Η πρόσληψη και κατανομή θρεπτικών συστατικών ενσωματώνει τα χαρακτηριστικά αναζήτησης τροφής και κύκλου ζωής των εντόμων. Για να αντισταθμίσουν τις ελλείψεις σε συγκεκριμένα θρεπτικά συστατικά σε διαφορετικά στάδια ζωής, τα έντομα μπορούν να αποκτήσουν αυτά τα θρεπτικά συστατικά μέσω συμπληρωματικής σίτισης, για παράδειγμα, τρεφόμενα με εκκρίσεις σπονδυλωτών σε μια διαδικασία γνωστή ως λακκούβες. Το κουνούπι Anopheles arabiani φαίνεται να υποσιτίζεται και, ως εκ τούτου, απαιτεί θρεπτικά συστατικά τόσο για τον μεταβολισμό όσο και για την αναπαραγωγή. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί εάν η ανάδευση των ούρων αγελάδας από το An. arabiensis για την πρόσληψη θρεπτικών συστατικών βελτιώνει τα χαρακτηριστικά κύκλου ζωής.
Βεβαιωθείτε ότι είναι ασφαλές. Το arabiensis προσελκύστηκε από την οσμή φρέσκων ούρων αγελάδας 24 ωρών, 72 ωρών και 168 ωρών, και θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή και τρέφονταν με αίμα (48 ώρες μετά το γεύμα αίματος) μετρήθηκαν σε ολφακτόμετρο σωλήνα Υ και τα έγκυα θηλυκά αξιολογήθηκαν για δοκιμή ωοτοκίας. Στη συνέχεια, χρησιμοποιήθηκε μια συνδυασμένη χημική και ηλεκτροφυσιολογική ανάλυση για την ταυτοποίηση βιοδραστικών ενώσεων στα ούρα αγελάδας και στις τέσσερις ηλικιακές κατηγορίες. Συνθετικά μείγματα βιοδραστικών ενώσεων αξιολογήθηκαν σε δοκιμές σωλήνα Υ και σε δοκιμές πεδίου. Για να διερευνηθούν τα ούρα αγελάδας και η κύρια αζωτούχα ένωση ουρία ως πιθανές συμπληρωματικές τροφές για φορείς ελονοσίας, μετρήθηκαν οι παράμετροι σίτισης και τα χαρακτηριστικά του ιστορικού ζωής. Αξιολογήθηκε η αναλογία των θηλυκών κουνουπιών και η ποσότητα ούρων αγελάδας και ουρίας που απορροφήθηκαν. Μετά τη σίτιση, τα θηλυκά αξιολογήθηκαν για επιβίωση, προσδεδεμένη πτήση και αναπαραγωγή.
Αναζητήστε το αίμα και την τροφή του ξενιστή. Σε εργαστηριακές και επιτόπιες μελέτες, οι Άραβες προσελκύστηκαν από το φυσικό και συνθετικό άρωμα των φρέσκων και παλαιωμένων ούρων αγελάδας. Τα έγκυα θηλυκά ήταν αδιάφορα για τις αντιδράσεις στα ούρα αγελάδας στα σημεία ωοτοκίας. Τα θηλυκά που αναζητούν τον ξενιστή και τα θηλυκά που ρουφούν αίμα απορροφούν ενεργά τα ούρα αγελάδας και την ουρία και κατανέμουν αυτούς τους πόρους σύμφωνα με τους συμβιβασμούς του ιστορικού ζωής ως συνάρτηση της φυσιολογικής κατάστασης για πτήση, επιβίωση ή αναπαραγωγή.
Απόκτηση και κατανομή ούρων αγελάδας από τον Anopheles arabinis για βελτιωμένα χαρακτηριστικά του κύκλου ζωής. Η συμπληρωματική χορήγηση ούρων αγελάδας επηρεάζει άμεσα την ικανότητα των φορέων αυξάνοντας την ημερήσια επιβίωση και την πυκνότητα των φορέων και έμμεσα μεταβάλλοντας την πτητική δραστηριότητα και ως εκ τούτου θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη σε μελλοντικά μοντέλα.
Η απόκτηση και κατανομή θρεπτικών συστατικών ενσωματώνει την αναζήτηση τροφής και τα χαρακτηριστικά του κύκλου ζωής των εντόμων [1,2,3]. Τα έντομα είναι σε θέση να επιλέγουν και να αποκτούν τροφή και να εκτελούν αντισταθμιστική σίτιση με βάση τη διαθεσιμότητα τροφής και τις απαιτήσεις σε θρεπτικά συστατικά [1, 3]. Η κατανομή των θρεπτικών συστατικών εξαρτάται από τη διαδικασία του κύκλου ζωής και μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετικές απαιτήσεις για την ποιότητα και την ποσότητα της διατροφής σε διαφορετικά στάδια ζωής των εντόμων [1, 2]. Για να αντισταθμίσουν τις ελλείψεις σε συγκεκριμένα θρεπτικά συστατικά, τα έντομα μπορούν να αποκτήσουν αυτά τα θρεπτικά συστατικά μέσω συμπληρωματικής σίτισης, όπως με λάσπη, διάφορα περιττώματα και εκκρίσεις σπονδυλωτών, και ψοφίμια, μια διαδικασία γνωστή ως λακκούβες [2]. Αν και περιγράφεται κυρίως μια ποικιλία ειδών πεταλούδων και σκώρων, οι ποτίστρες εμφανίζονται και σε άλλες τάξεις εντόμων, και η έλξη και η σίτιση με αυτούς τους τύπους πόρων μπορεί να έχει σημαντικές επιπτώσεις στην υγεία και σε άλλα χαρακτηριστικά του κύκλου ζωής [2, 4, 5, 6], 7]. Το κουνούπι της ελονοσίας Anopheles gambiae sensu lato (sl) αναδύεται ως «υποσιτισμένο» ενήλικο [8], επομένως το πότισμα μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στα χαρακτηριστικά του κύκλου ζωής του, αλλά αυτή η συμπεριφορά μέχρι στιγμής έχει... έχει παραμεληθεί. Η χρήση της ανάδευσης ως μέσου αύξησης της πρόσληψης θρεπτικών συστατικών σε αυτό το σημαντικό όχημα χρήζει προσοχής, καθώς μπορεί να έχει σημαντικές επιδημιολογικές συνέπειες.
Η πρόσληψη αζώτου στα ενήλικα θηλυκά κουνούπια Anopheles είναι περιορισμένη λόγω των χαμηλών θερμιδικών αποθεμάτων που μεταφέρονται από το στάδιο της προνύμφης και της αναποτελεσματικής αξιοποίησης του αιματάλευρου [9]. Το θηλυκό Ann.gambiae sl συνήθως αντισταθμίζει αυτό συμπληρώνοντας με συμπληρωματικά αιματάλευρα [10, 11], θέτοντας έτσι περισσότερους ανθρώπους σε κίνδυνο να προσβληθούν από την ασθένεια και θέτοντας τα κουνούπια σε μεγαλύτερο κίνδυνο θήρευσης. Εναλλακτικά, τα κουνούπια μπορούν να χρησιμοποιήσουν συμπληρωματική σίτιση με περιττώματα σπονδυλωτών για να αποκτήσουν αζωτούχες ενώσεις που ενισχύουν την προσαρμογή και την ευελιξία πτήσης, όπως αποδεικνύεται από άλλα έντομα [2]. Από αυτή την άποψη, η ισχυρή και ξεχωριστή έλξη ενός από τα αδελφά είδη εντός του An. Το σύμπλεγμα ειδών sl της Γκάμπια, Anopheles arabinis, φρέσκα και παλαιωμένα ούρα αγελάδας [12,13,14], είναι ενδιαφέρον. Το Anopheles arabinis είναι οπορτουνιστικό στις προτιμήσεις του ξενιστή του και είναι γνωστό ότι συναναστρέφεται και τρέφεται με βοοειδή. Τα ούρα αγελάδας είναι ένας πόρος πλούσιος σε αζωτούχες ενώσεις, με την ουρία να αντιπροσωπεύει το 50-95% του συνολικού αζώτου στα φρέσκα ούρα [15, 16]. Καθώς τα ούρα αγελάδας παλαιώνουν, οι μικροοργανισμοί χρησιμοποιούν αυτούς τους πόρους για να μειώσουν την πολυπλοκότητα των αζωτούχων ενώσεων εντός 24 ωρών [15]. Με την ταχεία αύξηση της αμμωνίας, που σχετίζεται με τη μείωση του οργανικού αζώτου, οι αλκαλόφιλοι μικροοργανισμοί (πολλοί από τους οποίους παράγουν ενώσεις τοξικές για τα κουνούπια) ευδοκιμούν [15], οι οποίοι μπορεί να είναι θηλυκοί. Το Ann.arabiensis έλκεται κατά προτίμηση από ούρα ηλικίας 24 ωρών ή λιγότερο [13, 14].
