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La corrosión microbiana (CMI) es un problema grave en muchas industrias, ya que puede ocasionar enormes pérdidas económicas. El acero inoxidable superdúplex 2707 (2707 HDSS) se utiliza en ambientes marinos debido a su excelente resistencia química. Sin embargo, su resistencia a la CMI no se ha demostrado experimentalmente. Este estudio examinó el comportamiento de la CMI del 2707 HDSS causada por la bacteria marina aerobia Pseudomonas aeruginosa. El análisis electroquímico mostró que, en presencia de biopelícula de Pseudomonas aeruginosa en el medio 2216E, se produce un cambio positivo en el potencial de corrosión y un aumento en la densidad de corriente de corrosión. El análisis de espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) mostró una disminución en el contenido de Cr en la superficie de la muestra bajo la biopelícula. El análisis visual de las picaduras mostró que la biopelícula de P. aeruginosa produjo una profundidad máxima de picaduras de 0,69 µm durante 14 días de incubación. Aunque se trata de una cantidad pequeña, indica que la cepa 2707 HDSS no es completamente inmune a la CMI de los biofilms de P. aeruginosa.
Los aceros inoxidables dúplex (DSS) se utilizan ampliamente en diversas industrias debido a la combinación perfecta de excelentes propiedades mecánicas y resistencia a la corrosión1,2. Sin embargo, aún se produce corrosión por picaduras localizada que afecta la integridad de este acero3,4. El DSS no es resistente a la corrosión microbiana (MIC)5,6. A pesar de la amplia gama de aplicaciones del DSS, todavía existen entornos donde su resistencia a la corrosión no es suficiente para un uso prolongado. Esto significa que se requieren materiales más costosos con mayor resistencia a la corrosión. Jeon et al7 encontraron que incluso los aceros inoxidables superdúplex (SDSS) tienen algunas limitaciones en términos de resistencia a la corrosión. Por lo tanto, en algunos casos, se requieren aceros inoxidables superdúplex (HDSS) con mayor resistencia a la corrosión. Esto llevó al desarrollo de HDSS altamente aleados.
La resistencia a la corrosión del DSS depende de la proporción de las fases alfa y gamma y está empobrecida en Cr, Mo y W en las regiones 8, 9, 10 adyacentes a la segunda fase. El HDSS contiene un alto contenido de Cr, Mo y N11, por lo que tiene una excelente resistencia a la corrosión y un alto valor (45-50) del número de resistencia a la corrosión por picaduras equivalente (PREN) determinado por % en peso de Cr + 3,3 (% en peso de Mo + 0,5 % en peso de W) + 16 % en peso de N12. Su excelente resistencia a la corrosión depende de una composición equilibrada que contiene aproximadamente un 50 % de fases ferríticas (α) y un 50 % de fases austeníticas (γ). El HDSS tiene mejores propiedades mecánicas y mayor resistencia a la corrosión por cloruros. La resistencia a la corrosión mejorada extiende el uso del HDSS en entornos de cloruros más agresivos, como los entornos marinos.
Las MIC son un problema importante en muchas industrias, como la del petróleo y el gas y la del agua14. Las MIC representan el 20% de todos los daños por corrosión15. Las MIC son una corrosión bioelectroquímica que se puede observar en muchos entornos. Los biofilms que se forman en las superficies metálicas cambian las condiciones electroquímicas, afectando así el proceso de corrosión. Se cree ampliamente que la corrosión por MIC es causada por biofilms. Los microorganismos electrogénicos consumen metales para obtener la energía que necesitan para sobrevivir17. Estudios recientes sobre MIC han demostrado que la EET (transferencia de electrones extracelular) es el factor limitante de la velocidad en la MIC inducida por microorganismos electrogénicos. Zhang et al. 18 demostraron que los intermediarios de electrones aceleran la transferencia de electrones entre las células de Desulfovibrio sessificans y el acero inoxidable 304, lo que resulta en un ataque de MIC más severo. Anning et al. 19 y Wenzlaff et al. 20 han demostrado que los biofilms de bacterias corrosivas reductoras de sulfato (SRB) pueden absorber directamente electrones de los sustratos metálicos, lo que resulta en picaduras severas.
Se sabe que el DSS es susceptible a la MIC en medios que contienen SRB, bacterias reductoras de hierro (IRB), etc. 21. Estas bacterias causan picaduras localizadas en la superficie del DSS bajo biopelículas22,23. A diferencia del DSS, la MIC del HDSS24 no se conoce bien.
