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微生物腐食（MIC）は、莫大な経済的損失につながる可能性があるため、多くの産業で深刻な問題となっています。スーパーデュプレックスステンレス鋼2707（2707 HDSS）は、優れた耐薬品性のため海洋環境で使用されています。しかし、MICに対する耐性は実験的に実証されていません。本研究では、海洋好気性細菌Pseudomonas aeruginosaによって引き起こされるMIC 2707 HDSSの挙動を調べました。電気化学分析の結果、2216E培地中にPseudomonas aeruginosaバイオフィルムが存在すると、腐食電位の正の変化と腐食電流密度の増加が起こることが示されました。X線光電子分光法（XPS）の分析では、バイオフィルム下のサンプル表面のCr含有量の減少が示されました。ピットの目視分析では、P. aeruginosaバイオフィルムは14日間の培養中に最大0.69 µmのピット深さを生成したことが示されました。これは小さい数値ではあるが、2707 HDSSが緑膿菌バイオフィルムのMICに対して完全に免疫を持っているわけではないことを示している。
二相ステンレス鋼（DSS）は、優れた機械的特性と耐食性の完璧な組み合わせにより、さまざまな産業で広く使用されています1,2。しかし、局所的な孔食は依然として発生し、この鋼の完全性に影響を与えます3,4。DSSは微生物腐食（MIC）に耐性がありません5,6。DSSの用途は多岐にわたりますが、DSSの耐食性が長期使用に十分でない環境もまだ存在します。これは、より高い耐食性を持つより高価な材料が必要であることを意味します。Jeonら7は、スーパー二相ステンレス鋼（SDSS）でさえ、耐食性に関していくつかの限界があることを発見しました。したがって、場合によっては、より高い耐食性を持つスーパー二相ステンレス鋼（HDSS）が必要になります。これが、高合金HDSSの開発につながりました。
DSSの耐食性は、α相とγ相の比率と、第2相に隣接するCr、Mo、Wが枯渇した領域8、9、10に依存します。HDSSはCr、Mo、Nを多く含んでいるため、耐食性に優れ、重量％Cr + 3.3 (重量％Mo + 0.5重量％W) + 16重量％Nで決定される等価孔食抵抗数(PREN)の値(45～50)が高くなります。その優れた耐食性は、フェライト(α)相とオーステナイト(γ)相が約50％ずつ含まれるバランスの取れた組成に依存します。HDSSは機械的特性が優れており、塩化物腐食に対する耐性も高くなっています。耐食性の向上により、HDSSは海洋環境などのより腐食性の高い塩化物環境でも使用できるようになります。
MIC は、石油・ガス産業や水産業など多くの産業で大きな問題となっています 14。MIC は、すべての腐食損傷の 20% を占めています 15。MIC は、多くの環境で観察される生物電気化学的腐食です。金属表面に形成されるバイオフィルムは電気化学的条件を変化させ、それによって腐食プロセスに影響を与えます。MIC 腐食はバイオフィルムによって引き起こされると広く考えられています。発電性微生物は、生存に必要なエネルギーを得るために金属を侵食します 17。最近の MIC 研究では、EET (細胞外電子伝達) が発電性微生物によって誘発される MIC の律速因子であることが示されています。Zhang ら 18 は、電子中間体が Desulfovibrio sessificans 細胞と 304 ステンレス鋼間の電子伝達を加速し、より深刻な MIC 攻撃をもたらすことを実証しました。Anning ら 19 および Wenzlaff ら20は、腐食性硫酸還元細菌（SRB）のバイオフィルムが金属基板から直接電子を吸収し、深刻な孔食を引き起こすことを示した。
DSSは、硫酸還元細菌（SRB）、鉄還元細菌（IRB）などを含む培地でMICに感受性があることが知られています21。これらの細菌は、バイオフィルムの下のDSSの表面に局所的なピットを引き起こします22,23。DSSとは異なり、HDSS24のMICはよく知られていません。
Pseudomonas aeruginosaは、グラム陰性で運動性のある桿菌であり、自然界に広く分布しています25。Pseudomonas aeruginosaは海洋環境における主要な微生物群でもあり、MIC濃度の上昇を引き起こします。Pseudomonasは腐食プロセスに積極的に関与しており、バイオフィルム形成時の先駆的なコロニー形成者として認識されています。Mahatら28およびYuanら29は、Pseudomonas aeruginosaが水環境における軟鋼および合金の腐食速度を増加させる傾向があることを実証しました。
