Barības vielu iegūšana un izplatīšana integrē kukaiņu barošanās un dzīves cikla īpašības. Lai kompensētu noteiktu barības vielu trūkumu dažādos dzīves posmos, kukaiņi var iegūt šīs barības vielas, izmantojot papildu barību, piemēram, barojoties ar mugurkaulnieku sekrētiem procesā, kas pazīstams kā peļķes. Ods Anopheles arabiani, šķiet, ir nepietiekami barots, un tāpēc tam ir nepieciešamas barības vielas gan metabolismam, gan vairošanai. Šī pētījuma mērķis bija novērtēt, vai An. arabiensis maisīšana ar govs urīnu barības vielu iegūšanai uzlabo dzīves cikla īpašības.
Pārliecinieties, ka tas ir droši. arabiensis pievilināja svaiga, 24 stundas, 72 stundas un 168 stundas veca govs urīna smarža, un saimnieku meklējošās un ar asinīm barotās (48 stundas pēc asins maltītes) mātītes tika mērītas Y-veida olfaktometrā, un grūsnām mātītēm tika veikts nārsta tests. Pēc tam tika izmantota kombinēta ķīmiskā un elektrofizioloģiskā analīze, lai identificētu bioaktīvos savienojumus govs urīnā visās četrās vecuma klasēs. Sintētiskie bioaktīvo savienojumu maisījumi tika novērtēti Y-veida un lauka izmēģinājumos. Lai izpētītu govs urīnu un tā galveno slāpekli saturošo savienojumu urīnvielu kā potenciālu papildu barību malārijas vektoriem, tika mērīti barošanas parametri un dzīves cikla raksturlielumi. Tika novērtēta mātīšu odu proporcija un absorbētā govs urīna un urīnvielas daudzums. Pēc barošanas tika novērtēta mātīšu izdzīvošana, piesieta lidošana un vairošanās.
Meklējiet saimnieka asinis un barības vielas. Laboratorijas un lauka pētījumos arābus piesaistīja svaiga un izturēta govs urīna dabīgā un sintētiskā smarža. Grūsnām mātītēm govs urīna reakcija nārsta vietās bija vienaldzīga. Saimnieku meklējošās un asinis sūcošās mātītes aktīvi absorbē govs urīnu un urīnvielu un sadala šos resursus atbilstoši dzīves cikla kompromisiem kā fizioloģiskā stāvokļa funkciju lidojumam, izdzīvošanai vai vairošanai.
Anopheles arabinis govju urīna iegūšana un izplatīšana dzīves cikla raksturlielumu uzlabošanai. Govju urīna papildbarošana ietekmē vektoru kapacitāti tieši, palielinot ikdienas izdzīvošanas rādītājus un vektoru blīvumu, un netieši, mainot lidošanas aktivitāti, tāpēc tā būtu jāņem vērā turpmākajos modeļos.
Barības vielu iegūšana un sadale integrē kukaiņu barošanās un dzīves cikla raksturlielumus [1,2,3]. Kukaiņi spēj atlasīt un iegūt barību, kā arī veikt kompensējošu barošanos, pamatojoties uz barības pieejamību un barības vielu prasībām [1, 3]. Barības vielu sadalījums ir atkarīgs no dzīves cikla procesa un var izraisīt atšķirīgas prasības attiecībā uz uztura kvalitāti un daudzumu dažādos kukaiņu dzīves posmos [1, 2]. Lai kompensētu noteiktu barības vielu trūkumu, kukaiņi var iegūt šīs barības vielas, izmantojot papildu barošanos, piemēram, ar dubļiem, dažādiem mugurkaulnieku ekskrementiem un sekrētiem, kā arī maitu, process, kas pazīstams kā peļķes [2]. Lai gan galvenokārt ir aprakstītas dažādas tauriņu un kožu sugas, dzirdināšanas vietas ir arī citās kukaiņu kārtās, un pievilcība un barošanās ar šāda veida resursiem var būtiski ietekmēt veselību un citas dzīves cikla iezīmes [2, 4, 5, 6],7]. Malārijas ods Anopheles gambiae sensu lato (sl) parādās kā "nepietiekami barots" pieaugušais īpatnis [8], tāpēc laistīšanai var būt svarīga loma tā dzīves cikla raksturlielumos, taču šī uzvedība līdz šim ir atstāta novārtā. Uzmanību pelna uzbudinājuma izmantošana kā līdzeklis barības vielu uzņemšanas palielināšanai šajā svarīgajā transportlīdzeklī, jo tam var būt būtiskas epidemioloģiskas sekas.
Pieaugušu Anopheles odu mātīšu slāpekļa uzņemšana ir ierobežota, jo no kāpuru stadijas tiek pārnestas zemas kaloriju rezerves un neefektīva asins miltu izmantošana [9]. Ann.gambiae sl mātītes to parasti kompensē, papildinot barību ar asins miltiem [10, 11], tādējādi pakļaujot vairāk cilvēku riskam saslimt ar šo slimību un odus lielākam plēsēju riskam. Alternatīvi, odi var izmantot mugurkaulnieku ekskrementu piebarošanu, lai iegūtu slāpekļa savienojumus, kas uzlabo adaptāciju un lidojuma manevrētspēju, kā to pierāda citi kukaiņi [2]. Šajā sakarā interesanta ir spēcīgā un izteiktā vienas no radniecīgajām sugām An ietvaros. Gambijas sl sugu kompleksā Anopheles arabinis svaigs un izturēts govs urīns [12,13,14]. Anopheles arabinis ir oportūnistisks saimnieka preferencēs un ir zināms, ka tas saistās ar liellopiem un barojas ar tiem. Govs urīns ir resurss, kas bagāts ar slāpekļa savienojumiem, un urīnviela veido 50–95% no kopējā slāpekļa svaigā urīnā [15, 16]. Tā kā govs urīns vecumu mikroorganismi izmanto šos resursus, lai 24 stundu laikā samazinātu slāpekļa savienojumu sarežģītību [15]. Strauji pieaugot amonjakam, kas saistīts ar organiskā slāpekļa samazināšanos, zeļ sārmaini mikroorganismi (daudzi no tiem ražo odiem toksiskus savienojumus) [15], kas var būt Ann.arabiensis mātītes, priekšroku dod urīnam, kas novecojis 24 stundas vai mazāk [13, 14].
Šajā pētījumā tika meklēti saimniekorganismu un ar asinīm baroti Ans. Pirmā gonadotropīna cikla laikā arabiensis tika novērtēta slāpekļa savienojumu, tostarp urīnvielas, iegūšana, sajaucot urīnu. Pēc tam tika veikta virkne eksperimentu, lai novērtētu, kā odu mātītes sadala šo potenciālo barības vielu resursu, lai uzlabotu izdzīvošanu, reprodukciju un turpmāku barības meklēšanu. Visbeidzot, tika novērtēta svaiga un izturēta govs urīna smarža, lai noteiktu, vai tās sniedz ticamas norādes par saimniekorganismu un ar asinīm barotu An. Meklējot šo potenciālo barības vielu resursu, arabiensis atklāja ķīmiskas korelācijas, kas ir pamatā novērotajai atšķirīgajai pievilcībai. Gaistošo organisko savienojumu (GOS) sintētiskie smaržu maisījumi, kas identificēti 24 stundas izturētā urīnā, tika tālāk novērtēti lauka apstākļos, paplašinot laboratorijas apstākļos iegūtos rezultātus un demonstrējot govs urīna smakas ietekmi uz dažādiem fizioloģiskajiem stāvokļiem. Odu pievilcība. Iegūtie rezultāti apstiprina, ka An. arabiensis iegūst un izplata mugurkaulnieku urīnā atrodamos slāpekļa savienojumus, lai ietekmētu dzīves cikla raksturlielumus. Šie rezultāti tiek apspriesti potenciālo epidemioloģisko seku kontekstā un to, kā tos var izmantot vektoru uzraudzībai un kontrolei.
