na lodzie przez 2–3 minuty i przymocowywano do szpilek owadobójczych za pomocą wosku pszczelego (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE), a następnie przywiązywano do ramion poziomych rur. Latający młyn. Obroty na lot rejestrowano za pomocą specjalnie zbudowanego rejestratora danych, a następnie przechowywano i wyświetlano za pomocą oprogramowania PC-Lab 2000™ (wersja 4.01; Velleman, Gavere, BE). Młyn latający umieszczono w klimatyzowanym pomieszczeniu (12 godz.:12 godz., światło: ciemność, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Aby zwizualizować wzorzec aktywności lotniczej, obliczono całkowitą przebytą odległość (m) oraz całkowitą liczbę kolejnych aktywności lotniczych na godzinę w okresie 24 godzin. Ponadto porównano średnie odległości przebyte przez poszczególne samice w różnych grupach leczenia i przeanalizowano je przy użyciu jednokierunkowej analizy wariancji oraz analizy post hoc Tukeya (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), gdzie średnią odległość uznano za zmienną zależną, a grupę leczenia za czynnik niezależny. Ponadto średnią liczbę rund obliczono w 10-minutowych przyrostach.
Aby ocenić wpływ diety na wydajność reprodukcyjną An.arabiensis, sześć samic (4 dpe) przeniesiono bezpośrednio do klatek Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) po pobraniu krwi, a następnie podawano im eksperymentalną dietę przez 48 godzin, jak opisano powyżej. Następnie dietę usunięto i trzeciego dnia przez 48 godzin podawano im kubki do tarła (30 ml; Nolato Hertila) wypełnione 20 ml wody destylowanej, zmieniając je co 24 godziny. Każdy schemat diety powtórzono 20–50 razy. Jaja policzono i zapisano dla każdej klatki eksperymentalnej. Podpróbki jaj wykorzystano do oceny średniej wielkości i zmienności długości poszczególnych jaj (n ≥ 200 na dietę) przy użyciu mikroskopu Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) wyposażonego w kamerę Leica (DFC) 320 R2; Pozostałe jaja przechowywano w klimatyzowanym pomieszczeniu w standardowych warunkach hodowlanych przez 24 godziny, a następnie zmierzono podpróbkę świeżo wyklutych larw pierwszego stadium (n ≥ 200 na dietę), jak opisano powyżej. Liczbę jaj oraz wielkość jaj i larw porównano pomiędzy grupami stosując jednokierunkową analizę wariancji i analizę post hoc Tukeya (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Lotne substancje z przestrzeni nad cieczą ze świeżego (1 godz. po pobraniu próbki), moczu po 24, 72 i 168 godzinach leżakowania zebrano z próbek pobranych od bydła rasy Zebu, Arsi. Dla wygody próbki moczu pobierano wcześnie rano, gdy krowy były jeszcze w oborze. Próbki moczu pobrano od 10 osobników, a 100–200 ml każdej próbki przeniesiono do indywidualnych poliamidowych torebek do pieczenia (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Niemcy) umieszczonych w 3-litrowych poliamidowych beczkach z pokrywką, wykonanych z plastiku chlorku winylu. Lotne substancje z przestrzeni nad cieczą z każdej próbki moczu bydła pobrano bezpośrednio (świeżo) lub po dojrzewaniu w temperaturze pokojowej przez 24 godz., 72 godz. i 168 godz., tzn. każda próbka moczu była reprezentatywna dla każdej grupy wiekowej.
Do zbierania substancji lotnych z przestrzeni nad lustrem cieczy zastosowano układ zamknięty, w którym strumień gazu przefiltrowany węglem aktywnym (100 ml min-1) przez worek poliamidowy do kolumny adsorpcyjnej przepompowano przez 2,5 godziny, stosując pompę próżniową z membraną (KNF Neuberger, Freiburg, Niemcy). Jako kontrolę, zbieranie substancji lotnych przeprowadzono z pustego worka poliamidowego. Kolumna adsorpcyjna została wykonana z rurki teflonowej (5,5 cm x 3 mm średnicy wewnętrznej) zawierającej 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) pomiędzy korkami z wełny szklanej. Przed użyciem kolumnę przepłukano 1 ml redestylowanego n-heksanu (Merck, Darmstadt, Niemcy) i 1 ml pentanu (99,0% czystości rozpuszczalnika klasy GC, Sigma Aldrich). Zaadsorbowane substancje lotne eluowano 400 μl pentan. Zbiory fazy gazowej połączono i przechowywano w temperaturze -20°C do momentu wykorzystania w dalszych analizach.
