Pridobivanje in porazdelitev hranil združujeta prehranjevanje žuželk in značilnosti življenjskega sloga. Da bi nadomestile pomanjkanje določenih hranil v različnih življenjskih obdobjih, lahko žuželke ta hranila pridobijo z dopolnilnim hranjenjem, na primer s hranjenjem z izločki vretenčarjev v procesu, znanem kot luže. Zdi se, da je komar Anopheles arabiani podhranjen in zato potrebuje hranila tako za presnovo kot za razmnoževanje. Cilj te študije je bil oceniti, ali mešanje kravjega urina z An. arabiensis za pridobivanje hranil izboljša značilnosti življenjskega sloga.
Prepričajte se, da je varno. arabiensis je pritegnil vonj svežega, 24 ur, 72 ur in 168 ur starega kravjega urina, samice, ki so iskale gostitelja in so se hranile s krvjo (48 ur po krvnem obroku), pa so bile izmerjene v olfaktometru z Y-cevko, breje samice pa so bile ocenjene za test drstenja. Nato je bila uporabljena kombinirana kemijska in elektrofiziološka analiza za identifikacijo bioaktivnih spojin v kravjem urinu v vseh štirih starostnih razredih. Sintetične mešanice bioaktivnih spojin so bile ocenjene v poskusih z Y-cevko in na terenu. Za raziskavo kravjega urina in njegove glavne dušikove spojine sečnine kot potencialne dopolnilne prehrane za prenašalce malarije so bili izmerjeni parametri hranjenja in značilnosti življenjskega sloga. Ocenjen je bil delež samic komarjev ter količina absorbiranega kravjega urina in sečnine. Po hranjenju so bile samice ocenjene glede preživetja, privezanega leta in razmnoževanja.
Iščejo kri in hrano gostitelja. V laboratorijskih in terenskih študijah so Arabce pritegnili naravni in sintetični vonj svežega in staranega kravjega urina. Breje samice so bile na drstiščih ravnodušne do odzivov kravjega urina. Samice, ki iščejo gostitelja in sesajo kri, aktivno absorbirajo kravji urin in sečnino ter te vire razporejajo glede na kompromise v življenjski zgodovini kot funkcijo fiziološkega stanja za let, preživetje ali razmnoževanje.
Pridobivanje in distribucija kravjega urina vrste Anopheles arabinis za izboljšanje značilnosti življenjskega cikla. Dodatno hranjenje s kravjim urinom neposredno vpliva na kapaciteto vektorjev s povečanjem dnevnega preživetja in gostote vektorjev ter posredno s spreminjanjem aktivnosti letenja, zato bi ga bilo treba upoštevati v prihodnjih modelih.
Pridobivanje in distribucija hranil združuje značilnosti iskanja hrane pri žuželkah in njihove življenjske značilnosti [1,2,3]. Žuželke so sposobne izbirati in pridobivati ​​hrano ter izvajati kompenzacijsko hranjenje glede na razpoložljivost hrane in potrebe po hranilih [1, 3]. Porazdelitev hranil je odvisna od življenjskega procesa in lahko vodi do različnih zahtev glede kakovosti in količine prehrane v različnih življenjskih fazah žuželk [1, 2]. Da bi nadomestile pomanjkanje določenih hranil, lahko žuželke ta hranila pridobivajo z dopolnilnim hranjenjem, na primer z blatom, različnimi iztrebki in izločki vretenčarjev ter mrhovino, kar je proces, znan kot luže [2]. Čeprav je opisanih predvsem veliko vrst metuljev in moljev, se napajališča pojavljajo tudi pri drugih redovih žuželk, privlačnost teh vrst virov in hranjenje z njimi pa lahko pomembno vplivata na zdravje in druge življenjske značilnosti [2, 4, 5, 6],7]. Malarijski komar Anopheles gambiae sensu lato (sl) se pojavi kot "podhranjen" odrasel komar [8], zato ima lahko zalivanje pomembno vlogo pri njegovih življenjskih značilnostih, vendar je bilo to vedenje doslej zanemarjeno. Uporaba agitacije kot sredstva za povečanje vnosa hranil pri tem pomembnem sredstvu si zasluži pozornost, saj ima lahko pomembne epidemiološke posledice.
Vnos dušika pri odraslih samicah komarjev vrste Anopheles je omejen zaradi nizkih kaloričnih rezerv, ki jih prenašajo iz larvalne faze, in neučinkovite izrabe krvne moke [9]. Samice vrste Ann.gambiae sl to običajno kompenzirajo z dopolnjevanjem s krvnimi obroki [10, 11], s čimer več ljudi izpostavijo tveganju okužbe z boleznijo, komarje pa večjemu tveganju plenjenja. Lahko pa komarji uporabijo dodatno hranjenje z izločki vretenčarjev za pridobivanje dušikovih spojin, ki izboljšajo prilagajanje in manevrsko sposobnost leta, kot kažejo druge žuželke [2]. V zvezi s tem je zanimiva močna in izrazita privlačnost ene od sorodnih vrst znotraj gambijskega vrstnega kompleksa vrste An.Anopheles arabinis, svežega in staranega kravjega urina [12, 13, 14]. Anopheles arabinis je oportunističen pri svojih gostiteljskih preferencah in je znano, da se povezuje z govedom in se z njim hrani. Kravje urin je vir, bogat z dušikovimi spojinami, pri čemer sečnina predstavlja 50–95 % celotnega dušika v svežem urinu [15, 16]. Ko se kravji urin stara, Mikroorganizmi te vire izkoristijo za zmanjšanje kompleksnosti dušikovih spojin v 24 urah [15]. Zaradi hitrega povečanja amonijaka, ki je povezano z zmanjšanjem organskega dušika, uspevajo alkalofilni mikroorganizmi (od katerih mnogi proizvajajo spojine, strupene za komarje) [15], kar je lahko posledica dejstva, da samice Ann.arabiensis prednostno privlači urin, star 24 ur ali manj [13, 14].
V tej študiji so iskali gostiteljske in krvoločne komarje An. Med prvim ciklom gonadotropinov so pri komarju arabiensis ocenili pridobivanje dušikovih spojin, vključno s sečnino, z mešanjem urina. Nato so izvedli vrsto poskusov za oceno, kako samice komarjev razporejajo ta potencialni vir hranil za boljše preživetje, razmnoževanje in nadaljnje iskanje hrane. Nazadnje so ocenili vonj svežega in staranega kravjega urina, da bi ugotovili, ali ti zagotavljajo zanesljive namige za gostiteljske in krvoločne komarje An. Pri iskanju tega potencialnega prehranskega vira je arabiensis odkril kemijske korelacije za opaženo različno privlačnostjo. Sintetične mešanice vonjav hlapnih organskih spojin (HOS), identificirane v 24-urnem staranem urinu, so bile nadalje ovrednotene v terenskih pogojih, s čimer so razširili rezultate, pridobljene v laboratorijskih pogojih, in prikazali vpliv vonja govejega urina na različna fiziološka stanja. Privlačnost komarjev. Pridobljeni rezultati potrjujejo, da An. arabiensis pridobiva in distribuira dušikove spojine, ki jih najdemo v urinu vretenčarjev, da bi vplival na značilnosti življenjskega cikla. Ti rezultati so obravnavani v kontekstu morebitnih epidemioloških posledic in kako jih je mogoče uporabiti za nadzor in nadzor vektorjev.
