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La corrosion microbienne (CMI) représente un problème majeur dans de nombreux secteurs industriels, pouvant engendrer d'importantes pertes économiques. L'acier inoxydable super duplex 2707 (2707 HDSS) est utilisé en milieu marin en raison de son excellente résistance chimique. Cependant, sa résistance à la CMI n'a pas encore été démontrée expérimentalement. Cette étude examine le comportement de l'acier inoxydable super duplex 2707 (2707 HDSS) soumis à la CMI induite par la bactérie aérobie marine Pseudomonas aeruginosa. L'analyse électrochimique a révélé qu'en présence d'un biofilm de Pseudomonas aeruginosa dans le milieu 2216E, le potentiel de corrosion augmente, de même que la densité du courant de corrosion. L'analyse par spectroscopie photoélectronique X (XPS) a mis en évidence une diminution de la teneur en chrome à la surface de l'échantillon sous le biofilm. L'analyse visuelle des piqûres a montré que le biofilm de P. aeruginosa induisait une profondeur maximale de 0,69 µm de piqûres après 14 jours d'incubation. Bien que ce soit faible, cela indique que la souche 2707 HDSS n'est pas complètement immunisée contre la CMI des biofilms de P. aeruginosa.
Les aciers inoxydables duplex (DSS) sont largement utilisés dans diverses industries grâce à leur excellente combinaison de propriétés mécaniques et de résistance à la corrosion^1,2. Cependant, la corrosion par piqûres localisée persiste et affecte l'intégrité de cet acier^3,4. Les DSS ne sont pas résistants à la corrosion microbienne (MIC)^5,6. Malgré leurs nombreuses applications, leur résistance à la corrosion reste insuffisante dans certains environnements pour une utilisation à long terme. Il est donc nécessaire d'utiliser des matériaux plus coûteux présentant une résistance à la corrosion supérieure. Jeon et al.⁷ ont constaté que même les aciers inoxydables super duplex (SDSS) présentent certaines limitations en termes de résistance à la corrosion. Par conséquent, dans certains cas, des aciers inoxydables super duplex (HDSS) offrant une résistance à la corrosion encore plus élevée sont requis. Ceci a conduit au développement des HDSS fortement alliés.
La résistance à la corrosion des aciers inoxydables duplex (DSS) dépend du rapport des phases α et γ et est appauvrie en chrome (Cr), molybdène (Mo) et tungstène (W) dans les régions 8, 9 et 10 adjacentes à la phase β. Les aciers inoxydables à haute densité (HDSS) contiennent une forte teneur en Cr, Mo et N11, ce qui leur confère une excellente résistance à la corrosion et un indice de résistance à la piqûration équivalent (PREN) élevé (45-50). Cet indice est déterminé par la formule suivante : % massique Cr + 3,3 (% massique Mo + 0,5 % massique W) + 16 % massique N12. Cette excellente résistance à la corrosion est due à une composition équilibrée, contenant environ 50 % de phases ferritique (α) et 50 % de phases austénitique (γ). Les HDSS présentent de meilleures propriétés mécaniques et une résistance accrue à la corrosion par les chlorures. Cette résistance améliorée à la corrosion étend leur utilisation aux environnements chlorés plus agressifs, tels que les milieux marins.
La corrosion microbiologique (CMI) représente un problème majeur dans de nombreux secteurs industriels, tels que les industries pétrolière, gazière et de l'eau¹⁴. Elle est responsable de 20 % des dommages dus à la corrosion¹⁵. La CMI est une corrosion bioélectrochimique observable dans de nombreux environnements. Les biofilms qui se forment sur les surfaces métalliques modifient les conditions électrochimiques, influençant ainsi le processus de corrosion. Il est largement admis que la corrosion microbiologique est causée par les biofilms. Les micro-organismes électrogènes dégradent les métaux pour obtenir l'énergie nécessaire à leur survie¹⁷. Des études récentes sur la CMI ont montré que le transfert d'électrons extracellulaire (TEE) est le facteur limitant la vitesse de la CMI induite par les micro-organismes électrogènes. Zhang et al.¹⁸ ont démontré que les intermédiaires électroniques accélèrent le transfert d'électrons entre les cellules de Desulfovibrio sessificans et l'acier inoxydable 304, ce qui entraîne une attaque microbiologique plus sévère. Anning et al.¹⁹ et Wenzlaff et al.²⁰ ont montré que les biofilms de bactéries sulfato-réductrices (BSR) corrosives peuvent absorber directement des électrons des substrats métalliques, provoquant une corrosion par piqûres importante.