本研究の主な目的は、電気化学的手法、表面分析法、および腐食生成物分析を用いて、海洋好気性細菌 Pseudomonas aeruginosa によって引き起こされる MIC 2707 HDSS の特性を調査することであった。MIC 2707 HDSS の挙動を調べるために、開回路電位 (OCP)、線形分極抵抗 (LPR)、電気化学インピーダンス分光法 (EIS)、および電位動的分極を含む電気化学的研究を実施した。腐食した表面上の化学元素を検出するために、エネルギー分散型分光分析 (EDS) を実施した。さらに、Pseudomonas aeruginosa を含む海洋環境の影響下での酸化膜不動態化の安定性を決定するために、X 線光電子分光法 (XPS) を使用した。ピットの深さは、共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) で測定した。
表1は2707 HDSSの化学組成を示しています。表2は、2707 HDSSが650 MPaの降伏強度を持つ優れた機械的特性を有することを示しています。図1は、固溶化熱処理を施した2707 HDSSの光学顕微鏡組織を示しています。約50%のオーステナイト相と50%のフェライト相を含む組織では、二次相のないオーステナイト相とフェライト相の細長い帯が見られます。
図2aは、2707 HDSSを2216E非生物培地およびP. aeruginosaブロス中で37℃で14日間曝露したときの、開放回路電位（Eocp）と曝露時間の関係を示しています。Eocpの最大かつ最も顕著な変化は最初の24時間以内に起こることがわかります。両方のケースでEocp値は約16時間で-145 mV（SCEと比較）でピークに達し、その後急激に低下し、非生物サンプルでは-477 mV（SCEと比較）、P. aeruginosaクーポンでは-236 mV（SCEと比較）に達しました。24時間後、P. aeruginosaのEocp 2707 HDSS値は-228 mV（SCEと比較）で比較的安定していましたが、非生物サンプルの対応する値は約-442 mV（SCEと比較）でした。 P. aeruginosaが存在する場合のEocpは非常に低かった。
37℃における非生物培地および緑膿菌培養液中の2707個のHDSSサンプルの電気化学的研究：
(a) 露光時間に対する Eocp、(b) 14 日目の分極曲線、(c) 露光時間に対する Rp、および (d) 露光時間に対する icorr。
表3は、14日間にわたって非生物的および緑膿菌接種培地に曝露された2707個のHDSSサンプルの電気化学的腐食パラメータを示しています。陽極曲線と陰極曲線の接線を外挿して、標準的な方法30,31に従って腐食電流密度（icorr）、腐食電位（Ecorr）、およびターフェル勾配（βαおよびβc）を与える交点を取得しました。
図2bに示すように、P. aeruginosaの曲線が上方にシフトした結果、非生物的曲線と比較してEcorrが増加した。腐食速度に比例するicorr値は、Pseudomonas aeruginosaサンプルでは0.328 µA cm-2に増加し、これは非生物的サンプル（0.087 µA cm-2）の4倍である。
LPR は、迅速な腐食分析のための古典的な非破壊電気化学的手法です。MIC32 の研究にも使用されています。図 2c には、暴露時間の関数としての分極抵抗 (Rp) が示されています。Rp 値が高いほど、腐食が少ないことを意味します。最初の 24 時間以内に、Rp 2707 HDSS は、非生物試料で 1955 kΩ cm2、Pseudomonas aeruginosa 試料で 1429 kΩ cm2 でピークに達しました。図 2c はまた、Rp 値が 1 日後に急速に減少し、その後 13 日間は比較的変化がないことを示しています。Pseudomonas aeruginosa サンプルの Rp 値は約 40 kΩ cm2 であり、非生物試料の 450 kΩ cm2 値よりもはるかに低い値です。
icorrの値は均一腐食速度に比例します。その値は、以下のStern-Giri式から計算できます。
Zoeら33によると、本研究におけるTafel勾配Bの典型的な値は26 mV/decとされた。図2dは、非生物サンプル2707のicorrが比較的安定していたのに対し、P. aeruginosaサンプルは最初の24時間後に大きく変動したことを示している。P. aeruginosaサンプルのicorr値は、非生物コントロールの値よりも1桁高かった。この傾向は、分極抵抗の結果と一致している。