Ribe vrste Anopheles arabicans (sev Dongola) so vzdrževali pri temperaturi 25 ± 2 °C, relativni vlažnosti 65 ± 5 % in ciklu svetlobe in teme 12:12 ur. Ličinke so vzrejali v plastičnih pladnjih (20 cm × 18 cm × 7 cm), napolnjenih z destilirano vodo, in jih hranili s hrano za ribe Tetramin® (Tetra Werke, Melle, Nemčija). Buke so zbrali v 30 ml skodelice (Nolato Hertila, Åstorp, Švedska) in jih nato prenesli v kletke Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Tajvan), da so omogočili izleganje odraslih osebkov. Odraslim osebkom so do 4 dni po izleganju (dpe) po želji dajali 10 % raztopino saharoze, nakar so samice, ki iščejo gostitelja, tik pred poskusom ponudili hrano ali pa so jih pred poskusom čez noč stradale z destilirano vodo, kot je opisano spodaj. Samice, uporabljene za poskuse z letalno cevjo, so stradale le 4–6 dni. ur z vodo ad libitum. Za pripravo krvosesnih komarjev za nadaljnje biološke teste so 4 samice dpe prejele defibrotično ovčjo kri (Håtunalab, Bro, SE) z uporabo membranskega sistema za hranjenje (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, Združeno kraljestvo). Popolnoma preobremenjene samice so nato premestili v posamezne kletke in jim neposredno dali hrano, kot je opisano spodaj, ali 10 % saharozo ad libitum 3 dni pred spodaj opisanimi poskusi. Slednje samice so bile uporabljene za biološke teste v letalnih ceveh in prenesene v laboratorij, nato pa so 4–6 ur pred poskusom prejemale destilirano vodo ad libitum.
Za kvantificiranje porabe urina in sečnine pri odraslih samicah An.Arab so bili uporabljeni testi hranjenja. Samice, ki so iskale gostitelja in so se hranile s krvjo, so 48 ur prejemale dieto, ki je vsebovala 1 % razredčenega svežega in staranega kravjega urina, različne koncentracije sečnine in dve kontrolni skupini (10 % saharoze in vode). Poleg tega je bilo prehrani dodano živilsko barvilo (1 mg ml-1 ksilen cianid FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) in dobavljeno v matriki 4 × 4 v 250 µl mikrocentrifugalnih epruvetah (Axygen Scientific, Union City, CA, ZDA; slika 1A) do roba (~300 µl). Da bi se izognili konkurenci med komarji in morebitnim učinkom barvila, smo 10 komarjev postavili v veliko petrijevko (premera 12 cm in višine 6 cm; Semadeni, Ostermundigen, CH; slika 1A) v popolni temi pri 25 ± 2 cm °C in relativni vlažnosti 65 ± 5 %. Ti poskusi so bili ponovljeni 5- do 10-krat. Po izpostavitvi hrani so komarje do nadaljnje analize namestili na -20 °C.
Poiščite goveji urin in sečnino, ki ju absorbirata gostitelj in krvosesna samica Anopheles arabianus. V poskusu hranjenja (A) so samice komarjev prejele prehrano, ki je vsebovala svež in staran kravji urin, različne koncentracije sečnine, saharozo (10 %) in destilirano vodo (H2O). Samice, ki iščejo gostitelja (B), in samice, ki se hranijo s krvjo (C), so absorbirale več saharoze kot katera koli druga testirana prehrana. Upoštevajte, da so samice, ki iščejo gostitelja, absorbirale 72-urni kravji urin manj kot 168-urni kravji urin (B). Povprečna skupna vsebnost dušika (± standardni odklon) urina je prikazana na vstavku. Samice, ki iščejo gostitelja (D, F), in samice, ki sesajo kri (E, G), absorbirajo sečnino na način, odvisen od odmerka. Povprečni vdihani volumni (D, E) z različnimi črkovnimi imeni so se med seboj bistveno razlikovali (enosmerna ANOVA z uporabo Tukeyjeve post hoc analize; p < 0,05). Stolpci napak predstavljajo standardno napako povprečja (BE). Ravna črtkana črta predstavlja logaritemsko linearno regresijsko premico (F, G).
Za sproščanje absorbirane hrane so komarje posamično dali v 1,5 ml mikrocentrifugalne epruvete, ki so vsebovale 230 µl destilirane vode, tkivo pa so raztrgali z uporabo pestiča za enkratno uporabo in brezžičnega motorja (VWR International, Lund, SE), nato pa so jih centrifugirali pri 10 krpm 10 minut. Supernatant (200 µl) so prenesli na 96-vdolbinsko mikroploščo (Sigma-Aldrich) in določili absorbanco (λ620) s spektrofotometričnim bralnikom mikroplošč (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm. Lahko pa so komarje zmleli v 1 ml destilirane vode, od katere je bilo 900 µl prenesenih v kiveto za spektrofotometrično analizo (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Za kvantifikacijo vnosa hrane so pripravili standardno krivuljo s serijskim redčenjem, da so dobili od 0,2 µl do 2,4 µl 1 mg ml-1 ksilena. cianid. Nato je bila optična gostota znanih koncentracij barvila uporabljena za določitev količine hrane, ki jo je vsak komar zaužil.
Podatki o volumnu so bili analizirani z enosmerno analizo variance (ANOVA), ki ji je sledila Tukeyjeva post hoc parna primerjava (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, ZDA, 1989–2007). Linearne regresijske analize so opisale od koncentracije odvisen vnos sečnine in primerjale odzive med komarji, ki iščejo gostitelja, in komarji, ki sesajo kri (GraphPad Prism v8.0.0 za Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, ZDA).
Približno 20 µl vzorcev urina iz vsake starostne skupine je bilo vezanih na Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) in inkapsuliranih v pločevinaste kapsule (8 mm × 5 mm). Kapsule so bile vstavljene v zgorevalno komoro analizatorja CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA), da bi določili vsebnost dušika v svežem in staranem urinu v skladu s protokolom proizvajalca. Skupni dušik (g N l-1) je bil kvantificiran na podlagi znanih koncentracij sečnine, uporabljenih kot standard.