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, móvil y con forma de bacilo, ampliamente distribuida en la naturaleza.²⁵ Pseudomonas aeruginosa también constituye un importante grupo microbiano en el medio marino, causando elevadas concentraciones de CMI. Pseudomonas participa activamente en el proceso de corrosión y se reconoce como colonizador pionero durante la formación de biopelículas. Mahat et al.²⁸ y Yuan et al.²⁹ demostraron que Pseudomonas aeruginosa tiende a aumentar la tasa de corrosión del acero dulce y sus aleaciones en ambientes acuáticos.
El objetivo principal de este trabajo fue investigar las propiedades del MIC 2707 HDSS afectadas por la bacteria marina aerobia Pseudomonas aeruginosa mediante métodos electroquímicos, análisis de superficie y análisis de productos de corrosión. Se realizaron estudios electroquímicos, incluyendo potencial de circuito abierto (OCP), resistencia a la polarización lineal (LPR), espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) y polarización dinámica potencial, para estudiar el comportamiento del MIC 2707 HDSS. Se llevó a cabo un análisis espectrométrico de energía dispersiva (EDS) para detectar elementos químicos en una superficie corroída. Además, se utilizó espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) para determinar la estabilidad de la pasivación de la película de óxido bajo la influencia de un ambiente marino que contiene Pseudomonas aeruginosa. La profundidad de las picaduras se midió con un microscopio confocal de barrido láser (CLSM).
La Tabla 1 muestra la composición química del acero inoxidable 2707 HDSS. La Tabla 2 muestra que el acero inoxidable 2707 HDSS posee excelentes propiedades mecánicas con un límite elástico de 650 MPa. La Figura 1 muestra la microestructura óptica del acero inoxidable 2707 HDSS sometido a tratamiento térmico de solución. En la microestructura, que contiene aproximadamente un 50 % de austenita y un 50 % de ferrita, se observan bandas alargadas de ambas fases sin fases secundarias.
La figura 2a muestra el potencial de circuito abierto (Eocp) frente al tiempo de exposición para 2707 HDSS en medio abiótico 2216E y caldo de P. aeruginosa durante 14 días a 37 °C. Muestra que el cambio más grande y significativo en Eocp ocurre dentro de las primeras 24 horas. Los valores de Eocp en ambos casos alcanzaron un pico de -145 mV (en comparación con SCE) alrededor de las 16 h y luego cayeron bruscamente, alcanzando -477 mV (en comparación con SCE) y -236 mV (en comparación con SCE) para la muestra abiótica y cupones de Pseudomonas aeruginosa, respectivamente). Después de 24 horas, el valor de Eocp 2707 HDSS para P. aeruginosa fue relativamente estable en -228 mV (en comparación con SCE), mientras que el valor correspondiente para muestras no biológicas fue aproximadamente -442 mV (en comparación con SCE). La concentración de Eocp en presencia de P. aeruginosa fue bastante baja.
Estudio electroquímico de 2707 muestras de HDSS en medio abiótico y caldo de Pseudomonas aeruginosa a 37 °C:
(a) Eocp en función del tiempo de exposición, (b) curvas de polarización en el día 14, (c) Rp en función del tiempo de exposición y (d) icorr en función del tiempo de exposición.
La Tabla 3 muestra los parámetros de corrosión electroquímica de 2707 muestras de HDSS expuestas a medios abióticos y inoculados con Pseudomonas aeruginosa durante un período de 14 días. Las tangentes de las curvas del ánodo y del cátodo se extrapolaron para obtener intersecciones que dan la densidad de corriente de corrosión (icorr), el potencial de corrosión (Ecorr) y la pendiente de Tafel (βα y βc) según métodos estándar30,31.
Como se muestra en la figura 2b, un desplazamiento ascendente en la curva de P. aeruginosa resultó en un aumento de Ecorr en comparación con la curva abiótica. El valor de icorr, que es proporcional a la tasa de corrosión, aumentó a 0,328 µA cm-2 en la muestra de Pseudomonas aeruginosa, lo que representa cuatro veces más que en la muestra no biológica (0,087 µA cm-2).
