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La corrosione microbica (MIC) rappresenta un grave problema in molti settori industriali, in quanto può causare ingenti perdite economiche. L'acciaio inossidabile super duplex 2707 (2707 HDSS) è utilizzato in ambienti marini grazie alla sua eccellente resistenza chimica. Tuttavia, la sua resistenza alla MIC non è stata dimostrata sperimentalmente. Questo studio ha esaminato il comportamento dell'acciaio inossidabile 2707 HDSS sottoposto a MIC causata dal batterio marino aerobico Pseudomonas aeruginosa. L'analisi elettrochimica ha mostrato che, in presenza di biofilm di Pseudomonas aeruginosa nel mezzo 2216E, si verifica una variazione positiva del potenziale di corrosione e un aumento della densità di corrente di corrosione. L'analisi mediante spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) ha evidenziato una diminuzione del contenuto di Cr sulla superficie del campione al di sotto del biofilm. L'analisi visiva delle cavità ha mostrato che il biofilm di P. aeruginosa ha prodotto una profondità massima di 0,69 µm durante 14 giorni di incubazione. Sebbene si tratti di una quantità minima, ciò indica che il ceppo 2707 HDSS non è completamente immune alla MIC dei biofilm di P. aeruginosa.
Gli acciai inossidabili duplex (DSS) sono ampiamente utilizzati in diversi settori industriali grazie alla perfetta combinazione di eccellenti proprietà meccaniche e resistenza alla corrosione1,2. Tuttavia, si verificano ancora fenomeni di pitting localizzato che compromettono l'integrità di questo acciaio3,4. Il DSS non è resistente alla corrosione microbica (MIC)5,6. Nonostante l'ampia gamma di applicazioni del DSS, esistono ancora ambienti in cui la sua resistenza alla corrosione non è sufficiente per un utilizzo a lungo termine. Ciò significa che sono necessari materiali più costosi con una maggiore resistenza alla corrosione. Jeon et al7 hanno scoperto che anche gli acciai inossidabili super duplex (SDSS) presentano alcune limitazioni in termini di resistenza alla corrosione. Pertanto, in alcuni casi, sono necessari acciai inossidabili super duplex (HDSS) con una maggiore resistenza alla corrosione. Questo ha portato allo sviluppo di HDSS altamente legati.
La resistenza alla corrosione del DSS dipende dal rapporto tra le fasi alfa e gamma e dalle regioni 8, 9, 10 adiacenti alla seconda fase, impoverite in Cr, Mo e W. L'HDSS contiene un elevato contenuto di Cr, Mo e N11, pertanto presenta un'eccellente resistenza alla corrosione e un alto valore (45-50) del numero di resistenza alla vaiolatura equivalente (PREN) determinato da % in peso di Cr + 3,3 (% in peso di Mo + 0,5% in peso di W) + 16% in peso di N12. La sua eccellente resistenza alla corrosione dipende da una composizione bilanciata contenente circa il 50% di fasi ferritiche (α) e il 50% di fasi austenitiche (γ). L'HDSS ha migliori proprietà meccaniche e una maggiore resistenza alla corrosione da cloruri. La migliore resistenza alla corrosione estende l'uso dell'HDSS in ambienti clorurati più aggressivi come gli ambienti marini.
La corrosione indotta da microrganismi (MIC) è un problema importante in molti settori industriali, come quello petrolifero, del gas e idrico14. La MIC rappresenta il 20% di tutti i danni da corrosione15. La MIC è una corrosione bioelettrochimica che può essere osservata in molti ambienti. I biofilm che si formano sulle superfici metalliche modificano le condizioni elettrochimiche, influenzando così il processo di corrosione. Si ritiene generalmente che la corrosione da MIC sia causata dai biofilm. I microrganismi elettrogeni consumano i metalli per ottenere l'energia necessaria alla loro sopravvivenza17. Recenti studi sulla MIC hanno dimostrato che il trasferimento di elettroni extracellulari (EET) è il fattore limitante nella MIC indotta da microrganismi elettrogeni. Zhang et al. 18 hanno dimostrato che gli intermediari elettronici accelerano il trasferimento di elettroni tra le cellule di Desulfovibrio sessificans e l'acciaio inossidabile 304, provocando un attacco MIC più grave. Anning et al. 19 e Wenzlaff et al. 20 studi hanno dimostrato che i biofilm di batteri solfato-riduttori corrosivi (SRB) possono assorbire direttamente elettroni dai substrati metallici, provocando una grave vaiolatura.