Il est connu que le DSS est sensible à la CMI dans les milieux contenant des SRB, des bactéries ferro-réductrices (IRB), etc. 21 . Ces bactéries provoquent des piqûres localisées à la surface du DSS sous les biofilms22,23. Contrairement au DSS, la CMI du HDSS24 n'est pas bien connue.
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie Gram négative, mobile et en forme de bâtonnet, largement répandue dans la nature²⁵. Elle constitue également un groupe microbien majeur en milieu marin, contribuant à l'élévation des concentrations minimales inhibitrices (CMI). Pseudomonas participe activement au processus de corrosion et est reconnue comme une bactérie pionnière lors de la formation de biofilms. Mahat et al.²⁸ et Yuan et al.²⁹ ont démontré que Pseudomonas aeruginosa tend à accélérer la corrosion des aciers doux et de leurs alliages en milieu aquatique.
L'objectif principal de ce travail était d'étudier les propriétés de l'acier inoxydable MIC 2707 HDSS altérées par la bactérie aérobie marine Pseudomonas aeruginosa, en utilisant des méthodes électrochimiques, d'analyse de surface et d'analyse des produits de corrosion. Des études électrochimiques, incluant le potentiel en circuit ouvert (OCP), la résistance de polarisation linéaire (LPR), la spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS) et la polarisation dynamique du potentiel, ont été réalisées pour étudier le comportement de l'acier inoxydable MIC 2707 HDSS. Une analyse par spectrométrie de dispersion d'énergie (EDS) a été effectuée pour détecter les éléments chimiques présents à la surface corrodée. De plus, la spectroscopie photoélectronique X (XPS) a été utilisée pour déterminer la stabilité de la couche de passivation d'oxyde sous l'influence d'un environnement marin contenant Pseudomonas aeruginosa. La profondeur des piqûres a été mesurée par microscopie confocale à balayage laser (CLSM).
Le tableau 1 présente la composition chimique de l'acier inoxydable HDSS 2707. Le tableau 2 indique que cet acier possède d'excellentes propriétés mécaniques, avec une limite d'élasticité de 650 MPa. La figure 1 illustre la microstructure optique de l'acier inoxydable HDSS 2707 après traitement thermique de mise en solution. Dans cette microstructure, composée d'environ 50 % d'austénite et 50 % de ferrite, on observe des bandes allongées d'austénite et de ferrite, sans phases secondaires.
La figure 2a présente le potentiel en circuit ouvert (Eocp) en fonction du temps d'exposition pour l'échantillon 2707 HDSS dans le milieu abiotique 2216E et dans un bouillon de culture de *P. aeruginosa* pendant 14 jours à 37 °C. Elle montre que la variation la plus importante et la plus significative de l'Eocp se produit au cours des premières 24 heures. Les valeurs d'Eocp atteignent un pic de -145 mV (par rapport à l'électrode de référence au calomel saturé, ECS) aux alentours de 16 h, puis chutent brutalement, atteignant -477 mV (par rapport à l'ECS) et -236 mV (par rapport à l'ECS) pour l'échantillon abiotique et les coupons de *Pseudomonas aeruginosa*, respectivement. Après 24 heures, la valeur d'Eocp de l'échantillon 2707 HDSS pour *P. aeruginosa* est relativement stable à -228 mV (par rapport à l'ECS), tandis que la valeur correspondante pour les échantillons non biologiques est d'environ -442 mV (par rapport à l'ECS). L'Eocp en présence de P. aeruginosa était assez faible.
Étude électrochimique de 2707 échantillons HDSS dans un milieu abiotique et un bouillon de Pseudomonas aeruginosa à 37 °C :
(a) Eocp en fonction du temps d'exposition, (b) courbes de polarisation au jour 14, (c) Rp en fonction du temps d'exposition et (d) icorr en fonction du temps d'exposition.