LPR es un método electroquímico clásico no destructivo para el análisis rápido de la corrosión. También se ha utilizado para estudiar MIC32. La figura 2c muestra la resistencia a la polarización (Rp) en función del tiempo de exposición. Un valor de Rp más alto indica menor corrosión. En las primeras 24 horas, la Rp 2707 HDSS alcanzó un máximo de 1955 kΩ cm2 para muestras abióticas y 1429 kΩ cm2 para muestras de Pseudomonas aeruginosa. La figura 2c también muestra que el valor de Rp disminuyó rápidamente después de un día y luego se mantuvo relativamente constante durante los siguientes 13 días. El valor de Rp de una muestra de Pseudomonas aeruginosa es de aproximadamente 40 kΩ cm2, que es mucho menor que el valor de 450 kΩ cm2 de una muestra no biológica.
El valor de icorr es proporcional a la tasa de corrosión uniforme. Su valor se puede calcular a partir de la siguiente ecuación de Stern-Giri:
Según Zoe et al. 33, el valor típico de la pendiente de Tafel B en este trabajo se consideró de 26 mV/década. La figura 2d muestra que la icorr de la muestra no biológica 2707 se mantuvo relativamente estable, mientras que la muestra de P. aeruginosa fluctuó considerablemente después de las primeras 24 horas. Los valores de icorr de las muestras de P. aeruginosa fueron un orden de magnitud superiores a los de los controles no biológicos. Esta tendencia es consistente con los resultados de la resistencia a la polarización.
EIS es otro método no destructivo utilizado para caracterizar reacciones electroquímicas en superficies corroídas. Espectros de impedancia y valores de capacitancia calculados de muestras expuestas a ambiente abiótico y solución de Pseudomonas aeruginosa, resistencia de película pasiva/biopelícula Rb formada en la superficie de la muestra, resistencia de transferencia de carga Rct, capacitancia de doble capa eléctrica Cdl (EDL) y parámetros constantes del elemento de fase QCPE (CPE). Estos parámetros se analizaron posteriormente ajustando los datos mediante un modelo de circuito equivalente (EEC).
La figura 3 muestra diagramas de Nyquist (a y b) y diagramas de Bode (a' y b') típicos para 2707 muestras HDSS en medios abióticos y caldo de P. aeruginosa para diferentes tiempos de incubación. El diámetro del anillo de Nyquist disminuye en presencia de Pseudomonas aeruginosa. El diagrama de Bode (Fig. 3b') muestra el aumento de la impedancia total. La información sobre la constante de tiempo de relajación se puede obtener a partir de los máximos de fase. La figura 4 muestra las estructuras físicas basadas en una monocapa (a) y una bicapa (b) y los EEC correspondientes. Se introduce CPE en el modelo EEC. Su admitancia e impedancia se expresan de la siguiente manera:
Dos modelos físicos y sus correspondientes circuitos equivalentes para ajustar el espectro de impedancia de la muestra 2707 HDSS:
donde Y0 es el valor del KPI, j es el número imaginario o (-1)1/2, ω es la frecuencia angular, n es el índice de potencia del KPI menor que uno35. La inversión de la resistencia de transferencia de carga (es decir, 1/Rct) corresponde a la tasa de corrosión. Cuanto menor sea Rct, mayor será la tasa de corrosión27. Después de 14 días de incubación, el Rct de las muestras de Pseudomonas aeruginosa alcanzó 32 kΩ cm2, que es mucho menor que los 489 kΩ cm2 de las muestras no biológicas (Tabla 4).
Las imágenes CLSM y SEM de la Figura 5 muestran claramente que el recubrimiento de biopelícula en la superficie de la muestra HDSS 2707 después de 7 días es denso. Sin embargo, después de 14 días, la cobertura de biopelícula fue deficiente y aparecieron algunas células muertas. La Tabla 5 muestra el espesor de la biopelícula en las muestras HDSS 2707 después de la exposición a P. aeruginosa durante 7 y 14 días. El espesor máximo de la biopelícula cambió de 23,4 µm después de 7 días a 18,9 µm después de 14 días. El espesor promedio de la biopelícula también confirmó esta tendencia. Disminuyó de 22,2 ± 0,7 µm después de 7 días a 17,8 ± 1,0 µm después de 14 días.
(a) Imagen CLSM 3D a los 7 días, (b) Imagen CLSM 3D a los 14 días, (c) Imagen SEM a los 7 días y (d) Imagen SEM a los 14 días.