Reakcje behawioralne poszukującego żywiciela i krwiożerczego An.Ekstrakty lotne z przestrzeni nad powierzchnią zebrane ze świeżego, 24-godzinnego, 72-godzinnego i 168-godzinnego moczu analizowano pod kątem obecności ekstraktów lotnych z komarów Arabidopsis przy użyciu olfaktometru z prostą szklaną rurką [18]. Eksperymenty przeprowadzono w ZT 13-15, czyli w szczytowym okresie aktywności poszukiwania domu przez An.Arab [19].Olfaktometr z szklaną rurką (80 cm × 9,5 cm średnicy wewnętrznej) oświetlono od góry czerwonym światłem o natężeniu 3 ± 1 luksów.Przepływ powietrza przefiltrowanego węglem drzewnym i nawilżonego (25 ± 2 °C, 65 ± 2% wilgotności względnej) przeszedł przez biotest z szybkością 30 cm s-1.Powietrze przepływa przez szereg sit z siatki ze stali nierdzewnej, tworząc laminarny przepływ i jednolitą strukturę pióropusza.Dozownik tamponów dentystycznych (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), zawieszone na 5 cm cewce na nawietrznym końcu olfaktometru, ze zmianą stymulatora co 5 minut. Do analizy użyto 10 μl każdego ekstraktu z przestrzeni nadpowierzchniowej rozcieńczonego w stosunku 1:10 jako bodziec. Podobną ilość pentanu użyto jako kontrolę. Poszczególne komary poszukujące żywiciela lub ssące krew umieszczono w indywidualnych klatkach wypuszczających 2-3 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Klatkę wypuszczającą umieszczono po stronie zawietrznej olfaktometru, a komary pozostawiono do aklimatyzacji na 1 minutę, a następnie otworzono zawór motylkowy klatki w celu wypuszczenia. Przyciąganie do preparatu lub kontroli analizowano jako odsetek komarów, które miały kontakt ze źródłem w ciągu 5 minut od wypuszczenia. Każdy ekstrakt lotny z przestrzeni nadpowierzchniowej i kontrola zostały powtórzone co najmniej 30 razy, a aby uniknąć efektów jednego dnia, przetestowano taką samą liczbę preparatów i kontroli na każdego dnia eksperymentu. Szukaj odpowiedzi od gospodarza i karmionego krwią. Zestawy arabskie i headspace analizowano przy użyciu nominalnej regresji logistycznej, a następnie porównano parami w celu uzyskania ilorazu szans (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Reakcja tarłowa An. Ekstrakty z przestrzeni nad powierzchnią moczu świeżej i starej krowy analizowano w klatkach Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Kubki plastikowe (30 ml; Nolato Hertila) wypełnione 20 ml wody destylowanej stanowiły podłoże do tarła i zostały umieszczone w przeciwległych rogach klatki, w odległości 24 cm od siebie. Kubki terapeutyczne dostosowywano za pomocą 10 μl każdego ekstraktu z przestrzeni nad powierzchnią w rozcieńczeniu 1:10. Do dostosowania kubka kontrolnego użyto takiej samej ilości pentanu. Kubki terapeutyczne i kontrolne wymieniano między każdym eksperymentem w celu kontroli wpływu położenia. Dziesięć karmionych krwią samic wypuszczono do klatek eksperymentalnych w ZT 9-11, a jaja w kubkach policzono 24 godziny później. Wzór na obliczenie indeksu tarła jest następujący: (liczba jaj złożonych w kubku terapeutycznym – liczba jaj złożonych w kubku kontrolnym)/(całkowita liczba (liczba złożonych jaj).Każde leczenie powtarzano 8 razy.
Analizę żeńskich szczepów An. arabiensis metodą chromatografii gazowej i detekcji wzoru anteny elektronowej (GC-EAD) przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem [20]. Krótko mówiąc, świeże ekstrakty lotne z przestrzeni nad cieczą rozdzielono przy użyciu chromatografu gazowego Agilent Technologies 6890 (Santa Clara, Kalifornia, USA) wyposażonego w kolumnę HP-5 (średnica wewnętrzna 30 μm × 0,25 mm, grubość filmu 0,25 μm, Agilent Technologies). i starzejącego się moczu. Wodór był używany jako faza ruchoma ze średnią liniową szybkością przepływu 45 cm s-1. Każdą próbkę (2 μl) wstrzykiwano przez 30 sekund w trybie bez podziału z temperaturą wlotową 225 °C. Temperaturę pieca GC zaprogramowano od 35 °C (utrzymanie 3 minuty) do 300 °C (utrzymanie 10 minut) przy 10 °C min-1. Do rozdzielacza odpływu GC dodano 4 psi azotu i rozdzielono 1:1 w krzyżu Gerstel 3D/2 o niskiej objętości martwej (Gerstel, Mülheim, DE) między detektorem z płomieniową jonizacją a EAD. Kapilara odpływu GC dla EAD została przepuszczona przez linię transferową Gerstel ODP-2, która śledzi temperaturę pieca GC plus 5 °C, do szklanej probówki (10 cm × 8 mm), gdzie została zmieszana z nawilżonym powietrzem filtrowanym węglem (1,5 l min−1). Antena została umieszczona w odległości 0,5 cm od ujścia rurki. Na każdego pojedynczego komara przypadało jedno powtórzenie, a w przypadku komarów poszukujących żywiciela wykonano co najmniej trzy powtórzenia na próbkach moczu w każdym wieku.