Σε αυτή τη μελέτη, αναζητήθηκαν το An. ξενιστής και τρεφόμενο με αίμα. Κατά τη διάρκεια του πρώτου κύκλου γοναδοτροπίνης, το arabiensis αξιολογήθηκε για την απόκτηση αζωτούχων ενώσεων, συμπεριλαμβανομένης της ουρίας, μέσω ανάμειξης ούρων. Στη συνέχεια, διεξήχθη μια σειρά πειραμάτων για να αξιολογηθεί ο τρόπος με τον οποίο τα θηλυκά κουνούπια κατανέμουν αυτόν τον πιθανό θρεπτικό πόρο για βελτιωμένη επιβίωση, αναπαραγωγή και περαιτέρω αναζήτηση τροφής. Τέλος, αξιολογήθηκε η οσμή των φρέσκων και παλαιωμένων ούρων αγελάδας για να προσδιοριστεί εάν αυτά παρείχαν αξιόπιστες ενδείξεις για το An. Στην αναζήτησή τους για αυτόν τον πιθανό θρεπτικό πόρο, το arabiensis ανακάλυψε χημικές συσχετίσεις πίσω από την παρατηρούμενη διαφορετική ελκυστικότητα. Τα συνθετικά μείγματα οσμών πτητικών οργανικών ενώσεων (VOCs) που εντοπίστηκαν σε ούρα 24 ωρών παλαιωμένα αξιολογήθηκαν περαιτέρω σε συνθήκες πεδίου, επεκτείνοντας τα αποτελέσματα που ελήφθησαν σε εργαστηριακές συνθήκες και καταδεικνύοντας την επίδραση της οσμής των ούρων βοοειδών σε διαφορετικές φυσιολογικές καταστάσεις. Έλξη κουνουπιών. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν επιβεβαιώνουν ότι το An. arabiensis αποκτά και διανέμει αζωτούχες ενώσεις που βρίσκονται στα ούρα σπονδυλωτών για να επηρεάσει τα χαρακτηριστικά του κύκλου ζωής τους. Αυτά τα αποτελέσματα συζητούνται στο πλαίσιο πιθανών επιδημιολογικών συνεπειών και πώς μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την επιτήρηση και τον έλεγχο των φορέων.
Τα Anopheles arabicans (στέλεχος Dongola) διατηρήθηκαν στους 25 ± 2 °C, 65 ± 5% σχετική υγρασία και κύκλο φωτός:σκότους 12:12 ωρών. Οι προνύμφες εκτράφηκαν σε πλαστικούς δίσκους (20 cm × 18 cm × 7 cm) γεμάτους με απεσταγμένο νερό και τράφηκαν με τροφή για ψάρια Tetramin® (Tetra Werke, Melle, DE). Οι νύμφες συλλέχθηκαν σε κύπελλα των 30 ml (Nolato Hertila, Åstorp, SE) και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε κλουβιά Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm· MegaView Science, Taichung, Ταϊβάν) για να επιτραπεί η εμφάνιση των ενηλίκων. Στα ενήλικα άτομα χορηγήθηκε διάλυμα σακχαρόζης 10% ad libitum μέχρι 4 ημέρες μετά την εμφάνιση (dpe), οπότε στα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή προσφέρθηκε τροφή αμέσως πριν από το πείραμα ή αφέθηκαν να φάνε όλη τη νύχτα με απεσταγμένο νερό πριν από το πείραμα, όπως περιγράφεται παρακάτω. Τα θηλυκά που χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα με σωλήνες πτήσης αφέθηκαν να φάνε μόνο για 4-6 ώρες με νερό και libitum. Για την προετοιμασία κουνουπιών που ρουφούν αίμα για επόμενες βιοδοκιμασίες, 4 θηλυκά dpe έλαβαν αποινωτικό αίμα προβάτου (Håtunalab, Bro, SE) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τροφοδοσίας μεμβράνης (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK). Τα πλήρως συμφορημένα θηλυκά μεταφέρθηκαν στη συνέχεια σε μεμονωμένα κλουβιά και τους χορηγήθηκε απευθείας τροφή, όπως περιγράφεται παρακάτω, ή 10% σακχαρόζη ad libitum για 3 ημέρες πριν από τα πειράματα που περιγράφονται παρακάτω. Τα τελευταία θηλυκά χρησιμοποιήθηκαν για βιοδοκιμασίες σε σωλήνες πτήσης και μεταφέρθηκαν στο εργαστήριο, και στη συνέχεια έλαβαν απεσταγμένο νερό ad libitum για 4-6 ώρες πριν από το πείραμα.
Χρησιμοποιήθηκαν δοκιμασίες σίτισης για την ποσοτικοποίηση της κατανάλωσης ούρων και ουρίας σε ενήλικα θηλυκά An.Arab. Στα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή και που τρέφονταν με αίμα δόθηκε μια δίαιτα που περιείχε 1% αραιωμένα φρέσκα και παλαιωμένα ούρα αγελάδας, διάφορες συγκεντρώσεις ουρίας και δύο μάρτυρες (10% σακχαρόζη και νερό) για 48 ώρες. Επιπλέον, προστέθηκε χρωστική τροφίμων (1 mg ml-1 κυανιούχο ξυλένιο FF· CAS 2650-17-1· Sigma-Aldrich, Στοκχόλμη, SE) στη δίαιτα και χορηγήθηκε σε μήτρα 4 × 4 σε μικροσωλήνες φυγοκέντρησης 250 µl (Axygen Scientific, Union City, CA, ΗΠΑ· Σχήμα 1Α). Γεμίστε μέχρι την άκρη (~300 µl). Για να αποφύγετε τον ανταγωνισμό μεταξύ των κουνουπιών και τις πιθανές επιπτώσεις του χρώματος της χρωστικής, τοποθετήστε 10 κουνούπια σε ένα μεγάλο τρυβλίο Petri (διαμέτρου 12 cm και ύψους 6 cm· Semadeni, Ostermundigen, CH· Σχήμα 1Α) σε απόλυτο σκοτάδι στους 25 ± 2 cm °C και 65 ± 5% σχετική θερμοκρασία. υγρασία. Αυτά τα πειράματα επαναλήφθηκαν 5 έως 10 φορές. Μετά την έκθεση σε τροφή, τα κουνούπια τοποθετήθηκαν στους -20 °C μέχρι περαιτέρω ανάλυση.
Αναζητήστε ούρα βοοειδών και ουρία που απορροφήθηκαν από τον ξενιστή και το θηλυκό Anopheles arabianus που ρουφάει αίμα. Στη δοκιμή σίτισης (Α), τα θηλυκά κουνούπια έλαβαν μια δίαιτα που αποτελούνταν από φρέσκα και παλαιωμένα ούρα αγελάδας, διάφορες συγκεντρώσεις ουρίας, σακχαρόζη (10%) και απεσταγμένο νερό (H2O). Τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή (Β) και που τρέφονταν με αίμα (Γ) απορρόφησαν περισσότερη σακχαρόζη από οποιαδήποτε άλλη δίαιτα που δοκιμάστηκε. Σημειώστε ότι τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή απορρόφησαν ούρα αγελάδας 72 ωρών λιγότερο από ούρα αγελάδας 168 ωρών (Β). Η μέση συνολική περιεκτικότητα σε άζωτο (± τυπική απόκλιση) των ούρων αναπαρίσταται στο ένθετο. Τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή (D, F) και τα θηλυκά που ρουφούσαν αίμα (E, G) προσλαμβάνουν ουρία με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Οι μέσοι εισπνεόμενοι όγκοι (D, E) με διαφορετικά ονόματα γραμμάτων διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους (μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας την ανάλυση post hoc του Tukey· p < 0,05). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου (BE). Η ευθεία διακεκομμένη γραμμή αντιπροσωπεύει τη λογαριθμική γραμμική γραμμή παλινδρόμησης (F, G)
Για την απελευθέρωση της απορροφημένης τροφής, τα κουνούπια τοποθετήθηκαν μεμονωμένα σε μικροφυγοκεντρικούς σωλήνες 1,5 ml που περιείχαν 230 µl απεσταγμένου νερού και ο ιστός διασπάστηκε χρησιμοποιώντας ένα γουδοχέρι μιας χρήσης και ασύρματο κινητήρα (VWR International, Lund, SE), ακολουθούμενο από φυγοκέντρηση στα 10 krpm για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο υγρό (200 µl) μεταφέρθηκε σε μικροπλάκα 96 φρεατίων (Sigma-Aldrich) και η απορρόφηση (λ620) προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας με βάση το φασματοφωτόμετρο (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) nm. Εναλλακτικά, τα κουνούπια αλέστηκαν σε 1 ml απεσταγμένου νερού, εκ των οποίων 900 µl μεταφέρθηκαν σε κυψελίδα για φασματοφωτομετρική ανάλυση (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Για την ποσοτικοποίηση της διαιτητικής πρόσληψης, παρασκευάστηκε μια πρότυπη καμπύλη με σειριακή αραίωση για να αποδοθούν 0,2 µl έως 2,4 µl 1 mg ml-1. κυανιούχο ξυλένιο. Στη συνέχεια, η οπτική πυκνότητα γνωστών συγκεντρώσεων χρωστικής χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ποσότητας τροφής που καταβρόχθιζε κάθε κουνούπι.
Τα δεδομένα όγκου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από συγκρίσεις ζευγών post hoc του Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, US, 1989–2007). Οι αναλύσεις γραμμικής παλινδρόμησης περιέγραψαν την εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση πρόσληψη ουρίας και συνέκριναν τις αποκρίσεις μεταξύ κουνουπιών που αναζητούν τον ξενιστή και κουνουπιών που ρουφούν αίμα (GraphPad Prism v8.0.0 για Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, US).
Περίπου 20 µl δειγμάτων ούρων από κάθε ηλικιακή ομάδα δεσμεύτηκαν σε Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 mesh, Sigma Aldrich) και ενθυλακώθηκαν σε κάψουλες κασσιτέρου (8 mm × 5 mm). Οι κάψουλες εισήχθησαν στον θάλαμο καύσης ενός αναλυτή CHNS/O (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ΗΠΑ) για να προσδιοριστεί η περιεκτικότητα σε άζωτο σε φρέσκα και παλαιωμένα ούρα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το συνολικό άζωτο (g N l-1) ποσοτικοποιήθηκε με βάση γνωστές συγκεντρώσεις ουρίας που χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπο.