È noto che il DSS è suscettibile alla MIC nei terreni contenenti SRB, batteri ferro-riduttori (IRB), ecc. 21. Questi batteri causano vaiolatura localizzata sulla superficie del DSS sotto i biofilm22,23. A differenza del DSS, la MIC dell'HDSS24 non è ben nota.
Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram-negativo, mobile, a forma di bastoncello, ampiamente diffuso in natura25. Pseudomonas aeruginosa è anche un importante gruppo microbico nell'ambiente marino, causando elevate concentrazioni di MIC (concentrazione minima inibitoria). Pseudomonas è attivamente coinvolto nel processo di corrosione ed è riconosciuto come un colonizzatore pioniere durante la formazione del biofilm. Mahat et al. 28 e Yuan et al. 29 hanno dimostrato che Pseudomonas aeruginosa tende ad aumentare il tasso di corrosione dell'acciaio dolce e delle leghe negli ambienti acquatici.
L'obiettivo principale di questo lavoro era quello di studiare le proprietà dell'acciaio inossidabile ad alta densità MIC 2707 (HDSS) corroso dal batterio marino aerobico Pseudomonas aeruginosa, utilizzando metodi elettrochimici, analisi di superficie e analisi dei prodotti di corrosione. Sono stati condotti studi elettrochimici, tra cui potenziale a circuito aperto (OCP), resistenza di polarizzazione lineare (LPR), spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS) e polarizzazione dinamica del potenziale, per studiare il comportamento dell'acciaio inossidabile MIC 2707. L'analisi spettrometrica a dispersione di energia (EDS) è stata effettuata per rilevare gli elementi chimici presenti sulla superficie corrosa. Inoltre, la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) è stata utilizzata per determinare la stabilità della passivazione del film di ossido sotto l'influenza di un ambiente marino contenente Pseudomonas aeruginosa. La profondità delle cavità è stata misurata mediante un microscopio confocale a scansione laser (CLSM).
La Tabella 1 mostra la composizione chimica dell'acciaio inossidabile HDSS 2707. La Tabella 2 mostra che l'acciaio inossidabile HDSS 2707 possiede eccellenti proprietà meccaniche con una resistenza allo snervamento di 650 MPa. La Figura 1 mostra la microstruttura ottica dell'acciaio inossidabile HDSS 2707 trattato termicamente in soluzione. Nella microstruttura, contenente circa il 50% di fase austenitica e il 50% di fase ferritica, sono visibili bande allungate di fase austenitica e ferritica senza fasi secondarie.
La figura 2a mostra il potenziale a circuito aperto (Eocp) in funzione del tempo di esposizione per 2707 HDSS in terreno abiotico 2216E e brodo di P. aeruginosa per 14 giorni a 37 °C. Si osserva che la variazione più ampia e significativa di Eocp si verifica entro le prime 24 ore. I valori di Eocp in entrambi i casi hanno raggiunto il picco a -145 mV (rispetto a SCE) intorno alle 16 ore e poi sono diminuiti bruscamente, raggiungendo -477 mV (rispetto a SCE) e -236 mV (rispetto a SCE) rispettivamente per il campione abiotico e i campioni di P. aeruginosa. Dopo 24 ore, il valore di Eocp per 2707 HDSS per P. aeruginosa è rimasto relativamente stabile a -228 mV (rispetto a SCE), mentre il valore corrispondente per i campioni non biologici era di circa -442 mV (rispetto a SCE). L'Eocp in presenza di P. aeruginosa era piuttosto basso.
Studio elettrochimico di 2707 campioni di HDSS in terreno abiotico e brodo di Pseudomonas aeruginosa a 37 °C:
(a) Eocp in funzione del tempo di esposizione, (b) curve di polarizzazione al giorno 14, (c) Rp in funzione del tempo di esposizione e (d) icorr in funzione del tempo di esposizione.