Za oceno vpliva prehrane na preživetje samic, ki iščejo gostitelja in sesajo kri, so bili komarji posamezno nameščeni v velike petrijevke (premera 12 cm in višine 6 cm; Semadeni) z odprtino v pokrovu (premera 3 cm) z mrežico, prekrito z mrežo. Prehrana je bila zagotovljena neposredno po 4 dneh po okužbi in je vključevala 1 % razredčenega svežega in staranega kravjega urina, štiri koncentracije sečnine in dve kontroli, 10 % saharoze in vode. Vsaka prehrana je bila s pipeto nanesena na zobni tampon (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE), vstavljen v 5 ml brizgo (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE), bat je bil odstranjen in postavljen na vrh petrijevke (slika 1).1A). Prehrano menjajte vsak dan. Vzdržujte laboratorij, kot je opisano zgoraj. Preživele komarje so šteli dvakrat na dan, mrtve komarje pa so zavrgli, dokler ni poginil zadnji komar (n = 40 na tretiranje). Preživetje komarjev, ki so se hranili z različnimi dietami, so statistično analizirali z uporabo Kaplan-Meyerjevih krivulj preživetja in log-rank testov. za primerjavo porazdelitve preživetja med dietami (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Prilagojen leteči mlin za komarje po meri, ki temelji na Attisanu in sodelavcih [17], izdelan iz 5 mm debelih prozornih akrilnih plošč (10 cm širine x 10 cm dolžine x 10 cm višine) brez sprednje in zadnje plošče (slika 3: zgoraj). Zgibni sklop z navpično cevjo iz plinskokromatografske kolone (0,25 mm notranji premer; 7,5 cm dolžine) s konci, prilepljenimi na iglo za žuželke, obešeno med par neodimskih magnetov, oddaljenih 9 cm. Vodoravna cev iz istega materiala (6,5 cm dolžine) je prerezala navpično cev in tvorila privezano roko in roko, ki je nosila majhen kos aluminijaste folije kot signal za prekinitev svetlobe.
Samice, ki so bile stradane 24 ur, so 30 minut pred zadrževanjem prejele zgornjo dieto. Popolnoma nahranjene samice komarjev so nato posamično anestezirali na ledu 2–3 minute in jih s čebeljim voskom pritrdili na žuželke (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) ter nato privezali na ročice horizontalnih cevi. Leteči mlin. Število vrtljajev na let je bilo zabeleženo s posebej izdelanim zapisovalnikom podatkov, nato shranjeno in prikazano s programsko opremo PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Leteči mlin je bil postavljen v klimatsko reguliran prostor (12 ur:12 ur, svetloba:tema, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relativne vlažnosti).
Za vizualizacijo vzorca letalske aktivnosti sta bila izračunana skupna preletena razdalja (m) in skupno število zaporednih letalskih aktivnosti na uro v 24-urnem obdobju. Poleg tega so bile povprečne prelete razdalje posameznih samic primerjane med različnimi tretmaji in analizirane z uporabo enosmerne ANOVA in Tukeyjeve post hoc analize (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), kjer je bila povprečna razdalja obravnavana kot odvisna spremenljivka, medtem ko je tretma neodvisen dejavnik. Poleg tega je bilo povprečno število krogov izračunano v 10-minutnih korakih.
Za oceno vpliva prehrane na reproduktivno sposobnost vrste An.arabiensis so šest samic (4 dpe) po odvzemu krvi premestili neposredno v kletke Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) in jim nato 48 ur zagotovili poskusno prehrano, kot je opisano zgoraj. Prehrano so nato odstranili in tretji dan za 48 ur zagotovili drstilne skodelice (30 ml; Nolato Hertila), napolnjene z 20 ml destilirane vode, ki so jo menjali vsakih 24 ur. Vsak prehranski režim ponovite 20–50-krat. Jajčeca so prešteli in zabeležili za vsako poskusno kletko. Podvzorci jajčec so bili uporabljeni za oceno povprečne velikosti in variacije dolžine posameznih jajčec (n ≥ 200 na prehrano) z uporabo mikroskopa Dialux-20 (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Nemčija), opremljenega s kamero Leica (DFC) 320 R2; Leica Microsystems Ltd., Nemčija). Preostala jajčeca so bila 24 ur shranjena v klimatiziranem prostoru v standardnih pogojih gojenja, podvzorec nedavno izleženih ličink prvega stadija (n ≥ 200 na dieto) pa je bil izmerjen, kot je opisano zgoraj. Število jajčec ter velikost jajčec in ličink so bili primerjani med tretmaji z uporabo enosmerne ANOVA in Tukeyjeve post hoc analize (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Hlapne snovi v prostoru nad vodo iz svežega (1 uro po vzorčenju), 24 ur, 72 ur in 168 ur starega urina so bile zbrane iz vzorcev, odvzetih od goveda zebu in pasme arsi. Zaradi lažje uporabe so bili vzorci urina odvzeti zgodaj zjutraj, ko so bile krave še v hlevu. Vzorce urina so odvzeli 10 posameznikom in 100–200 ml vsakega vzorca so prenesli v posamezne poliamidne vrečke za peko (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, Nemčija) v 3-litrskih poliamidnih sodih s pokrovom v plastičnih sodih iz vinilklorida. Hlapne snovi v prostoru nad vodo iz vsakega vzorca govejega urina so bile zbrane bodisi neposredno (sveže) bodisi po zorenju pri sobni temperaturi 24 ur, 72 ur in 168 ur, tj. vsak vzorec urina je bil reprezentativen za vsako starostno skupino.
Za zbiranje hlapnih snovi v prostoru nad tekočino je bil uporabljen sistem z zaprto zanko, s katerim je krožil plinski tok, filtriran z aktivnim ogljem (100 ml min-1), skozi poliamidno vrečko do adsorpcijske kolone 2,5 ure z uporabo membranske vakuumske črpalke (KNF Neuberger, Freiburg, Nemčija). Kot kontrola je bil odvzem v prostoru nad tekočino izveden iz prazne poliamidne vrečke. Adsorpcijska kolona je bila izdelana iz teflonske cevi (5,5 cm x 3 mm notranji premer), ki je vsebovala 35 mg Porapaka Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, ZDA) med steklenimi volnami. Pred uporabo je bila kolona splaknjena z 1 ml redestiliranega n-heksana (Merck, Darmstadt, Nemčija) in 1 ml pentana (99,0 % čisto topilo, GC, Sigma Aldrich). Adsorbirane hlapne snovi so bile eluirane s 400 μl pentana. Zbirke v prostoru nad tekočino so bile združene in nato shranjene pri -20 °C do nadaljnje analize.