Anopheles arabicans (Dongola celms) tika turēti 25 ± 2 °C temperatūrā, 65 ± 5 % relatīvajā mitrumā un 12:12 h gaismas un tumsas ciklā. Kāpuri tika audzēti plastmasas paplātēs (20 cm × 18 cm × 7 cm), kas piepildītas ar destilētu ūdeni, un baroti ar Tetramin® zivju barību (Tetra Werke, Melle, Vācija). Kāpuri tika savākti 30 ml krūzītēs (Nolato Hertila, Åstorp, SE) un pēc tam pārvietoti uz Bugdorm sprostiem (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, Taivāna), lai nodrošinātu pieaugušo īpatņu izšķilšanos. Pieaugušajiem īpatņiem tika nodrošināts 10 % saharozes šķīdums ad libitum līdz 4 dienām pēc izšķilšanās (dpe), un pēc tam saimniekus meklējošām mātītēm tieši pirms eksperimenta tika piedāvāta barība vai arī tās tika badinātas uz nakti ar destilētu ūdeni pirms eksperimenta, kā aprakstīts tālāk. Mātītes, kas tika izmantotas lidojuma caurules eksperimentos, tika badinātas tikai 4–6 stundas ar ūdens ad libitum. Lai sagatavotu asinis sūkājošus odus turpmākajām biotestēšanas metodēm, 4 dpe mātītēm tika nodrošinātas defibrotiskas aitu asinis (Håtunalab, Bro, SE), izmantojot membrānas barošanas sistēmu (Hemotek Discovery Workshops, Akringtona, Apvienotā Karaliste). Pilnībā piesātinātas mātītes pēc tam tika pārvietotas uz atsevišķiem būriem un 3 dienas pirms tālāk aprakstītajiem eksperimentiem tām tika nodrošināta tieša barība, kā aprakstīts tālāk, vai 10% saharozes ad libitum. Pēdējās mātītes tika izmantotas lidojumu caurules biotestēšanas metodēm un pārvietotas uz laboratoriju, un pēc tam 4–6 stundas pirms eksperimenta tām tika dots destilēts ūdens ad libitum.
Barošanās testi tika izmantoti, lai kvantitatīvi noteiktu urīna un urīnvielas patēriņu pieaugušām An.Arab mātītēm. Saimnieku meklējošām un ar asinīm barotām mātītēm 48 stundas tika nodrošināta diēta, kas saturēja 1% atšķaidīta svaiga un izturēta govs urīna, dažādas urīnvielas koncentrācijas un divas kontroles grupas (10% saharozes un ūdens). Turklāt diētai tika pievienota pārtikas krāsviela (1 mg ml-1 ksilēncianīds FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stokholma, SE), kas tika piegādāta 4 × 4 matricā 250 µl mikrocentrifūgas mēģenēs (Axygen Scientific, Union City, CA, ASV; 1.A attēls). Piepildiet līdz malai (~300 µl). Lai izvairītos no konkurences starp odiem un iespējamās krāsvielas krāsas ietekmes, ievietojiet 10 odus lielā Petri trauciņā (12 cm diametrā un 6 cm augstumā; Semadeni, Ostermundigen, CH; 1.A attēls) pilnīgā tumsā 25 ± 2 cm °C temperatūrā un 65 ± 5% relatīvajā mitrumā. Šie eksperimenti tika atkārtoti 5 līdz 10 reizes. Pēc uztura iedarbības odi tika ievietoti -20 °C temperatūrā līdz turpmākai analīzei.
Meklējiet liellopu urīnu un urīnvielu, ko absorbē saimniekorganisms un asinssūcējas Anopheles arabianus mātītes. Barošanas pētījumā (A) odu mātītēm tika nodrošināta diēta, kas sastāvēja no svaiga un izturēta govs urīna, dažādām urīnvielas koncentrācijām, saharozes (10%) un destilēta ūdens (H2O). Saimnieku meklējošās (B) un ar asinīm barotās (C) mātītes absorbēja vairāk saharozes nekā jebkura cita testētā diēta. Ņemiet vērā, ka saimniekorganismu meklējošās mātītes absorbēja 72 stundu govs urīnu mazāk nekā 168 stundu govs urīnu (B). Urīna vidējais kopējais slāpekļa saturs (± standartnovirze) ir attēlots ieliktnī. Saimnieku meklējošās (D, F) un asinssūcējas (E, G) mātītes uzņem urīnvielu no devas atkarīgā veidā. Vidējie ieelpotie tilpumi (D, E) ar dažādiem burtu nosaukumiem bija būtiski atšķirīgi viens no otra (vienvirziena ANOVA, izmantojot Tukey post hoc analīzi; p < 0,05). Kļūdu joslas apzīmē vidējās vērtības standartkļūdu (BE). Taisnā pārtrauktā līnija apzīmē log-lineāro regresijas līniju (F, G).
Lai atbrīvotu absorbēto barību, odi atsevišķi tika ievietoti 1,5 ml mikrocentrifūgas mēģenēs, kas saturēja 230 µl destilēta ūdens, un audi tika sadalīti, izmantojot vienreiz lietojamo piestu un bezvadu motoru (VWR International, Lund, SE), kam sekoja centrifugēšana ar ātrumu 10 krpm 10 minūtes. Supernatants (200 µl) tika pārnests uz 96 iedobju mikroplašu (Sigma-Aldrich), un absorbcija (λ620) tika noteikta, izmantojot spektrofotometra mikroplašu lasītāju (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm). Alternatīvi, odi tika samalti 1 ml destilēta ūdens, no kura 900 µl tika pārnesti uz kiveti spektrofotometriskai analīzei (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Lai kvantitatīvi noteiktu uztura uzņemšanu, standarta līkne tika sagatavota, veicot sērijveida atšķaidīšanu, lai iegūtu 0,2 µl līdz 2,4 µl 1 mg ml-1 ksilola cianīda. Pēc tam zināmās krāsvielas optiskais blīvums koncentrācijas tika izmantotas, lai noteiktu katra odiņa uzņemtās barības daudzumu.
Tilpuma dati tika analizēti, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Tukey post hoc pāru salīdzinājumi (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, ASV, 1989–2007). Lineārās regresijas analīzes aprakstīja no koncentrācijas atkarīgu urīnvielas uzņemšanu un salīdzināja reakcijas starp saimnieku meklējošiem un asinīm sūcošiem odiem (GraphPad Prism v8.0.0 Mac datoriem, GraphPad Software, San Diego, CA, ASV).
Aptuveni 20 µl urīna paraugu no katras vecuma grupas tika piesaistīti Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) un iekapsulēti alvas kapsulās (8 mm × 5 mm). Kapsulas tika ievietotas CHNS/O analizatora (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) sadegšanas kamerā, lai noteiktu slāpekļa saturu svaigā un izturētā urīnā saskaņā ar ražotāja protokolu. Kopējais slāpeklis (g N l-1) tika kvantitatīvi noteikts, pamatojoties uz zināmām urīnvielas koncentrācijām, ko izmantoja kā standartu.