La Tabella 3 mostra i parametri di corrosione elettrochimica di 2707 campioni HDSS esposti a terreni abiotici e inoculati con Pseudomonas aeruginosa per un periodo di 14 giorni. Le tangenti delle curve anodiche e catodiche sono state estrapolate per ottenere le intersezioni che forniscono la densità di corrente di corrosione (icorr), il potenziale di corrosione (Ecorr) e la pendenza di Tafel (βα e βc) secondo i metodi standard30,31.
Come mostrato in figura 2b, uno spostamento verso l'alto della curva di P. aeruginosa ha determinato un aumento di Ecorr rispetto alla curva abiotica. Il valore di icorr, che è proporzionale alla velocità di corrosione, è aumentato a 0,328 µA cm-2 nel campione di Pseudomonas aeruginosa, che è quattro volte maggiore rispetto al campione non biologico (0,087 µA cm-2).
LPR è un classico metodo elettrochimico non distruttivo per l'analisi rapida della corrosione. È stato utilizzato anche per studiare MIC32. La figura 2c mostra la resistenza di polarizzazione (Rp) in funzione del tempo di esposizione. Un valore di Rp più elevato indica una minore corrosione. Nelle prime 24 ore, Rp 2707 HDSS ha raggiunto un picco di 1955 kΩ cm2 per i campioni abiotici e di 1429 kΩ cm2 per i campioni di Pseudomonas aeruginosa. La figura 2c mostra anche che il valore di Rp è diminuito rapidamente dopo un giorno ed è poi rimasto relativamente invariato nei successivi 13 giorni. Il valore di Rp di un campione di Pseudomonas aeruginosa è di circa 40 kΩ cm2, che è molto inferiore al valore di 450 kΩ cm2 di un campione non biologico.
Il valore di icorr è proporzionale alla velocità di corrosione uniforme. Il suo valore può essere calcolato mediante la seguente equazione di Stern-Giri:
Secondo Zoe et al. 33, il valore tipico della pendenza di Tafel B in questo lavoro è stato considerato pari a 26 mV/dec. La Figura 2d mostra che l'icorr del campione non biologico 2707 è rimasto relativamente stabile, mentre il campione di P. aeruginosa ha subito forti fluttuazioni dopo le prime 24 ore. I valori di icorr dei campioni di P. aeruginosa erano di un ordine di grandezza superiori a quelli dei controlli non biologici. Questa tendenza è coerente con i risultati della resistenza di polarizzazione.
L'EIS è un altro metodo non distruttivo utilizzato per caratterizzare le reazioni elettrochimiche su superfici corrose. Spettri di impedenza e valori di capacità calcolati di campioni esposti ad ambiente abiotico e soluzione di Pseudomonas aeruginosa, resistenza del film passivo/biofilm Rb formato sulla superficie del campione, resistenza al trasferimento di carica Rct, capacità del doppio strato elettrico Cdl (EDL) e parametri costanti dell'elemento di fase QCPE (CPE). Questi parametri sono stati ulteriormente analizzati adattando i dati utilizzando un modello di circuito equivalente (EEC).
La figura 3 mostra i tipici diagrammi di Nyquist (a e b) e di Bode (a' e b') per 2707 campioni HDSS in terreno abiotico e brodo di P. aeruginosa per diversi tempi di incubazione. Il diametro dell'anello di Nyquist diminuisce in presenza di Pseudomonas aeruginosa. Il diagramma di Bode (Fig. 3b') mostra l'aumento dell'impedenza totale. Informazioni sulla costante di tempo di rilassamento possono essere ottenute dai massimi di fase. La figura 4 mostra le strutture fisiche basate su un monostrato (a) e un doppio strato (b) e i corrispondenti EEC. Il CPE è introdotto nel modello EEC. La sua ammettenza e impedenza sono espresse come segue:
Due modelli fisici e i corrispondenti circuiti equivalenti per l'adattamento dello spettro di impedenza del campione 2707 HDSS:
dove Y0 è il valore KPI, j è il numero immaginario o (-1)1/2, ω è la frequenza angolare, n è l'indice di potenza KPI inferiore a uno35. L'inversione della resistenza di trasferimento di carica (ovvero 1/Rct) corrisponde al tasso di corrosione. Minore è Rct, maggiore è il tasso di corrosione27. Dopo 14 giorni di incubazione, l'Rct dei campioni di Pseudomonas aeruginosa ha raggiunto 32 kΩ cm2, che è molto inferiore ai 489 kΩ cm2 dei campioni non biologici (Tabella 4).