Identyfikacja związków bioaktywnych w zbiorach przestrzeni nadpowierzchniowej świeżego i starego moczu bydlęcego przy użyciu połączonego GC i spektrometru masowego (GC-MS; 6890 GC i 5975 MS; Agilent Technologies) w celu wywołania odpowiedzi antenowych w analizie GC-EAD, działającego w trybie jonizacji elektronowej przy 70 eV. GC został wyposażony w kolumnę kapilarną z topionej krzemionki pokrytą powłoką UI HP-5MS (60 m × 0,25 mm średnicy wewnętrznej, 0,25 μm grubości filmu) wykorzystującą hel jako fazę ruchomą ze średnią liniową szybkością przepływu 35 cm s-1. Próbkę 2 μl wstrzyknięto przy użyciu tych samych ustawień wtryskiwacza i temperatury pieca, co w analizie GC-EAD. Związki zidentyfikowano na podstawie ich czasu retencji (wskaźnik Kováta) i widm masowych w porównaniu z biblioteką niestandardową i biblioteką NIST14 (Agilent). Zidentyfikowane związki potwierdzono wstrzykując autentyczne standardy (Dodatkowy plik 1: Tabela S2). Do ilościowego oznaczania wstrzyknięto octan heptylu (10 ng, 99,8% czystości chemicznej, Aldrich) jako zewnętrzny standard.
Ocena skuteczności syntetycznej mieszanki zapachowej składającej się ze związków bioaktywnych zidentyfikowanych w świeżym i starym moczu, która przyciąga poszukujące żywiciela i wysysające krew komary Ans.arabiensis, przy użyciu tego samego olfaktometru i protokołu, co powyżej. Mieszaniny syntetyczne naśladowały skład i proporcje związków w mieszanych ekstraktach lotnych z przestrzeni nad lustrem cieczy świeżego, 24-godzinnego, 48-godzinnego, 72-godzinnego i 168-godzinnego moczu (Rysunek 5D-G; Dodatkowy plik 1: Tabela S2). Do analizy należy użyć 10 μl rozcieńczenia 1:100 w pełni syntetycznej mieszanki, o całkowitej szybkości uwalniania wynoszącej od około 140 do 2400 ng h-1, w celu oceny atrakcyjności dla żywicieli i wysysających krew komarów. Następnie przeprowadza się test na kompletnych mieszankach, w których usuwa się subtraktywne mieszanki pojedynczych związków kompletnej mieszanki. Należy szukać odpowiedzi od żywiciela i komarów karmionych krwią Ans.Arabiensis w porównaniu z syntetycznym i Analizę mieszanek subtraktywnych przeprowadzono przy użyciu nominalnej regresji logistycznej, a następnie porównano parami ilorazy nieparzyste (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Aby ocenić, czy mocz krowi może służyć jako sygnał siedliskowy dla komarów wywołujących malarię, świeży i stary mocz krowi, zebrany w sposób opisany powyżej, wraz z wodą umieszczono w wiadrach o pojemności 3 l (100 ml) i umieszczono w pułapkach-przynętach. (wersja BG-HDT; BioGents, Regensburg, DE). Dziesięć pułapek rozmieszczono w odległości 50 m od siebie na pastwisku, 400 m od społeczności wiejskiej (Silay, Etiopia, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) i bez bydła, na stałych terenach lęgowych i wioskach. Pięć pułapek ogrzewano, aby symulować obecność żywiciela, natomiast pięć pułapek pozostawiono nieogrzewanych. Każde miejsce zabiegu zmieniano co noc przez łącznie pięć nocy. Liczbę komarów złapanych w pułapki z przynętą w postaci moczu w różnym wieku porównywano za pomocą regresji logistycznej z rozkładem beta dwumianowym (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
W wiosce, w której występuje endemiczna malaria, niedaleko miasta Maki w regionie Oromia w Etiopii (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; Rycina 6A), badanie przeprowadzono w okresie od połowy sierpnia do połowy września przed corocznym opryskiem resztkowym w pomieszczeniach, w trakcie długiego sezonu deszczowego. Do badania wybrano pięć par domów (oddalonych od siebie o 20–50 m) położonych na obrzeżach wioski (Rycina 6A). Kryteria wyboru domów były następujące: zakaz trzymania w domu zwierząt, zakaz gotowania w domu (przynajmniej w okresie próbnym) oraz domy z maksymalnie dwoma mieszkańcami, śpiącymi w pomieszczeniach bez insektycydów. pod moskitierą. Zatwierdzenie etyczne zostało przyznane przez Instytucjonalną Komisję ds. Etyki Badań Naukowych (IRB/022/2016) Wydziału Nauk Przyrodniczych (CNS-IRB) Uniwersytetu w Addis Abebie, zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Deklarację Helsińską Światowego Stowarzyszenia Medycznego. Zgodę każdego z głów gospodarstw domowych uzyskano przy pomocy personelu zajmującego się poprawą stanu zdrowia. Cały proces jest zatwierdzany przez lokalne administracje na poziomie dystryktu i okręgu („kebele”). Projekt eksperymentu opierał się na schemacie kwadratu łacińskiego 2 × 2, w którym mieszanki syntetyczne i kontrole przydzielono do sparowanych domów pierwszej nocy i zamieniono między domami kolejnej nocy eksperymentalnej. Ten proces powtórzono dziesięć razy. Ponadto, aby oszacować aktywność komarów w wybranych domach, pułapki CDC ustawiono tak, aby działały przez pięć kolejnych nocy na początku, w środku i na końcu badania terenowego o tej samej porze dnia.