EISは、腐食した表面での電気化学反応を特徴付けるために使用されるもう1つの非破壊的な方法です。非生物環境および緑膿菌溶液に曝露されたサンプルのインピーダンススペクトルと計算された容量値、サンプル表面に形成された不動態皮膜/バイオフィルム抵抗Rb、電荷移動抵抗Rct、電気二重層容量Cdl（EDL）、および定数QCPE位相要素パラメータ（CPE）。これらのパラメータは、等価回路（EEC）モデルを使用してデータをフィッティングすることによりさらに分析されました。
図3には、異なる培養時間における非生物培地およびP. aeruginosa培地中の2707 HDSSサンプルの典型的なナイキスト線図（aおよびb）とボード線図（a'およびb'）が示されています。ナイキストリングの直径は、Pseudomonas aeruginosaの存在下で減少します。ボード線図（図3b'）は、全インピーダンスの増加を示しています。緩和時定数に関する情報は、位相の最大値から得ることができます。図4には、単層（a）および二層（b）に基づく物理構造と、対応するEECが示されています。CPEがEECモデルに導入されています。そのアドミタンスとインピーダンスは次のように表されます。
サンプル2707 HDSSのインピーダンススペクトルをフィッティングするための2つの物理モデルと対応する等価回路：
ここで、Y0 は KPI 値、j は虚数または (-1)1/2、ω は角周波数、n は 1 未満の KPI べき乗指数です 35。電荷移動抵抗の逆数 (すなわち 1/Rct) は腐食速度に対応します。Rct が小さいほど腐食速度が高くなります 27。14 日間の培養後、Pseudomonas aeruginosa サンプルの Rct は 32 kΩ cm2 に達し、これは非生物学的サンプルの 489 kΩ cm2 よりはるかに小さい値です (表 4)。
図 5 の CLSM 画像と SEM 画像から、7 日後の HDSS サンプル 2707 の表面のバイオフィルムコーティングが密であることが明確にわかります。しかし、14 日後にはバイオフィルムの被覆が悪く、死細胞がいくつか現れました。表 5 は、P. aeruginosa に 7 日と 14 日曝露した後の 2707 HDSS サンプル上のバイオフィルムの厚さを示しています。バイオフィルムの最大厚さは、7 日後の 23.4 µm から 14 日後の 18.9 µm に変化しました。平均バイオフィルムの厚さもこの傾向を裏付けています。7 日後の 22.2 ± 0.7 μm から 14 日後の 17.8 ± 1.0 μm に減少しました。
(a) 7日目の3D CLSM画像、(b) 14日目の3D CLSM画像、(c) 7日目のSEM画像、(d) 14日目のSEM画像。
EMFにより、14日間P. aeruginosaに曝露されたサンプル上のバイオフィルムおよび腐食生成物中の化学元素が明らかになった。図6に示すように、バイオフィルムおよび腐食生成物中のC、N、O、およびPの含有量は純金属よりも有意に高い。これは、これらの元素がバイオフィルムおよびその代謝物と関連しているためである。微生物は微量のクロムと鉄しか必要としない。サンプルの表面上のバイオフィルムおよび腐食生成物中のCrおよびFeの高レベルは、金属マトリックスが腐食により元素を失ったことを示している。
14 日後、培地 2216E で P. aeruginosa の有無にかかわらずピットが観察された。培養前、サンプルの表面は滑らかで欠陥がなかった (図 7a)。培養後、バイオフィルムと腐食生成物を除去し、図 7b および c に示すように、サンプルの表面の最も深いピットを CLSM を使用して調べた。非生物学的コントロールの表面には明らかなピットは見られなかった (最大ピット深さ 0.02 µm)。P. aeruginosa によって引き起こされた最大ピット深さは、3 つのサンプルからの平均最大ピット深さに基づいて、7 日で 0.52 µm、14 日で 0.69 µm であった (各サンプルで最大ピット深さを 10 個選択)。それぞれ 0.42 ± 0.12 µm および 0.52 ± 0.15 µm を達成した (表 5)。これらの穴の深さの値は小さいが、重要である。
（a）暴露前、（b）非生物的環境下で14日間、および（c）緑膿菌培養液中で14日間。
図8には、さまざまなサンプル表面のXPSスペクトルが示されており、各表面について分析された化学組成は表6にまとめられています。表6では、P. aeruginosaが存在する場合（サンプルAとB）のFeとCrの原子百分率は、非生物学的コントロール（サンプルCとD）のそれよりもはるかに低いことがわかりました。P. aeruginosaサンプルの場合、Cr 2p核レベルのスペクトル曲線は、結合エネルギー（BE）が574.4、576.6、578.3、586.8 eVの4つのピーク成分に適合し、それぞれCr、Cr2O3、CrO3、Cr(OH)3に帰属できます（図9aとb）。非生物試料の場合、Cr 2p 主レベルのスペクトルには、図 9c および d にそれぞれ Cr (結合エネルギー 573.80 eV) と Cr2O3 (結合エネルギー 575.90 eV) の 2 つの主ピークが含まれています。非生物試料と P. aeruginosa 試料の最も顕著な違いは、バイオフィルムの下に Cr6+ が存在し、Cr(OH)3 (結合エネルギー 586.8 eV) の相対的な割合が高いことでした。