Για να εκτιμηθεί η επίδραση της διατροφής στην επιβίωση των θηλυκών που αναζητούν ξενιστή και ρουφούν αίμα, τα κουνούπια τοποθετήθηκαν ξεχωριστά σε μεγάλα τρυβλία Petri (διαμέτρου 12 cm και ύψους 6 cm· Semadeni) με οπή καλυμμένη με πλέγμα στο καπάκι (διαμέτρου 3 cm) με οπή για αερισμό και παροχή τροφής. Οι δίαιτες χορηγήθηκαν αμέσως μετά από 4 dpe και περιελάμβαναν 1% αραιωμένα φρέσκα και παλαιωμένα ούρα αγελάδας, τέσσερις συγκεντρώσεις ουρίας και δύο ομάδες ελέγχου, 10% σακχαρόζη και νερό. Κάθε δίαιτα διοχετεύτηκε με πιπέτα σε οδοντικό ταμπόν (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) που εισήχθη σε σύριγγα 5 ml (Thermo Fisher Scientific, Gothenburg, SE), αφαιρέθηκε το έμβολο και τοποθετήθηκε πάνω σε τρυβλίο Petri (σχήμα 1).1A). Αλλάζετε τη διατροφή σας κάθε μέρα. Διατηρήστε το εργαστήριο όπως περιγράφεται παραπάνω. Τα επιζώντα κουνούπια μετρήθηκαν δύο φορές την ημέρα, ενώ τα νεκρά κουνούπια απορρίφθηκαν μέχρι να πεθάνει το τελευταίο κουνούπι (n = 40 ανά θεραπεία). Η επιβίωση των κουνουπιών που τρέφονταν με διάφορες δίαιτες αναλύθηκε στατιστικά χρησιμοποιώντας καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meyer και δοκιμές log-rank. για να συγκρίνετε τις κατανομές επιβίωσης μεταξύ των δίαιτων (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).
Ένας ειδικά κατασκευασμένος ιπτάμενος μύλος κουνουπιών βασισμένος στους Attisano et al.[17], κατασκευασμένος από διαφανή ακρυλικά πάνελ πάχους 5 mm (πλάτος 10 cm x μήκος 10 cm x ύψος 10 cm) χωρίς μπροστινά και πίσω πάνελ (Εικ. 3: πάνω). Ένα περιστρεφόμενο συγκρότημα με έναν κατακόρυφο σωλήνα κατασκευασμένο από στήλη αεριοχρωματογραφίας (εσωτερική διάμετρος 0,25 mm, μήκος 7,5 cm) με άκρα κολλημένα σε μια βελόνα εντόμου αιωρούμενη ανάμεσα σε ένα ζεύγος μαγνητών νεοδυμίου σε απόσταση 9 cm μεταξύ τους. Ένας οριζόντιος σωλήνας κατασκευασμένος από το ίδιο υλικό (6,5 cm L) διέκοπτε τον κατακόρυφο σωλήνα για να σχηματίσει έναν δεμένο βραχίονα και έναν βραχίονα που έφερε ένα μικρό κομμάτι φύλλου αλουμινίου ως σήμα διακοπής φωτός.
Σε θηλυκά που είχαν λιμοκτονήσει για 24 ώρες δόθηκε η παραπάνω δίαιτα για 30 λεπτά πριν από την ακινητοποίηση. Τα πλήρως τρεφόμενα θηλυκά κουνούπια αναισθητοποιήθηκαν στη συνέχεια ατομικά σε πάγο για 2-3 λεπτά και προσαρτήθηκαν σε καρφίτσες εντόμων με κερί μέλισσας (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) και στη συνέχεια δέθηκαν στους βραχίονες των οριζόντιων σωλήνων. Ιπτάμενος μύλος. Οι περιστροφές ανά πτήση καταγράφηκαν από ένα ειδικά κατασκευασμένο καταγραφικό δεδομένων, στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν και εμφανίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE). Ο ιπτάμενος μύλος τοποθετήθηκε σε ένα δωμάτιο με ρυθμιζόμενο κλίμα (12 ώρες:12 ώρες, φως: σκοτάδι, 25 ± 2 °C, 65 ± 5% RH).
Για την απεικόνιση του μοτίβου της πτητικής δραστηριότητας, υπολογίστηκε η συνολική απόσταση που διανύθηκε (m) και ο συνολικός αριθμός διαδοχικών πτήσεων ανά ώρα σε διάστημα 24 ωρών. Επιπλέον, οι μέσες αποστάσεις που διανύθηκαν από μεμονωμένες γυναίκες συγκρίθηκαν μεταξύ των θεραπειών και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και ανάλυση post hoc του Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.), όπου η μέση απόσταση θεωρήθηκε εξαρτημένη μεταβλητή, ενώ η θεραπεία είναι ανεξάρτητος παράγοντας. Επιπλέον, ο μέσος αριθμός πτήσεων υπολογίζεται σε διαστήματα των 10 λεπτών.
Για να αξιολογηθεί η επίδραση της διατροφής στην αναπαραγωγική απόδοση του An.arabiensis, έξι θηλυκά (4 dpe) μεταφέρθηκαν απευθείας σε κλουβιά Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm) μετά τη συλλογή αίματος και στη συνέχεια τους χορηγήθηκε η πειραματική διατροφή για 48 ώρες όπως περιγράφεται παραπάνω. Στη συνέχεια, οι δίαιτες αφαιρέθηκαν και την τρίτη ημέρα δόθηκαν κύπελλα ωοτοκίας (30 ml· Nolato Hertila) γεμάτα με 20 ml απεσταγμένου νερού για 48 ώρες, αλλάζοντας κάθε 24 ώρες. Επαναλάβετε κάθε διατροφικό σχήμα 20-50 φορές. Τα αυγά μετρήθηκαν και καταγράφηκαν για κάθε πειραματικό κλουβί. Χρησιμοποιήθηκαν υποδείγματα αυγών για την αξιολόγηση της μέσης μεταβολής μεγέθους και μήκους των μεμονωμένων αυγών (n ≥ 200 ανά δίαιτα) χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Dialux-20 (DM1000· Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) εξοπλισμένο με κάμερα Leica (DFC) 320 R2. Leica Microsystems Ltd., Γερμανία). Τα υπόλοιπα αυγά διατηρήθηκαν σε κλιματιζόμενο δωμάτιο υπό τυπικές συνθήκες εκτροφής για 24 ώρες και μετρήθηκε ένα υποδείγμα πρόσφατα εμφανισμένων προνυμφών 1ου σταδίου (n ≥ 200 ανά δίαιτα), όπως περιγράφεται παραπάνω. Ο αριθμός των αυγών και το μέγεθος των αυγών και των προνυμφών συγκρίθηκαν μεταξύ των θεραπειών και χρησιμοποιώντας μονόδρομη ANOVA και ανάλυση post hoc του Tukey (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Πτητικές ουσίες από φρέσκα (1 ώρα μετά τη δειγματοληψία), ούρα 24 ωρών, 72 ωρών και 168 ωρών ηλικίας συλλέχθηκαν από δείγματα που συλλέχθηκαν από βοοειδή Zebu, φυλές Arsi. Για λόγους ευκολίας, δείγματα ούρων συλλέχθηκαν νωρίς το πρωί, ενώ οι αγελάδες βρίσκονταν ακόμα στον στάβλο. Συλλέχθηκαν δείγματα ούρων από 10 άτομα και 100-200 ml από κάθε δείγμα μεταφέρθηκαν σε μεμονωμένες σακούλες ψησίματος από πολυαμίδιο (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH and Co., Minden, DE) σε πολυαμίδιο 3 λίτρων με καπάκι σε πλαστικά βαρέλια χλωριούχου βινυλίου. Οι πτητικές ουσίες από κάθε δείγμα ούρων βοοειδών συλλέχθηκαν είτε απευθείας (φρέσκα) είτε μετά από ωρίμανση σε θερμοκρασία δωματίου για 24 ώρες, 72 ώρες και 168 ώρες, δηλαδή κάθε δείγμα ούρων ήταν αντιπροσωπευτικό για κάθε ηλικιακή ομάδα.
Για τη συλλογή πτητικών ουσιών από τον υπερκείμενο χώρο, χρησιμοποιήθηκε σύστημα κλειστού βρόχου για την κυκλοφορία ενός ρεύματος αερίου φιλτραρισμένου με ενεργό άνθρακα (100 ml min-1) μέσω ενός σάκου πολυαμιδίου στη στήλη προσρόφησης για 2,5 ώρες χρησιμοποιώντας αντλία κενού διαφράγματος (KNF Neuberger, Freiburg, DE). Ως έλεγχος, η συλλογή του υπερκείμενου χώρου πραγματοποιήθηκε από έναν άδειο σάκο πολυαμιδίου. Η στήλη προσρόφησης ήταν κατασκευασμένη από σωλήνα Teflon (5,5 cm x 3 mm id) που περιείχε 35 mg Porapak Q (50/80 mesh; Waters Associates, Milford, MA, ΗΠΑ) μεταξύ βυσμάτων υαλοβάμβακα. Πριν από τη χρήση, η στήλη ξεπλύθηκε με 1 ml επαναπεσταγμένου n-εξανίου (Merck, Darmstadt, DE) και 1 ml πεντανίου (99,0% καθαρός διαλύτης GC, Sigma Aldrich). Τα προσροφημένα πτητικά εκλούστηκαν με 400 μl πεντανίου. Οι συλλογές από τον υπερκείμενο χώρο συγκεντρώθηκαν και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν στους -20°C μέχρι να χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω ανάλυση.