Lai novērtētu uztura ietekmi uz saimniekus meklējošo un asinssūcēju mātīšu izdzīvošanu, odi tika individuāli ievietoti lielos Petri trauciņos (12 cm diametrā un 6 cm augstumā; Semadeni) ar ar sietu pārklātu caurumu vākā (3 cm diametrā) ventilācijai un barības piegādei. Barība tika nodrošināta tieši pēc 4 dienām un ietvēra 1% atšķaidītu svaigu un izturētu govs urīnu, četras urīnvielas koncentrācijas un divas kontroles, 10% saharozi un ūdeni. Katra barība tika uzpipetēta uz zobu tampona (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE), kas ievietots 5 ml šļircē (Thermo Fisher Scientific, Gēteborga, SE), noņemts virzulis un novietots uz Petri trauciņa (1. attēls). 1.A). Mainiet savu uzturu katru dienu. Uzturējiet laboratoriju, kā aprakstīts iepriekš. Izdzīvojušie odi tika skaitīti divas reizes dienā, bet mirušie odi tika izmesti, līdz pēdējais ods nomira (n = 40 katrā apstrādes reizē). Ar dažādām diētām barotu odu izdzīvošana tika statistiski analizēta, izmantojot Kaplana-Meijera izdzīvošanas līknes un log-rank testus, lai salīdzinātu izdzīvošanas sadalījumu. diētu salīdzinājumi (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Pēc Attisano et al. [17] projekta izgatavotas pielāgotas odu lidojošās dzirnavas, kas izgatavotas no 5 mm bieziem caurspīdīgiem akrila paneļiem (10 cm platas x 10 cm garas x 10 cm augstas) bez priekšējiem un aizmugurējiem paneļiem (3. attēls: augšpusē). Šarnīra mezgls ar vertikālu cauruli, kas izgatavota no gāzu hromatogrāfijas kolonnas (0,25 mm iekšējais diametrs; 7,5 cm garums), kuras gali ir pielīmēti pie kukaiņu adatas, kas ir piekārta starp neodīma magnētiem 9 cm attālumā viens no otra. Horizontāla caurule, kas izgatavota no tā paša materiāla (6,5 cm garums), sadalīja vertikālo cauruli divās daļās, veidojot piesietu roku un roku, kas nesa nelielu alumīnija folijas gabalu kā gaismu pārtraucošu signālu.
24 stundas badā turētām mātītēm 30 minūtes pirms noturēšanas tika dota iepriekšminētā diēta. Pilnībā pabarotām odu mātītēm pēc tam individuāli 2–3 minūtes tika dota anestēzija uz ledus un piestiprinātas pie kukaiņu adatām ar bišu vasku (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) un pēc tam piesietas pie horizontālo cauruļu stieņiem. Lidojošās dzirnavas. Apgriezienus lidojuma laikā reģistrēja speciāli izgatavots datu reģistrētājs, pēc tam saglabāja un attēloja, izmantojot PC-Lab 2000™ programmatūru (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Lidojošās dzirnavas tika novietotas klimatiski regulētā telpā (12 h:12 h, gaisma: tumsa, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relatīvais mitrums).
Lai vizualizētu lidojuma aktivitātes modeli, 24 stundu periodā tika aprēķināts kopējais nolidotais attālums (m) un kopējais secīgo lidojumu aktivitāšu skaits stundā. Turklāt atsevišķu mātīšu vidējie nolidotie attālumi tika salīdzināti dažādās apstrādes grupās un analizēti, izmantojot vienvirziena ANOVA un Tukey post hoc analīzi (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), kur vidējais attālums tika uzskatīts par atkarīgu mainīgo, bet apstrāde - par neatkarīgu faktoru. Turklāt vidējais lidojuma reižu skaits tiek aprēķināts ar 10 minūšu soli.
Lai novērtētu uztura ietekmi uz An.arabiensis reproduktīvo sniegumu, sešas mātītes (4 dpe) pēc asins savākšanas tika pārvietotas tieši uz Bugdorm sprostiem (30 cm × 30 cm × 30 cm) un pēc tam 48 stundas nodrošināja eksperimentālo barību, kā aprakstīts iepriekš. Pēc tam barības tika noņemtas, un trešajā dienā uz 48 stundām tika nodrošinātas nārsta bļodiņas (30 ml; Nolato Hertila), kas piepildītas ar 20 ml destilēta ūdens, mainot tās ik pēc 24 stundām. Katru barošanas režīmu atkārtoja 20–50 reizes. Ikri tika skaitīti un reģistrēti katrā eksperimentālajā sprostā. Ikru apakšparaugi tika izmantoti, lai novērtētu atsevišķu ikru vidējo izmēru un garuma variāciju (n ≥ 200 uz barību), izmantojot Dialux-20 mikroskopu (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, Vācija), kas aprīkots ar Leica kameru (DFC) 320 R2; Atlikušās olas 24 stundas tika turētas klimatkontrolētā telpā standarta audzēšanas apstākļos, un nesen izšķīlušos 1. stadijas kāpuru apakšparaugs (n ≥ 200 uz katru barību) tika mērīts, kā aprakstīts iepriekš. Olu skaits un olu un kāpuru lielums tika salīdzināts starp apstrādes grupām, izmantojot vienvirziena ANOVA un Tukey post hoc analīzi (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
No zebu liellopu un arsi šķirnes liellopu urīna paraugiem tika savākti svaiga (1 stundu pēc parauga ņemšanas), 24 stundas, 72 stundas un 168 stundas izturēta urīna gaistošo vielu paraugi galvas telpā. Ērtības labad urīna paraugi tika savākti agri no rīta, kamēr govis vēl atradās kūtī. Urīna paraugi tika savākti no 10 īpatņiem, un 100–200 ml katra parauga tika pārnesti atsevišķos poliamīda cepšanas maisiņos (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Mindena, Vācija) 3 litru poliamīda ar vāku vinilhlorīda plastmasas mucās. Katra liellopu urīna parauga galvas telpas gaistošie vielu paraugi tika savākti vai nu tieši (svaigi), vai pēc nogatavināšanas istabas temperatūrā 24 stundas, 72 stundas un 168 stundas, t.i., katrs urīna paraugs bija reprezentatīvs katrai vecuma grupai.
Gaistošo vielu savākšanai galvas telpā tika izmantota slēgtas cilpas sistēma, lai cirkulētu aktivētās ogles filtrētu gāzes plūsmu (100 ml min-1) caur poliamīda maisiņu uz adsorbcijas kolonnu 2,5 stundas, izmantojot diafragmas vakuuma sūkni (KNF Neuberger, Freiburg, Vācija). Kā kontrolei galvas telpas savākšana tika veikta no tukša poliamīda maisiņa. Adsorbcijas kolonna bija izgatavota no teflona caurulēm (5,5 cm x 3 mm iekšējais diametrs), kas saturēja 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, ASV) starp stikla vates aizbāžņiem. Pirms lietošanas kolonna tika izskalota ar 1 ml atkārtoti destilēta n-heksāna (Merck, Darmstadt, Vācija) un 1 ml pentāna (99,0% tīra šķīdinātāja GC pakāpe, Sigma Aldrich). Adsorbētās gaistošās vielas tika eluētas ar 400 μl pentāna. Galvas telpas kolekcijas tika apvienotas un pēc tam uzglabātas -20°C temperatūrā līdz turpmākai analīzei.