El análisis EMF reveló la presencia de elementos químicos en biopelículas y productos de corrosión en muestras expuestas a P. aeruginosa durante 14 días. La figura 6 muestra que el contenido de C, N, O y P en las biopelículas y los productos de corrosión es significativamente mayor que en los metales puros, dado que estos elementos se asocian a las biopelículas y sus metabolitos. Los microorganismos solo necesitan trazas de cromo y hierro. Los altos niveles de Cr y Fe en la biopelícula y los productos de corrosión en la superficie de las muestras indican que la matriz metálica ha perdido elementos debido a la corrosión.
Después de 14 días, se observaron picaduras con y sin P. aeruginosa en el medio 2216E. Antes de la incubación, la superficie de las muestras era lisa y sin defectos (Fig. 7a). Después de la incubación y la eliminación del biofilm y los productos de corrosión, las picaduras más profundas en la superficie de las muestras se examinaron usando CLSM, como se muestra en Fig. 7b y c. No se encontró picadura evidente en la superficie de los controles no biológicos (profundidad máxima de picadura 0,02 µm). La profundidad máxima de picadura causada por P. aeruginosa fue de 0,52 µm a los 7 días y 0,69 µm a los 14 días, con base en la profundidad máxima de picadura promedio de 3 muestras (se seleccionaron 10 profundidades máximas de picadura para cada muestra). Logro de 0,42 ± 0,12 µm y 0,52 ± 0,15 µm, respectivamente (Tabla 5). Estos valores de profundidad de los agujeros son pequeños pero importantes.
(a) antes de la exposición, (b) 14 días en un ambiente abiótico y (c) 14 días en caldo de Pseudomonas aeruginosa.
En la figura 8 se muestran los espectros XPS de varias superficies de muestra, y la composición química analizada para cada superficie se resume en la Tabla 6. En la Tabla 6, los porcentajes atómicos de Fe y Cr en presencia de P. aeruginosa (muestras A y B) fueron mucho menores que los de los controles no biológicos (muestras C y D). Para una muestra de P. aeruginosa, la curva espectral al nivel del núcleo Cr 2p se ajustó a cuatro componentes de pico con energías de enlace (BE) de 574,4, 576,6, 578,3 y 586,8 eV, que pueden atribuirse a Cr, Cr2O3, CrO3 y Cr(OH)3, respectivamente (Fig. 9a y b). Para muestras no biológicas, el espectro del nivel principal Cr 2p contiene dos picos principales para Cr (573,80 eV para BE) y Cr2O3 (575,90 eV para BE) en las figuras 9c y 9d, respectivamente. La diferencia más notable entre las muestras abióticas y las muestras de P. aeruginosa fue la presencia de Cr6+ y una mayor proporción relativa de Cr(OH)3 (BE 586,8 eV) debajo del biofilm.
Los espectros XPS amplios de la superficie de la muestra 2707 HDSS en dos medios son de 7 y 14 días, respectivamente.
(a) 7 días de exposición a P. aeruginosa, (b) 14 días de exposición a P. aeruginosa, (c) 7 días en un ambiente abiótico y (d) 14 días en un ambiente abiótico.
El HDSS exhibe un alto nivel de resistencia a la corrosión en la mayoría de los entornos. Kim et al.2 informaron que el HDSS UNS S32707 fue identificado como un DSS altamente aleado con un PREN mayor que 45. El valor PREN de la muestra 2707 HDSS en este trabajo fue 49. Esto se debe al alto contenido de cromo y al alto contenido de molibdeno y níquel, que son útiles en entornos ácidos y entornos con alto contenido de cloruro. Además, una composición bien equilibrada y una microestructura libre de defectos son beneficiosas para la estabilidad estructural y la resistencia a la corrosión. Sin embargo, a pesar de su excelente resistencia química, los datos experimentales en este trabajo sugieren que el HDSS 2707 no es completamente inmune a las MIC de biopelículas de P. aeruginosa.