Vedenjski odzivi komarjev An, ki iščejo gostitelja in se prehranjujejo s krvjo. Hlapni ekstrakti Headspace, zbrani iz svežega, 24-urnega, 72-urnega in 168-urnega urina, so bili analizirani na hlapne ekstrakte komarjev Arabidopsis z uporabo ravnega steklenega olfaktometra [18]. Poskusi so bili izvedeni med ZT 13-15, obdobjem največje aktivnosti komarjev An, ki iščejo dom. Arab [19]. Stekleni olfaktometer (80 cm × 9,5 cm notranji premer) je bil osvetljen s 3 ± 1 lx rdeče svetlobe od zgoraj. Pretok zraka, filtriran z ogljem in vlažen (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % relativne vlažnosti), je prestal biološki test s hitrostjo 30 cm s-1. Zrak se prevaja skozi vrsto mrežastih sit iz nerjavečega jekla, kar ustvarja laminarni tok in enakomerno strukturo perja. Dozirnik zobnih tamponov (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), obešen na 5 cm tuljavo na vetrovnem koncu olfaktometra, s spremembo stimulatorja vsakih 5 minut. Za analizo je bilo kot stimulus uporabljenih 10 μl vsakega ekstrakta iz prostora pod vodo, razredčenega v razmerju 1:10. Kot kontrola je bila uporabljena enaka količina pentana. Posamezni komarji, ki iščejo gostitelja ali sesajo kri, so bili 2–3 ure pred začetkom poskusa nameščeni v posamezne kletke za sproščanje. Kletka za sproščanje je bila postavljena na stran olfaktometra, ki je bila obrnjena proti vetru, in komarji so se 1 minuto aklimatizirali, nato pa so odprli metuljasti ventil kletke za sproščanje. Privlačnost k zdravljenju ali kontroli je bila analizirana kot delež komarjev, ki so prišli v stik z virom v 5 minutah po sproščanju. Vsak hlapen ekstrakt iz prostora pod vodo in kontrola sta bila ponovljena vsaj 30-krat, da bi se izognili učinkom katerega koli dneva, pa je bilo na vsak poskusni dan testiranih enako število zdravljenj in kontrol. Odzivi iskanja iz gostitelja in krvno hranjenih Ans. Arabski in headspace nizi so bili analizirani z uporabo nominalne logistične regresije, ki ji je sledila parna primerjava za razmerja lihih (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Anov drstni odziv. Izvlečki iz svežega in staranega kravjega urina so bili analizirani v kletkah Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Plastični lončki (30 ml; Nolato Hertila), napolnjeni z 20 ml destilirane vode, so služili kot drstni substrat in so bili postavljeni v nasprotnih kotih kletke, 24 cm narazen. V tretmajske lončke so dodali 10 μl vsakega ekstrakta iz tretmaja v razredčitvi 1:10. Za nastavitev kontrolnega lončka je bila uporabljena enaka količina pentana. Med posameznimi poskusi so izmenjali tretmajske in kontrolne lončke, da bi nadzorovali učinke položaja. Deset samic, ki so se hranile s krvjo, so izpustili v poskusne kletke ob 9. in 11. uri zjutraj, jajčeca v lončkih pa so prešteli 24 ur kasneje. Formula za izračun drstnega indeksa je: (število jajčec, odloženih v tretmajski lonček – število jajčec, odloženih v kontrolni lonček)/(skupno število odloženih jajčec). Vsak tretma je bil ponovljen 8-krat.
Analiza samic An.arabiensis s plinsko kromatografijo in detekcijo elektronskega antenskega vzorca (GC-EAD) je bila izvedena, kot je bilo opisano že prej [20]. Na kratko, sveže hlapne ekstrakte v prostoru nad paro smo ločili z uporabo Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, Kalifornija, ZDA), opremljenega s kolono HP-5 (30 m × 0,25 mm notranji premer, debelina filma 0,25 μm, Agilent Technologies). in staranje urina. Kot mobilna faza je bil uporabljen vodik s povprečnim linearnim pretokom 45 cm s-1. Vsak vzorec (2 μl) je bil vbrizgan 30 sekund v načinu brez delitve pri vhodni temperaturi 225 °C. Temperatura GC pečice je bila programirana od 35 °C (3 minute zadrževanja) do 300 °C (10 minut zadrževanja) pri 10 °C min-1. V delilniku iztoka GC je bil dodan 4 psi dušika in razdeljen v razmerju 1:1 v križu z nizko mrtvo prostornino Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, Nemčija) med detektorjem plamenske ionizacije in EAD. Kapilara iztoka GC za EAD je bila speljana skozi prenosno cev Gerstel ODP-2, ki sledi temperaturi GC pečice plus 5 °C, v stekleno cev (10 cm × 8 mm), kjer je bila zmešana z vlažnim zrakom, filtriranim z ogljikom (1,5 l min-1). Antena je bila postavljena 0,5 cm od izhodu epruvete. Vsak posamezen komar je predstavljal eno ponovitev, za komarje, ki iščejo gostitelja, pa so bile opravljene vsaj tri ponovitve na vzorcih urina vsake starosti.
Identifikacija bioaktivnih spojin v zbirkah svežega in staranega govejega urina v zračnem prostoru z uporabo kombiniranega plinskega kromatografa (GC-MS; 6890 GC in 5975 MS; Agilent Technologies) za izzivanje antenskih odzivov v analizi GC-EAD, ki deluje v načinu ionizacije z elektronskim udarom pri 70 eV. GC je bil opremljen s kapilarno kolono iz taljenega silicijevega dioksida, prevlečeno s HP-5MS UI (notranji premer 60 m × 0,25 mm, debelina filma 0,25 μm), z uporabo helija kot mobilne faze s povprečno linearno hitrostjo pretoka 35 cm s-1. Vzorec 2 μl je bil vbrizgan z enakimi nastavitvami injektorja in temperaturo pečice kot za analizo GC-EAD. Spojine so bile identificirane na podlagi njihovega retencijskega časa (Kovátov indeks) in masnih spektrov v primerjavi s knjižnico po meri in knjižnico NIST14 (Agilent). Identificirane spojine so bile potrjene z vbrizgavanjem avtentičnih standardov (Dodatna datoteka 1: Tabela S2). Za kvantifikacijo je bil uporabljen heptil acetat (10 ng, Kot zunanji standard je bil injiciran 99,8-odstotni kemijski čistost, Aldrich).