Le immagini CLSM e SEM in Figura 5 mostrano chiaramente che il rivestimento di biofilm sulla superficie del campione HDSS 2707 dopo 7 giorni è denso. Tuttavia, dopo 14 giorni, la copertura del biofilm era scarsa e sono comparse alcune cellule morte. La Tabella 5 mostra lo spessore del biofilm sui campioni HDSS 2707 dopo l'esposizione a P. aeruginosa per 7 e 14 giorni. Lo spessore massimo del biofilm è passato da 23,4 µm dopo 7 giorni a 18,9 µm dopo 14 giorni. Anche lo spessore medio del biofilm ha confermato questa tendenza. È diminuito da 22,2 ± 0,7 μm dopo 7 giorni a 17,8 ± 1,0 μm dopo 14 giorni.
(a) Immagine CLSM 3D a 7 giorni, (b) Immagine CLSM 3D a 14 giorni, (c) Immagine SEM a 7 giorni e (d) Immagine SEM a 14 giorni.
L'analisi EMF ha rivelato la presenza di elementi chimici nei biofilm e nei prodotti di corrosione su campioni esposti a P. aeruginosa per 14 giorni. La Figura 6 mostra che il contenuto di C, N, O e P nei biofilm e nei prodotti di corrosione è significativamente più elevato rispetto a quello dei metalli puri, poiché questi elementi sono associati ai biofilm e ai loro metaboliti. I microbi necessitano solo di tracce di cromo e ferro. Gli alti livelli di Cr e Fe nei biofilm e nei prodotti di corrosione sulla superficie dei campioni indicano che la matrice metallica ha perso elementi a causa della corrosione.
Dopo 14 giorni, sono state osservate fossette con e senza P. aeruginosa nel terreno 2216E. Prima dell'incubazione, la superficie dei campioni era liscia e priva di difetti (Fig. 7a). Dopo l'incubazione e la rimozione del biofilm e dei prodotti di corrosione, le fossette più profonde sulla superficie dei campioni sono state esaminate mediante CLSM, come mostrato in Fig. 7b e c. Non è stata riscontrata alcuna fossetta evidente sulla superficie dei controlli non biologici (profondità massima della fossetta 0,02 µm). La profondità massima della fossetta causata da P. aeruginosa è stata di 0,52 µm a 7 giorni e 0,69 µm a 14 giorni, in base alla profondità massima media della fossetta di 3 campioni (per ogni campione sono state selezionate 10 profondità massime della fossetta). Raggiungimento di 0,42 ± 0,12 µm e 0,52 ± 0,15 µm, rispettivamente (Tabella 5). Questi valori di profondità del foro sono piccoli ma importanti.
(a) prima dell'esposizione, (b) 14 giorni in un ambiente abiotico e (c) 14 giorni in brodo di Pseudomonas aeruginosa.
Nella figura, la Tabella 8 mostra gli spettri XPS di varie superfici del campione, e la composizione chimica analizzata per ciascuna superficie è riassunta nella Tabella 6. Nella Tabella 6, le percentuali atomiche di Fe e Cr in presenza di P. aeruginosa (campioni A e B) erano molto inferiori a quelle dei controlli non biologici (campioni C e D). Per un campione di P. aeruginosa, la curva spettrale al livello del nucleo Cr 2p è stata adattata a quattro componenti di picco con energie di legame (BE) di 574,4, 576,6, 578,3 e 586,8 eV, che possono essere attribuite rispettivamente a Cr, Cr2O3, CrO3 e Cr(OH)3 (Fig. 9a e b). Per i campioni non biologici, lo spettro del livello principale Cr 2p contiene due picchi principali per Cr (573,80 eV per BE) e Cr2O3 (575,90 eV per BE) nelle Figg. 9c e d, rispettivamente. La differenza più evidente tra i campioni abiotici e i campioni di P. aeruginosa è stata la presenza di Cr6+ e una maggiore proporzione relativa di Cr(OH)3 (BE 586,8 eV) sotto il biofilm.