Syntetyczną mieszaninę zawierającą sześć związków bioaktywnych rozpuszczono w heptanie (97,0% rozpuszczalnika klasy GC, Sigma Aldrich) i uwolniono w ilości 140 ng h-1 za pomocą dozownika knota bawełnianego [20]. Dozownik knota pozwolił na uwalnianie wszystkich związków w stałych proporcjach przez cały 12-godzinny eksperyment. Heptan został użyty jako kontrola. Fiolkę zawieszono obok punktu wejścia pułapki świetlnej Centrów Kontroli i Zapobiegania Chorobom (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; rycina 6A). Pułapki zawieszono 0,8–1 m nad ziemią, w pobliżu stóp łóżka, a ochotnik spał pod nieobrobioną moskitierą i pracował między 18:00 a 06:30. Komary schwytane ze względu na płeć i stan fizjologiczny (niekarmione, karmione, w ciąży i w ciąży [21]) przebadano następnie za pomocą analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu zidentyfikowania gatunków morfologicznie zidentyfikowanych jako A. gambiae sl. Członkowie kompleksu [23]. W badaniu terenowym, odławianie pułapek w parach domów analizowano za pomocą nominalnego modelu dopasowania logistycznego, gdzie zmienną zależną była atrakcyjność, a efektem stałym – leczenie (mieszanka syntetyczna vs. kontrola) (JMP® 14.0. 0. SAS Institute Inc.). W niniejszym artykule przedstawiamy wartości χ2 i p z testu ilorazu wiarygodności.
Oceń, czy jest to bezpieczne. Arabiensis był w stanie uzyskać mocz, swoje główne źródło azotu, mocznik, poprzez bezpośrednie karmienie, w ciągu 48 godzin od podania przez 4 dni po (dpe) próbach karmienia samic poszukujących żywiciela i karmionych krwią (Ryc. 1A). Zarówno samice poszukujące żywiciela, jak i ssące krew wchłonęły znacznie więcej sacharozy niż jakakolwiek inna dieta lub woda (odpowiednio F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 i F(5,299) = 56,00, p < 0,0001; Rys. 1B, C). Ponadto samice poszukujące żywiciela zjadły mniej moczu po 72 godzinach w porównaniu z moczem po 168 godzinach (Ryc. 1B). Po zaoferowaniu diety zawierającej mocznik, samice poszukujące żywiciela wchłonęły znacznie większą ilość mocznika w stężeniu 2,69 mM w porównaniu ze wszystkimi innymi stężeniami i wodą, podczas gdy nie można było ich odróżnić od 10% sacharozy (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Rysunek 1D). Stanowiło to kontrast z reakcją samic karmionych krwią, które zazwyczaj wchłaniały znacznie więcej diety zawierającej mocznik niż wody, choć znacznie mniej niż 10% sacharozy (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; Rysunek 1).1E). Ponadto, porównując oba stany fizjologiczne, samice poddane flebotomii wchłaniały więcej mocznika niż samice poszukujące żywiciela przy najniższych stężeniach, a te samice wchłaniały podobne ilości mocznika przy wyższych stężeniach (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; Rysunek 1F, G). Podczas gdy spożycie z diety zawierającej mocznik wydawało się mieć optymalne wartości (Rys. 1D, E), samice w obu stanach fizjologicznych były w stanie aby regulować ilość wchłanianego mocznika w całym zakresie stężeń mocznika w sposób logarytmiczno-liniowy (rys. 1F, G). Podobnie komary wydają się kontrolować pobieranie azotu poprzez regulację ilości wchłanianego moczu, ponieważ ilość azotu w moczu znajduje odzwierciedlenie w ilości wchłanianego moczu (wstawki na rysunkach 1B, C i B).
Aby ocenić wpływ moczu i mocznika na przeżywalność komarów poszukujących żywiciela i ssących krew, samicom podawano mocz w każdym z czterech grup wiekowych (świeży, po 24 h, 72 h i 168 h od złożenia), a także mocznik w różnych stężeniach, a także wodę destylowaną i 10% sacharozę jako kontrolę (Rysunek 2A). Ta analiza przeżywalności wykazała, że ​​dieta miała istotny wpływ na ogólne przeżycie samic poszukujących żywiciela (mocz: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; mocznik: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Rys. 2B, C) i samic karmionych krwią (mocz: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; mocznik: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Rysunek 2D,E). We wszystkich eksperymentach samice karmione dietą składającą się z moczu, mocznika i wody miały znacząco niższe wskaźniki przeżycia w porównaniu do samic karmionych dietą sacharozową (Rysunek 2B-E). Samice poszukujące żywiciela karmione świeżym i nieświeżym moczem wykazywały różne wskaźniki przeżycia, przy czym te karmione nieświeżym moczem z 72 godzin (p = 0,016) miały najniższe prawdopodobieństwo przeżycia (Rysunek 2B). Ponadto samice poszukujące żywiciela karmione mocznikiem w stężeniu 135 mM przeżyły dłużej niż kontrole otrzymujące wodę (p < 0,04) (Rysunek 2C). W porównaniu z wodą kobiety karmione świeżym moczem i moczem z 24 godzin przeżyły dłużej (odpowiednio p = 0,001 i p = 0,012; Rysunek 2D), podczas gdy kobiety karmione moczem z 72 godzin przeżyły dłużej niż te karmione Skróconym świeżym moczem i moczem z 24 godzin (p < 0,0001 i p = 0,013, odpowiednio; Rysunek 2D). Samice karmione krwią, którym podawano 135 mM mocznika, przeżyły dłużej niż samice karmione innymi stężeniami mocznika i wody (p < 0,013; Rysunek 2E).