2つの媒体中のサンプル2707 HDSSの表面の広範囲XPSスペクトルは、それぞれ7日目と14日目である。
(a) 緑膿菌に7日間曝露、(b) 緑膿菌に14日間曝露、(c) 非生物的環境に7日間、(d) 非生物的環境に14日間。
HDSSは、ほとんどの環境で高いレベルの耐食性を示します。Kimら2は、HDSS UNS S32707がPRENが45を超える高合金DSSとして同定されたと報告しました。本研究のサンプル2707 HDSSのPREN値は49でした。これは、酸性環境で有用な高クロム含有量と高モリブデンおよびニッケル含有量によるものです。また、塩化物含有量の高い環境にも適しています。さらに、バランスの取れた組成と欠陥のない微細構造は、構造安定性と耐食性に有益です。しかし、優れた耐薬品性に​​もかかわらず、本研究の実験データは、2707 HDSSがP. aeruginosaバイオフィルムMICに対して完全に耐性があるわけではないことを示唆しています。
電気化学的結果から、P. aeruginosa ブロス中の 2707 HDSS の腐食速度は、非生物学的環境と比較して 14 日後に著しく増加することが示されました。図 2a では、最初の 24 時間で非生物的培地と P. aeruginosa ブロスの両方で Eocp の減少が観察されました。その後、バイオフィルムがサンプルの表面を完全に覆い、Eocp は比較的安定します 36。しかし、生物学的 Eocp レベルは非生物学的 Eocp レベルよりもはるかに高くなりました。この違いは P. aeruginosa バイオフィルムの形成に関連していると考える理由があります。図 2d では、P. aeruginosa が存在する場合、icorr 2707 HDSS の値は 0.627 μA cm-2 に達し、これは非生物的コントロール (0.063 μA cm-2) よりも 1 桁高い値であり、EIS で測定された Rct 値と一致しています。最初の数日間は、緑膿菌細胞の付着とバイオフィルムの形成により、緑膿菌培養液中のインピーダンス値が増加しました。しかし、バイオフィルムがサンプル表面を完全に覆うと、インピーダンスは減少します。保護層は主にバイオフィルムの形成とバイオフィルム代謝物によって攻撃されます。その結果、腐食耐性は時間とともに低下し、緑膿菌の付着により局所腐食が発生しました。非生物的環境での傾向は異なりました。非生物的コントロールの腐食耐性は、緑膿菌培養液に曝露されたサンプルの対応する値よりもはるかに高くなりました。さらに、非生物的アクセッションでは、Rct 2707 HDSS 値は 14 日目に 489 kΩ cm2 に達し、緑膿菌が存在する場合の Rct 値 (32 kΩ cm2) の 15 倍になりました。したがって、2707 HDSSは無菌環境下では優れた耐食性を示すが、緑膿菌バイオフィルム由来のMICには耐性がない。
これらの結果は、図 2b の分極曲線からも観察できます。陽極分岐は、緑膿菌バイオフィルムの形成と金属酸化反応に関連付けられています。この場合、陰極反応は酸素の還元です。緑膿菌の存在により腐食電流密度が著しく増加し、非生物的対照よりも約 1 桁高くなりました。これは、緑膿菌バイオフィルムが 2707 HDSS の局部腐食を促進することを示しています。Yuan ら 29 は、緑膿菌バイオフィルムの作用により Cu-Ni 70/30 合金の腐食電流密度が増加することを発見しました。これは、緑膿菌バイオフィルムによる酸素還元の生体触媒作用による可能性があります。この観察は、本研究の MIC 2707 HDSS も説明できる可能性があります。好気性バイオフィルムの下では酸素が少ない可能性もあります。したがって、金属表面を酸素で再不動態化することを拒否したことが、本研究におけるMICの一因となっている可能性がある。
ディキンソンら38は、化学反応および電気化学反応の速度は、試料表面の付着細菌の代謝活動と腐食生成物の性質によって直接影響を受ける可能性があると示唆した。図5および表5に示すように、14日後には細胞数とバイオフィルムの厚さが減少した。これは、14日後には2216E培地の栄養枯渇または2707 HDSSマトリックスからの有毒金属イオンの放出により、2707 HDSS表面の付着細胞のほとんどが死滅したという事実によって合理的に説明できる。これはバッチ実験の限界である。