Gli spettri XPS ad ampio raggio della superficie del campione 2707 HDSS in due mezzi sono rispettivamente di 7 e 14 giorni.
(a) 7 giorni di esposizione a P. aeruginosa, (b) 14 giorni di esposizione a P. aeruginosa, (c) 7 giorni in un ambiente abiotico e (d) 14 giorni in un ambiente abiotico.
L'HDSS presenta un elevato livello di resistenza alla corrosione nella maggior parte degli ambienti. Kim et al.² hanno riportato che l'HDSS UNS S32707 è stato identificato come un DSS altamente legato con un PREN superiore a 45. Il valore PREN del campione 2707 HDSS in questo lavoro era 49. Ciò è dovuto all'alto contenuto di cromo e all'alto contenuto di molibdeno e nichel, utili in ambienti acidi e in ambienti con elevato contenuto di cloruri. Inoltre, una composizione ben bilanciata e una microstruttura priva di difetti sono vantaggiose per la stabilità strutturale e la resistenza alla corrosione. Tuttavia, nonostante la sua eccellente resistenza chimica, i dati sperimentali in questo lavoro suggeriscono che l'HDSS 2707 non è completamente immune alle MIC del biofilm di P. aeruginosa.
I risultati elettrochimici hanno mostrato che il tasso di corrosione dell'HDSS 2707 nel brodo di P. aeruginosa è aumentato significativamente dopo 14 giorni rispetto all'ambiente non biologico. Nella Figura 2a, è stata osservata una diminuzione di Eocp sia nel mezzo abiotico che nel brodo di P. aeruginosa durante le prime 24 ore. Dopodiché, il biofilm ricopre completamente la superficie del campione e Eocp diventa relativamente stabile36. Tuttavia, il livello di Eocp biologico era molto più alto del livello di Eocp non biologico. Ci sono motivi per credere che questa differenza sia associata alla formazione di biofilm di P. aeruginosa. Nella Fig. 2d, in presenza di P. aeruginosa, il valore icorr dell'HDSS 2707 ha raggiunto 0,627 μA cm-2, che è un ordine di grandezza superiore a quello del controllo abiotico (0,063 μA cm-2), il che era coerente con il valore Rct misurato tramite EIS. Nei primi giorni, i valori di impedenza nel brodo di P. aeruginosa sono aumentati a causa dell'adesione delle cellule di P. aeruginosa e della formazione di biofilm. Tuttavia, quando il biofilm ricopre completamente la superficie del campione, l'impedenza diminuisce. Lo strato protettivo viene attaccato principalmente a causa della formazione di biofilm e dei loro metaboliti. Di conseguenza, la resistenza alla corrosione è diminuita nel tempo e l'adesione di P. aeruginosa ha causato corrosione localizzata. L'andamento negli ambienti abiotici è stato diverso. La resistenza alla corrosione del controllo non biologico è risultata molto più elevata rispetto al valore corrispondente dei campioni esposti al brodo di P. aeruginosa. Inoltre, per gli accessioni abiotici, il valore Rct 2707 HDSS ha raggiunto 489 kΩ cm2 al giorno 14, ovvero 15 volte superiore al valore Rct (32 kΩ cm2) in presenza di P. aeruginosa. Pertanto, l'acciaio inossidabile HDSS 2707 presenta un'eccellente resistenza alla corrosione in un ambiente sterile, ma non è resistente alle MIC (concentrazioni minime inibitorie) dei biofilm di P. aeruginosa.