Przeżywalność żywicieli i krwiopijnych samic Anopheles arabinis żywiących się moczem krowim i mocznikiem. W biopróbie (A) samicom komarów podawano dietę składającą się ze świeżego i starego moczu krowiego, mocznika w różnych stężeniach, sacharozy (10%) i wody destylowanej (H2O). Przeżywalność komarów poszukujących żywiciela (B, C) i krwiopijnych (D, E) rejestrowano co 12 godzin, aż do momentu, gdy wszystkie samice żywione moczem (B, D) i mocznikiem (C, E) oraz osobniki kontrolne – sacharozą i wodą – padły.
Całkowity dystans i liczba rund określone w teście młyna lotnego w ciągu 24 godzin różniły się między komarami szukającymi żywiciela i ssącymi krew, które wykazały ogólnie mniejszą aktywność lotu (rys. 3). Komary szukające żywiciela, które dostarczały świeży i stary mocz lub sacharozę i wodę, wykazywały odmienne wzorce lotu (rys. 3), przy czym samice żywiące się świeżym moczem były bardziej aktywne o świcie, podczas gdy te karmione 24- i 168-godzinnym moczem Komary żywiące się moczem wykazywały różne wzorce lotu i były głównie dzienne. Samice komarów, które dostarczały sacharozę lub 72-godzinny mocz, wykazywały aktywność przez cały okres 24 godzin, podczas gdy samice, które dostarczały wodę, były bardziej aktywne w środku okresu. Komary żywione sacharozą wykazywały najwyższy poziom aktywności późną nocą i wczesnym rankiem, podczas gdy u tych, które spożywały 72-godzinny mocz, zaobserwowano stały spadek aktywności w ciągu 24 godzin (rysunek 3).
Wydajność lotu polującej na żywiciela, krwiopijnej samicy Anopheles arabinis, żywiącej się moczem krowim i mocznikiem. W teście w młynie przelotowym samice komarów żywiące się świeżym i dojrzałym moczem krowim, mocznikiem o różnym stężeniu, sacharozą (10%) i wodą destylowaną (H2O) były przywiązywane do poziomych, swobodnie obracających się ramion (powyżej). W przypadku samic poszukujących żywiciela (po lewej) i żywiących się krwią (po prawej) rejestrowano całkowity dystans i liczbę lotów na godzinę dla każdej diety w ciągu 24 godzin (ciemny: szary; jasny: biały). Średni dystans i średnia liczba lotów są pokazane po prawej stronie wykresu aktywności dobowej. Słupki błędów oznaczają błąd standardowy średniej. Analiza statystyczna — patrz tekst
Ogólnie rzecz biorąc, ogólna aktywność lotu samic poszukujących żywiciela podążała za schematem podobnym do odległości lotu w okresie 24 godzin. Średnia odległość lotu była istotnie zależna od przyjmowanej diety (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), a samice poszukujące żywiciela, które spożyły 72-godzinny mocz, latały istotnie dłuższe odległości w porównaniu do wszystkich innych diet (p < 0,0001), a komary karmione sacharozą latały dłużej niż komary karmione świeżym (p = 0,022) i 24-godzinnym moczem (p = 0,022). W przeciwieństwie do schematu aktywności lotu opisanego przez dietę moczową, samice poszukujące żywiciela karmione mocznikiem wykazywały stałą aktywność lotu w okresie 24 godzin, osiągając szczyt w drugiej połowie fazy ciemności (rys. 3). Chociaż schematy aktywności były podobne, samice poszukujące żywiciela karmione mocznikiem istotnie zwiększały średnią odległość lotu w zależności od wchłoniętego stężenia (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Samice poszukujące żywiciela, karmione dowolnym stężeniem mocznika, latały dłużej niż samice karmione wodą lub sacharozą (p < 0,03).