Saimnieku meklējošo un asinsēdāju An uzvedības reakcijas. No svaiga, 24 stundas, 72 stundas un 168 stundas izturēta urīna savāktie gaistošie ekstrakti no Arabidopsis odiem tika analizēti, izmantojot taisnas stikla caurules olfaktometru [18]. Eksperimenti tika veikti ZT 13-15 laikā, kas ir An mājas meklēšanas aktivitātes maksimuma periods. Arab [19]. Stikla caurules olfaktometrs (80 cm × 9,5 cm iekšējais diametrs) tika apgaismots ar 3 ± 1 lx sarkanu gaismu no augšas. Ar ogli filtrēta un mitrināta gaisa plūsma (25 ± 2 °C, 65 ± 2% relatīvais mitrums) izturēja biotestu ar ātrumu 30 cm s-1. Gaiss tiek izvadīts caur virkni nerūsējošā tērauda sietu, radot lamināru plūsmu un vienmērīgu strūklas struktūru. Zobu tamponu dozators (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), kas piekārts pie 5 cm spirāles olfaktometra vēja galā, ar stimulatoru. mainās ik pēc 5 minūtēm. Analīzei kā stimuls tika izmantoti 10 μl katra galvas telpas ekstrakta, atšķaidīti 1:10. Kā kontrole tika izmantots vienāds pentāna daudzums. Atsevišķi saimniekus meklējoši vai asinis sūcoši odi tika ievietoti individuālos atbrīvošanas būros 2-3 stundas pirms eksperimenta sākuma. Atbrīvošanas būris tika novietots olfaktometra vēja pusē, un odiem ļāva aklimatizēties 1 minūti, un pēc tam tika atvērts būra droseļvārsts, lai atbrīvotu. Pievilcība apstrādei vai kontrolei tika analizēta kā odu īpatsvars, kas nonāca saskarē ar avotu 5 minūšu laikā pēc atbrīvošanas. Katrs galvas telpas gaistošais ekstrakts un kontrole tika atkārtoti vismaz 30 reizes, un, lai izvairītos no jebkuras vienas dienas ietekmes, katrā eksperimenta dienā tika pārbaudīts vienāds apstrādes un kontroles grupu skaits. Meklēšanas reakcijas no saimnieka un ar asinīm barotiem Ans.Arabic un galvas telpas kopām tika analizētas, izmantojot nominālo loģistisko regresiju, kam sekoja pāru salīdzinājumi nepāra attiecībām (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
An nārsta reakcija. Svaiga un izturēta govju urīna galvas telpas ekstrakti tika analizēti Bugdorm sprostos (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science). Nārsta substrātu nodrošināja plastmasas krūzītes (30 ml; Nolato Hertila), kas piepildītas ar 20 ml destilēta ūdens, un tās tika novietotas sprosta pretējos stūros 24 cm attālumā vienu no otras. Apstrādes krūzītēs tika pievienoti 10 μl katra galvas telpas ekstrakta atšķaidījumā 1:10. Kontroles krūzītes regulēšanai tika izmantots vienāds pentāna daudzums. Apstrādes un kontroles krūzītes tika apmainītas starp katru eksperimentu, lai kontrolētu pozīcijas ietekmi. Desmit ar asinīm barotas mātītes tika izlaistas eksperimentālajos sprostos ZT 9-11, un olas krūzītēs tika saskaitītas 24 stundas vēlāk. Nārsta indeksa aprēķināšanas formula ir: (apstrādes krūzītē izdēto olu skaits - kontroles krūzītē izdēto olu skaits)/(kopējais izdēto olu skaits). Katra apstrāde tika atkārtota 8 reizes.
Mātīšu An.arabiensis gāzu hromatogrāfijas un elektronu antenu rakstu detektēšanas (GC-EAD) analīze tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [20]. Īsumā, svaigi gaistošie ekstrakti galvas telpā tika atdalīti, izmantojot Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, ASV), kas aprīkota ar HP-5 kolonnu (30 m × 0,25 mm iekšējais diametrs, 0,25 μm plēves biezums, Agilent Technologies). un novecojošu urīnu. Kā kustīgā fāze tika izmantots ūdeņradis ar vidējo lineāro plūsmas ātrumu 45 cm s-1. Katrs paraugs (2 μl) tika injicēts 30 sekundes bezdalīšanas režīmā ar ieplūdes temperatūru 225 °C. GC krāsns temperatūra tika ieprogrammēta no 35 °C (3 minūšu noturēšana) līdz 300 °C (10 minūšu noturēšana) pie 10 °C min-1. GC notekūdeņu sadalītājā tika pievienots 4 psi slāpeklis un sadalīts 1:1 Gerstel 3D/2 zema mirušā tilpuma krusteniskajā ierīcē (Gerstel, Mīlheima, Vācija) starp liesmas jonizācijas detektoru un EAD. GC notekūdeņu kapilārs EAD tika novadīts caur Gerstel ODP-2 pārvades līniju, kas izseko GC krāsns temperatūru plus 5 °C, stikla mēģenē (10 cm × 8 mm), kur tas tika sajaukts ar ar ogli filtrētu, mitrinātu gaisu (1,5 l min-1). Antena tika novietota 0,5 cm attālumā no mēģenes izejas. Katrs atsevišķs moskīts tika uzskaitīts vienam atkārtojumam un saimniekus meklējošiem odiem katra vecuma urīna paraugiem tika veikti vismaz trīs atkārtojumi.
Bioaktīvo savienojumu identificēšana svaiga un izturēta liellopu urīna galvas telpas kolekcijās, izmantojot kombinētu GC un masas spektrometru (GC-MS; 6890 GC un 5975 MS; Agilent Technologies), lai izraisītu antenas reakcijas GC-EAD analīzē, darbojoties elektronu trieciena jonizācijas režīmā pie 70 eV. GC bija aprīkots ar HP-5MS UI pārklātu kausēta silīcija kapilāro kolonnu (60 m × 0,25 mm iekšējais diametrs, 0,25 μm plēves biezums), izmantojot hēliju kā mobilo fāzi ar vidējo lineāro plūsmas ātrumu 35 cm s-1. 2 μl paraugs tika injicēts, izmantojot tos pašus inžektora iestatījumus un krāsns temperatūru kā GC-EAD analīzei. Savienojumi tika identificēti, pamatojoties uz to aiztures laiku (Kováta indekss) un masas spektriem, salīdzinot ar pielāgoto bibliotēku un NIST14 bibliotēku (Agilent). Identificētie savienojumi tika apstiprināti, injicējot autentiskus standartus (1. papildu fails: S2 tabula). Kvantitatīvai noteikšanai tika izmantots heptilacetāts (10 ng, 99,8% ķīmiskā tīrība, Aldrich). injicēts kā ārējais standarts.
Sintētiskā smaržu maisījuma, kas sastāv no svaigā un izturētā urīnā identificētiem bioaktīviem savienojumiem, efektivitātes novērtēšana, lai piesaistītu saimniekus meklējošus un asinssūcējus Ans.arabiensis, izmantojot to pašu olfaktometru un protokolu kā iepriekš. Sintētiskie maisījumi atdarināja savienojumu sastāvu un proporcijas svaiga, 24 stundu, 48 stundu, 72 stundu un 168 stundu izturēta urīna jauktos galvas telpas gaistošos ekstraktos (5.D-G attēls; 1. papildu fails: S2 tabula). Analīzei izmanto 10 μl pilnībā sintētiskā maisījuma 1:100 atšķaidījuma ar kopējo izdalīšanās ātrumu no aptuveni 140 līdz 2400 ng h-1, lai novērtētu pievilcību saimniekiem un asinssūcējiem odiem. Pēc tam tests tiek veikts ar pilnīgiem maisījumiem, kuros tiek noņemti pilnīga maisījuma atsevišķu savienojumu subtraktīvie maisījumi. Meklēšanas reakcijas no saimniekiem un ar asinīm barotiem Ans.Arab vs sintētiskie un subtraktīvie maisījumi tika analizēti, izmantojot nominālo loģistisko regresiju, kam sekoja pāru salīdzinājumi nepāra attiecībām (JMP Pro, (14.0.0 versija, SAS institūts Inc.).