Le tableau 3 présente les paramètres de corrosion électrochimique de 2707 échantillons d'acier inoxydable hydrosoluble (HDSS) exposés à des milieux abiotiques et à des milieux inoculés avec Pseudomonas aeruginosa pendant une période de 14 jours. Les tangentes aux courbes anodique et cathodique ont été extrapolées pour obtenir des intersections permettant de calculer la densité de courant de corrosion (icorr), le potentiel de corrosion (Ecorr) et la pente de Tafel (βα et βc) selon les méthodes normalisées^30,31.
Comme le montre la figure 2b, le décalage vers le haut de la courbe de P. aeruginosa a entraîné une augmentation de Ecorr par rapport à la courbe abiotique. La valeur d'icorr, proportionnelle à la vitesse de corrosion, a atteint 0,328 µA cm⁻² dans l'échantillon contenant Pseudomonas aeruginosa, soit quatre fois plus que dans l'échantillon non biologique (0,087 µA cm⁻²).
La LPR est une méthode électrochimique non destructive classique pour l'analyse rapide de la corrosion. Elle a également été utilisée pour étudier le MIC32. La figure 2c montre la résistance de polarisation (Rp) en fonction du temps d'exposition. Une valeur de Rp plus élevée indique une corrosion moindre. Au cours des premières 24 heures, la Rp de l'acier inoxydable HDSS 2707 a atteint un pic de 1955 kΩ cm² pour les échantillons abiotiques et de 1429 kΩ cm² pour les échantillons de Pseudomonas aeruginosa. La figure 2c montre également que la valeur de Rp a diminué rapidement après une journée, puis est restée relativement stable pendant les 13 jours suivants. La valeur de Rp d'un échantillon de Pseudomonas aeruginosa est d'environ 40 kΩ cm², ce qui est bien inférieur à la valeur de 450 kΩ cm² d'un échantillon non biologique.
La valeur de icorr est proportionnelle à la vitesse de corrosion uniforme. Sa valeur peut être calculée à partir de l'équation de Stern-Giri suivante :
Selon Zoe et al.³³, la valeur typique de la pente de Tafel B utilisée dans cette étude a été fixée à 26 mV/décade. La figure 2d montre que l'icorr de l'échantillon non biologique 2707 est resté relativement stable, tandis que celui de l'échantillon de P. aeruginosa a fortement fluctué après les premières 24 heures. Les valeurs d'icorr des échantillons de P. aeruginosa étaient un ordre de grandeur supérieur à celles des témoins non biologiques. Cette tendance est cohérente avec les résultats de la résistance de polarisation.
La spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS) est une autre méthode non destructive utilisée pour caractériser les réactions électrochimiques sur les surfaces corrodées. Les spectres d'impédance et les valeurs de capacité calculées des échantillons exposés à un environnement abiotique et à une solution de Pseudomonas aeruginosa, la résistance du film passif/biofilm Rb formé à la surface de l'échantillon, la résistance de transfert de charge Rct, la capacité de la double couche électrique Cdl (EDL) et les paramètres de l'élément de phase constant QCPE (CPE) ont été déterminés. Ces paramètres ont ensuite été analysés par ajustement des données à l'aide d'un modèle de circuit équivalent (EEC).
La figure 3 présente les diagrammes de Nyquist (a et b) et de Bode (a' et b') typiques de 2707 échantillons HDSS en milieu abiotique et en bouillon de P. aeruginosa pour différents temps d'incubation. Le diamètre de l'anneau de Nyquist diminue en présence de Pseudomonas aeruginosa. Le diagramme de Bode (figure 3b') montre l'augmentation de l'impédance totale. La constante de temps de relaxation peut être déterminée à partir des maxima de phase. La figure 4 illustre les structures physiques d'une monocouche (a) et d'une bicouche (b), ainsi que les EEC correspondantes. Un CPE est intégré au modèle d'EEC. Son admittance et son impédance sont exprimées comme suit :
Deux modèles physiques et circuits équivalents correspondants pour ajuster le spectre d'impédance de l'échantillon 2707 HDSS :
où Y0 représente la valeur de l'indicateur de performance clé (KPI), j le nombre imaginaire ou (-1)^1/2, ω la fréquence angulaire et n l'indice de puissance du KPI inférieur à un³⁵. L'inversion de la résistance de transfert de charge (soit 1/Rct) correspond à la vitesse de corrosion. Plus Rct est faible, plus la vitesse de corrosion est élevée²⁷. Après 14 jours d'incubation, la valeur de Rct des échantillons de Pseudomonas aeruginosa a atteint 32 kΩ cm², soit bien inférieure aux 489 kΩ cm² des échantillons non biologiques (tableau 4).
