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A corrosão microbiana (CIM) é um problema sério em muitas indústrias, pois pode levar a enormes perdas econômicas. O aço inoxidável superduplex 2707 (2707 HDSS) é utilizado em ambientes marinhos devido à sua excelente resistência química. No entanto, sua resistência à CIM ainda não foi demonstrada experimentalmente. Este estudo examinou o comportamento do 2707 HDSS sob CIM causada pela bactéria aeróbica marinha Pseudomonas aeruginosa. A análise eletroquímica mostrou que, na presença de biofilme de Pseudomonas aeruginosa no meio 2216E, ocorre uma mudança positiva no potencial de corrosão e um aumento na densidade de corrente de corrosão. A análise por espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) mostrou uma diminuição no teor de cromo na superfície da amostra sob o biofilme. A análise visual das cavidades mostrou que o biofilme de P. aeruginosa produziu uma profundidade máxima de 0,69 µm durante 14 dias de incubação. Embora seja um valor pequeno, indica que a cepa 2707 HDSS não é completamente imune à concentração inibitória mínima (CIM) dos biofilmes de P. aeruginosa.
Os aços inoxidáveis ​​duplex (DSS) são amplamente utilizados em diversas indústrias devido à combinação perfeita de excelentes propriedades mecânicas e resistência à corrosão^1,2. No entanto, a corrosão por pite localizada ainda ocorre e afeta a integridade desse aço^3,4. O DSS não é resistente à corrosão microbiana (MIC)^5,6. Apesar da ampla gama de aplicações para o DSS, ainda existem ambientes onde a resistência à corrosão do DSS não é suficiente para uso a longo prazo. Isso significa que materiais mais caros com maior resistência à corrosão são necessários. Jeon et al.⁷ descobriram que mesmo os aços inoxidáveis ​​superduplex (SDSS) apresentam algumas limitações em termos de resistência à corrosão. Portanto, em alguns casos, são necessários aços inoxidáveis ​​superduplex (HDSS) com maior resistência à corrosão. Isso levou ao desenvolvimento de HDSS altamente ligados.
A resistência à corrosão do aço inoxidável duplex (DSS) depende da proporção entre as fases alfa e gama e da depleção em Cr, Mo e W nas regiões 8, 9 e 10 adjacentes à segunda fase. O aço inoxidável duplex de alta resistência (HDSS) contém um alto teor de Cr, Mo e N11, portanto, possui excelente resistência à corrosão e um alto valor (45-50) do número de resistência à corrosão por pite equivalente (PREN), determinado por % em peso de Cr + 3,3 (% em peso de Mo + 0,5% em peso de W) + 16% em peso de N12. Sua excelente resistência à corrosão depende de uma composição equilibrada contendo aproximadamente 50% de fases ferríticas (α) e 50% de fases austeníticas (γ). O HDSS apresenta melhores propriedades mecânicas e maior resistência à corrosão por cloretos. A melhoria na resistência à corrosão amplia o uso do HDSS em ambientes com cloretos mais agressivos, como ambientes marinhos.
A corrosão microbiológica (MIC) é um problema importante em muitas indústrias, como as de petróleo e gás e de tratamento de água¹⁴. A MIC é responsável por 20% de todos os danos por corrosão¹⁵. Trata-se de uma corrosão bioeletroquímica que pode ser observada em diversos ambientes. Biofilmes que se formam em superfícies metálicas alteram as condições eletroquímicas, afetando, assim, o processo de corrosão. Acredita-se amplamente que a corrosão por MIC seja causada por biofilmes. Microorganismos eletrogênicos corroem metais para obter a energia necessária à sua sobrevivência¹⁷. Estudos recentes sobre MIC demonstraram que a transferência extracelular de elétrons (EET) é o fator limitante da taxa de corrosão por MIC induzida por microorganismos eletrogênicos. Zhang et al.¹⁸ demonstraram que intermediários de elétrons aceleram a transferência de elétrons entre células de Desulfovibrio sessificans e o aço inoxidável 304, resultando em um ataque de MIC mais severo. Anning et al.¹⁹ e Wenzlaff et al.²⁰ mostraram que biofilmes de bactérias redutoras de sulfato (BRS) corrosivas podem absorver elétrons diretamente de substratos metálicos, resultando em corrosão por pite severa.