Całkowita aktywność lotu komarów ssących krew była stabilna i utrzymywała się przez 24 godziny przy wszystkich dietach, ze zwiększoną aktywnością moczu w drugiej połowie okresu ciemności u samic karmionych wodą, jak również u samic karmionych świeżo i w wieku 24 godzin (rysunek 3). Podczas gdy dieta oparta na moczu istotnie wpływała na średni dystans lotu u samic karmionych krwią (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), dieta oparta na moczniku nie miała takiego wpływu (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) w przypadku innego moczu i diety kontrolnej (świeżej, p = 0,0091; 72 godziny, p = 0,0022; 168 godzin, p = 0,001; sacharozy, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Wpływ karmienia moczem i mocznikiem na parametry rozrodcze oceniano w biotestach składania jaj (rysunek 4A) i badano na podstawie liczby jaj złożonych przez każdą samicę, wielkości jaj i nowo wyklutych larw pierwszego stadium. Liczba złożonych jaj.Samice arabskie karmione moczem różniły się dietą (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; rys. 4B).Samice karmione 24-godzinnym moczem i krwią zniosły znacznie więcej jaj niż samice karmione innymi dietami moczowymi i były podobne do tych karmionych sacharozą (rys. 4B).Podobnie, wielkość jaj składanych przez samice karmione moczem różniła się w zależności od diety (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), przy czym samice karmione 24-godzinnym moczem i sacharozą składały znacznie większe jaja niż samice karmione wodą, podczas gdy jaja samic karmionych 168 h moczu były znacząco mniejsze (ryc. 4C). Ponadto dieta moczowa znacząco wpłynęła na wielkość larw (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), przy czym z jaj złożonych przez samice karmione moczem w wieku 24 i 72 godzin wylęgały się znacząco większe larwy niż z jaj złożonych przez larwy karmione wodą i moczem w wieku 168 godzin (ryc. 4D).
Wydajność reprodukcyjna samic komara Anopheles arabinis żywiących się moczem krowim i mocznikiem. Samice komarów karmione krwią otrzymywały dietę składającą się ze świeżego i starego moczu krowiego, mocznika o różnym stężeniu, sacharozy (10%) i wody destylowanej (H2O) przez 48 godzin przed umieszczeniem w biotestach i uzyskaniem substratów do składania jaj przez 48 godzin (A). Liczba jaj (B, E), wielkość jaj (C, F) i wielkość larw (D, G) były istotnie zależne od podawanej diety (mocz krowi: BD; mocznik: EG). Średnie dla każdego parametru mierzonego przy użyciu różnych nazw literowych istotnie różniły się od siebie (jednokierunkowa analiza wariancji przy użyciu analizy post hoc Tukeya; p < 0,05). Słupki błędów oznaczają błąd standardowy średniej
Jako główny składnik azotowy moczu, mocznik, podawany w diecie samic karmionych krwią, znacząco wpływał na parametry reprodukcyjne we wszystkich badaniach. Liczba jaj składanych przez samice karmione mocznikiem po posiłku krwią, w zależności od stężenia mocznika (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), samice karmione mocznikiem w stężeniu od 134 µM do 1,34 mM składały więcej jaj (Rysunek 4E). Samice karmione mocznikiem w stężeniu 134 µM lub wyższym składały większe jaja niż samice karmione wodą (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Rysunek 4F), a także wielkość larw, chociaż zależna od podobnych stężeń mocznika u matek (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) była bardziej zmienna (Rys. (4G).
Ogólna atrakcyjność dla lotnych ekstraktów z przestrzeni nadpowierzchniowej moczu bydlęcego poszukujących żywiciela. Arabiensis oceniany w olfaktometrze rurowym szklanym (rys. 5A) był istotnie uzależniony od wieku moczu (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; rys. 5B). Analiza post hoc wykazała, że ​​zapach stęchłego moczu po 24 godzinach powodował istotnie wyższy poziom atrakcyjności w porównaniu ze wszystkimi innymi metodami leczenia (72 godziny: p = 0,0060, 168 godzin: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), z wyjątkiem zapachu świeżego moczu (p = 0,13; rys. 5B). Chociaż ogólna atrakcyjność komarów ssących krew zapachem moczu nie była istotnie różna (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; rys. 5C), stwierdzono, że te samice były istotnie bardziej atrakcyjne dla przestrzeni nadpowierzchniowej ekstrakty lotne w porównaniu z moczem pobranym w ciągu 72 godzin w porównaniu z grupą kontrolną (p = 0,0066; rycina 5C).