Lai novērtētu, vai govs urīns varētu kalpot par saimnieka dzīvotnes norādi malārijas odiem, svaigs un izturēts govs urīns, kas savākts, kā aprakstīts iepriekš, un ūdens tika ievietoti 3 litru spainīšos ar sietu (100 ml) un ievietoti saimnieka ēsmas slazdos. (BG-HDT versija; BioGents, Regensburg, Vācija). Desmit slazdi tika novietoti 50 m attālumā viens no otra ganībās, 400 m attālumā no ciemata kopienas (Silay, Etiopija, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) un bez liellopiem, pastāvīgās vairošanās vietās un ciematos. Pieci slazdi tika apsildīti, lai simulētu saimnieka klātbūtni, savukārt pieci slazdi tika atstāti neapsildīti. Katra apstrādes vieta tika mainīta katru nakti kopumā piecas naktis. Odu skaits, kas notverts slazdos, kuros ēsma bija piesūcināta ar dažāda vecuma urīnu, tika salīdzināts, izmantojot loģistisko regresiju ar beta binomiālo sadalījumu (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Malārijas endēmiskā ciematā netālu no Maki pilsētas, Oromijas reģionā, Etiopijā (8° 11′ 08″ N, 38° 81′ 70″ E; 6.A attēls). Pētījums tika veikts laikā no augusta vidus līdz septembra vidum pirms ikgadējās iekštelpu atlieku izsmidzināšanas, kā arī garās lietus sezonas. Pētījumam tika izvēlēti pieci māju pāri (20–50 m attālumā), kas atrodas ciemata nomalē (6.A attēls). Māju atlases kritēriji bija šādi: mājā nebija atļauts turēt dzīvniekus, nebija atļauts gatavot ēdienu iekštelpās (izmantojot malku vai ogles) (vismaz izmēģinājuma periodā) un mājas ar ne vairāk kā diviem iedzīvotājiem, kas guļ neinsekticīdu saturošās telpās. zem apstrādātā moskītu tīkla. Ētisko apstiprinājumu ir piešķīrusi Adisabebas Universitātes Dabaszinātņu fakultātes (CNS-IRB) Institucionālās pētniecības ētikas pārskata padome (IRB/022/2016) saskaņā ar Pasaules Medicīnas asociācijas Helsinku deklarācijā noteiktajām vadlīnijām. No katra mājsaimniecības vadītāja tika iegūta piekrišana ar veselības aprūpes personāla palīdzību. Visu procesu apstiprina vietējās administrācijas rajona un iecirkņa (“kebele”) līmenī. Eksperimenta dizains atbilst 2 × 2 latīņu kvadrāta dizainam, kurā sintētiskie maisījumi un kontroles grupas tika piešķirtas pāru mājām pirmajā naktī un mainītas starp mājām nākamajā eksperimentālajā naktī. Šis process tika atkārtots desmit reizes. Turklāt, lai novērtētu odu aktivitāti izvēlētajās mājās, CDC slazdi tika iestatīti tā, lai tie darbotos piecas naktis pēc kārtas lauka izmēģinājuma sākumā, vidū un beigās vienā un tajā pašā diennakts laikā.
Sintētisks maisījums, kas satur sešus bioaktīvus savienojumus, tika izšķīdināts heptānā (97,0% šķīdinātāja GC pakāpe, Sigma Aldrich) un atbrīvots ar ātrumu 140 ng h-1, izmantojot kokvilnas dakts dozatoru [20]. Dakts dozators ļāva visiem savienojumiem atbrīvoties nemainīgās proporcijās visa 12 stundu eksperimenta laikā. Heptāns tika izmantots kā kontrole. Flakons tika pakārts blakus Slimību kontroles un profilakses centru (CDC) gaismas slazda ieejas punktam (John W. Hock Company, Gainesville, FL, ASV; 6A. attēls). Slazdi tika pakārti 0,8–1 m virs zemes, gultas kājgalī, un brīvprātīgais gulēja zem neapstrādāta moskītu tīkla un darbojās no plkst. 18:00 līdz 06:30. Pēc dzimuma un fizioloģiskā stāvokļa (nebaroti, paēduši, daļēji grūsni un grūsni [21]) notvertie odi pēc tam tika pārbaudīti, izmantojot polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) analīzi, lai identificētu sugu, kas morfoloģiski identificēta kā A. gambiae sl. Kompleksa locekļi [23]. Lauka pētījumā slazds Pāru māju ķeršana slazdā tika analizēta, izmantojot nominālo loģistisko atbilstības modeli, kur pievilcība bija atkarīgais mainīgais un apstrāde (sintētiskais maisījums pret kontroli) bija fiksētais efekts (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Šeit mēs ziņojam χ2 un p vērtības no ticamības attiecības testa.
Novērtējiet, vai tas ir droši. arabiensis spēja iegūt urīnu, savu galveno slāpekļa avotu, urīnvielu, tieši barojot, 48 stundu laikā pēc ievadīšanas 4 dienas pēc saimnieka meklēšanas un asins barošanas mātītēm (1.A att.). Gan saimnieka meklējošās, gan asinssūcējas mātītes absorbēja ievērojami vairāk saharozes nekā jebkura cita diēta vai ūdens (attiecīgi F(5426) = 20,15, p < 0,0001 un F(5299) = 56,00, p < 0,0001; 1.B,C att.). Turklāt saimnieka meklējošās mātītes 72 stundu laikā apēda mazāk urīna nekā 168 stundu laikā (1.B att.). Piedāvājot barību, kas satur urīnvielu, saimnieka meklējošās mātītes absorbēja ievērojami lielāku urīnvielas daudzumu 2,69 mM salīdzinājumā ar visām citām koncentrācijām un ūdeni, bet neatšķiras no 10% saharozes (F(10813) = 15,72, p < 0,0001; 1.D attēls). Tas bija pretstatā ar asinīm barotu mātīšu reakcijai, kuras parasti absorbēja ievērojami vairāk urīnvielu saturošas diētas nekā ūdeni, lai gan ievērojami mazāk par 10% saharozes (F(10 557) = 78,35, p < 0,0001; 1.E attēls). Turklāt, salīdzinot abus fizioloģiskos stāvokļus, flebotomizētas mātītes absorbēja vairāk urīnvielas nekā saimniekus meklējošas mātītes zemākajās koncentrācijās, un šīs mātītes absorbēja līdzīgu urīnvielas daudzumu augstākās koncentrācijās (F(1 953) = 78,82, p < 0,0001; 1.F, G attēls). Lai gan uzņemšana no urīnvielu saturošas diētas, šķiet, bija optimāla (1.D, E attēls), mātītes abos fizioloģiskajos stāvokļos spēja modulēt absorbētās urīnvielas daudzumu visā urīnvielas koncentrācijas diapazonā log-lineārā veidā (1.F, G attēls). ).Līdzīgi, šķiet, ka odi kontrolē slāpekļa uzņemšanu, regulējot absorbētā urīna daudzumu, jo slāpekļa daudzums urīnā atspoguļojas absorbētajā daudzumā (1.B attēls, C un B ieliktņi).