Les images CLSM et MEB de la figure 5 montrent clairement que le biofilm recouvrant la surface de l'échantillon HDSS 2707 est dense après 7 jours. Cependant, après 14 jours, la couverture par le biofilm est faible et quelques cellules mortes sont apparues. Le tableau 5 présente l'épaisseur du biofilm sur les échantillons HDSS 2707 après exposition à *P. aeruginosa* pendant 7 et 14 jours. L'épaisseur maximale du biofilm est passée de 23,4 µm après 7 jours à 18,9 µm après 14 jours. L'épaisseur moyenne du biofilm confirme également cette tendance : elle a diminué de 22,2 ± 0,7 µm après 7 jours à 17,8 ± 1,0 µm après 14 jours.
(a) Image CLSM 3D à 7 jours, (b) Image CLSM 3D à 14 jours, (c) Image MEB à 7 jours et (d) Image MEB à 14 jours.
L'analyse EMF a révélé la présence d'éléments chimiques dans les biofilms et les produits de corrosion d'échantillons exposés à *P. aeruginosa* pendant 14 jours. La figure 6 montre que les teneurs en C, N, O et P dans les biofilms et les produits de corrosion sont significativement plus élevées que dans les métaux purs, car ces éléments sont associés aux biofilms et à leurs métabolites. Les microbes n'ont besoin que de traces de chrome et de fer. Les concentrations élevées de Cr et de Fe dans les biofilms et les produits de corrosion à la surface des échantillons indiquent que la matrice métallique a perdu des éléments par corrosion.
Après 14 jours, des piqûres, avec et sans *P. aeruginosa*, ont été observées dans le milieu 2216E. Avant incubation, la surface des échantillons était lisse et sans défaut (Fig. 7a). Après incubation et élimination du biofilm et des produits de corrosion, les piqûres les plus profondes à la surface des échantillons ont été examinées par microscopie confocale à balayage laser (CLSM), comme illustré sur les figures 7b et 7c. Aucune piqûre notable n'a été observée à la surface des témoins non biologiques (profondeur maximale des piqûres : 0,02 µm). La profondeur maximale des piqûres causées par *P. aeruginosa* était de 0,52 µm à 7 jours et de 0,69 µm à 14 jours, d'après la profondeur maximale moyenne des piqûres mesurée sur 3 échantillons (10 profondeurs maximales ont été sélectionnées pour chaque échantillon). Les valeurs obtenues étaient respectivement de 0,42 ± 0,12 µm et de 0,52 ± 0,15 µm (Tableau 5). Ces valeurs de profondeur sont faibles, mais significatives.
(a) avant l'exposition, (b) 14 jours dans un environnement abiotique et (c) 14 jours dans un bouillon de Pseudomonas aeruginosa.
La figure 8 présente les spectres XPS des différentes surfaces d'échantillons, et la composition chimique analysée pour chaque surface est résumée dans le tableau 6. Dans ce tableau, les pourcentages atomiques de Fe et Cr en présence de *P. aeruginosa* (échantillons A et B) étaient nettement inférieurs à ceux des témoins non biologiques (échantillons C et D). Pour un échantillon contenant *P. aeruginosa*, la courbe spectrale au niveau du noyau Cr 2p a été décomposée en quatre pics d'énergies de liaison (BE) de 574,4, 576,6, 578,3 et 586,8 eV, attribuables respectivement à Cr, Cr₂O₃, CrO₃ et Cr(OH)₃ (figures 9a et 9b). Pour les échantillons non biologiques, le spectre du niveau principal Cr 2p présente deux pics principaux correspondant à Cr (573,80 eV pour l'énergie de liaison) et à Cr₂O₃ (575,90 eV pour l'énergie de liaison), comme illustré respectivement sur les figures 9c et 9d. La différence la plus marquante entre les échantillons abiotiques et les échantillons de P. aeruginosa réside dans la présence de Cr⁶⁺ et une proportion relative plus élevée de Cr(OH)₃ (énergie de liaison de 586,8 eV) sous le biofilm.