Vrednotenje učinkovitosti sintetične mešanice vonjav, ki jo sestavljajo bioaktivne spojine, identificirane v svežem in staranem urinu, za privabljanje gostitelja iščejočega in krvosesnega Ans.arabiensis, z uporabo istega olfaktometra in protokola kot zgoraj. Sintetične mešanice so posnemale sestavo in deleže spojin v mešanih hlapnih ekstraktih svežega, 24-urnega, 48-urnega, 72-urnega in 168-urnega urina, staranega v zgornjem prostoru (slika 5D-G; Dodatna datoteka 1: Tabela S2). Za analizo uporabite 10 μl razredčitve 1:100 popolnoma sintetične mešanice s skupno hitrostjo sproščanja od približno 140 do 2400 ng h-1, za oceno privlačnosti za gostitelja in krvosesne komarje. Nato se test izvede na popolnih mešanicah, pri katerih se odstranijo subtraktivne mešanice posameznih spojin celotne mešanice. Odzivi iskanja od gostitelja in krvosesnega Ans. Arabske v primerjavi s sintetičnimi in subtraktivnimi mešanicami so bile analizirane z uporabo nominalne logistične regresije, ki ji je sledila parna primerjava za razmerja lihih (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Da bi ocenili, ali bi kravji urin lahko služil kot znak za gostiteljsko okolje za malarijske komarje, smo svež in staran kravji urin, zbran, kot je opisano zgoraj, skupaj z vodo, dali v mrežasta 3-litrska vedra (100 ml) in namestili v pasti za vabo gostitelja (različica BG-HDT; BioGents, Regensburg, Nemčija). Deset pasti je bilo postavljenih 50 m narazen na pašniku, 400 m od vaške skupnosti (Silay, Etiopija, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) in brez goveda, na stalnih gnezdiščih in v vaseh. Pet pasti je bilo ogrevanih, da bi simulirali prisotnost gostitelja, pet pasti pa je ostalo neogrevanih. Vsako mesto tretiranja se je menjavalo vsako noč skupno pet noči. Število komarjev, ujetih v pasti, napolnjene z urinom različnih starosti, smo primerjali z uporabo logistične regresije z beta binomsko porazdelitvijo (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
V vasi, endemični za malarijo, blizu mesta Maki v regiji Oromia v Etiopiji (8° 11′ 08″ S, 38° 81′ 70″ V; slika 6A). Študija je bila izvedena med sredino avgusta in sredino septembra pred letnim škropljenjem z ostanki škodljivcev v zaprtih prostorih, skupaj z dolgo deževno sezono. Za študijo je bilo izbranih pet parov hiš (20–50 m narazen), ki se nahajajo na obrobju vasi (slika 6A). Merila za izbiro hiš so bila: živali v hiši niso dovoljene, kuhanje v zaprtih prostorih (kurjenje drv ali oglja) ni bilo dovoljeno (vsaj v poskusnem obdobju) in hiše z največ dvema prebivalcema, ki spijo v neinsekticidnih prostorih. pod tretirano mrežo proti komarjem. Etično odobritev je podelil Odbor za institucionalno raziskovalno etiko (IRB/022/2016) Fakultete za naravoslovje (CNS-IRB) Univerze v Adis Abebi v skladu s smernicami, ki jih je določila Helsinška deklaracija Svetovnega zdravniškega združenja. Soglasje vsakega vodje gospodinjstva je bilo pridobljeno s pomočjo zdravstvenega osebja. Celoten postopek podpirajo lokalne uprave na ravni okrožja in oddelka („kebele“). Poskusna zasnova je sledila latinskemu kvadratu 2 × 2, pri katerem so bile sintetične mešanice in kontrole prvo noč dodeljene parnim hišam, naslednjo poskusno noč pa so se zamenjale med hišami. Ta postopek je bil ponovljen desetkrat. Poleg tega so bile za oceno aktivnosti komarjev v izbranih hišah pasti CDC nastavljene tako, da so delovale pet zaporednih noči na začetku, sredini in koncu terenskega poskusa ob istem času dneva.
Sintetično mešanico, ki je vsebovala šest bioaktivnih spojin, smo raztopili v heptanu (97,0 % topilo, GC, Sigma Aldrich) in jo sproščali s hitrostjo 140 ng h-1 z uporabo razpršilnika z bombažnim stenjem [20]. Razpršilnik s stenjem je omogočil sproščanje vseh spojin v konstantnih razmerjih skozi 12-urni poskus. Heptan je bil uporabljen kot kontrola. Viala je bila obešena poleg vstopne točke svetlobne pasti Centra za nadzor in preprečevanje bolezni (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, ZDA; slika 6A). Pasti so bile obešene 0,8–1 m nad tlemi, blizu vznožja postelje, prostovoljec pa je spal pod neobdelano mrežo proti komarjem in je deloval med 18.00 in 6.30. Komarji, ujeti po spolu in fiziološkem stanju (nehranjeni, hranjeni, delno breji in breji [21]), so bili nato pregledani z analizo verižne reakcije s polimerazo (PCR), da bi identificirali vrsto, morfološko identificirano kot A. gambiae sl. Člani kompleksa [23]. Na terenu V tej študiji je bilo lovljenje parov hiš s pastmi analizirano z uporabo nominalnega logističnega modela prilagajanja, kjer je bila privlačnost odvisna spremenljivka, zdravljenje (sintetična mešanica proti kontrolni skupini) pa fiksni učinek (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Tukaj poročamo o vrednostih χ2 in p iz testa razmerja verjetnosti.
Ocenite, ali je varno. arabiensis je lahko pridobil urin, svoj glavni vir dušika, sečnino, z neposrednim hranjenjem v 48 urah po dajanju 4 dni po (dpe) poskusih hranjenja samic, ki iščejo gostitelja, in samic, ki sesajo kri (slika 1A). Tako samice, ki iščejo gostitelja, kot samice, ki sesajo kri, so absorbirale bistveno več saharoze kot katero koli drugo prehrano ali vodo (F(5,426) = 20,15, p < 0,0001 in F(5,299) = 56,00, p < 0,0001; slika 1B,C). Poleg tega so samice, ki iščejo gostitelja, po 72 urah zaužile manj urina v primerjavi z urinom po 168 urah (slika 1B). Ko so jim ponudili prehrano, ki je vsebovala sečnino, so samice, ki iščejo gostitelja, absorbirale bistveno večjo količino sečnine pri 2,69 mM v primerjavi z vsemi drugimi koncentracijami in vodo, medtem ko je bila nerazločljiva od 10 % saharoze (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; slika 1D). To je bilo v nasprotju z odzivom samic, ki so se hranile s krvjo in so običajno absorbirale bistveno več diete, ki vsebuje sečnino, kot vode, čeprav bistveno manj kot 10 % saharoze (F(10,557) = 78,35, p < 0,0001; slika 1).1E). Poleg tega so pri primerjavi obeh fizioloških stanj samice s flebotomijo absorbirale več sečnine kot samice, ki iščejo gostitelja, pri najnižjih koncentracijah, te samice pa so absorbirale podobne količine sečnine pri višjih koncentracijah (F(1,953) = 78,82, p < 0,0001; slika 1F, G). Medtem ko se je zdelo, da ima vnos iz diete, ki vsebuje sečnino, optimalne vrednosti (slika 1D, E), so samice v obeh fizioloških stanjih lahko modulirale količino absorbirane sečnine v celotnem območju koncentracij sečnine na logaritemsko linearen način (slika 1F, G). ). Podobno se zdi, da komarji nadzorujejo privzem dušika z uravnavanjem količine absorbiranega urina, saj se količina dušika v urinu odraža v absorbirani količini (vstavki na sliki 1B, C in B).