Los resultados electroquímicos mostraron que la tasa de corrosión de 2707 HDSS en caldo de P. aeruginosa aumentó significativamente después de 14 días en comparación con el entorno no biológico. En la Figura 2a, se observó una disminución en Eocp tanto en el medio abiótico como en el caldo de P. aeruginosa durante las primeras 24 horas. Después de eso, el biofilm cubre completamente la superficie de la muestra, y Eocp se vuelve relativamente estable36. Sin embargo, el nivel biológico de Eocp fue mucho más alto que el nivel no biológico de Eocp. Hay razones para creer que esta diferencia está asociada con la formación de biofilms de P. aeruginosa. En la figura 2d en presencia de P. aeruginosa, el valor de icorr 2707 HDSS alcanzó 0,627 μA cm-2, que es un orden de magnitud más alto que el del control abiótico (0,063 μA cm-2), lo que fue consistente con el valor de Rct medido por EIS. Durante los primeros días, los valores de impedancia en el caldo de P. aeruginosa aumentaron debido a la adhesión de células de P. aeruginosa y la formación de biopelículas. Sin embargo, cuando la biopelícula cubre completamente la superficie de la muestra, la impedancia disminuye. La capa protectora se ve atacada principalmente debido a la formación de biopelículas y sus metabolitos. En consecuencia, la resistencia a la corrosión disminuyó con el tiempo y la adhesión de P. aeruginosa causó corrosión localizada. Las tendencias en ambientes abióticos fueron diferentes. La resistencia a la corrosión del control no biológico fue mucho mayor que el valor correspondiente de las muestras expuestas al caldo de P. aeruginosa. Además, para las accesiones abióticas, el valor Rct 2707 HDSS alcanzó 489 kΩ cm2 el día 14, lo que es 15 veces mayor que el valor Rct (32 kΩ cm2) en presencia de P. aeruginosa. Por lo tanto, el acero inoxidable 2707 HDSS tiene una excelente resistencia a la corrosión en un entorno estéril, pero no es resistente a las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) de los biofilms de P. aeruginosa.
Estos resultados también se pueden observar en las curvas de polarización de las Figs. 2b. La ramificación anódica se ha asociado con la formación de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa y las reacciones de oxidación de metales. En este caso, la reacción catódica es la reducción de oxígeno. La presencia de P. aeruginosa aumentó significativamente la densidad de corriente de corrosión, aproximadamente un orden de magnitud mayor que en el control abiótico. Esto indica que la biopelícula de P. aeruginosa mejora la corrosión localizada del HDSS 2707. Yuan et al.29 encontraron que la densidad de corriente de corrosión de la aleación Cu-Ni 70/30 aumentó bajo la acción de la biopelícula de P. aeruginosa. Esto puede deberse a la biocatálisis de la reducción de oxígeno por las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. Esta observación también puede explicar el MIC 2707 HDSS en este trabajo. También puede haber menos oxígeno bajo biopelículas aerobias. Por lo tanto, la negativa a re-pasivar la superficie metálica con oxígeno puede ser un factor que contribuya a la corrosión inducida por microorganismos (MIC) en este trabajo.
Dickinson et al. 38 sugirieron que la velocidad de las reacciones químicas y electroquímicas puede verse directamente afectada por la actividad metabólica de las bacterias sésiles en la superficie de la muestra y la naturaleza de los productos de corrosión. Como se muestra en la Figura 5 y la Tabla 5, el número de células y el espesor del biofilm disminuyeron después de 14 días. Esto puede explicarse razonablemente por el hecho de que, después de 14 días, la mayoría de las células sésiles en la superficie de 2707 HDSS murieron debido al agotamiento de nutrientes en el medio 2216E o a la liberación de iones de metales tóxicos de la matriz 2707 HDSS. Esta es una limitación de los experimentos por lotes.
En este trabajo, un biofilm de P. aeruginosa contribuyó al agotamiento local de Cr y Fe bajo el biofilm en la superficie de 2707 HDSS (Fig. 6). La Tabla 6 muestra la reducción en Fe y Cr en la muestra D en comparación con la muestra C, lo que indica que el Fe y Cr disueltos causados ​​por el biofilm de P. aeruginosa persistieron durante los primeros 7 días. El entorno 2216E se utiliza para simular el entorno marino. Contiene 17700 ppm de Cl-, que es comparable a su contenido en el agua de mar natural. La presencia de 17700 ppm de Cl- fue la razón principal de la disminución de Cr en las muestras abióticas de 7 y 14 días analizadas por XPS. En comparación con las muestras de P. aeruginosa, la disolución de Cr en las muestras abióticas fue mucho menor debido a la fuerte resistencia de 2707 HDSS al cloro en condiciones abióticas. En la figura 9 se muestra la presencia de Cr6+ en la película pasivante. Es posible que esté implicada en la eliminación de cromo de las superficies de acero por parte de las biopelículas de P. aeruginosa, como sugieren Chen y Clayton.