Reakcje behawioralne na naturalne i syntetyczne zapachy moczu krowiego w poszukiwaniu żywiciela i krwiopijnego Anopheles arabianus. Schemat szklanego olfaktometru (A). Przyciąganie lotnych ekstraktów z przestrzeni nadpowierzchniowej ze świeżego i starego moczu krowiego do komarów żywiciela (B) i krwiopijnych (C). Znajdź reakcję macek Lorda An. Pokazano ekstrakty z przestrzeni nadpowierzchniowej wyizolowane ze świeżego (D), 24-godzinnego (E), 72-godzinnego (F) i 168-godzinnego (G) moczu krowiego. Ślady detekcji anteny elektronowej (EAD) pokazują zmiany napięcia w odpowiedzi na związki bioaktywne w przestrzeni nadpowierzchniowej wyeluowane z chromatografu gazowego i wykryte przez detektor z płomieniową jonizacją (FID). Pasek skali przedstawia amplitudę odpowiedzi (mV) w funkcji czasu retencji (s). Pokazano właściwości i szybkość uwalniania (µg h-1) biologicznie aktywnych związków. Pojedyncza gwiazdka (*) oznacza spójną odpowiedź o niskiej amplitudzie. Podwójne gwiazdki (**) oznaczają niepowtarzalne reakcje.Znajdź żywiciela (H) i krwiopijcę (I) An.arabiensis różnie reaguje na syntetyczne mieszanki zapachów świeżego i starego moczu krowiego.Średnie proporcje komarów zwabionych różnymi nazwami liter znacząco różniły się od siebie (jednokierunkowa analiza wariancji z wykorzystaniem analizy post hoc Tukeya; p < 0,05).Słupki błędów oznaczają błąd standardowy skali
U samic Ann.arabiensis, 72 i 120 godzin po pobraniu krwi w trakcie tarła, nie wykazano preferencji dla lotnych ekstraktów z przestrzeni nad powierzchnią moczu świeżego i starego bydła w porównaniu z kontrolami pentanowymi (χ2 = 3,07, p > 0,05; Dodatkowy plik 1: Ryc. S1).
W przypadku żeńskich osobników Ann. arabiensis analizy GC-EAD i GC-MS pozwoliły zidentyfikować odpowiednio osiem, sześć, trzy i trzy związki bioaktywne (ryc. 5D-G). Chociaż zaobserwowano różnice w liczbie związków wywołujących reakcje elektrofizjologiczne, większość z tych związków była obecna w każdym wyciągu lotnym z przestrzeni nad powierzchnią moczu pobranym ze świeżego i starego moczu. Dlatego w dalszych analizach każdego wyciągu uwzględniono tylko te związki, które wywołały reakcję fizjologiczną czułek samic powyżej progu.
Całkowita szybkość uwalniania lotnych związków bioaktywnych w zbiorze przestrzeni nad cieczą wzrosła z 29 µg h-1 w świeżym moczu do 242 µg h-1 w moczu po 168 godzinach starzenia, głównie z powodu p-krezolu i m-formaldehydu. Stężenie fenolu wzrasta, podobnie jak stężenie fenolu. Natomiast szybkości uwalniania innych związków, takich jak 2-cykloheksen-1-on i dekanal, zmniejszały się wraz ze wzrostem wieku moczu, co korelowało z obserwowanym spadkiem intensywności sygnału (obfitości) na chromatogramie (rys. 5D) - panel lewy G) i reakcjami fizjologicznymi na te związki (rys. 5D - panel prawy G).
Ogólnie rzecz biorąc, syntetyczna mieszanka miała podobny naturalny stosunek związków bioaktywnych zidentyfikowanych w lotnych ekstraktach świeżego i leżakowanego moczu (rys. 5D–G) i nie wydawała się wzbudzać znaczącego zainteresowania w poszukiwaniu żywiciela (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; rys. 5H) lub komarów ssących krew (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; rys. 5I). Jednakże, porównania parami post hoc między metodami leczenia wykazały, że komary poszukujące żywiciela były znacząco atrakcyjne dla syntetycznej mieszanki 24-godzinnego leżakowanego moczu w porównaniu z kontrolami pentanowymi (p = 0,0086; rys. 5H).
Aby ocenić rolę poszczególnych składników w syntetycznych mieszankach 24-godzinnego moczu, sześć mieszanek subtraktywnych oceniono w porównaniu z mieszankami kompletnymi w teście z rurką w kształcie litery Y, w którym usunięto pojedyncze związki. W przypadku komarów poszukujących żywiciela odejmowanie pojedynczych związków od mieszanki kompletnej miało istotny wpływ na reakcje behawioralne (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Dodatkowy plik 1: Rysunek S2A), wszystkie mieszanki subtraktywne były bardziej atrakcyjne niż mniejsze niż w pełni wymieszane. Natomiast usunięcie pojedynczych związków z mieszanki w pełni syntetycznej nie miało wpływu na reakcje behawioralne komarów ssących krew (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), z wyjątkiem dekanalu, którego stężenie było niższe w porównaniu z atrakcyjnością mieszanki kompletnej (p = 0,022; Dodatkowy plik 1: Rysunek S2B).
W wiosce w Etiopii, w której występuje endemiczna malaria, skuteczność syntetycznej mieszanki 24-godzinnego moczu krowiego w przyciąganiu komarów w warunkach polowych oceniano przez dziesięć nocy (rys. 6A). Łącznie schwytano i zidentyfikowano 4861 komarów, z czego 45,7% stanowiły Anthropus gambiae sl, 18,9% Anopheles pharoensis, a 35,4% Culex spp. (Dodatkowy plik 1: Tabela S1). Anopheles arabinis jest jedynym członkiem kompleksu gatunków An.Gambian zidentyfikowanym za pomocą analizy PCR. Średnio schwytano 320 komarów na noc, w tym czasie pułapki z przynętami z syntetycznej mieszanki złapały więcej komarów niż pułapki parowane bez mieszanki (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Pułapki bez przynęty rozstawiano każdej z pięciu nocy kontrolnych na początku, środek i koniec badania.Podobną liczbę komarów złapano w każdej parze pułapek, co wskazuje na brak odchyleń między domkami (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) i brak spadku populacji w okresie badania.W porównaniu z pułapkami kontrolnymi liczba komarów złapanych w pułapki zawierające syntetyczną mieszankę była istotnie zwiększona: poszukujące żywiciela (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), niedawne pobieranie krwi (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) i ciąża (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Dodatkowy plik 1: Tabela S1).Odzwierciedla to również całkowita liczba złapanych komarów: poszukujące żywiciela > krwiopijne > ciężarne > półciężarne > samce.