Lai novērtētu urīna un urīnvielas ietekmi uz saimniekus meklējošu un asinīm sūcošu odu izdzīvošanu, mātītēm tika dots visu četru vecumu urīns (svaigs, 24 stundas, 72 stundas un 168 stundas pēc nogulsnēšanās), un kontrolei tika izmantots dažādas urīnvielas koncentrācijas, kā arī destilēts ūdens un 10% saharoze (2.A attēls). Šī izdzīvošanas analīze parādīja, ka uzturam bija būtiska ietekme uz kopējo izdzīvošanu saimniekus meklējošām mātītēm (urīns: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; urīnviela: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; 2.B, C attēls) un ar asinīm barotām mātītēm (urīns: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; urīnviela: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; 2.D, E attēls). Visos eksperimentos mātītēm, kuras baroja ar urīnu, urīnvielu un ūdeni, bija ievērojami zemāki izdzīvošanas rādītāji salīdzinājumā ar mātītēm, kuras baroja ar saharozes diētu (2.B-E attēls). Saimniekus meklējošām mātītēm, kuras baroja ar svaigu un novecojušu urīnu, bija atšķirīgi izdzīvošanas rādītāji, un tām, kuras baroja ar 72 stundas novecojušu urīnu (p = 0,016), bija viszemākā izdzīvošanas varbūtība (2.B attēls). Turklāt saimniekus meklējošās mātītes, kuras baroja ar 135 mM urīnvielu, izdzīvoja ilgāk nekā kontroles grupa ar ūdeni (p < 0,04) (2.C attēls). Salīdzinot ar ūdeni, sievietes, kuras baroja ar svaigu urīnu un 24 stundu urīnu, izdzīvoja ilgāk (attiecīgi p = 0,001 un p = 0,012; 2.D attēls), savukārt sievietes, kuras baroja ar 72 stundu urīnu, izdzīvoja ilgāk nekā tās, kuras baroja ar īslaicīgu svaigu urīnu un 24 stundas izturētu urīnu (attiecīgi p < 0,0001 un p = 0,013; 2.D attēls). Barojot ar 135 mM urīnvielu, ar asinīm barotās mātītes izdzīvoja ilgāk nekā visas citas urīnvielas un ūdens koncentrācijas. (p < 0,013; 2.E attēls).
Saimnieka un asinssūcēja Anopheles arabinis mātīšu izdzīvošana, barojoties ar govs urīnu un urīnvielu. Bioanalīzes (A) ietvaros odu mātītēm tika nodrošināta diēta, kas sastāvēja no svaiga un izturēta govs urīna, dažādas urīnvielas koncentrācijas, saharozes (10%) un destilēta ūdens (H2O). Saimnieku meklējošo (B, C) un asinssūcēju (D, E) odu izdzīvošana tika reģistrēta ik pēc 12 stundām, līdz visas mātītes, kas barojās ar urīnu (B, D) un urīnvielu (C, E), un kontroles grupas, saharozes un ūdens, īpatņi bija miruši.
Kopējais attālums un apļu skaits, kas noteikts lidošanas dzirnavu testā 24 stundu laikā, atšķīrās starp saimniekus meklējošajiem un asinīm sūcošajiem odiem, kuriem kopumā bija mazāka lidošanas aktivitāte (3. att.). Saimniekus meklējošie odi, kas nodrošināja svaigu un izturētu urīnu vai saharozi un ūdeni, uzrādīja atšķirīgus lidošanas modeļus (3. att.), mātītēm, kas barojās ar svaigu urīnu, bija aktīvākas rītausmā, savukārt tām, kas barojās ar 24 un 168 stundas veciem odiem, kas barojās ar urīnu, bija atšķirīgi lidošanas modeļi, un tie galvenokārt lidoja diennakts laikā. Odu mātītes, kas nodrošināja saharozi vai 72 stundu urīnu, uzrādīja aktivitāti visu 24 stundu periodu, savukārt mātītes, kas nodrošināja ūdeni, bija aktīvākas perioda vidū. Odi, kas barojās ar saharozi, visaugstāko aktivitātes līmeni uzrādīja vēlu naktī un agri no rīta, savukārt tiem, kas uzņēma 72 stundas vecu urīnu, aktivitāte 24 stundu laikā vienmērīgi samazinājās (3. attēls).
Mednieku meklētas asinssūcēja Anopheles arabinis mātītes lidošanas veiktspēja, barojoties ar govju urīnu un urīnvielu. Lidmašīnu testā odu mātītes, barojoties ar svaigu un izturētu govju urīnu, dažādām urīnvielas, saharozes (10%) un destilēta ūdens (H2O) koncentrācijām, tika piesietas pie horizontālām, brīvi rotējošām rokām (augšā). Saimnieku meklējošām (pa kreisi) un asinssūcējām (pa labi) mātītēm tika reģistrēts kopējais attālums un lidojumu skaits stundā katrai diētai 24 stundu periodā (tumši: pelēki; gaiši: balti). Vidējais attālums un vidējais lidojumu skaits ir parādīts diennakts aktivitātes grafika labajā pusē. Kļūdu joslas apzīmē vidējā lieluma standarta kļūdu. Statistikas analīzi skatīt tekstā.
Kopumā saimniekus meklējošo mātīšu lidošanas aktivitāte 24 stundu periodā bija līdzīga lidošanas attāluma modelim. Vidējo lidošanas attālumu būtiski ietekmēja uzņemtā barība (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), un saimniekus meklējošās mātītes, kas bija uzņemušas 72 stundu urīnu, nolidoja ievērojami lielākus attālumus salīdzinājumā ar visām pārējām diētām (p < 0,0001), un ar saharozi barotie odi lidoja ilgāk nekā ar svaigu (p = 0,022) un 24 stundas izturētu urīnu (p = 0,022) barotie odi. Pretstatā lidošanas aktivitātes modelim, ko apraksta urīna barība, ar urīnvielu barotās saimniekus meklējošās mātītes uzrādīja noturīgu lidošanas aktivitāti 24 stundu periodā, sasniedzot maksimumu tumšās fāzes otrajā pusē (3. att.). Lai gan aktivitātes modeļi bija līdzīgi, saimniekus meklējošās mātītes, kas barotas ar urīnvielu, ievērojami palielināja vidējo lidošanas attālumu atkarībā no absorbētās koncentrācijas (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Saimnieku meklējošās mātītes, kurām tika dota jebkura urīnvielas koncentrācija, lidoja ilgāk nekā mātītes, kurām tika dota vai nu ūdens, vai saharozes deva (p < 0,03).
Asinssūcēju odu kopējā lidošanas aktivitāte bija stabila un saglabājās 24 stundu laikā, lietojot visas barības, un mātītēm, kuras baroja ar ūdeni, kā arī mātītēm, kuras baroja ar svaigu ūdeni un 24 stundas vecas, urīna aktivitāte bija palielināta tumšā perioda otrajā pusē (3. attēls). Lai gan urīna diēta būtiski ietekmēja vidējo lidojuma attālumu ar asinīm barotām mātītēm (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), urīnvielas diēta to neietekmēja (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) salīdzinājumā ar citu urīna un kontroles diētu (svaigs, p = 0,0091; 72 stundas, p = 0,0022; 168 stundas, p = 0,001; saharoze, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Urīna un urīnvielas barošanas ietekme uz reproduktīvajiem parametriem tika novērtēta olu dēšanas biotestos (4.A attēls), un tā tika pētīta atkarībā no katras mātītes izdēto olu skaita, olu lieluma un tikko izšķīlušos pirmā stadijas kāpuru skaita. Izdēto olu skaits. Ar urīnu barotās arābu mātītes atšķīrās atkarībā no uztura (F(5,222) = 4,38, p = 0,0008; 4.B attēls). Mātītes, kas barotas ar 24 stundu urīna un asins miltiem, izdēja ievērojami vairāk olu nekā mātītes, kas barotas ar citu urīna barību, un tas bija līdzīgs tām, kas barotas ar saharozi (4.B attēls). Tāpat ar urīnu baroto mātīšu izdēto olu lielums atšķīrās atkarībā no uztura (F(5,209) = 12,85, p < 0,0001), un 24 stundu urīna un saharozes barotās mātītes dēja ievērojami lielākas olas nekā mātītes, kas barotas ar ūdeni, savukārt mātīšu, kas barotas ar 168 stundām urīna, olas bija ievērojami mazākas (4.C attēls). Turklāt urīna uzturs būtiski ietekmēja kāpuru lielumu (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), un no olām, ko izdējušas 24 un 72 stundas vecas ar urīnu barotas mātītes, izšķiļas ievērojami lielāki kāpuri nekā no olām, ko izdējuši olu kāpuri. Ar ūdeni barotas un 168 stundas vecas ar urīnu barotas mātītes (4.D attēls).