Οι συμπεριφορικές αντιδράσεις των An που αναζητούν και τρώνε αίμα από κουνούπια An. Τα πτητικά εκχυλίσματα Headspace που συλλέχθηκαν από φρέσκα, 24ωρα, 72ωρα και 168ωρα ούρα αναλύθηκαν για πτητικά εκχυλίσματα από κουνούπια Arabidopsis χρησιμοποιώντας ένα ολφακτόμετρο με ευθύ γυάλινο σωλήνα [18]. Τα πειράματα διεξήχθησαν κατά τη διάρκεια του ZT 13-15, την περίοδο αιχμής της δραστηριότητας αναζήτησης κατοικίας του An. Arab [19]. Ένα ολφακτόμετρο με γυάλινο σωλήνα (80 cm × 9,5 cm id) φωτίστηκε με 3 ± 1 lx κόκκινου φωτός από πάνω. Ροή αέρα φιλτραρισμένου με άνθρακα και υγροποιημένου (25 ± 2 °C, 65 ± 2% σχετική υγρασία) πέρασε τη βιοδοκιμασία στα 30 cm s-1. Ο αέρας διέρχεται από μια σειρά από πλέγματα από ανοξείδωτο χάλυβα, δημιουργώντας μια στρωτή ροή και μια ομοιόμορφη δομή νέφους. Δοσομετρητής οδοντιατρικού ταμπόν (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB), αναρτημένο από ένα πηνίο 5 cm στο προσήνεμο άκρο του ολφακτόμετρου, με αλλαγές διεγέρτη κάθε 5 λεπτά. Για την ανάλυση, χρησιμοποιήθηκαν 10 μl από κάθε εκχύλισμα κεφαλής, αραιωμένα 1:10, ως ερέθισμα. Χρησιμοποιήθηκε ίση ποσότητα πεντανίου ως έλεγχος. Μεμονωμένα κουνούπια που αναζητούσαν ή ρουφούσαν αίμα τοποθετήθηκαν σε ατομικά κλουβιά απελευθέρωσης 2-3 ώρες πριν από την έναρξη του πειράματος. Ο κλωβός απελευθέρωσης τοποθετήθηκε στην πλευρά του ολφακτόμετρου που έδειχνε τον άνεμο και τα κουνούπια αφέθηκαν να εγκλιματιστούν για 1 λεπτό και στη συνέχεια άνοιξε η βαλβίδα πεταλούδας του κλωβού για απελευθέρωση. Η έλξη προς την αγωγή ή τον έλεγχο αναλύθηκε ως το ποσοστό των κουνουπιών που ήρθαν σε επαφή με την πηγή εντός 5 λεπτών από την απελευθέρωση. Κάθε πτητικό εκχύλισμα κεφαλής και έλεγχος επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 30 φορές και για να αποφευχθούν οι επιπτώσεις οποιασδήποτε ημέρας, δοκιμάστηκε ο ίδιος αριθμός θεραπειών και ελέγχων σε κάθε πειραματική ημέρα. Οι απαντήσεις αναζήτησης από ξενιστή και τρέφονταν με αίμα. Τα σύνολα αραβικού έναντι κεφαλής αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ονομαστική λογιστική παλινδρόμηση ακολουθούμενη από ζευγαρωτές συγκρίσεις για περιττές αναλογίες (JMP Pro, v14.0.0, SAS Ινστιτούτο Α.Ε.).
Απόκριση ωοτοκίας του An. Εκχυλίσματα κεφαλής από φρέσκα και παλαιωμένα ούρα αγελάδας αναλύθηκαν σε κλουβιά Bugdorm (30 cm × 30 cm × 30 cm· MegaView Science). Πλαστικά κύπελλα (30 mL· Nolato Hertila) γεμάτα με 20 mL απεσταγμένου νερού παρείχαν το υπόστρωμα ωοτοκίας και τοποθετήθηκαν σε αντίθετες γωνίες του κλουβιού, σε απόσταση 24 cm μεταξύ τους. Τα κύπελλα θεραπείας ρυθμίστηκαν με 10 μl κάθε εκχυλίσματος κεφαλής σε αραίωση 1:10. Χρησιμοποιήθηκε ίση ποσότητα πεντανίου για τη ρύθμιση του κυπέλλου ελέγχου. Τα κύπελλα θεραπείας και ελέγχου ανταλλάχθηκαν μεταξύ κάθε πειράματος για τον έλεγχο των επιδράσεων θέσης. Δέκα θηλυκά που τρέφονταν με αίμα απελευθερώθηκαν σε πειραματικά κλουβιά στο ZT 9-11 και τα αυγά σε κύπελλα μετρήθηκαν 24 ώρες αργότερα. Ο τύπος για τον υπολογισμό του δείκτη ωοτοκίας είναι: (ο αριθμός των αυγών που γεννήθηκαν στο κύπελλο θεραπείας - ο αριθμός των αυγών που γεννήθηκαν στο κύπελλο ελέγχου)/(ο συνολικός αριθμός των αυγών που γεννήθηκαν). Κάθε θεραπεία επαναλήφθηκε 8 φορές.
Η ανάλυση αεριοχρωματογραφίας και ανίχνευσης προτύπου ηλεκτρονικής κεραίας (GC-EAD) του θηλυκού An.arabiensis πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, τα φρέσκα πτητικά εκχυλίσματα του υπερκείμενου χώρου διαχωρίστηκαν χρησιμοποιώντας μια Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, ΗΠΑ) εξοπλισμένη με στήλη HP-5 (30 m × 0,25 mm εσωτερικές διαστάσεις, πάχος μεμβράνης 0,25 μm, Agilent Technologies). και ούρα γήρανσης. Ως κινητή φάση χρησιμοποιήθηκε υδρογόνο με μέσο γραμμικό ρυθμό ροής 45 cm s-1. Κάθε δείγμα (2 μl) εγχύθηκε για 30 δευτερόλεπτα σε λειτουργία χωρίς διαχωρισμό με θερμοκρασία εισόδου 225 °C. Η θερμοκρασία του φούρνου GC προγραμματίστηκε από 35 °C (διατήρηση 3 λεπτών) έως 300 °C (διατήρηση 10 λεπτών) στους 10 °C min-1. Στον διαχωριστή εκροής GC, προστέθηκαν 4 psi αζώτου και διαχωρίστηκαν 1:1 σε διασταύρωση χαμηλού νεκρού όγκου Gerstel 3D/2 (Gerstel, Mülheim, DE) μεταξύ του ανιχνευτή ιονισμού φλόγας και του EAD. Το τριχοειδές εκροής GC για το EAD διήλθε μέσω μιας γραμμής μεταφοράς Gerstel ODP-2, η οποία παρακολουθεί τη θερμοκρασία του φούρνου GC συν 5 °C, σε έναν γυάλινο σωλήνα (10 cm × 8 mm), όπου αναμίχθηκε με φιλτραρισμένο με άνθρακα, υγροποιημένο αέρα (1,5 l min-1). Η κεραία τοποθετήθηκε 0,5 cm από την έξοδο του σωλήνα. Κάθε μεμονωμένο κουνούπι αντιπροσώπευε μία επαναλαμβανόμενη αναπαραγωγή, και για τα κουνούπια που αναζητούσαν ξενιστή, πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον τρεις επαναλήψεις σε δείγματα ούρων κάθε ηλικίας.
Ταυτοποίηση βιοδραστικών ενώσεων σε συλλογές ούρων βοοειδών από φρέσκα και παλαιωμένα ζώα χρησιμοποιώντας συνδυασμένη GC και φασματόμετρο μάζας (GC-MS; 6890 GC και 5975 MS; Agilent Technologies) για την πρόκληση κεραιακών αποκρίσεων στην ανάλυση GC-EAD, που λειτουργεί σε λειτουργία ιονισμού ηλεκτρονίων στα 70 eV. Η GC ήταν εξοπλισμένη με τριχοειδή στήλη συντηγμένου πυριτίου επικαλυμμένη με HP-5MS UI (εσωτερική διάμετρος 60 m × 0,25 mm, πάχος μεμβράνης 0,25 μm) χρησιμοποιώντας ήλιο ως κινητή φάση με μέσο γραμμικό ρυθμό ροής 35 cm s-1. Ένα δείγμα 2 μl εγχύθηκε χρησιμοποιώντας τις ίδιες ρυθμίσεις εγχυτήρα και θερμοκρασία φούρνου όπως για την ανάλυση GC-EAD. Οι ενώσεις ταυτοποιήθηκαν με βάση τον χρόνο κατακράτησής τους (δείκτης Kovát) και τα φάσματα μάζας σε σύγκριση με την προσαρμοσμένη βιβλιοθήκη και τη βιβλιοθήκη NIST14 (Agilent). Οι ταυτοποιημένες ενώσεις επιβεβαιώθηκαν με την έγχυση αυθεντικών προτύπων (Πρόσθετο Αρχείο 1: Πίνακας S2). Για ποσοτικοποίηση, οξικός επτυλεστέρας (10 ng, χημική καθαρότητα 99,8%, Aldrich) εγχύθηκε ως εξωτερικό πρότυπο.
Αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας ενός συνθετικού μείγματος οσμής που αποτελείται από βιοδραστικές ενώσεις που εντοπίστηκαν σε φρέσκα και παλαιωμένα ούρα για την προσέλκυση του Ans.arabiensis που αναζητά και ρουφάει αίμα από τον ξενιστή, χρησιμοποιώντας το ίδιο ολφακτόμετρο και πρωτόκολλο όπως παραπάνω. Τα συνθετικά μείγματα μιμήθηκαν τη σύνθεση και τις αναλογίες των ενώσεων σε μικτά πτητικά εκχυλίσματα φρέσκων, 24ωρων, 48ωρων, 72ωρων και 168ωρων παλαιωμένων ούρων (Σχήμα 5D-G· Πρόσθετο Αρχείο 1: Πίνακας S2). Για την ανάλυση, χρησιμοποιήστε 10 μl αραίωσης 1:100 του πλήρως συνθετικού μείγματος, με συνολικό ρυθμό απελευθέρωσης που κυμαίνεται από περίπου 140-2400 ng h-1, για την αξιολόγηση της ελκυστικότητας για τα κουνούπια που ρουφούν αίμα και τα κουνούπια που ρουφούν αίμα. Στη συνέχεια, η δοκιμή εκτελείται σε πλήρη μείγματα, στα οποία αφαιρούνται τα αφαιρετικά μείγματα μεμονωμένων ενώσεων του πλήρους μείγματος. Οι απαντήσεις αναζήτησης από τον ξενιστή και τα κουνούπια που τρέφονται με αίμα Ans.Arab έναντι συνθετικών και αφαιρετικών μειγμάτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ονομαστική λογιστική παλινδρόμηση ακολουθούμενη από ζευγαρωτές συγκρίσεις για περιττές αναλογίες (JMP Pro, έκδοση 14.0.0, SAS Institute Inc.).