Questi risultati possono essere osservati anche dalle curve di polarizzazione in Fig. 2b. La ramificazione anodica è stata associata alla formazione di biofilm di Pseudomonas aeruginosa e alle reazioni di ossidazione del metallo. In questo caso, la reazione catodica è la riduzione dell'ossigeno. La presenza di P. aeruginosa ha aumentato significativamente la densità di corrente di corrosione, circa un ordine di grandezza superiore rispetto al controllo abiotico. Ciò indica che il biofilm di P. aeruginosa aumenta la corrosione localizzata dell'acciaio inossidabile HDSS 2707. Yuan et al.29 hanno scoperto che la densità di corrente di corrosione della lega Cu-Ni 70/30 aumentava sotto l'azione del biofilm di P. aeruginosa. Ciò potrebbe essere dovuto alla biocatalisi della riduzione dell'ossigeno da parte dei biofilm di Pseudomonas aeruginosa. Questa osservazione potrebbe anche spiegare il MIC dell'acciaio inossidabile HDSS 2707 in questo lavoro. Potrebbe esserci anche meno ossigeno sotto i biofilm aerobici. Pertanto, il rifiuto di ripassivare la superficie metallica con ossigeno potrebbe essere un fattore che contribuisce al MIC in questo lavoro.
Dickinson et al. 38 hanno suggerito che la velocità delle reazioni chimiche ed elettrochimiche può essere influenzata direttamente dall'attività metabolica dei batteri sessili sulla superficie del campione e dalla natura dei prodotti di corrosione. Come mostrato nella Figura 5 e nella Tabella 5, il numero di cellule e lo spessore del biofilm sono diminuiti dopo 14 giorni. Ciò può essere ragionevolmente spiegato dal fatto che, dopo 14 giorni, la maggior parte delle cellule sessili sulla superficie dell'HDSS 2707 è morta a causa dell'esaurimento dei nutrienti nel mezzo 2216E o del rilascio di ioni metallici tossici dalla matrice HDSS 2707. Questa è una limitazione degli esperimenti in batch.
In questo lavoro, un biofilm di P. aeruginosa ha contribuito all'esaurimento locale di Cr e Fe sotto il biofilm sulla superficie dell'acciaio inossidabile HDSS 2707 (Fig. 6). La Tabella 6 mostra la riduzione di Fe e Cr nel campione D rispetto al campione C, indicando che il Fe e il Cr disciolti causati dal biofilm di P. aeruginosa sono persistiti per i primi 7 giorni. L'ambiente 2216E è utilizzato per simulare l'ambiente marino. Contiene 17700 ppm di Cl-, che è paragonabile al suo contenuto nell'acqua di mare naturale. La presenza di 17700 ppm di Cl- è stata la ragione principale della diminuzione di Cr nei campioni abiotici a 7 e 14 giorni analizzati mediante XPS. Rispetto ai campioni di P. aeruginosa, la dissoluzione di Cr nei campioni abiotici è stata molto minore a causa della forte resistenza dell'acciaio inossidabile HDSS 2707 al cloro in condizioni abiotiche. La Fig. 9 mostra la presenza di Cr6+ nel film passivante. Potrebbe essere coinvolto nella rimozione del cromo dalle superfici in acciaio da parte dei biofilm di P. aeruginosa, come suggerito da Chen e Clayton.
A causa della crescita batterica, i valori di pH del terreno prima e dopo la coltivazione erano rispettivamente 7,4 e 8,2. Pertanto, al di sotto del biofilm di P. aeruginosa, è improbabile che la corrosione da acidi organici abbia contribuito a questo lavoro a causa del pH relativamente elevato nel terreno di coltura. Il pH del terreno di controllo non biologico non è cambiato in modo significativo (da un valore iniziale di 7,4 a un valore finale di 7,5) durante il periodo di prova di 14 giorni. L'aumento del pH nel terreno di inoculo dopo l'incubazione è stato dovuto all'attività metabolica di P. aeruginosa e si è riscontrato che aveva lo stesso effetto sul pH anche in assenza di strisce reattive.
Come mostrato in Figura 7, la profondità massima delle cavità causate dal biofilm di P. aeruginosa è stata di 0,69 µm, un valore molto maggiore rispetto a quello del mezzo abiotico (0,02 µm). Ciò è coerente con i dati elettrochimici descritti in precedenza. La profondità delle cavità di 0,69 µm è più di dieci volte inferiore al valore di 9,5 µm riportato per il 2205 DSS nelle stesse condizioni. Questi dati dimostrano che il 2707 HDSS presenta una migliore resistenza ai MIC rispetto al 2205 DSS. Ciò non dovrebbe sorprendere, poiché il 2707 HDSS ha livelli di Cr più elevati che forniscono una passivazione più lunga, rendono più difficile la depassivazione di P. aeruginosa e, grazie alla sua struttura di fase bilanciata senza precipitazione secondaria dannosa che causa la formazione di cavità.