Anopheles arabinis mātīšu reproduktīvā veiktspēja, barojoties ar govs urīnu un urīnvielu. Ar asinīm barotas odu mātītes 48 stundas pirms ievietošanas biotestos un olu dēšanas substrātu iegūšanas (A) tika barotas ar barību, kas sastāvēja no svaiga un izturēta govs urīna, dažādām urīnvielas koncentrācijām, saharozes (10%) un destilēta ūdens (H2O). Olu skaitu (B, E), olu lielumu (C, F) un kāpuru lielumu (D, G) būtiski ietekmēja sniegtā barība (govs urīns: BD; urīnviela: EG). Katra parametra vidējās vērtības, kas izmērītas, izmantojot dažādus burtu nosaukumus, bija būtiski atšķirīgas viena no otras (vienvirziena ANOVA, izmantojot Tukey post hoc analīzi; p < 0,05). Kļūdu joslas apzīmē vidējās vērtības standarta kļūdu.
Kā galvenā urīna slāpekļa sastāvdaļa, urīnviela, kad to kā barību nodrošināja ar asinīm barotām mātītēm, visos pētījumos būtiski ietekmēja reproduktīvos parametrus. Mātīšu, kuras baroja ar urīnvielu, pēc asins maltītes izdēto olu skaits atkarībā no urīnvielas koncentrācijas (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), mātītes, kurām baroja ar urīnvielas koncentrāciju no 134 µM līdz 1,34 mM, izdēja vairāk olu (4.E attēls). Mātītes, kuras baroja ar urīnvielas koncentrāciju 134 µM vai vairāk, izdēja lielākas olas nekā mātītes, kuras baroja ar ūdeni (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; 4.F attēls), un kāpuru izmērs, lai gan to ietekmēja līdzīga urīnvielas koncentrācija mātītēm (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001), bija mainīgāks (4.G attēls).
Vispārējā pievilcība saimniekus meklējošiem liellopu urīna gaistošajiem ekstraktiem galvas telpā. Ar stikla mēģenes olfaktometru (5.A att.) novērtētajam arabiensis būtiski ietekmēja urīna vecums (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; 5.B att.). Post hoc analīze parādīja, ka novecojuša urīna smarža 24 stundu laikā izraisīja ievērojami augstāku pievilcības līmeni salīdzinājumā ar visām pārējām apstrādes metodēm (72 stundas: p = 0,0060, 168 stundas: p = 0,012, pentāns: p = 0,00070), izņemot svaiga urīna smaržu (p = 0,13; 5.B att.). Lai gan asinssūcēju odu kopējā pievilcība urīna smaržai būtiski neatšķīrās (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; 5.C att.), tika konstatēts, ka šīs mātītes bija ievērojami pievilcīgākas galvas telpas gaistošajiem ekstraktiem salīdzinājumā ar 72 stundas izturētu urīnu salīdzinājumā ar kontroles grupu (p = 0,0066; 5.C attēls).
Uzvedības reakcijas uz dabīgām un sintētiskām govju urīna smaržām, meklējot saimniekorganismu un ar asinīm barotu Anopheles arabianus. Stikla caurules olfaktometra shēma (A). Svaiga un izturēta govju urīna gaistošo ekstraktu piesaiste saimniekorganismam (B) un asinssūcējiem (C) odiem. Atrodiet Lord An taustekļu reakciju. Parādīti galvas telpas ekstrakti, kas izolēti no svaiga (D), 24 stundas (E), 72 stundas (F) un 168 stundas (G) izturēta govju urīna. Elektronu antenu noteikšanas (EAD) līknes parāda sprieguma izmaiņas, reaģējot uz bioaktīviem savienojumiem galvas telpā, kas eluēti no gāzu hromatogrāfa un noteikti ar liesmas jonizācijas detektoru (FID). Mēroga josla attēlo atbildes amplitūdu (mV) pret aiztures laiku (s). Parādītas bioloģiski aktīvo savienojumu īpašības un izdalīšanās ātrums (µg h-1). Viena zvaigznīte (*) norāda uz konsekventu zemas amplitūdas atbildi. Divas zvaigznītes (**) norāda uz neatkārtojamām atbildēm. Atrodiet saimniekorganismu (H) un asinssūcēju (I). An.arabiensis atšķirīgi pievelk sintētiskus svaiga un izturēta govs urīna aromātu maisījumus. Vidējā odu proporcija, ko pievilināja dažādi burtu nosaukumi, būtiski atšķīrās viena no otras (vienvirziena ANOVA, izmantojot Tukey post hoc analīzi; p < 0,05). Kļūdu joslas apzīmē skalas standarta kļūdu.
Mātītēm Ann.arabiensis 72 stundas un 120 stundas pēc asins maltītes nārsta laikā netika konstatēta nekāda priekšroka svaiga un izturēta govs urīna gaistošajiem ekstraktiem galvas telpā, salīdzinot ar pentāna kontroles grupu (χ2 = 3,07, p > 0,05; 1. papildfails: S1. att.).
Mātītēm Ann.arabiensis GC-EAD un GC-MS analīzēs tika identificēti astoņi, seši, trīs un trīs bioaktīvi savienojumi (5.D–G attēls). Lai gan tika novērotas atšķirības savienojumu skaitā, kas izraisīja elektrofizioloģiskas reakcijas, lielākā daļa šo savienojumu bija katrā gaistošajā ekstraktā, kas savākts no svaiga un izturēta urīna. Tāpēc katram ekstraktam turpmākajās analīzēs tika iekļauti tikai tie savienojumi, kas izraisīja fizioloģisku reakciju no mātīšu antenām virs sliekšņa.
Kopējais bioaktīvo savienojumu gaistošo vielu izdalīšanās ātrums urīna galvtelpā palielinājās no 29 µg h-1 svaigā urīnā līdz 242 µg h-1 168 stundas izturētā urīnā, galvenokārt p-krezola un m-formaldehīda dēļ. Fenola, kā arī fenola līmeņa paaugstināšanās dēļ. Turpretī citu savienojumu, piemēram, 2-cikloheksēn-1-ona un dekanāla, izdalīšanās ātrums samazinājās, palielinoties urīna vecumam, kas korelēja ar novēroto signāla intensitātes (pārpilnības) samazināšanos hromatogrammā (5.D-G att., kreisais panelis) un fizioloģiskajām reakcijām uz šiem savienojumiem (5.D-G att., labais panelis).