Les spectres XPS larges de la surface de l'échantillon 2707 HDSS dans deux milieux sont respectivement de 7 et 14 jours.
(a) 7 jours d'exposition à P. aeruginosa, (b) 14 jours d'exposition à P. aeruginosa, (c) 7 jours dans un environnement abiotique et (d) 14 jours dans un environnement abiotique.
L'acier inoxydable duplex haute résistance (HDSS) présente une résistance élevée à la corrosion dans la plupart des environnements. Kim et al.² ont rapporté que l'acier inoxydable duplex haute résistance UNS S32707 était un acier inoxydable fortement allié avec un indice PREN supérieur à 45. Dans cette étude, l'indice PREN de l'échantillon 2707 HDSS était de 49. Ceci est dû à sa teneur élevée en chrome, molybdène et nickel, éléments bénéfiques en milieux acides et à forte concentration en chlorures. De plus, une composition équilibrée et une microstructure sans défauts contribuent à sa stabilité structurale et à sa résistance à la corrosion. Cependant, malgré son excellente résistance chimique, les données expérimentales de cette étude suggèrent que l'acier inoxydable duplex 2707 n'est pas totalement immunisé contre les concentrations minimales inhibitrices (CMI) du biofilm de Pseudomonas aeruginosa.
Les résultats électrochimiques ont montré que le taux de corrosion de l'acier inoxydable HDSS 2707 dans le bouillon de culture de *P. aeruginosa* augmentait significativement après 14 jours, comparativement au milieu non biologique. Sur la figure 2a, une diminution du potentiel de corrosion (Eocp) a été observée à la fois dans le milieu abiotique et dans le bouillon de culture de *P. aeruginosa* au cours des 24 premières heures. Par la suite, le biofilm recouvre complètement la surface de l'échantillon et le potentiel de corrosion se stabilise relativement³⁶. Cependant, le niveau de potentiel de corrosion biologique était nettement supérieur au niveau de potentiel de corrosion non biologique. Il est probable que cette différence soit liée à la formation de biofilms de *P. aeruginosa*. Sur la figure 2d, en présence de *P. aeruginosa*, la valeur de *icorr* de l'acier inoxydable HDSS 2707 a atteint 0,627 μA cm^-2, soit un ordre de grandeur supérieur à celle du témoin abiotique (0,063 μA cm^-2), ce qui concorde avec la valeur de résistance de corrosion (Rct) mesurée par spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS). Durant les premiers jours, les valeurs d'impédance dans le bouillon de culture de *P. aeruginosa* ont augmenté en raison de l'adhérence des cellules de *P. aeruginosa* et de la formation de biofilms. Cependant, lorsque le biofilm recouvre complètement la surface de l'échantillon, l'impédance diminue. La couche protectrice est principalement attaquée par la formation de biofilms et de leurs métabolites. Par conséquent, la résistance à la corrosion diminue au fil du temps et l'adhérence de *P. aeruginosa* provoque une corrosion localisée. Les tendances observées en milieu abiotique sont différentes. La résistance à la corrosion du témoin non biologique est nettement supérieure à celle des échantillons exposés au bouillon de culture de *P. aeruginosa*. De plus, pour les échantillons abiotiques, la valeur Rct 2707 HDSS atteint 489 kΩ cm² au 14^e jour, soit 15 fois plus que la valeur Rct (32 kΩ cm²) en présence de *P. aeruginosa*. Ainsi, l'acier inoxydable HDSS 2707 présente une excellente résistance à la corrosion dans un environnement stérile, mais n'est pas résistant aux CMI des biofilms de P. aeruginosa.