Debido al crecimiento bacteriano, los valores de pH del medio antes y después del cultivo fueron de 7,4 y 8,2, respectivamente. Por lo tanto, es improbable que la corrosión por ácidos orgánicos bajo el biofilm de P. aeruginosa contribuya a este trabajo debido al pH relativamente alto en el medio general. El pH del medio de control no biológico no cambió significativamente (de 7,4 inicial a 7,5 final) durante el período de prueba de 14 días. El aumento del pH en el medio de siembra después de la incubación se debió a la actividad metabólica de P. aeruginosa y se observó que tenía el mismo efecto sobre el pH en ausencia de tiras reactivas.
Como se muestra en la Figura 7, la profundidad máxima de picadura causada por el biofilm de P. aeruginosa fue de 0,69 µm, mucho mayor que la del medio abiótico (0,02 µm). Esto es consistente con los datos electroquímicos descritos anteriormente. La profundidad de picadura de 0,69 µm es más de diez veces menor que el valor de 9,5 µm reportado para 2205 DSS en las mismas condiciones. Estos datos muestran que 2707 HDSS exhibe mejor resistencia a los MIC que 2205 DSS. Esto no debería ser sorprendente ya que 2707 HDSS tiene niveles más altos de Cr que proporcionan una pasivación más prolongada, más difícil de despasivar P. aeruginosa, y debido a su estructura de fase equilibrada sin precipitación secundaria dañina que cause picaduras.
En conclusión, se observaron microporosidades inducidas por microorganismos (MIC) en la superficie del acero inoxidable 2707 HDSS en caldo de cultivo de P. aeruginosa, en comparación con la escasa presencia de microporosidades en el ambiente abiótico. Este trabajo demuestra que el acero inoxidable 2707 HDSS presenta mayor resistencia a las microporosidades inducidas por microorganismos que el acero inoxidable 2205 DSS, aunque no es completamente inmune debido a la biopelícula de P. aeruginosa. Estos resultados contribuyen a la selección de aceros inoxidables adecuados y a la estimación de su vida útil en el entorno marino.
Cupón para 2707 HDSS proporcionado por la Escuela de Metalurgia de la Universidad del Noreste (NEU) en Shenyang, China. La composición elemental de 2707 HDSS se muestra en la Tabla 1, que fue analizada por el Departamento de Análisis y Pruebas de Materiales de la NEU. Todas las muestras fueron tratadas para solución sólida a 1180 °C durante 1 hora. Antes de la prueba de corrosión, una muestra de 2707 HDSS en forma de moneda con un área de superficie superior abierta de ​​1 cm2 fue pulida a grano 2000 con papel de lija de carburo de silicio y luego pulida con una suspensión de polvo de Al2O3 de 0,05 µm. Los lados y la base están protegidos con pintura inerte. Después del secado, las muestras fueron lavadas con agua desionizada estéril y esterilizadas con etanol al 75 % (v/v) durante 0,5 h. Luego fueron secadas al aire bajo luz ultravioleta (UV) durante 0,5 h antes de su uso.
La cepa marina de Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099 se adquirió del Centro de Colección de Cultivos Marinos de Xiamen (MCCC), China. Pseudomonas aeruginosa se cultivó en condiciones aeróbicas a 37 °C en matraces de 250 ml y celdas electroquímicas de vidrio de 500 ml utilizando el medio líquido Marine 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China). El medio contiene (g/l): 19,45 NaCl, 5,98 MgCl2, 3,24 Na2SO4, 1,8 CaCl2, 0,55 KCl, 0,16 Na2CO3, 0,08 KBr, 0,034 SrCl2, 0,08 SrBr2, 0,022 H3BO3, 0,004 NaSiO3, 0,016 6NH26NH3, 3,0016 NH3 5,0 peptona, 1,0 extracto de levadura y 0,1 citrato de hierro. Autoclave a 121 °C durante 20 minutos antes de la inoculación. Cuente las células sésiles y planctónicas con un hemocitómetro bajo un microscopio óptico a 400 aumentos. La concentración inicial de Pseudomonas aeruginosa planctónica inmediatamente después de la inoculación fue de aproximadamente 106 células/ml.