Sabe-se que o DSS é suscetível à MIC em meios contendo SRBs, bactérias redutoras de ferro (IRBs), etc. 21 . Essas bactérias causam corrosão localizada na superfície do DSS sob biofilmes22,23. Ao contrário do DSS, a MIC do HDSS24 não é bem conhecida.
A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, móvel e em forma de bastonete, amplamente distribuída na natureza25. A Pseudomonas aeruginosa também é um importante grupo microbiano no ambiente marinho, causando concentrações elevadas de MIC (Concentração Inibitória Mínima). A Pseudomonas está ativamente envolvida no processo de corrosão e é reconhecida como uma colonizadora pioneira durante a formação de biofilme. Mahat et al.28 e Yuan et al.29 demonstraram que a Pseudomonas aeruginosa tende a aumentar a taxa de corrosão do aço carbono e de ligas metálicas em ambientes aquáticos.
O principal objetivo deste trabalho foi investigar as propriedades do aço inoxidável amorfo hidrofóbico MIC 2707 (HDSS) afetadas pela bactéria aeróbica marinha Pseudomonas aeruginosa, utilizando métodos eletroquímicos, análises de superfície e análise de produtos de corrosão. Estudos eletroquímicos, incluindo potencial de circuito aberto (OCP), resistência de polarização linear (LPR), espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e polarização dinâmica de potencial, foram realizados para estudar o comportamento do MIC 2707 HDSS. A análise por espectrometria de dispersão de energia (EDS) foi realizada para detectar elementos químicos na superfície corroída. Além disso, a espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) foi utilizada para determinar a estabilidade da passivação da película de óxido sob a influência de um ambiente marinho contendo Pseudomonas aeruginosa. A profundidade das cavidades foi medida por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).
A Tabela 1 mostra a composição química do aço inoxidável duplex 2707 (HDSS). A Tabela 2 mostra que o HDSS 2707 possui excelentes propriedades mecânicas, com uma resistência ao escoamento de 650 MPa. A Figura 1 mostra a microestrutura óptica do HDSS 2707 tratado termicamente em solução. Na microestrutura, que contém cerca de 50% de austenita e 50% de ferrita, são visíveis bandas alongadas de austenita e ferrita sem fases secundárias.
A Figura 2a mostra o potencial de circuito aberto (Eocp) em função do tempo de exposição para o HDSS 2707 em meio abiótico 2216E e em caldo de P. aeruginosa durante 14 dias a 37 °C. Observa-se que a maior e mais significativa alteração no Eocp ocorre nas primeiras 24 horas. Os valores de Eocp, em ambos os casos, atingiram um pico de -145 mV (em relação ao SCE) por volta de 16 horas e, em seguida, caíram acentuadamente, alcançando -477 mV (em relação ao SCE) e -236 mV (em relação ao SCE) para a amostra abiótica e para os cupons de P. aeruginosa, respectivamente. Após 24 horas, o valor de Eocp do HDSS 2707 para P. aeruginosa permaneceu relativamente estável em -228 mV (em relação ao SCE), enquanto o valor correspondente para as amostras não biológicas foi de aproximadamente -442 mV (em relação ao SCE). A concentração de Eocp na presença de P. aeruginosa foi bastante baixa.
Estudo eletroquímico de 2707 amostras de HDSS em meio abiótico e caldo de Pseudomonas aeruginosa a 37 °C:
(a) Eocp em função do tempo de exposição, (b) curvas de polarização no dia 14, (c) Rp em função do tempo de exposição e (d) icorr em função do tempo de exposição.
A Tabela 3 mostra os parâmetros de corrosão eletroquímica de 2707 amostras de HDSS expostas a meios abióticos e inoculados com Pseudomonas aeruginosa durante um período de 14 dias. As tangentes das curvas anódicas e catódicas foram extrapoladas para obter interseções que fornecem a densidade de corrente de corrosão (icorr), o potencial de corrosão (Ecorr) e a inclinação de Tafel (βα e βc) de acordo com métodos padrão30,31.