Ces résultats sont également visibles sur les courbes de polarisation de la figure 2b. La ramification anodique est associée à la formation de biofilm de Pseudomonas aeruginosa et aux réactions d'oxydation du métal. Dans ce cas, la réaction cathodique correspond à la réduction de l'oxygène. La présence de P. aeruginosa a considérablement augmenté la densité de courant de corrosion, d'environ un ordre de grandeur supérieur à celle du témoin abiotique. Ceci indique que le biofilm de P. aeruginosa favorise la corrosion localisée de l'acier inoxydable HDSS 2707. Yuan et al.²⁹ ont constaté que la densité de courant de corrosion de l'alliage Cu-Ni 70/30 augmentait sous l'action du biofilm de P. aeruginosa. Ceci pourrait être dû à la biocatalyse de la réduction de l'oxygène par les biofilms de Pseudomonas aeruginosa. Cette observation pourrait également expliquer la corrosion microbiologique (MIC) de l'acier inoxydable HDSS 2707 observée dans cette étude. La concentration d'oxygène pourrait également être plus faible en présence de biofilms aérobies. Par conséquent, le refus de repasser la surface métallique avec de l'oxygène pourrait être un facteur contribuant à la corrosion microbiologique observée dans ce travail.
Dickinson et al. [38] ont suggéré que la vitesse des réactions chimiques et électrochimiques peut être directement influencée par l'activité métabolique des bactéries sessiles présentes à la surface de l'échantillon et par la nature des produits de corrosion. Comme le montrent la figure 5 et le tableau 5, le nombre de cellules et l'épaisseur du biofilm ont diminué après 14 jours. Ceci s'explique probablement par le fait qu'après 14 jours, la plupart des cellules sessiles à la surface de l'acier inoxydable austénitique 2707 (HDSS 2707) sont mortes, soit par épuisement des nutriments dans le milieu 2216E, soit par libération d'ions métalliques toxiques provenant de la matrice de l'HDSS 2707. Il s'agit d'une limite inhérente aux expériences en batch.
Dans cette étude, un biofilm de *P. aeruginosa* a contribué à l'appauvrissement local en Cr et Fe sous le biofilm à la surface de l'acier inoxydable hydrothermal 2707 (figure 6). Le tableau 6 montre la réduction des concentrations de Fe et Cr dans l'échantillon D par rapport à l'échantillon C, indiquant que le Fe et le Cr dissous par le biofilm de *P. aeruginosa* ont persisté pendant les 7 premiers jours. L'environnement 2216E est utilisé pour simuler le milieu marin. Il contient 17 700 ppm de Cl⁻, une concentration comparable à celle de l'eau de mer naturelle. La présence de 17 700 ppm de Cl⁻ est la principale cause de la diminution du Cr dans les échantillons abiotiques prélevés après 7 et 14 jours et analysés par XPS. Comparée aux échantillons contenant *P. aeruginosa*, la dissolution du Cr dans les échantillons abiotiques était beaucoup plus faible en raison de la forte résistance de l'acier inoxydable hydrothermal 2707 au chlore en conditions abiotiques. La figure 9 montre la présence de Cr⁶⁺ dans le film de passivation. Il pourrait être impliqué dans l'élimination du chrome des surfaces en acier par les biofilms de P. aeruginosa, comme l'ont suggéré Chen et Clayton.
En raison de la croissance bactérienne, les valeurs de pH du milieu avant et après culture étaient respectivement de 7,4 et 8,2. Ainsi, sous le biofilm de *P. aeruginosa*, la corrosion par les acides organiques est peu susceptible de contribuer à cette étude, compte tenu du pH relativement élevé du milieu. Le pH du milieu témoin non biologique n'a pas varié significativement (de 7,4 initialement à 7,5 finalement) au cours des 14 jours de l'expérience. L'augmentation du pH dans le milieu d'ensemencement après incubation était due à l'activité métabolique de *P. aeruginosa* et a eu le même effet sur le pH en l'absence de bandelettes de test.
Comme le montre la figure 7, la profondeur maximale des piqûres induites par le biofilm de *P. aeruginosa* était de 0,69 µm, soit bien supérieure à celle observée en milieu abiotique (0,02 µm). Ce résultat est cohérent avec les données électrochimiques décrites précédemment. La profondeur de 0,69 µm est plus de dix fois inférieure à la valeur de 9,5 µm rapportée pour l'acier inoxydable duplex 2205 dans les mêmes conditions. Ces données indiquent que l'acier inoxydable hydrodynamique 2707 présente une meilleure résistance aux CMI que l'acier inoxydable duplex 2205. Ce résultat n'est pas surprenant, car l'acier inoxydable hydrodynamique 2707 possède des teneurs en chrome plus élevées, ce qui prolonge la passivation et rend la dépassivation de *P. aeruginosa* plus difficile. De plus, sa structure de phase équilibrée, exempte de précipitations secondaires nuisibles, prévient la formation de piqûres.