Se realizaron pruebas electroquímicas en una celda de vidrio clásica de tres electrodos con un volumen medio de 500 ml. La lámina de platino y el electrodo de calomelanos saturado (SAE) se conectaron al reactor a través de capilares de Luggin rellenos con puentes salinos, que sirvieron como contraelectrodo y electrodo de referencia, respectivamente. Para la fabricación de los electrodos de trabajo, se conectó un alambre de cobre cauchutado a cada muestra y se cubrió con resina epoxi, dejando aproximadamente 1 cm2 de área desprotegida para el electrodo de trabajo en un lado. Durante las mediciones electroquímicas, las muestras se colocaron en el medio 2216E y se mantuvieron a una temperatura de incubación constante (37 °C) en un baño de agua. Los datos de OCP, LPR, EIS y polarización dinámica de potencial se midieron utilizando un potenciostato Autolab (Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., EE. UU.). Las pruebas LPR se registraron a una velocidad de barrido de 0,125 mV s-1 en el rango de -5 a 5 mV con Eocp y una frecuencia de muestreo de 1 Hz. Se realizó un análisis de espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) con una onda sinusoidal en un rango de frecuencia de 0,01 a 10 000 Hz, aplicando un voltaje de 5 mV en estado estacionario de Eocp. Antes del barrido de potencial, los electrodos permanecieron en reposo hasta alcanzar un valor estable del potencial de corrosión libre. Posteriormente, se midieron las curvas de polarización desde -0,2 hasta 1,5 V en función de Eocp, con una velocidad de barrido de 0,166 mV/s. Cada prueba se repitió tres veces, con y sin P. aeruginosa.
Las muestras para análisis metalográfico se pulieron mecánicamente con papel de carburo de silicio (SiC) húmedo de grano 2000 y posteriormente se pulieron con una suspensión de polvo de Al2O3 de 0,05 µm para observación óptica. El análisis metalográfico se realizó con un microscopio óptico. Las muestras se atacaron químicamente con una solución al 10 % en peso de hidróxido de potasio 43.
Después de la incubación, las muestras se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) y luego se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % (v/v) durante 10 horas para fijar las biopelículas. Luego se deshidrataron con etanol en lotes (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % en volumen) antes del secado al aire. Finalmente, se depositó una película de oro sobre la superficie de la muestra para proporcionar conductividad para la observación SEM. Las imágenes SEM se enfocaron en los puntos con las células de P. aeruginosa más sésiles en la superficie de cada muestra. Realizó un análisis EDS para encontrar elementos químicos. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser Zeiss (CLSM) (LSM 710, Zeiss, Alemania) para medir la profundidad de la fosa. Para observar las picaduras de corrosión debajo de la biopelícula, la muestra de prueba se limpió primero de acuerdo con la Norma Nacional China (CNS) GB/T4334.4-2000 para eliminar los productos de corrosión y la biopelícula de la superficie de la muestra de prueba.
Se realizó un análisis de espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS, sistema de análisis de superficie ESCALAB250, Thermo VG, EE. UU.) utilizando una fuente de rayos X monocromática (línea Kα de aluminio con una energía de 1500 eV y una potencia de 150 W) en un amplio rango de energías de enlace 0 en condiciones estándar de –1350 eV. Se registraron espectros de alta resolución utilizando una energía de transmisión de 50 eV y un paso de 0,2 eV.
Las muestras incubadas se retiraron y se lavaron suavemente con PBS (pH 7,4 ± 0,2) durante 15 s45. Para observar la viabilidad bacteriana de los biofilms en las muestras, los biofilms se tiñeron utilizando el kit de viabilidad bacteriana LIVE/DEAD BacLight (Invitrogen, Eugene, OR, EE. UU.). El kit contiene dos colorantes fluorescentes: el colorante fluorescente verde SYTO-9 y el colorante fluorescente rojo de yoduro de propidio (PI). En CLSM, los puntos fluorescentes verdes y rojos representan células vivas y muertas, respectivamente. Para la tinción, 1 ml de una mezcla que contenía 3 µl de SYTO-9 y 3 µl de solución de PI se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente (23 °C) en la oscuridad. Posteriormente, las muestras teñidas se examinaron a dos longitudes de onda (488 nm para células vivas y 559 nm para células muertas) utilizando un aparato CLSM Nikon (C2 Plus, Nikon, Japón). El espesor del biofilm se midió en modo de escaneo 3D.
Cómo citar este artículo: Li, H. et al. Corrosión microbiana del acero inoxidable superdúplex 2707 por biopelícula marina de Pseudomonas aeruginosa. The Science. 6, 20190. doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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