In conclusione, sulla superficie dell'acciaio inossidabile ad alta densità 2707 sono state riscontrate vaiolature da corrosione indotta da microrganismi (MIC) in brodo di coltura di P. aeruginosa, a differenza delle vaiolature insignificanti osservate in ambiente abiotico. Questo studio dimostra che l'acciaio inossidabile ad alta densità 2707 presenta una maggiore resistenza alla corrosione indotta da microrganismi rispetto all'acciaio inossidabile duplex 2205, pur non essendo completamente immune a tale corrosione a causa del biofilm di P. aeruginosa. Questi risultati sono utili per la selezione di acciai inossidabili idonei e per la valutazione della loro durata utile in ambiente marino.
Coupon per 2707 HDSS fornito dalla Facoltà di Metallurgia della Northeastern University (NEU) di Shenyang, Cina. La composizione elementare del 2707 HDSS è riportata nella Tabella 1, analizzata dal Dipartimento di Analisi e Test dei Materiali della NEU. Tutti i campioni sono stati sottoposti a trattamento di soluzione solida a 1180 °C per 1 ora. Prima del test di corrosione, un campione di 2707 HDSS a forma di moneta con una superficie superiore aperta di 1 cm² è stato lucidato con carta abrasiva al carburo di silicio fino a grana 2000 e successivamente con una sospensione di polvere di Al₂O₃ da 0,05 µm. I lati e il fondo sono stati protetti con vernice inerte. Dopo l'asciugatura, i campioni sono stati lavati con acqua deionizzata sterile e sterilizzati con etanolo al 75% (v/v) per 0,5 ore. Sono stati quindi asciugati all'aria sotto luce ultravioletta (UV) per 0,5 ore prima dell'uso.
Il ceppo marino di Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099 è stato acquistato dal Centro di raccolta di colture marine di Xiamen (MCCC), Cina. Pseudomonas aeruginosa è stato coltivato in condizioni aerobiche a 37 °C in fiasche da 250 ml e celle elettrochimiche in vetro da 500 ml utilizzando il terreno liquido Marine 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, Cina). Il terreno di coltura contiene (g/l): 19,45 NaCl, 5,98 MgCl2, 3,24 Na2SO4, 1,8 CaCl2, 0,55 KCl, 0,16 Na2CO3, 0,08 KBr, 0,034 SrCl2, 0,08 SrBr2, 0,022 H3BO3, 0,004 NaSiO3, 0,016 6NH26NH3, 3,0016 NH3 5,0 peptone, 1,0 estratto di lievito e 0,1 citrato di ferro. Autoclavare a 121°C per 20 minuti prima dell'inoculazione. Contare le cellule sessili e planctoniche con un emocitometro al microscopio ottico a 400x di ingrandimento. La concentrazione iniziale di Pseudomonas aeruginosa planctonica immediatamente dopo l'inoculazione era di circa 10⁶ cellule/ml.
Le prove elettrochimiche sono state eseguite in una classica cella di vetro a tre elettrodi con un volume medio di 500 ml. La lamina di platino e l'elettrodo a calomelano saturo (SAE) sono stati collegati al reattore tramite capillari di Luggin riempiti con ponti salini, che fungevano rispettivamente da controelettrodo e elettrodo di riferimento. Per la realizzazione degli elettrodi di lavoro, un filo di rame gommato è stato fissato a ciascun campione e ricoperto con resina epossidica, lasciando circa 1 cm² di area non protetta per l'elettrodo di lavoro su un lato. Durante le misurazioni elettrochimiche, i campioni sono stati posti nel mezzo 2216E e mantenuti a una temperatura di incubazione costante (37 °C) in un bagno termostatico. I dati relativi a OCP, LPR, EIS e potenziale di polarizzazione dinamica sono stati misurati utilizzando un potenziostato Autolab (Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., USA). Le prove LPR sono state registrate a una velocità di scansione di 0,125 mV s⁻¹ nell'intervallo da -5 a 5 mV con Eocp e una frequenza di campionamento di 1 Hz. L'analisi EIS è stata eseguita con un'onda sinusoidale in un intervallo di frequenza da 0,01 a 10.000 Hz utilizzando una tensione applicata di 5 mV a Eocp stazionario. Prima della scansione del potenziale, gli elettrodi sono stati mantenuti in modalità inattiva fino al raggiungimento di un valore stabile del potenziale di corrosione libero. Le curve di polarizzazione sono state quindi misurate da -0,2 a 1,5 V in funzione di Eocp a una velocità di scansione di 0,166 mV/s. Ogni test è stato ripetuto 3 volte con e senza P. aeruginosa.