En conclusion, des piqûres de corrosion microbiologique (MIC) ont été observées à la surface de l'acier inoxydable HDSS 2707 dans un bouillon de culture contenant *P. aeruginosa*, contrairement aux piqûres négligeables observées en milieu abiotique. Cette étude démontre que l'acier inoxydable HDSS 2707 présente une meilleure résistance à la MIC que l'acier inoxydable DSS 2205, mais qu'il n'est pas totalement immunisé contre cette corrosion en raison du biofilm de *P. aeruginosa*. Ces résultats contribuent au choix d'aciers inoxydables adaptés et à l'estimation de leur durée de vie en milieu marin.
Échantillon d'acier inoxydable HDSS 2707 fourni par l'École de métallurgie de l'Université du Nord-Est (NEU) de Shenyang, en Chine. La composition élémentaire de cet acier est présentée dans le tableau 1 ; elle a été analysée par le Département d'analyse et d'essais des matériaux de la NEU. Tous les échantillons ont subi un traitement de mise en solution à 1180 °C pendant 1 heure. Avant les essais de corrosion, un échantillon d'acier inoxydable HDSS 2707 de forme cylindrique, présentant une surface supérieure ouverte de 1 cm², a été poli jusqu'à un grain de 2000 avec du papier abrasif au carbure de silicium, puis avec une suspension de poudre d'alumine (Al₂O₃) de 0,05 µm. Les faces latérales et inférieures ont été protégées par une peinture inerte. Après séchage, les échantillons ont été lavés à l'eau déminéralisée stérile et stérilisés à l'éthanol à 75 % (v/v) pendant 30 minutes. Ils ont ensuite été séchés à l'air sous rayonnement ultraviolet (UV) pendant 30 minutes avant utilisation.
La souche marine de Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099 a été achetée auprès du Centre de collection de cultures marines de Xiamen (MCCC), en Chine. Pseudomonas aeruginosa a été cultivée en conditions aérobies à 37 °C dans des flacons de 250 ml et des cellules électrochimiques en verre de 500 ml, en utilisant le milieu liquide Marine 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, Chine). Le milieu contient (g/l) : 19,45 NaCl, 5,98 MgCl₂, 3,24 Na₂SO₄, 1,8 CaCl₂, 0,55 KCl, 0,16 Na₂CO₃, 0,08 KBr, 0,034 SrCl₂, 0,08 SrBr₂, 0,022 H₃BO₃, 0,004 Na₂SiO₃, 0,016 NH₂NH₃, 3,0016 NH₃, 5,0 g de peptone, 1,0 g d'extrait de levure et 0,1 g de citrate de fer. Autoclaver à 121 °C pendant 20 minutes avant l'inoculation. Dénombrer les cellules sessiles et planctoniques à l'aide d'une cellule de Malassez sous un microscope optique à un grossissement de 400x. La concentration initiale de Pseudomonas aeruginosa planctonique immédiatement après l'inoculation était d'environ 10⁶ cellules/ml.
Des tests électrochimiques ont été réalisés dans une cellule en verre classique à trois électrodes d'un volume de 500 ml. Une feuille de platine et une électrode au calomel saturée (ECS) étaient reliées au réacteur par des capillaires de Luggin remplis de ponts salins, servant respectivement de contre-électrode et d'électrode de référence. Pour la fabrication des électrodes de travail, un fil de cuivre caoutchouté a été fixé à chaque échantillon et recouvert de résine époxy, laissant une surface non protégée d'environ 1 cm² sur une face. Lors des mesures électrochimiques, les échantillons ont été placés dans le milieu 2216E et maintenus à une température d'incubation constante (37 °C) dans un bain-marie. Les données de potentiel en circuit ouvert (OCP), de résistance de polarisation linéaire (LPR), d'impédance électrochimique (EIS) et de polarisation dynamique du potentiel ont été mesurées à l'aide d'un potentiostat Autolab (Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., États-Unis). Les tests LPR ont été enregistrés à une vitesse de balayage de 0,125 mV s⁻¹ dans la gamme de -5 à 5 mV avec Eocp et une fréquence d'échantillonnage de 1 Hz. L'EIS a été réalisée avec un signal sinusoïdal sur une gamme de fréquences de 0,01 à 10 000 Hz, en appliquant une tension de 5 mV à l'état stationnaire du potentiel de corrosion libre (Eocp). Avant le balayage de potentiel, les électrodes étaient au repos jusqu'à stabilisation du potentiel de corrosion libre. Les courbes de polarisation ont ensuite été mesurées de -0,2 à 1,5 V en fonction de Eocp à une vitesse de balayage de 0,166 mV/s. Chaque test a été répété trois fois, avec et sans P. aeruginosa.