Ocena terenowa skuteczności 24-godzinnej syntetycznej mieszanki zapachowej moczu krowiego. Badania terenowe przeprowadzono w południowo-środkowej Etiopii (mapa), w pobliżu miasta Maki (wkładka), używając pułapki świetlnej Centers for Disease Control (CDC) (po prawej) w parach domków o wzorze kwadratu łacińskiego (obraz lotniczy) (A). Fotopułapki CDC z przynętą w postaci syntetycznego zapachu przyciągają i łapią samice komarów Anopheles arabesques (B), ale nie Anopheles farroes (C), w inny sposób, efekt zależny od stanu fizjologicznego. Ponadto pułapki te złapały znacząco zwiększoną liczbę komarów żywicielskich Culex. (D) W porównaniu z grupą kontrolną. Słupki po lewej stronie przedstawiają średni wskaźnik selekcji komarów złapanych w pary pułapek z przynętą zapachową (zielona) i kontrolnych (otwartych) (N = 10), podczas gdy słupki po prawej stronie przedstawiają średni wskaźnik selekcji w parach pułapek kontrolnych (otwartych; N = 5). ). Gwiazdki oznaczają poziomy istotności statystycznej (*p = 0,01 i ***p < 0,0001)
Wszystkie trzy gatunki zostały odłowione w różny sposób w pułapkach zawierających mieszanki syntetyczne. Poszukując żywiciela (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), żywienia się krwią (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) i ciąży (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), osobnik .arabiensis został złapany w pułapkę i uwolnił mieszankę syntetyczną (rys. 6B), podczas gdy ilość An nie różniła się. Znaleziono Pharoensis w różnych stanach fizjologicznych (rys. 6C). W przypadku gatunku Culex, w porównaniu z pułapkami kontrolnymi, stwierdzono jedynie istotny wzrost liczby komarów poszukujących żywicieli w pułapkach z przynętą w postaci mieszanki syntetycznej (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; rys. 6D).
Pułapki-przynęty umieszczone poza potencjalnymi żywicielami, między miejscami lęgowymi a społecznościami wiejskimi w Etiopii, zostały wykorzystane do oceny, czy komary przenoszące malarię wykorzystują zapach moczu krowiego jako sygnał siedliskowy. W przypadku braku sygnałów żywiciela, ciepła oraz obecności lub braku zapachu moczu krowiego, nie schwytano żadnych komarów (plik dodatkowy 1: Rysunek S3). Jednak w obecności wysokiej temperatury i zapachu moczu krowiego samice komarów przenoszących malarię były przyciągane i schwytane, aczkolwiek w małych liczbach, niezależnie od wieku moczu (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; plik dodatkowy 1: Rysunek S3). Natomiast kontrole wodne nie schwytały komarów przenoszących malarię w wysokich temperaturach (plik dodatkowy 1: Rysunek S3).
Komary przenoszące malarię nabywają i rozprowadzają związki zawierające azot poprzez kompensacyjne żerowanie na moczu krów (np. kałużach), aby wzmocnić cechy cyklu życiowego, podobnie jak inne owady [2, 4, 24, 25, 26]. Mocz krów jest łatwo dostępnym, odnawialnym zasobem, ściśle związanym z miejscami odpoczynku wektorów malarii, takimi jak obory i wysoka roślinność w pobliżu domów wiejskich i miejsc tarliska. Samice komarów lokalizują to źródło za pomocą zapachu i są w stanie regulować pobieranie związków azotowych z moczu, w tym mocznika, głównego składnika azotowego moczu [15, 16]. W zależności od stanu fizjologicznego samicy komara, składniki odżywcze w moczu są przydzielane w celu zwiększenia aktywności lotu i przeżycia samic komarów poszukujących żywiciela, a także przeżycia i cech reprodukcyjnych osobników karmionych krwią podczas pierwszego cyklu gonadotropowego. Dlatego mieszanie moczu odgrywa ważną rolę odżywczą dla wektorów malarii, które są zamknięte jak niedożywione dorosłe osobniki [8], ponieważ zapewnia samicom komarów zdolność do nabywania ważnych związków azotowych poprzez stosowanie diety o niskim ryzyku. Odkrycie to ma istotne konsekwencje epidemiologiczne, ponieważ samice wydłużają swoją oczekiwaną długość życia, zwiększają swoją aktywność i wydajność reprodukcyjną, a wszystko to wpływa na zdolność wektorów. Co więcej, takie zachowanie może być celem przyszłych programów zarządzania wektorami.