Za oceno učinkov urina in sečnine na preživetje komarjev, ki iščejo gostitelja, in krvosesnih komarjev, so samice hranili z urinom vseh štirih starosti (svež, 24 ur, 72 ur in 168 ur po odlaganju), razpon koncentracij sečnine, pa tudi destilirana voda in 10 % saharoza pa so služili kot kontrola (slika 2A). Ta analiza preživetja je pokazala, da je imela prehrana pomemben vpliv na skupno preživetje pri samicah, ki iščejo gostitelja (urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; sečnina: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; slika 2B, C), in samicah, ki so se hranile s krvjo (urin: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; sečnina: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001;). Slika 2D, E). V vseh poskusih so imele samice, hranjene z urinom, sečnino in vodo, bistveno nižje stopnje preživetja v primerjavi s samicami, hranjenimi s saharozo (slika 2B-E). Samice, ki iščejo gostitelja in so se hranile s svežim in starnim urinom, so pokazale različne stopnje preživetja, pri čemer so imele tiste, ki so se hranile s 72-urnim starnim urinom (p = 0,016), najnižjo verjetnost preživetja (slika 2B). Poleg tega so samice, ki iščejo gostitelja in so se hranile s 135 mM sečnino, preživele dlje kot kontrolne skupine z vodo (p < 0,04) (slika 2C). V primerjavi z vodo so samice, hranjene s svežim urinom in 24-urnim urinom, preživele dlje (p = 0,001 oziroma p = 0,012; slika 2D), medtem ko so ženske, hranjene s 72-urnim urinom, preživele dlje kot tiste, ki so se hranile s kratkim svežim urinom in 24-urnim starnim urinom (p < 0,0001 oziroma p = 0,013; slika 2D). Pri hranjenju s 135 mM sečnino, Samice, ki so se hranile s krvjo, so preživele dlje kot vse druge koncentracije sečnine in vode (p < 0,013; slika 2E).
Preživetje gostitelja in krvosesnih samic Anopheles arabinis, ki so se hranile s kravjim urinom in sečnino. V biološkem testu (A) so samice komarjev prejele prehrano, ki je bila sestavljena iz svežega in staranega kravjega urina, različnih koncentracij sečnine, saharoze (10 %) in destilirane vode (H2O). Preživetje komarjev, ki iščejo gostitelja (B, C), in krvosesnih komarjev (D, E), so beležili vsakih 12 ur, dokler niso poginile vse samice, ki so se hranile z urinom (B, D) in sečnino (C, E), ter kontrolne samice, ki so se hranile s saharozo in vodo.
Skupna razdalja in število krogov, določenih v testu letenja v 24-urnem obdobju, sta se razlikovala med komarji, ki iščejo gostitelja, in komarji, ki sesajo kri, ki so pokazali manjšo aktivnost leta (slika 3). Komarji, ki iščejo gostitelja in so zagotavljali svež in staran urin ali saharozo in vodo, so pokazali različne vzorce leta (slika 3), pri čemer so bile samice, ki so se hranile s svežim urinom, bolj aktivne ob zori, medtem ko so se tiste, ki so se hranile s 24 in 168 ur starim urinom, hranile z urinom, medtem ko so bile samice, ki so se hranile z urinom, bolj aktivne v celotnem 24-urnem obdobju, medtem ko so bile samice, ki so se hranile z vodo, bolj aktivne v srednjem obdobju. Komarji, ki so se hranili s saharozo, so pokazali najvišjo raven aktivnosti pozno ponoči in zgodaj zjutraj, medtem ko so tisti, ki so zaužili 72 ur staran urin, v 24 urah doživeli stalen upad aktivnosti (slika 3).
Letalska zmogljivost krvosesnih samic vrste Anopheles arabinis, ki iščejo lovce in se hranijo s kravjim urinom in sečnino. V testu letenja so bile samice komarjev, ki so se hranile s svežim in staranim kravjim urinom, različnimi koncentracijami sečnine, saharoze (10 %) in destilirane vode (H2O), privezane na vodoravne, prosto vrteče se roke (zgoraj). Pri samicah, ki iščejo gostitelja (levo), in krvosesnih samicah (desno), sta bila zabeležena skupna razdalja in število letov na uro za vsako prehrano v 24-urnem obdobju (temno: sivo; svetlo: belo). Povprečna razdalja in povprečno število poletov sta prikazana desno od grafa cirkadiane aktivnosti. Stolpci napak predstavljajo standardno napako povprečja. Statistična analiza glej besedilo.
Na splošno je skupna aktivnost leta samic, ki iščejo gostitelja, sledila vzorcu, podobnemu razdalji leta v 24-urnem obdobju. Na povprečno razdaljo leta je pomembno vplivala zaužita prehrana (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), samice, ki iščejo gostitelja in so zaužile 72 ur urina, pa so preletele bistveno daljše razdalje v primerjavi z vsemi drugimi dietami (p < 0,0001), komarji, ki so se hranili s saharozo, pa so leteli dlje kot komarji, ki so se hranili s svežim (p = 0,022) in 24 ur starim urinom (p = 0,022). V nasprotju z vzorcem aktivnosti leta, ki ga opisuje prehrana z urinom, so samice, ki iščejo gostitelja in so se hranile s sečnino, pokazale vztrajno aktivnost leta v 24-urnem obdobju, ki je dosegla vrhunec v drugi polovici temne faze (slika 3). Čeprav so bili vzorci aktivnosti podobni, so samice, ki iščejo gostitelja in so se hranile s sečnino, znatno povečale povprečno razdaljo leta, odvisno od absorbirane koncentracije (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Samice, ki so iskale gostitelja in so bile hranjene s katero koli koncentracijo sečnine, so letele dlje kot samice, ki so bile hranjene bodisi z vodo bodisi s saharozo (p < 0,03).
Skupna aktivnost letenja krvosesnih komarjev je bila stabilna in se je ohranila 24 ur pri vseh dietah, s povečano aktivnostjo urina v drugi polovici temnega obdobja pri samicah, hranjenih z vodo, kot tudi pri samicah, hranjenih s svežo in 24 ur staro hrano (slika 3). Medtem ko je dieta z urinom pomembno vplivala na povprečno razdaljo leta pri samicah, hranjenih s krvjo (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), dieta z ureo ni (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) pri drugem urinu in kontrolni dieti (svež, p = 0,0091; 72 ur, p = 0,0022; 168 ur, p = 0,001; saharoza, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Vplivi hranjenja z urinom in sečnino na reproduktivne parametre so bili ocenjeni v bioloških testih odlaganja jajčec (slika 4A) in raziskani glede na število jajčec, ki jih je posamezna samica odložila, velikost jajčec in novo izvaljene ličinke prvega stadija. Število odloženih jajčec. Arabske samice, hranjene z urinom, so se razlikovale glede na prehrano (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; slika 4B). Samice, hranjene z 24-urnim urinom in krvno moko, so odložile bistveno več jajčec kot samice, hranjene z drugimi vrstami urina, in so bile podobne tistim, ki so se hranile s saharozo (slika 4B). Podobno se je velikost jajčec, ki so jih odložile samice, hranjene z urinom, razlikovala glede na prehrano (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001), pri čemer so samice, hranjene z 24-urnim urinom in saharozo, odložile bistveno večja jajčeca kot samice, hranjene z vodo, medtem ko so bila jajčeca samic, hranjenih s 168 urami urina, bistveno manjša (slika 4C). Poleg tega je prehrana z urinom pomembno vplivala na velikost ličink (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), pri čemer so iz jajčec, ki so jih odložile 24 in 72 ur stare samice, hranjene z urinom, izlegle bistveno večje ličinke kot iz jajčec, ki so jih odložile ličinke. Samice, hranjene z vodo in 168 ur z urinom (slika 4D).