Kopumā sintētiskajam maisījumam bija līdzīga dabiskā bioaktīvo savienojumu attiecība, kas identificēta svaiga un izturēta urīna galvas telpu gaistošos ekstraktos (5.D–G att.), un tas, šķiet, neizraisīja būtisku pievilcību saimnieka meklējumos (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; 5.H att.) vai asinssūcēju odu meklējumos (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; 5.I att.). Tomēr post hoc pāru salīdzinājumi starp apstrādes metodēm parādīja, ka saimnieku meklējošie odi bija ievērojami pievilcīgi 24 stundas izturēta urīna sintētiskajam maisījumam, salīdzinot ar pentāna kontroles grupām (p = 0,0086; 5.H att.).
Lai novērtētu atsevišķu komponentu lomu 24 stundas izturēta urīna sintētiskajos maisījumos, Y-mēģenes testā tika salīdzināti seši subtraktīvie maisījumi ar pilniem maisījumiem, kuros tika atdalīti atsevišķi savienojumi. Saimnieku meklējošiem odiem atsevišķu savienojumu atņemšanai no pilnā maisījuma bija būtiska ietekme uz uzvedības reakcijām (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; 1. papildfails: S2A attēls), visi subtraktīvie maisījumi bija pievilcīgāki nekā mazāki nekā pilnībā sajaukti. Turpretī atsevišķu savienojumu atņemšana no pilnībā sintētiskā maisījuma neietekmēja asinssūcēju odu uzvedības reakcijas (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), izņemot dekanālu, kas izraisīja zemākus līmeņus salīdzinājumā ar pilno maisījumu (pievilcība) (p = 0,022; 1. papildfails: S2B attēls).
Malārijas endēmiskā ciematā Etiopijā desmit naktis tika novērtēta sintētiska 24 stundu govs urīna maisījuma efektivitāte odu pievilināšanā lauka apstākļos (6.A att.). Kopumā tika notverti un identificēti 4861 odi, no kuriem 45,7% bija Anthropus.gambiae sl, 18,9% bija Anopheles pharoensis un 35,4% bija Culex spp. (1. papildu fails: S1 tabula). Anopheles arabinis ir vienīgais An.Gambian sugu kompleksa pārstāvis, kas identificēts ar PCR analīzi. Vidēji naktī tika notverti 320 odi, un šajā laikā slazdi ar sintētisku jauktu ēsmu noķēra vairāk odu nekā pāru slazdi bez maisījuma (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Slazdi bez ēsmas tika uzstādīti katrā no piecām kontroles naktīm izmēģinājuma sākumā, vidū un beigās. Katrā slazdu pārī tika notverti līdzīgs odu skaits. norādot, ka starp mājām nav konstatēta neobjektivitāte (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) un populācijas samazināšanās pētījuma periodā. Salīdzinot ar kontroles slazdiem, odu skaits, kas noķerti slazdos ar sintētisko maisījumu, bija ievērojami palielināts: saimnieka meklēšana (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), nesena asins barošana (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) un grūsnība (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; 1. papildfails: S1. tabula). Tas atspoguļojas arī kopējā noķerto odu skaitā: saimnieka meklēšana > asinssūcēji > grūsni > daļēji grūsni > tēviņi.
24 stundu sintētiska govs urīna smakas maisījuma efektivitātes lauka novērtējums. Lauka izmēģinājumi tika veikti Etiopijas dienvidcentrālajā daļā (karte), netālu no Maki pilsētas (ievietot), izmantojot Slimību kontroles un profilakses centru (CDC) gaismas slazdus (pa labi) pāru mājās ar latīņu kvadrāta dizainu (attēls no gaisa) (A). Sintētiskie ar smaku ēsmu piesūcinātie CDC fotoslazdi pievilina un notver Anopheles arabesques mātītes (B), bet ne Anopheles farroes (C), citādā veidā, kas ir no fizioloģiskā stāvokļa atkarīgs efekts. Turklāt šie slazdi notvēra ievērojami lielāku saimnieku Culex odu skaitu. (D) Salīdzinot ar kontroli. Stieņi kreisajā pusē attēlo vidējo odu atlases indeksu, kas notverti smaržojošās ēsmas (zaļā krāsā) un kontroles (atvērtās) slazdu pāros (N = 10), savukārt stabiņi labajā pusē attēlo vidējo atlases indeksu kontroles slazdu pāros (atvērtās; N ​​= 5). ). Zvaigznītes norāda statistiskās nozīmības līmeņus (*p = 0,01 un ***p < 0,0001).
Trīs sugas tika notvertas atšķirīgi slazdos, kas saturēja sintētiskus maisījumus. Meklējot saimnieku (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), asins barošanu (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) un grūsnību (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), .arabiensis tika iesprostots slazdā, kas atbrīvoja sintētisko maisījumu (6.B att.), savukārt An daudzums neatšķīrās. Tika atrasti Pharoensis dažādos fizioloģiskos stāvokļos (6.C att.). Culex gadījumā slazdos ar sintētisko maisījumu tika konstatēts tikai ievērojams saimniekus meklējošo odu skaita pieaugums (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; 6.D att.), salīdzinot ar kontroles slazdiem.
Lai novērtētu, vai malārijas odi izmanto govs urīna smaržu kā saimnieka dzīvotnes norādi, tika izmantoti saimnieku ēsmas slazdi, kas atradās ārpus potenciālajiem saimniekiem starp vairošanās vietām un lauku kopienām Etiopijā. Bez saimnieka norādēm, karstuma un ar vai bez govs urīna smakas klātbūtnes odi netika notverti (1. papildfails: S3. attēls). Tomēr augstas temperatūras un govs urīna smakas klātbūtnē malārijas odu mātītes tika pievilinātas un notvertas, kaut arī nelielā skaitā, neatkarīgi no urīna vecuma (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; 1. papildfails: S3. attēls). Turpretī ūdens kontroles paradumos augstā temperatūrā malārijas odi netika notverti (1. papildfails: S3. attēls).
Malārijas odi iegūst un izplata slāpekli saturošus savienojumus, kompensējoši barojoties ar govs urīnu (t. i., peļķēm), lai uzlabotu dzīves cikla īpašības, līdzīgi kā citiem kukaiņiem [2, 4, 24, 25, 26]. Govs urīns ir viegli pieejams atjaunojams resurss, kas ir cieši saistīts ar malārijas pārnēsātāju atpūtas vietām, piemēram, govju novietnēm un augstu veģetāciju lauku māju un nārsta vietu tuvumā. Odu mātītes atrod šo resursu pēc smaržas un spēj regulēt slāpekļa savienojumu uzņemšanu urīnā, tostarp urīnvielas, kas ir galvenā slāpekļa sastāvdaļa urīnā [15, 16]. Atkarībā no odu mātītes fizioloģiskā stāvokļa, barības vielas urīnā tiek piešķirtas, lai uzlabotu saimniekus meklējošo odu mātīšu lidošanas aktivitāti un izdzīvošanu, kā arī ar asinīm barotu īpatņu izdzīvošanas un reproduktīvās īpašības pirmā gonadotropā cikla laikā. Tāpēc urīna sajaukšanai ir svarīga uztura loma malārijas pārnēsātājiem, kas ir noslēgti, piemēram, nepietiekami baroti pieaugušie īpatņi [8], jo tā nodrošina odu mātītēm iespēju iegūt svarīgus slāpekļa savienojumus, iesaistoties zema riska barošanā. Šim atklājumam ir būtiskas epidemioloģiskas sekas, jo mātītes palielina savu paredzamo dzīves ilgumu, aktivitāti un reproduktīvo spēju. izvadi, kas viss ietekmē vektoru ietilpību. Turklāt šāda uzvedība varētu būt nākotnes vektoru pārvaldības programmu mērķis.