この研究では、P. aeruginosa バイオフィルムが 2707 HDSS 表面のバイオフィルム下の Cr と Fe の局所的な減少に寄与しました (図 6)。表 6 は、サンプル C と比較したサンプル D の Fe と Cr の減少を示しており、P. aeruginosa バイオフィルムによって引き起こされた溶解した Fe と Cr が最初の 7 日間持続したことを示しています。2216E 環境は海洋環境をシミュレートするために使用されます。これは、天然海水中の含有量に匹敵する 17700 ppm Cl- を含んでいます。17700 ppm Cl- の存在は、XPS で分析した 7 日および 14 日の非生物サンプル中の Cr の減少の主な理由でした。P. aeruginosa サンプルと比較すると、非生物条件下での 2707 HDSS の塩素に対する強い耐性により、非生物サンプル中の Cr の溶解ははるかに少なくなりました。図 9 は、不動態化膜中の Cr6+ の存在を示しています。 ChenとClaytonが示唆したように、これはP. aeruginosaのバイオフィルムによる鋼鉄表面からのクロムの除去に関与している可能性がある。
細菌の増殖により、培養前後の培地のpH値はそれぞれ7.4と8.2であった。したがって、P. aeruginosaバイオフィルムの下では、培地全体のpHが比較的高いため、有機酸腐食はこの研究に寄与する可能性は低い。非生物学的対照培地のpHは、14日間の試験期間中、有意な変化は見られなかった（初期7.4から最終7.5）。培養後の種培地のpHの上昇はP. aeruginosaの代謝活動によるものであり、試験紙がない場合でもpHに同様の影響を与えることがわかった。
図7に示すように、P. aeruginosaバイオフィルムによって引き起こされた最大ピット深さは0.69 µmであり、これは非生物培地（0.02 µm）よりもはるかに大きい。これは、上述の電気化学データと一致する。0.69 µmのピット深さは、同じ条件下で2205 DSSについて報告された9.5 µmの値よりも10倍以上小さい。これらのデータは、2707 HDSSが2205 DSSよりもMICに対する耐性が優れていることを示している。2707 HDSSはCrレベルが高く、より長い不動態化を提供し、P. aeruginosaの不動態化解除がより困難であり、有害な二次沈殿のないバランスのとれた相構造によりピットが発生するため、これは驚くべきことではない。
結論として、P. aeruginosa培養液中の2707 HDSSの表面にはMICピットが認められたのに対し、非生物的環境ではピットはほとんど認められなかった。本研究は、2707 HDSSが2205 DSSよりもMICに対する耐性が高いことを示しているが、P. aeruginosaバイオフィルムの存在により、MICに対して完全に耐性があるわけではない。これらの結果は、海洋環境に適したステンレス鋼の選定と耐用年数の評価に役立つ。
中国瀋陽の東北大学冶金学部から提供された2707 HDSSのクーポン。2707 HDSSの元素組成は表1に示されており、これはNEU材料分析試験部によって分析された。すべてのサンプルは1180℃で1時間固溶処理された。腐食試験の前に、上面が1cm2のコイン状の2707 HDSSを炭化ケイ素サンドペーパーで2000グリットまで研磨し、次に0.05µmのAl2O3粉末スラリーで研磨した。側面と底面は不活性塗料で保護されている。乾燥後、サンプルを滅菌脱イオン水で洗浄し、75%（v/v）エタノールで0.5時間滅菌した。その後、使用前に紫外線（UV）光の下で0.5時間風乾した。
海洋性緑膿菌株MCCC 1A00099は、中国の厦門海洋培養コレクションセンター（MCCC）から購入した。緑膿菌は、250 mlフラスコおよび500 mlガラス電気化学セル中で、37℃の好気条件下で、Marine 2216E液体培地（青島ホープバイオテクノロジー株式会社、中国青島）を用いて培養した。培地の成分は（g/l）：NaCl 19.45、MgCl2 5.98、Na2SO4 3.24、CaCl2 1.8、KCl 0.55、Na2CO3 0.16、KBr 0.08、SrCl2 0.034、SrBr2 0.08、H3BO3 0.022、NaSiO3 0.004、NH2NH3 0.016、NH3 3.0016、ペプトン 5.0、酵母エキス 1.0、クエン酸鉄 0.1 です。接種前に 121 ℃で 20 分間オートクレーブ滅菌します。血球計算盤を用いて、光学顕微鏡で 400 倍の倍率で付着細胞と浮遊細胞を計数します。接種直後の浮遊性緑膿菌の初期濃度は約10⁶細胞/mlであった。