Για να αξιολογηθεί εάν τα ούρα αγελάδας θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως ένδειξη οικοτόπου για τα κουνούπια της ελονοσίας, φρέσκα και παλαιωμένα ούρα αγελάδας, που συλλέχθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, και νερό τοποθετήθηκαν σε κουβάδες των 3 λίτρων (100 ml) με πλέγμα και τοποθετήθηκαν σε παγίδες δολώματος ξενιστή. (Έκδοση BG-HDT· BioGents, Regensburg, DE). Δέκα παγίδες τοποθετήθηκαν σε απόσταση 50 μέτρων μεταξύ τους σε βοσκότοπους, 400 μέτρα από την κοινότητα του χωριού (Silay, Αιθιοπία, 5°53'24''N, 37°29'24''E) και χωρίς βοοειδή, σε μόνιμους χώρους αναπαραγωγής και χωριά. Πέντε παγίδες θερμάνθηκαν για να προσομοιωθεί η παρουσία ενός ξενιστή, ενώ πέντε παγίδες αφέθηκαν χωρίς θέρμανση. Κάθε θέση επεξεργασίας εναλλάσσεται κάθε βράδυ για συνολικά πέντε νύχτες. Οι αριθμοί κουνουπιών που συλλέχθηκαν σε παγίδες που δολώθηκαν με ούρα διαφορετικών ηλικιών συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας λογιστική παλινδρόμηση με διωνυμική κατανομή βήτα (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).
Σε ένα χωριό όπου ενδημεί η ελονοσία κοντά στην πόλη Μάκι, στην περιοχή Ορόμια της Αιθιοπίας (8° 11′ 08″ Β, 38° 81′ 70″ Α· Σχήμα 6Α). Η μελέτη διεξήχθη μεταξύ των μέσων Αυγούστου και των μέσων Σεπτεμβρίου πριν από τον ετήσιο εσωτερικό ψεκασμό υπολειμματικών ψεκασμών, μαζί με μια μακρά περίοδο βροχών. Για τη μελέτη επιλέχθηκαν πέντε ζεύγη σπιτιών (20-50 μέτρα μεταξύ τους) που βρίσκονται στα περίχωρα του χωριού (Εικ. 6Α). Τα κριτήρια που χρησιμοποιήθηκαν για την επιλογή των σπιτιών ήταν: δεν επιτρέπονταν ζώα στο σπίτι, δεν επιτρεπόταν το μαγείρεμα σε εσωτερικούς χώρους (άντληση καυσόξυλων ή κάρβουνου) (τουλάχιστον κατά τη διάρκεια της δοκιμαστικής περιόδου) και σπίτια με μέγιστο δύο κατοίκους, που κοιμόντουσαν σε αντιεντομοκτόνα. κάτω από την επεξεργασμένη κουνουπιέρα. Η ηθική έγκριση έχει χορηγηθεί από το Συμβούλιο Ελέγχου Δεοντολογίας Θεσμικής Έρευνας (IRB/022/2016) της Σχολής Φυσικών Επιστημών (CNS-IRB), Πανεπιστήμιο της Αντίς Αμπέμπα, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που έχουν θεσπιστεί από τη Διακήρυξη του Παγκόσμιου Ιατρικού Συλλόγου του Ελσίνκι. Η συγκατάθεση κάθε αρχηγού νοικοκυριού ελήφθη με τη βοήθεια του προσωπικού υγειονομικής επέκτασης. Ολόκληρη η διαδικασία εγκρίνεται από τις τοπικές διοικήσεις σε επίπεδο περιφέρειας και θαλάμου («kebele»). Ο πειραματικός σχεδιασμός ακολούθησε ένα σχέδιο λατινικού τετραγώνου 2 × 2, στο οποίο συνθετικά μείγματα και έλεγχοι ανατέθηκαν σε ζευγαρωμένα σπίτια την πρώτη νύχτα και ανταλλάχθηκαν μεταξύ των σπιτιών την επόμενη πειραματική νύχτα. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε δέκα φορές. Επιπλέον, για την εκτίμηση της δραστηριότητας των κουνουπιών σε επιλεγμένα σπίτια, οι παγίδες CDC ρυθμίστηκαν να λειτουργούν πέντε συνεχόμενες νύχτες στην αρχή, τη μέση και το τέλος της δοκιμής πεδίου την ίδια ώρα της ημέρας.
Ένα συνθετικό μείγμα που περιείχε έξι βιοδραστικές ενώσεις διαλύθηκε σε επτάνιο (βαθμός GC διαλύτη 97,0%, Sigma Aldrich) και απελευθερώθηκε στα 140 ng h-1 χρησιμοποιώντας έναν διανομέα φυτιλιού βαμβακιού [20]. Ο διανομέας φυτιλιού επέτρεψε την απελευθέρωση όλων των ενώσεων σε σταθερές αναλογίες καθ' όλη τη διάρκεια του 12ωρου πειράματος. Το επτάνιο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Το φιαλίδιο αιωρήθηκε δίπλα στο σημείο εισόδου της φωτοπαγίδας των Κέντρων Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, ΗΠΑ· Σχήμα 6Α). Οι παγίδες κρεμάστηκαν 0,8 - 1 m πάνω από το έδαφος, κοντά στους πρόποδες του κρεβατιού, και ένας εθελοντής κοιμήθηκε κάτω από μια μη επεξεργασμένη κουνουπιέρα και λειτούργησε μεταξύ 18:00 και 06:30. Τα κουνούπια που συλλέχθηκαν ανά φύλο και φυσιολογική κατάσταση (μη τροφοδοτημένα, τροφοδοτημένα, ημι-έγκυα και έγκυα [21] στη συνέχεια εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) για την αναγνώριση του είδους που μορφολογικά αναγνωρίστηκε ως A. gambiae sl. Μέλη του συμπλέγματος [23]. Στο Σε επιτόπια μελέτη, η παγίδευση ζευγαρωμένων σπιτιών αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα ονομαστικό λογιστικό μοντέλο προσαρμογής, όπου η έλξη ήταν η εξαρτημένη μεταβλητή και η μεταχείριση (συνθετικό μείγμα έναντι ελέγχου) ήταν το σταθερό αποτέλεσμα (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Εδώ, αναφέρουμε τις τιμές χ2 και p από το τεστ λόγου πιθανοφάνειας.
Αξιολογήστε εάν είναι ασφαλές. Το arabiensis μπόρεσε να λάβει ούρα, την κύρια πηγή αζώτου του, την ουρία, με άμεση σίτιση, εντός 48 ωρών από τη χορήγηση για 4 ημέρες μετά (dpe) δοκιμές σίτισης θηλυκών που αναζητούσαν ξενιστή και τρέφονταν με αίμα (Εικ. 1Α). Τόσο τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή όσο και τα θηλυκά που ρουφούσαν αίμα απορρόφησαν σημαντικά περισσότερη σακχαρόζη από οποιαδήποτε άλλη δίαιτα ή νερό (F(5.426) = 20,15, p < 0,0001 και F(5.299) = 56,00, p < 0,0001, αντίστοιχα· Εικ. 1Β,Γ). Επιπλέον, τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή έτρωγαν λιγότερο στα ούρα στις 72 ώρες σε σύγκριση με τα ούρα στις 168 ώρες (Εικ. 1Β). Όταν τους προσφέρθηκε μια δίαιτα που περιείχε ουρία, τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή απορρόφησαν σημαντικά μεγαλύτερη ποσότητα ουρίας στα 2,69 mM σε σύγκριση με όλες τις άλλες συγκεντρώσεις και νερό, ενώ δεν διακρινόταν από 10% σακχαρόζη (F(10.813) = 15,72, p < 0,0001; Σχήμα 1D). Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την απόκριση των θηλυκών που τρέφονταν με αίμα, τα οποία συνήθως απορρόφησαν σημαντικά περισσότερες τροφές που περιείχαν ουρία από ό,τι νερό, αν και σημαντικά λιγότερο από 10% σακχαρόζη (F(10.557) = 78,35, p < 0,0001; Σχήμα 1).1E). Επιπλέον, κατά τη σύγκριση μεταξύ των δύο φυσιολογικών καταστάσεων, τα θηλυκά που είχαν υποστεί φλεβοτομή απορρόφησαν περισσότερη ουρία από τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις και αυτά τα θηλυκά απορρόφησαν παρόμοιες ποσότητες ουρίας σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (F(1.953) = 78,82, p < 0,0001; Σχήμα 1F, G). Ενώ η πρόσληψη από μια δίαιτα που περιείχε ουρία φάνηκε να έχει βέλτιστες τιμές (Εικόνα 1D, E), τα θηλυκά και στις δύο φυσιολογικές καταστάσεις ήταν σε θέση να ρυθμίσουν την ποσότητα ουρίας που απορροφήθηκε σε ολόκληρο το εύρος των συγκεντρώσεων ουρίας με λογαριθμικό γραμμικό τρόπο (Εικόνα 1F, G). ).Ομοίως, τα κουνούπια φαίνεται να ελέγχουν την πρόσληψη αζώτου ρυθμίζοντας την ποσότητα των ούρων που απορροφώνται, καθώς η ποσότητα αζώτου στα ούρα αντικατοπτρίζεται στην ποσότητα που απορροφάται (ένθετα Σχήματα 1Β, Γ και Β).