Reproduktivna zmogljivost samic vrste Anopheles arabinis, ki so se hranile s kravjim urinom in sečnino. Samice komarjev, ki so se hranile s krvjo, so 48 ur pred biološkimi testi in pridobitvijo substratov za odlaganje jajčec (A) hranile s prehrano, ki je vsebovala svež in staran kravji urin, različne koncentracije sečnine, saharozo (10 %) in destilirano vodo (H2O). Na število jajčec (B, E), velikost jajčec (C, F) in velikost ličink (D, G) je pomembno vplivala zagotovljena prehrana (kravji urin: BD; sečnina: EG). Povprečja za vsak parameter, izmerjena z različnimi črkovnimi imeni, so se med seboj bistveno razlikovala (enosmerna ANOVA z uporabo Tukeyjeve post hoc analize; p < 0,05). Stolpci napak predstavljajo standardno napako povprečja.
Kot glavna dušikova sestavina urina je sečnina, ko so jo samice, hranjene s krvjo, prejemale kot hrano, v vseh študijah pomembno vplivala na reproduktivne parametre. Število jajčec, ki so jih samice, hranjene s sečnino, izlegle po obroku s krvjo, je bilo odvisno od koncentracije sečnine (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), samice, hranjene s koncentracijami sečnine med 134 µM in 1,34 mM, so izlegle več jajčec (slika 4E). Samice, hranjene s koncentracijami sečnine 134 µM ali več, so izlegle večja jajčeca kot samice, hranjene z vodo (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; slika 4F), velikost ličink pa je bila bolj spremenljiva, čeprav so nanjo vplivale podobne koncentracije sečnine pri materah (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) (slika 4G).
Splošna privlačnost za hlapne ekstrakte iz govejega urina, ki išče gostitelja. Na vrsto Arabiensis, ocenjeno v olfaktometru s stekleno cevko (slika 5A), je pomembno vplivala starost urina (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; slika 5B). Post hoc analiza je pokazala, da je vonj po zatohlem urinu pri 24 urah povzročil bistveno višjo stopnjo privlačnosti v primerjavi z vsemi drugimi tretmaji (72 ur: p = 0,0060, 168 ur: p = 0,012, pentan: p = 0,00070), razen vonja po svežem urinu (p = 0,13; slika 5B). Čeprav se splošna privlačnost krvosesnih komarjev za vonj urina ni bistveno razlikovala (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; slika 5C), so bile te samice bistveno bolj privlačne za hlapne ekstrakte iz 72 ur staranega urina v primerjavi s kontrolno skupino (p = 0,0066; slika 5C).
Vedenjski odzivi na vonjave naravnega in sintetičnega kravjega urina pri iskanju gostitelja in krvosesajočih komarjev Anopheles arabianus. Shema steklene cevke olfaktometra (A). Privlačnost hlapnih ekstraktov v prostoru nad tekočino iz svežega in staranega kravjega urina na gostitelja (B) in krvosesajoče komarje (C). Poiščite reakcijo lovk Lorda An. Prikazani so ekstrakti v prostoru nad tekočino, izolirani iz svežega (D), 24-urnega (E), 72-urnega (F) in 168-urnega (G) staranega kravjega urina. Sledi detekcije elektronske antene (EAD) kažejo spremembe napetosti kot odziv na bioaktivne spojine v prostoru nad tekočino, eluirane iz plinskega kromatografa in zaznane s plamensko-ionizacijskim detektorjem (FID). Merilna lestvica predstavlja amplitudo odziva (mV) glede na retencijski čas (s). Prikazane so lastnosti in hitrosti sproščanja (µg h-1) biološko aktivnih spojin. Ena zvezdica (*) označuje dosleden odziv z nizko amplitudo. Dvojne zvezdice (**) označujejo nereproducibilne odzive. Poiščite gostitelja (H) in krvosesajoče komarje. (I) An.arabiensis ima različno privlačnost za sintetične mešanice vonjav svežega in staranega kravjega urina. Povprečni deleži komarjev, ki jih privlačijo različna imena črk, so se med seboj bistveno razlikovali (enosmerna ANOVA z uporabo Tukeyjeve post hoc analize; p < 0,05). Stolpci napak predstavljajo standardno napako lestvice.
Samica Ann.arabiensis, 72 ur in 120 ur po krvavitvi, med drstenjem, ni pokazala prednosti za hlapne ekstrakte iz svežega in staranega kravjega urina v primerjavi s kontrolno skupino s pentanom (χ2 = 3,07, p > 0,05; Dodatna datoteka 1: Slika S1).
Pri samicah vrste Ann.arabiensis so analize GC-EAD in GC-MS identificirale osem, šest, tri in tri bioaktivne spojine (slika 5D-G). Čeprav so bile opažene razlike v številu spojin, ki so sprožile elektrofiziološke odzive, je bila večina teh spojin prisotna v vsakem hlapnem ekstraktu v zgornjem prostoru, zbranem iz svežega in staranega urina. Zato so bile v nadaljnje analize za vsak ekstrakt vključene le spojine, ki so sprožile fiziološki odziv ženskih anten nad pragom.
Skupna hitrost sproščanja hlapnih bioaktivnih spojin v zbirki v zgornjem prostoru se je povečala z 29 µg h-1 v svežem urinu na 242 µg h-1 v 168 ur starem urinu, predvsem zaradi p-krezola in m-formaldehida. Poveča se tudi količina fenola in fenola. Nasprotno pa se je hitrost sproščanja drugih spojin, kot sta 2-cikloheksen-1-on in dekanal, zmanjševala z naraščajočo starostjo urina, kar je bilo povezano z opaženim zmanjšanjem intenzivnosti (številčnosti) signala v kromatogramu (slika 5D)-G leva plošča) in fiziološkimi odzivi na te spojine (slika 5D-G desna plošča).