Les échantillons destinés à l'analyse métallographique ont été polis mécaniquement à l'aide de papier abrasif au carbure de silicium de grain 2000 (à l'eau), puis polis avec une suspension de poudre d'alumine (Al₂O₃) de 0,05 µm en vue de l'observation optique. L'analyse métallographique a été réalisée à l'aide d'un microscope optique. Les échantillons ont été attaqués chimiquement avec une solution d'hydroxyde de potassium à 10 % en poids.
Après incubation, les échantillons ont été lavés trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) puis fixés avec du glutaraldéhyde à 2,5 % (v/v) pendant 10 heures afin de fixer les biofilms. Ils ont ensuite été déshydratés par des bains successifs d'éthanol (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 % v/v) avant d'être séchés à l'air. Enfin, un film d'or a été déposé à la surface de l'échantillon pour assurer sa conductivité en vue de l'observation au MEB. Les images MEB ont été focalisées sur les zones présentant la plus forte concentration de cellules de *P. aeruginosa* sessiles à la surface de chaque échantillon. Une analyse EDS a été réalisée pour identifier les éléments chimiques. Un microscope confocal à balayage laser Zeiss (CLSM) (LSM 710, Zeiss, Allemagne) a été utilisé pour mesurer la profondeur des ponctuations. Pour observer les piqûres de corrosion sous le biofilm, l'échantillon d'essai a d'abord été nettoyé conformément à la norme nationale chinoise (CNS) GB/T4334.4-2000 afin d'éliminer les produits de corrosion et le biofilm de la surface de l'échantillon d'essai.
L'analyse par spectroscopie photoélectronique X (XPS, système d'analyse de surface ESCALAB250, Thermo VG, États-Unis) a été réalisée à l'aide d'une source de rayons X monochromatique (raie Kα de l'aluminium, énergie de 1500 eV et puissance de 150 W) sur une large gamme d'énergies de liaison, de 0 à –1350 eV dans les conditions standard. Les spectres haute résolution ont été enregistrés avec une énergie de transmission de 50 eV et un pas de 0,2 eV.
Les échantillons incubés ont été retirés et lavés délicatement avec du PBS (pH 7,4 ± 0,2) pendant 15 s. Pour observer la viabilité bactérienne des biofilms présents sur les échantillons, ces derniers ont été colorés à l'aide du kit de viabilité bactérienne LIVE/DEAD BacLight (Invitrogen, Eugene, OR, États-Unis). Ce kit contient deux colorants fluorescents : le SYTO-9 (vert) et l'iodure de propidium (PI) (rouge). En microscopie confocale à balayage laser (CLSM), les points fluorescents verts et rouges représentent respectivement les cellules vivantes et mortes. Pour la coloration, 1 ml d'un mélange contenant 3 µl de SYTO-9 et 3 µl de solution de PI a été incubé pendant 20 minutes à température ambiante (23 °C) à l'obscurité. Les échantillons colorés ont ensuite été examinés à deux longueurs d'onde (488 nm pour les cellules vivantes et 559 nm pour les cellules mortes) à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser Nikon (C2 Plus, Nikon, Japon). L'épaisseur du biofilm a été mesurée en mode de numérisation 3D.
Comment citer cet article : Li, H. et al. Corrosion microbienne de l’acier inoxydable super duplex 2707 par le biofilm marin de Pseudomonas aeruginosa. the science. 6, 20190. doi : 10.1038/srep20190 (2016).
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