Για να αξιολογηθούν οι επιδράσεις των ούρων και της ουρίας στην επιβίωση των κουνουπιών που αναζητούν ξενιστή και των κουνουπιών που ρουφούν αίμα, τα θηλυκά τράφηκαν με ούρα και των τεσσάρων ηλικιών (φρέσκα, 24 ώρες, 72 ώρες και 168 ώρες μετά την εναπόθεση) και ένα εύρος συγκεντρώσεων ουρίας, καθώς και απεσταγμένο νερό και 10% σακχαρόζη χρησίμευσαν ως έλεγχος (Σχήμα 2Α). Αυτή η ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι η διατροφή είχε σημαντική επίδραση στη συνολική επιβίωση στα θηλυκά που αναζητούν ξενιστή (ούρα: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001· ουρία: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001· Σχήμα 2Β, Γ) και στα θηλυκά που τρέφονταν με αίμα (ούρα: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001· ουρία: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001· Σχήμα 2Δ,Ε). Σε όλα τα πειράματα, τα θηλυκά τράφηκαν με Η δίαιτα ούρων, ουρίας και νερού είχε σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά επιβίωσης σε σύγκριση με τα θηλυκά που τράφηκαν με δίαιτα σακχαρόζης (Σχήμα 2Β-Ε). Τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή και τράφηκαν με φρέσκα και μπαγιάτικα ούρα εμφάνισαν διαφορετικά ποσοστά επιβίωσης, με εκείνα που τράφηκαν με μπαγιάτικα ούρα 72 ωρών (p = 0,016) να έχουν τη χαμηλότερη πιθανότητα επιβίωσης (Σχήμα 2Β). Επιπλέον, τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή τράφηκαν με 135 mM ουρία επιβίωσαν περισσότερο από τις ομάδες ελέγχου με νερό (p < 0,04) (Σχήμα 2Γ). Σε σύγκριση με το νερό, οι γυναίκες που τράφηκαν με φρέσκα ούρα και ούρα 24 ωρών επιβίωσαν περισσότερο (p = 0,001 και p = 0,012, αντίστοιχα· Σχήμα 2Δ), ενώ οι γυναίκες που τράφηκαν με ούρα 72 ωρών επιβίωσαν περισσότερο από εκείνες που τράφηκαν με κοντά φρέσκα ούρα και ούρα 24 ωρών (p < 0,0001 και p = 0,013, αντίστοιχα· Σχήμα 2Δ). Όταν τράφηκαν με 135 mM ουρία, τα θηλυκά που τράφηκαν με αίμα επιβίωσαν περισσότερο από όλες τις άλλες συγκεντρώσεις ουρίας και νερού (p < 0,013· Σχήμα 2Ε).
Επιβίωση του ξενιστή και των θηλυκών Anopheles arabinis που τρέφονται με ούρα αγελάδας και ουρία. Στη βιοδοκιμασία (Α), τα θηλυκά κουνούπια έλαβαν μια διατροφή που αποτελούνταν από φρέσκα και παλαιωμένα ούρα αγελάδας, διάφορες συγκεντρώσεις ουρίας, σακχαρόζη (10%) και απεσταγμένο νερό (H2O). Η επιβίωση των κουνουπιών που αναζητούν τον ξενιστή (B, C) και των κουνουπιών που ρουφούν αίμα (D, E) καταγράφηκε κάθε 12 ώρες μέχρι να πεθάνουν όλα τα θηλυκά που τρέφονταν με ούρα (B, D) και ουρία (C, E), και οι μάρτυρες, σακχαρόζη και νερό.
Η συνολική απόσταση και ο αριθμός των γύρων που προσδιορίστηκαν στη δοκιμή μύλου πτήσης σε διάστημα 24 ωρών διέφεραν μεταξύ των κουνουπιών που αναζητούσαν ξενιστή και των κουνουπιών που ρουφούσαν αίμα, τα οποία έδειξαν συνολικά μικρότερη δραστηριότητα πτήσης (Εικ. 3). Τα κουνούπια που αναζητούσαν ξενιστή και παρείχαν φρέσκα και παλαιωμένα ούρα ή σακχαρόζη και νερό εμφάνισαν διακριτά πρότυπα πτήσης (Εικ. 3), με τα θηλυκά που τρέφονταν με φρέσκα ούρα να είναι πιο δραστήρια την αυγή, ενώ εκείνα που τρέφονταν με κουνούπια ηλικίας 24 και 168 ωρών που τρέφονταν με ούρα εμφάνισαν διαφορετικά πρότυπα πτήσης και ήταν κυρίως ημερήσια. Τα θηλυκά κουνούπια που παρείχαν σακχαρόζη ή ούρα 72 ωρών εμφάνισαν δραστηριότητα καθ' όλη τη διάρκεια του 24ώρου, ενώ τα θηλυκά που παρείχαν νερό ήταν πιο δραστήρια κατά τη διάρκεια της μέσης περιόδου. Τα κουνούπια που τρέφονταν με σακχαρόζη εμφάνισαν τα υψηλότερα επίπεδα δραστηριότητας αργά το βράδυ και νωρίς το πρωί, ενώ εκείνα που κατάπιαν ούρα ηλικίας 72 ωρών παρουσίασαν σταθερή μείωση της δραστηριότητας σε διάστημα 24 ωρών (Εικ. 3).
Απόδοση πτήσης θηλυκών Anopheles arabinis που αναζητούν αίμα και τρέφονται με ούρα αγελάδας και ουρία. Στη δοκιμή πτητικής μύλης, θηλυκά κουνούπια που τρέφονταν με φρέσκα και παλαιωμένα ούρα αγελάδας, διάφορες συγκεντρώσεις ουρίας, σακχαρόζης (10%) και απεσταγμένου νερού (H2O) ήταν δεμένα σε οριζόντιους, ελεύθερα περιστρεφόμενους βραχίονες (παραπάνω). Για τα θηλυκά που αναζητούν αίμα (αριστερά) και τα θηλυκά που αναζητούν αίμα (δεξιά), καταγράφηκε η συνολική απόσταση και ο αριθμός των πτήσεων ανά ώρα για κάθε δίαιτα σε διάστημα 24 ωρών (σκούρο: γκρι· ανοιχτό: λευκό). Η μέση απόσταση και ο μέσος αριθμός των πτήσεων εμφανίζονται στα δεξιά του γραφήματος της κιρκαδικής δραστηριότητας. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου. Στατιστική ανάλυση βλ. κείμενο.
Γενικά, η συνολική πτητική δραστηριότητα των θηλυκών που αναζητούσαν ξενιστή ακολούθησε ένα μοτίβο παρόμοιο με αυτό της απόστασης πτήσης σε διάστημα 24 ωρών. Η μέση απόσταση πτήσης επηρεάστηκε σημαντικά από την τροφή που κατανάλωσαν (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), και τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή και κατανάλωναν 72 ώρες ούρων, πέταξαν σημαντικά μεγαλύτερες αποστάσεις σε σύγκριση με όλες τις άλλες δίαιτες (p < 0,0001), και τα κουνούπια που τρέφονταν με σακχαρόζη πέταξαν περισσότερο από τα κουνούπια που τρέφονταν με φρέσκα (p = 0,022) και τα κουνούπια που τρέφονταν με ούρα 24 ωρών (p = 0,022). Σε αντίθεση με το μοτίβο πτητικής δραστηριότητας που περιγράφεται από τη δίαιτα με ούρα, τα θηλυκά που τρέφονταν με ουρία και αναζητούσαν ξενιστή εμφάνισαν επίμονη πτητική δραστηριότητα σε διάστημα 24 ωρών, με κορύφωση κατά το δεύτερο μισό της σκοτεινής φάσης (Εικ. 3). Αν και τα μοτίβα δραστηριότητας ήταν παρόμοια, τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή και τρέφονταν με ουρία αύξησαν σημαντικά τη μέση απόσταση πτήσης ανάλογα με την απορροφούμενη συγκέντρωση (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Τα θηλυκά που αναζητούσαν ξενιστή και τράφηκαν με οποιαδήποτε συγκέντρωση ουρίας πέταξαν περισσότερο χρόνο από τα θηλυκά που τράφηκαν είτε με νερό είτε με σακχαρόζη (p < 0,03).
Η συνολική πτητική δραστηριότητα των κουνουπιών που ρουφούν αίμα ήταν σταθερή και διατηρήθηκε για 24 ώρες σε όλες τις δίαιτες, με αυξημένη δραστηριότητα ούρων κατά το δεύτερο μισό της σκοτεινής περιόδου για τα θηλυκά που τρέφονταν με νερό, καθώς και για τα θηλυκά που τρέφονταν φρέσκα και 24 ωρών (εικόνα 3). Ενώ η δίαιτα με ούρα επηρέασε σημαντικά τη μέση απόσταση πτήσης στα θηλυκά που τρέφονταν με αίμα (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), η δίαιτα με ουρία δεν επηρέασε (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24) με άλλα ούρα και δίαιτα ελέγχου (φρέσκο, p = 0,0091; 72 ώρες, p = 0,0022; 168 ώρες, p = 0,001; σακχαρόζη, p = 0,0017; dH2O, p = 0,036).
Οι επιδράσεις της διατροφής με ούρα και ουρία στις αναπαραγωγικές παραμέτρους αξιολογήθηκαν σε βιοδοκιμές ωοτοκίας (Σχήμα 4Α) και διερευνήθηκαν σύμφωνα με τον αριθμό των αυγών που γέννησε κάθε θηλυκό, το μέγεθος του αυγού και τις νεοεκκολαφθείσες προνύμφες πρώτου σταδίου. Ο αριθμός των αυγών που γέννησε. Τα θηλυκά αραβικής καταγωγής που τρέφονταν με ούρα διέφεραν ανάλογα με τη διατροφή (F(5.222) = 4,38, p = 0,0008· Σχήμα 4Β). Τα θηλυκά που τράφηκαν με ούρα 24 ωρών και αιματάλευρο γέννησαν σημαντικά περισσότερα αυγά από τα θηλυκά που τράφηκαν με άλλες δίαιτες με ούρα και ήταν παρόμοια με εκείνα που τράφηκαν με σακχαρόζη (Σχήμα 4Β). Ομοίως, το μέγεθος των αυγών που γέννησαν τα θηλυκά που τράφηκαν με ούρα διέφερε ανάλογα με τη διατροφή (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), με τα θηλυκά που τράφηκαν με ούρα 24 ωρών και με σακχαρόζη να γεννούν σημαντικά μεγαλύτερα αυγά από τα θηλυκά που τράφηκαν με νερό, ενώ τα αυγά των θηλυκών που τράφηκαν με 168 ώρες ούρων ήταν σημαντικά μικρότερα (Σχήμα 4Γ). Επιπλέον, η διατροφή με ούρα επηρέασε σημαντικά το μέγεθος των προνυμφών (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), με σημαντικά μεγαλύτερες προνύμφες να αναδύονται από αυγά που γεννήθηκαν από θηλυκά ηλικίας 24 και 72 ωρών που τρέφονταν με ούρα σε σχέση με αυγά που γεννήθηκαν από προνύμφες αυγών. Θηλυκά που τρέφονταν με νερό και θηλυκά που τρέφονταν με ούρα σε ηλικία 168 ωρών (Σχήμα 4D).