Na splošno je imela sintetična mešanica podobno naravno razmerje bioaktivnih spojin, kot so bile ugotovljene v hlapnih ekstraktih svežega in staranega urina v zgornjem prostoru (slika 5D–G), in se ni zdela bistveno privlačna pri iskanju gostitelja (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; slika 5H) ali komarjev, ki sesajo kri (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; slika 5I). Vendar pa so post hoc parne primerjave med tretiranji pokazale, da so bili komarji, ki iščejo gostitelja, bistveno privlačnejši za sintetično mešanico 24 ur staranega urina v primerjavi s kontrolami s pentanom (p = 0,0086; slika 5H).
Za oceno vloge posameznih komponent v sintetičnih mešanicah 24 ur staranega urina je bilo v testu z Y-cevko ocenjenih šest subtraktivnih mešanic v primerjavi s popolnimi mešanicami, pri čemer so bile posamezne spojine odstranjene. Pri komarjih, ki iščejo gostitelja, je imelo odštevanje posameznih spojin od celotne mešanice pomemben vpliv na vedenjske odzive (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Dodatna datoteka 1: Slika S2A), vse subtraktivne mešanice pa so bile manjše od popolnoma zmešanih. Nasprotno pa odstranitev posameznih spojin iz popolnoma sintetične mešanice ni vplivala na vedenjske odzive krvosesnih komarjev (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), z izjemo dekanala, ki je povzročil nižje ravni privlačnosti v primerjavi s celotno mešanico (p = 0,022; Dodatna datoteka 1: Slika S2B).
V vasi v Etiopiji, kjer je bila malarija endemična, so deset noči ocenjevali učinkovitost sintetične mešanice 24-urnega kravjega urina pri privabljanju komarjev v terenskih pogojih (slika 6A). Skupno je bilo ujetih in identificiranih 4861 komarjev, od tega 45,7 % Anthropus.gambiae sl, 18,9 % Anopheles pharoensis in 35,4 % Culex spp. (Dodatna datoteka 1: Tabela S1). Anopheles arabinis je edini član vrstnega kompleksa An.Gambian, identificiran z analizo PCR. V povprečju je bilo ujetih 320 komarjev na noč, v tem času pa so pasti s sintetičnimi mešanicami vab ujele več komarjev kot parne pasti brez mešanice (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Pasti brez vab so bile postavljene vsako od petih kontrolnih noči na začetku, sredini in koncu poskusa. V vsakem paru pasti je bilo ujetih podobno število komarjev, kar kaže na brez pristranskosti med hišami (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) in brez upada populacije v obdobju študije. V primerjavi s kontrolnimi pastmi se je število komarjev, ujetih v pasti, ki so vsebovale sintetično mešanico, znatno povečalo: iskanje gostitelja (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nedavno hranjenje s krvjo (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) in brejost (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Dodatna datoteka 1: Tabela S1). To se odraža tudi v skupnem številu ujetih komarjev: iskanje gostitelja > krvosesanje > brejost > delno brejost > samec.
Terenska ocena učinkovitosti 24-urne sintetične mešanice vonja po kravjem urinu. Terenski poskusi so bili izvedeni v južno-osrednji Etiopiji (zemljevid), blizu mesta Maki (vložek), z uporabo svetlobne pasti Centra za nadzor bolezni (CDC) (desno) v parnih hišicah, z latinsko kvadratno zasnovo (zračna slika) (A). Sintetične fotopasti CDC z vonjem privabljajo in ujamejo samice Anopheles arabesques (B), ne pa tudi Anopheles farroes (C), na drugačen način, učinek, odvisen od fiziološkega stanja. Poleg tega so te pasti ujeli znatno povečano število komarjev gostiteljev Culex. (D) V primerjavi s kontrolo. Stolpci na levi predstavljajo povprečni selekcijski indeks komarjev, ujetih v pare pasti z vonjem (zelena) in kontrolne (odprte) pasti (N = 10), medtem ko stolpci na desni predstavljajo povprečni selekcijski indeks v parih kontrolnih pasti (odprte; N = 5). Zvezdice označujejo statistične stopnje pomembnosti (*p = 0,01 in ***p < 0,0001).
Tri vrste so bile v paste, ki so vsebovale sintetične mešanice, ujete različno. Pri iskanju gostitelja (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), hranjenju s krvjo (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) in brejosti (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) je bil .arabiensis ujet v past, ki je sproščala sintetično mešanico (slika 6B), medtem ko se količina An ni razlikovala. Ugotovljeni so bili komarji Pharaoensis v različnih fizioloških stanjih (slika 6C). Pri Culexu je bilo v pasteh z vabami s sintetično mešanico ugotovljeno le znatno povečanje števila komarjev, ki iščejo gostitelje (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; slika 6D) v primerjavi s kontrolnimi pastmi.
Za oceno, ali malarijski komarji uporabljajo vonj kravjega urina kot znak za gostiteljski habitat, so bile uporabljene pasti za gostitelje, ki so bile nameščene zunaj potencialnih gostiteljev med gnezdišči in podeželskimi skupnostmi v Etiopiji. V odsotnosti znakov za gostitelja, vročine in z ali brez prisotnosti vonja kravjega urina niso ujeli nobenega komarja (Dodatna datoteka 1: Slika S3). Vendar pa so bile v prisotnosti visoke temperature in vonja kravjega urina samice malarijskih komarjev privabljene in ujete, čeprav v majhnem številu, neodvisno od starosti urina (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Dodatna datoteka 1: Slika S3). Nasprotno pa kontrolne skupine z vodo niso ujeli malarijskih komarjev pri visokih temperaturah (Dodatna datoteka 1: Slika S3).
Komarji proti malariji pridobivajo in distribuirajo dušikove spojine s kompenzacijskim hranjenjem s kravjim urinom (tj. lužami), da izboljšajo značilnosti življenjskega cikla, podobno kot druge žuželke [2, 4, 24, 25, 26]. Kravji urin je lahko dostopen obnovljiv vir, tesno povezan s počivališči prenašalcev malarije, kot so hlevi in ​​visoka vegetacija v bližini podeželskih domov in drstišč. Samice komarjev ta vir najdejo po vonju in so sposobne uravnavati vnos dušikovih spojin v urinu, vključno s sečnino, glavno dušikovo komponento v urinu [15, 16]. Glede na fiziološko stanje samice komarja se hranila v urinu dodelijo za izboljšanje aktivnosti letenja in preživetja samic komarjev, ki iščejo gostitelja, ter za preživetje in reproduktivne značilnosti osebkov, ki se hranijo s krvjo, med prvim gonadotropnim ciklom. Zato ima mešanje urina pomembno prehransko vlogo za prenašalce malarije, ki so zaprti kot podhranjeni odrasli [8], saj omogoča samicam komarjev, da pridobijo pomembne dušikove spojine z uživanjem hrane z nizkim tveganjem. Ta ugotovitev ima pomembne epidemiološke posledice, saj samice podaljšajo svojo življenjsko dobo, aktivnost in reproduktivna produktivnost, kar vse vpliva na kapaciteto vektorjev. Poleg tega bi lahko bilo to vedenje tarča prihodnjih programov za obvladovanje vektorjev.