I campioni per l'analisi metallografica sono stati lucidati meccanicamente con carta abrasiva al SiC a grana 2000 bagnata e successivamente ulteriormente lucidati con una sospensione di polvere di Al2O3 da 0,05 µm per l'osservazione ottica. L'analisi metallografica è stata eseguita utilizzando un microscopio ottico. I campioni sono stati incisi con una soluzione al 10% in peso di idrossido di potassio 43.
Dopo l'incubazione, i campioni sono stati lavati 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) e quindi fissati con glutaraldeide al 2,5% (v/v) per 10 ore per fissare i biofilm. Sono stati poi disidratati con etanolo a concentrazioni crescenti (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100% in volume) prima dell'asciugatura all'aria. Infine, è stato depositato un film d'oro sulla superficie del campione per fornire conduttività per l'osservazione al microscopio elettronico a scansione (SEM). Le immagini SEM sono state focalizzate sui punti con il maggior numero di cellule di P. aeruginosa sessili sulla superficie di ciascun campione. È stata eseguita un'analisi EDS per individuare gli elementi chimici. Per misurare la profondità delle cavità è stato utilizzato un microscopio confocale a scansione laser Zeiss (CLSM) (LSM 710, Zeiss, Germania). Per osservare le fosse di corrosione sotto il biofilm, il campione di prova è stato prima pulito secondo lo standard nazionale cinese (CNS) GB/T4334.4-2000 per rimuovere i prodotti di corrosione e il biofilm dalla superficie del campione.
L'analisi mediante spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS, sistema di analisi di superficie ESCALAB250, Thermo VG, USA) è stata eseguita utilizzando una sorgente di raggi X monocromatica (linea Kα dell'alluminio con un'energia di 1500 eV e una potenza di 150 W) in un ampio intervallo di energie di legame 0 in condizioni standard di –1350 eV. Gli spettri ad alta risoluzione sono stati registrati utilizzando un'energia di trasmissione di 50 eV e un passo di 0,2 eV.
I campioni incubati sono stati rimossi e lavati delicatamente con PBS (pH 7,4 ± 0,2) per 15 s45. Per osservare la vitalità batterica dei biofilm sui campioni, questi sono stati colorati utilizzando il kit LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen, Eugene, OR, USA). Il kit contiene due coloranti fluorescenti: il colorante fluorescente verde SYTO-9 e il colorante fluorescente rosso ioduro di propidio (PI). Nella microscopia confocale a scansione laser (CLSM), i punti fluorescenti verdi e rossi rappresentano rispettivamente le cellule vive e morte. Per la colorazione, 1 ml di una miscela contenente 3 µl di soluzione di SYTO-9 e 3 µl di soluzione di PI è stato incubato per 20 minuti a temperatura ambiente (23 °C) al buio. Successivamente, i campioni colorati sono stati esaminati a due lunghezze d'onda (488 nm per le cellule vive e 559 nm per le cellule morte) utilizzando un apparecchio CLSM Nikon (C2 Plus, Nikon, Giappone). Lo spessore del biofilm è stato misurato in modalità di scansione 3D.
Come citare questo articolo: Li, H. et al. Corrosione microbica dell'acciaio inossidabile super duplex 2707 da parte del biofilm marino di Pseudomonas aeruginosa. the science. 6, 20190. doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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