Αναπαραγωγική απόδοση θηλυκών κουνουπιών Anopheles arabinis που τρέφονται με ούρα αγελάδας και ουρία. Τα θηλυκά κουνούπια που τρέφονταν με αίμα τράφηκαν με τροφές που αποτελούνταν από φρέσκα και παλαιωμένα ούρα αγελάδας, διάφορες συγκεντρώσεις ουρίας, σακχαρόζη (10%) και απεσταγμένο νερό (H2O) για 48 ώρες πριν τοποθετηθούν σε βιολογικές δοκιμασίες και λάβουν υποστρώματα ωοτοκίας για 48 ώρες (A). Ο αριθμός των αυγών (B, E), το μέγεθος των αυγών (C, F) και το μέγεθος των προνυμφών (D, G) επηρεάστηκαν σημαντικά από την παρεχόμενη διατροφή (ούρα αγελάδας: BD· ουρία: EG). Οι μέσοι όροι για κάθε παράμετρο που μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας διαφορετικά ονόματα γραμμάτων διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους (μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας ανάλυση post hoc του Tukey· p < 0,05). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου.
Ως το κύριο αζωτούχο συστατικό των ούρων, η ουρία, όταν χορηγήθηκε ως τροφή σε θηλυκά που τρέφονταν με αίμα, επηρέασε σημαντικά τις αναπαραγωγικές παραμέτρους σε όλες τις μελέτες. Ο αριθμός των αυγών που γεννήθηκαν από τα θηλυκά που τρέφονταν με ουρία, μετά από ένα γεύμα αίματος, ανάλογα με τη συγκέντρωση ουρίας (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), τα θηλυκά που τρέφονταν με συγκεντρώσεις ουρίας μεταξύ 134 µM και 1,34 mM γέννησαν περισσότερα αυγά (Σχήμα 4E). Τα θηλυκά που τρέφονταν με συγκεντρώσεις ουρίας 134 µM ή περισσότερο γέννησαν μεγαλύτερα αυγά από τα θηλυκά που τρέφονταν με νερό (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Σχήμα 4F), και το μέγεθος των προνυμφών, αν και επηρεάστηκαν από παρόμοιες συγκεντρώσεις ουρίας στις μητέρες (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) ήταν πιο μεταβλητό (Σχήμα 4G).
Συνολική ελκυστικότητα για πτητικά εκχυλίσματα ούρων βοοειδών που αναζητούν ξενιστή. Το arabiensis που αξιολογήθηκε στο ολφακτόμετρο γυάλινου σωλήνα (Εικ. 5Α) επηρεάστηκε σημαντικά από την ηλικία των ούρων (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032· Εικ. 5Β). Η εκ των υστέρων ανάλυση έδειξε ότι η μπαγιάτικη οσμή ούρων στις 24 ώρες προκάλεσε σημαντικά υψηλότερα επίπεδα ελκυστικότητας σε σύγκριση με όλες τις άλλες θεραπείες (72 ώρες: p = 0,0060, 168 ώρες: p = 0,012, πεντάνιο: p = 0,00070), εκτός από τη μυρωδιά των φρέσκων ούρων (p = 0,13· Σχήμα 5Β). Αν και η συνολική έλξη των κουνουπιών που ρουφούν αίμα στην οσμή των ούρων δεν ήταν σημαντικά διαφορετική (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067· Εικ. 5C), αυτά τα θηλυκά βρέθηκαν να είναι σημαντικά πιο ελκυστικά για πτητικά εκχυλίσματα ούρων σε σύγκριση με τα ούρα 72 ωρών ηλικίας σε σύγκριση με τους μάρτυρες (p = 0,0066· Σχήμα 5Γ).
Συμπεριφορικές αντιδράσεις σε φυσικές και συνθετικές οσμές ούρων αγελάδας στην αναζήτηση ξενιστή και αιματοσιτιζόμενου Anopheles arabianus. Σχηματική απεικόνιση του ολφακτόμετρου από γυάλινο σωλήνα (A). Προσέλκυση πτητικών εκχυλισμάτων κεφαλής από φρέσκα και παλαιωμένα ούρα αγελάδας σε κουνούπια ξενιστή (B) και κουνούπια που ρουφούν αίμα (C). Βρείτε την αντίδραση πλοκαμιού του Lord An. Εμφανίζονται εκχυλίσματα κεφαλής που απομονώθηκαν από φρέσκα (D), 24ωρα (E), 72ωρα (F) και 168ωρα (G) παλαιωμένα ούρα αγελάδας. Τα ίχνη ανίχνευσης ηλεκτρονικής κεραίας (EAD) δείχνουν αλλαγές τάσης σε απόκριση σε βιοδραστικές ενώσεις στον κεφαλή που εκλούονται από τον αεριοχρωματογράφο και ανιχνεύονται από ανιχνευτή ιονισμού φλόγας (FID). Η ράβδος κλίμακας αντιπροσωπεύει το πλάτος απόκρισης (mV) έναντι του χρόνου κατακράτησης (s). Εμφανίζονται οι ιδιότητες και οι ρυθμοί απελευθέρωσης (µg h-1) των βιολογικά δραστικών ενώσεων. Ένας μονός αστερίσκος (*) υποδεικνύει μια συνεπή απόκριση χαμηλού πλάτους. Οι διπλοί αστερίσκοι (**) υποδεικνύουν μη αναπαραγώγιμες αντιδράσεις. Βρείτε τον ξενιστή (H) και Το αιμορραγούν (I) An.arabiensis έχει διαφορετική έλξη σε συνθετικά μείγματα φρέσκων και παλαιωμένων οσμών ούρων αγελάδας. Οι μέσες αναλογίες κουνουπιών που προσελκύονται από διαφορετικά ονόματα γραμμάτων διέφεραν σημαντικά μεταξύ τους (μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας την ανάλυση post hoc του Tukey· p < 0,05). Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα της κλίμακας.
Θηλυκό Ann.arabiensis, 72 ώρες και 120 ώρες μετά το αιματοφάγο, κατά την ωοτοκία, δεν παρατηρήθηκε προτίμηση για πτητικά εκχυλίσματα από φρέσκα και παλαιωμένα ούρα αγελάδας σε σύγκριση με τους μάρτυρες με πεντάνιο (χ2 = 3,07, p > 0,05; Πρόσθετο αρχείο 1: Σχήμα S1).
Για τα θηλυκά Ann.arabiensis, οι αναλύσεις GC-EAD και GC-MS αναγνώρισαν οκτώ, έξι, τρεις και τρεις βιοδραστικές ενώσεις (Σχήμα 5D-G). Παρόλο που παρατηρήθηκαν διαφορές στον αριθμό των ενώσεων που προκάλεσαν ηλεκτροφυσιολογικές αποκρίσεις, οι περισσότερες από αυτές τις ενώσεις ήταν παρούσες σε κάθε πτητικό εκχύλισμα υπερκείμενου χώρου που συλλέχθηκε από φρέσκα και παλαιωμένα ούρα. Επομένως, για κάθε εκχύλισμα, μόνο οι ενώσεις που προκάλεσαν φυσιολογική απόκριση από τις θηλυκές κεραίες πάνω από το όριο συμπεριλήφθηκαν σε περαιτέρω αναλύσεις.
Ο συνολικός ρυθμός απελευθέρωσης πτητικών βιοδραστικών ενώσεων στη συλλογή του υπερκείμενου ουροποιητικού αυξήθηκε από 29 µg h-1 σε φρέσκα ούρα σε 242 µg h-1 σε ούρα 168 ωρών, κυρίως λόγω της p-κρεσόλης και της m-φορμαλδεΰδης. Αυξήσεις στη φαινόλη καθώς και στη φαινόλη. Αντίθετα, οι ρυθμοί απελευθέρωσης άλλων ενώσεων, όπως η 2-κυκλοεξεν-1-όνη και η δεκανάλη, μειώθηκαν με την αύξηση της ηλικίας των ούρων, γεγονός που συσχετίστηκε με την παρατηρούμενη μείωση της έντασης του σήματος (αφθονία) στο χρωματογράφημα (Εικ. 5D)-G αριστερό πλαίσιο) και τις φυσιολογικές αποκρίσεις σε αυτές τις ενώσεις (Εικ. 5D-G δεξί πλαίσιο).
Συνολικά, το συνθετικό μείγμα είχε παρόμοια φυσική αναλογία βιοδραστικών ενώσεων που εντοπίστηκαν σε πτητικά εκχυλίσματα φρέσκων και παλαιωμένων ούρων (Εικ. 5D-G) και δεν φάνηκε να προκαλεί σημαντική έλξη στην αναζήτηση ξενιστή (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083· Εικ. 5H) ή κουνουπιών που ρουφούν αίμα (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30· Εικ. 5I). Ωστόσο, οι συγκρίσεις ζευγών μεταξύ των θεραπειών έδειξαν ότι τα κουνούπια που αναζητούσαν ξενιστή ήταν σημαντικά ελκυστικά για το συνθετικό μείγμα 24ωρων παλαιωμένων ούρων σε σύγκριση με τους μάρτυρες πεντανίου (p = 0,0086· Σχήμα 5H).