電気化学試験は、容量500 mlの古典的な3電極ガラスセルで行われた。白金シートと飽和カロメル電極（SAE）は、塩橋で満たされたルギン毛細管を介して反応器に接続され、それぞれ対極と参照電極として機能した。作用電極の作製には、ゴム引き銅線を各サンプルに取り付け、エポキシ樹脂で覆い、片側に作用電極用に約1 cm2の保護されていない領域を残した。電気化学測定中、サンプルは2216E培地に入れられ、水浴中で一定のインキュベーション温度（37℃）に保たれた。OCP、LPR、EIS、および電位動的分極データは、Autolabポテンショスタット（Reference 600TM、Gamry Instruments, Inc.、米国）を使用して測定された。LPR試験は、Eocpで-5～5 mVの範囲で0.125 mV s-1の走査速度で、1 Hzのサンプリングレートで記録された。 EISは、定常状態のEocpにおいて5mVの印加電圧を用いて、0.01～10,000Hzの周波数範囲で正弦波を用いて実施した。電位掃引の前に、電極は自由腐食電位の安定値に達するまでアイドルモードとした。その後、分極曲線は、0.166mV/sの走査速度で、Eocpの関数として-0.2～1.5Vの範囲で測定した。各試験は、P. aeruginosaの有無でそれぞれ3回ずつ繰り返した。
金属組織分析用のサンプルは、湿式2000番SiC研磨紙で機械的に研磨した後、光学観察のために0.05µmのAl2O3粉末懸濁液でさらに研磨した。金属組織分析は光学顕微鏡を使用して行った。サンプルは10重量％水酸化カリウム溶液43でエッチングした。
インキュベーション後、サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH 7.4 ± 0.2）で3回洗浄し、バイオフィルムを固定するために2.5%（v/v）グルタルアルデヒドで10時間固定した。次に、バッチ式エタノール（体積比で50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%）で脱水し、風乾した。最後に、SEM観察用の導電性を持たせるために、サンプルの表面に金膜を堆積した。SEM画像は、各サンプルの表面で最も付着性の高いP. aeruginosa細胞のあるスポットに焦点を合わせた。化学元素を見つけるためにEDS分析を行った。ピットの深さを測定するために、Zeiss共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）（LSM 710、Zeiss、ドイツ）を使用した。バイオフィルム下の腐食ピットを観察するために、まず試験サンプルの表面から腐食生成物とバイオフィルムを除去するために、中国国家規格（CNS）GB/T4334.4-2000に従って試験サンプルを洗浄した。
X線光電子分光法（XPS、ESCALAB250表面分析システム、Thermo VG社、米国）分析は、単色X線源（エネルギー1500 eV、出力150 WのアルミニウムKα線）を用いて、標準条件下、広範囲の結合エネルギー0～1350 eVで実施した。高分解能スペクトルは、透過エネルギー50 eV、ステップ0.2 eVで記録した。
インキュベートしたサンプルを取り出し、PBS (pH 7.4 ± 0.2) で 15 秒間優しく洗浄した。サンプル上のバイオフィルムの細菌生存率を観察するために、バイオフィルムを LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen、ユージーン、オレゴン州、米国) を使用して染色した。このキットには、SYTO-9 緑色蛍光色素とヨウ化プロピジウム (PI) 赤色蛍光色素の 2 つの蛍光色素が含まれている。CLSM では、緑色と赤色の蛍光ドットはそれぞれ生細胞と死細胞を表す。染色には、SYTO-9 3 µl と PI 溶液 3 µl を含む混合液 1 ml を暗所で室温 (23°C) で 20 分間インキュベートした。その後、染色したサンプルを Nikon CLSM 装置 (C2 Plus、ニコン、日本) を使用して 2 つの波長 (生細胞の場合は 488 nm、死細胞の場合は 559 nm) で観察した。バイオフィルムの厚さは3Dスキャンモードで測定した。
この記事の引用方法: Li, H. et al. Pseudomonas aeruginosa 海洋バイオフィルムによる 2707 スーパーデュプレックスステンレス鋼の微生物腐食。The Science. 6, 20190. doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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