Για την αξιολόγηση του ρόλου των μεμονωμένων συστατικών σε συνθετικά μείγματα ούρων 24 ωρών, αξιολογήθηκαν έξι αφαιρετικά μείγματα έναντι πλήρων μειγμάτων στη δοκιμασία Y-tube, στην οποία αφαιρέθηκαν μεμονωμένες ενώσεις. Για τα κουνούπια που αναζητούν ξενιστή, η αφαίρεση μεμονωμένων ενώσεων από το πλήρες μείγμα είχε σημαντική επίδραση στις συμπεριφορικές αποκρίσεις (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Πρόσθετο αρχείο 1: Σχήμα S2A), όλα τα αφαιρετικά μείγματα ήταν πιο ελκυστικά από ό,τι πλήρως αναμεμειγμένα. Αντίθετα, η αφαίρεση μεμονωμένων ενώσεων από το πλήρως συνθετικό μείγμα δεν επηρέασε τις συμπεριφορικές αποκρίσεις των κουνουπιών που ρουφούν αίμα (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), με εξαίρεση τη δεκανάλη, η οποία είχε ως αποτέλεσμα χαμηλότερα επίπεδα σε σύγκριση με το πλήρες μείγμα Attraction (p = 0,022; Πρόσθετο αρχείο 1: Σχήμα S2B).
Σε ένα χωριό στην Αιθιοπία, όπου ενδημεί η ελονοσία, αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα ενός συνθετικού μείγματος ούρων αγελάδας 24 ωρών στην προσέλκυση κουνουπιών υπό συνθήκες πεδίου για δέκα νύχτες (Εικ. 6Α). Συνολικά 4.861 κουνούπια συνελήφθησαν και ταυτοποιήθηκαν, εκ των οποίων το 45,7% ήταν Anthropus.gambiae sl, το 18,9% ήταν Anopheles pharoensis και το 35,4% ήταν Culex spp. (Πρόσθετο αρχείο 1: Πίνακας S1). Το Anopheles arabinis είναι το μόνο μέλος του συμπλέγματος ειδών An.Gambian που ταυτοποιήθηκε με ανάλυση PCR. Κατά μέσο όρο, 320 κουνούπια συνελήφθησαν ανά νύχτα, κατά τη διάρκεια του οποίου οι παγίδες με συνθετικά δολώματα έπιασαν περισσότερα κουνούπια από τις ζευγαρωμένες παγίδες χωρίς μείγμα (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). Μη δολωμένες παγίδες τοποθετήθηκαν σε καθεμία από τις πέντε νύχτες ελέγχου στην αρχή, στη μέση και στο τέλος της δοκιμής. Παρόμοιος αριθμός κουνουπιών συνελήφθη σε κάθε ζεύγος παγίδες, υποδεικνύοντας ότι δεν υπήρξε μεροληψία μεταξύ των κατοικιών (χ2(0, 1665) = 9 × 10-13, p > 0,05) και καμία μείωση του πληθυσμού κατά την περίοδο μελέτης. Σε σύγκριση με τις παγίδες ελέγχου, ο αριθμός των κουνουπιών που πιάστηκαν στις παγίδες που περιείχαν το συνθετικό μείγμα αυξήθηκε σημαντικά: αναζήτηση ξενιστή (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), πρόσφατη σίτιση με αίμα (χ2(0, 650) = 32,2, p < 0,0001) και εγκυμοσύνη (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Πρόσθετο αρχείο 1: Πίνακας S1). Αυτό αντικατοπτρίζεται επίσης στον συνολικό αριθμό κουνουπιών που πιάστηκαν: αναζήτηση ξενιστή > αιμορραγία > έγκυος > ημι-έγκυος > αρσενικό.
Αξιολόγηση πεδίου της αποτελεσματικότητας ενός 24ωρου συνθετικού μείγματος οσμής ούρων αγελάδας. Οι δοκιμές πεδίου διεξήχθησαν στη νοτιοκεντρική Αιθιοπία (χάρτης), κοντά στην πόλη Μάκι (εισαγωγή), χρησιμοποιώντας μια φωτεινή παγίδα των Κέντρων Ελέγχου και Πρόληψης Νοσημάτων (CDC) (δεξιά) σε ζευγαρωμένα σπίτια, με σχέδιο λατινικού τετραγώνου (εναέρια εικόνα) (Α). Οι συνθετικές φωτοπαγίδες CDC με δόλωμα οσμής προσελκύουν και συλλαμβάνουν θηλυκά Anopheles arabesques (Β), αλλά όχι Anopheles farroes (Γ), με διαφορετικό τρόπο, ένα φαινόμενο που εξαρτάται από τη φυσιολογική κατάσταση. Επιπλέον, αυτές οι παγίδες συνέλαβαν σημαντικά αυξημένο αριθμό κουνουπιών ξενιστών Culex. (Δ) Σε σύγκριση με τον έλεγχο. Οι ράβδοι στα αριστερά αντιπροσωπεύουν τον μέσο δείκτη επιλογής κουνουπιών που αλιεύτηκαν σε ζεύγη παγίδων οσμητικού δολώματος (πράσινο) και ελέγχου (ανοιχτές) (N = 10), ενώ οι ράβδοι στα δεξιά αντιπροσωπεύουν τον μέσο δείκτη επιλογής σε ζεύγη παγίδων ελέγχου (ανοιχτές· N = 5). Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας (*p = 0,01 και ***p < 0,0001)
Τα τρία είδη παγιδεύτηκαν με διαφορετικό τρόπο σε παγίδες που περιείχαν συνθετικά μείγματα. Αναζητώντας ξενιστή (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), τροφοδοτώντας με αίμα (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) και κυοφορώντας (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134), ένα .arabiensis παγιδεύτηκε στην παγίδα απελευθερώνοντας το συνθετικό μείγμα (Εικ. 6Β), ενώ η ποσότητα του An δεν διέφερε. Διαπιστώθηκε Pharoensis σε διαφορετικές φυσιολογικές καταστάσεις (Εικ. 6C). Για το Culex, διαπιστώθηκε μόνο σημαντική αύξηση στον αριθμό των κουνουπιών που αναζητούσαν ξενιστές σε παγίδες που δολώθηκαν με το συνθετικό μείγμα (χ2(1,1319) = 12,6, p = 0,0004; Εικ. 6D), σε σύγκριση με τις παγίδες ελέγχου.
Παγίδες δολώματος ξενιστή που βρίσκονται εκτός πιθανών ξενιστών, μεταξύ περιοχών αναπαραγωγής και αγροτικών κοινοτήτων στην Αιθιοπία, χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί εάν τα κουνούπια ελονοσίας χρησιμοποιούν την οσμή των ούρων αγελάδας ως ένδειξη οικοτόπου ξενιστή. Ελλείψει ενδείξεων ξενιστή, θερμότητας και με ή χωρίς την παρουσία οσμής ούρων αγελάδας, δεν συλλέχθηκαν κουνούπια (Πρόσθετο αρχείο 1: Σχήμα S3). Ωστόσο, παρουσία υψηλής θερμοκρασίας και οσμής ούρων αγελάδας, τα θηλυκά κουνούπια ελονοσίας προσελκύστηκαν και συλλέχθηκαν, αν και σε μικρούς αριθμούς, ανεξάρτητα από την ηλικία των ούρων (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Πρόσθετο αρχείο 1: Σχήμα S3). Αντίθετα, οι έλεγχοι νερού δεν συνέλαβαν κουνούπια ελονοσίας σε υψηλές θερμοκρασίες (Πρόσθετο αρχείο 1: Σχήμα S3).
Τα κουνούπια της ελονοσίας αποκτούν και κατανέμουν αζωτούχες ενώσεις μέσω αντισταθμιστικής διατροφής με ούρα αγελάδας (δηλαδή, λακκούβες) για να ενισχύσουν τα χαρακτηριστικά του κύκλου ζωής τους, παρόμοια με άλλα έντομα [2, 4, 24, 25, 26]. Τα ούρα αγελάδας είναι ένας άμεσα διαθέσιμος ανανεώσιμος πόρος που συνδέεται στενά με τους χώρους ανάπαυσης των φορέων της ελονοσίας, όπως τα στάβλοι και η ψηλή βλάστηση κοντά σε αγροτικές κατοικίες και σημεία ωοτοκίας. Τα θηλυκά κουνούπια εντοπίζουν αυτόν τον πόρο μέσω της όσφρησης και είναι σε θέση να ρυθμίζουν την πρόσληψη αζωτούχων ενώσεων στα ούρα, συμπεριλαμβανομένης της ουρίας, του κύριου αζωτούχου συστατικού στα ούρα [15, 16]. Ανάλογα με τη φυσιολογική κατάσταση του θηλυκού κουνουπιού, τα θρεπτικά συστατικά στα ούρα κατανέμονται για να ενισχύσουν την πτητική δραστηριότητα και την επιβίωση των θηλυκών κουνουπιών που αναζητούν ξενιστή, καθώς και τα χαρακτηριστικά επιβίωσης και αναπαραγωγής των ατόμων που τρέφονται με αίμα κατά τον πρώτο γοναδοτροπικό κύκλο. Επομένως, η ανάμειξη ούρων παίζει σημαντικό θρεπτικό ρόλο για τους φορείς της ελονοσίας που είναι κλειστοί όπως οι υποσιτισμένοι ενήλικες [8], καθώς παρέχει στα θηλυκά κουνούπια την ικανότητα να αποκτούν σημαντικές αζωτούχες ενώσεις συμμετέχοντας σε τροφοδότηση χαμηλού κινδύνου. Αυτό το εύρημα έχει σημαντικές επιδημιολογικές συνέπειες, καθώς τα θηλυκά αυξάνουν τη διάρκεια ζωής τους. προσδόκιμο ζωής, δραστηριότητα και αναπαραγωγική απόδοση, τα οποία επηρεάζουν την ικανότητα των φορέων. Επιπλέον, αυτή η συμπεριφορά μπορεί να αποτελέσει τον στόχο μελλοντικών προγραμμάτων διαχείρισης φορέων.