Como mostrado na figura 2b, um deslocamento ascendente na curva de P. aeruginosa resultou em um aumento no Ecorr em comparação com a curva abiótica. O valor de icorr, que é proporcional à taxa de corrosão, aumentou para 0,328 µA cm-2 na amostra de Pseudomonas aeruginosa, o que é quatro vezes maior do que na amostra não biológica (0,087 µA cm-2).
A LPR é um método eletroquímico clássico não destrutivo para análise rápida de corrosão. Também foi utilizada para estudar o MIC32. A Figura 2c mostra a resistência de polarização (Rp) em função do tempo de exposição. Um valor de Rp mais alto significa menor corrosão. Nas primeiras 24 horas, o Rp do HDSS 2707 atingiu um pico de 1955 kΩ cm² para amostras abióticas e 1429 kΩ cm² para amostras de Pseudomonas aeruginosa. A Figura 2c também mostra que o valor de Rp diminuiu rapidamente após um dia e permaneceu relativamente inalterado nos 13 dias seguintes. O valor de Rp de uma amostra de Pseudomonas aeruginosa é de cerca de 40 kΩ cm², muito inferior ao valor de 450 kΩ cm² de uma amostra não biológica.
O valor de icorr é proporcional à taxa de corrosão uniforme. Seu valor pode ser calculado a partir da seguinte equação de Stern-Giri:
De acordo com Zoe et al. 33, o valor típico da inclinação de Tafel B neste trabalho foi considerado 26 mV/década. A Figura 2d mostra que o icorr da amostra não biológica 2707 permaneceu relativamente estável, enquanto a amostra de P. aeruginosa apresentou grandes flutuações após as primeiras 24 horas. Os valores de icorr das amostras de P. aeruginosa foram uma ordem de magnitude maiores do que os dos controles não biológicos. Essa tendência é consistente com os resultados da resistência de polarização.
A espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) é outro método não destrutivo usado para caracterizar reações eletroquímicas em superfícies corroídas. Foram obtidos os espectros de impedância e os valores de capacitância calculados para amostras expostas a ambiente abiótico e solução de Pseudomonas aeruginosa, a resistência passiva/biofilme (Rb) formada na superfície da amostra, a resistência de transferência de carga (Rct), a capacitância da dupla camada elétrica (Cdl) e os parâmetros do elemento de fase constante (CPE) do modelo de circuito equivalente (EEC). Esses parâmetros foram posteriormente analisados ​​por meio do ajuste dos dados utilizando um modelo de circuito equivalente.
A Figura 3 mostra diagramas de Nyquist típicos (a e b) e diagramas de Bode (a' e b') para 2707 amostras de HDSS em meio abiótico e caldo de P. aeruginosa para diferentes tempos de incubação. O diâmetro do anel de Nyquist diminui na presença de Pseudomonas aeruginosa. O diagrama de Bode (Figura 3b') mostra o aumento da impedância total. Informações sobre a constante de tempo de relaxação podem ser obtidas a partir dos máximos de fase. A Figura 4 mostra as estruturas físicas baseadas em uma monocamada (a) e uma bicamada (b) e os respectivos EECs. O CPE é introduzido no modelo EEC. Sua admitância e impedância são expressas da seguinte forma:
Dois modelos físicos e circuitos equivalentes correspondentes para o ajuste do espectro de impedância da amostra 2707 HDSS:
onde Y0 é o valor do KPI, j é o número imaginário ou (-1)1/2, ω é a frequência angular, n é o índice de potência do KPI menor que um35. A inversão da resistência de transferência de carga (ou seja, 1/Rct) corresponde à taxa de corrosão. Quanto menor o Rct, maior a taxa de corrosão27. Após 14 dias de incubação, o Rct das amostras de Pseudomonas aeruginosa atingiu 32 kΩ cm2, o que é muito menor do que os 489 kΩ cm2 das amostras não biológicas (Tabela 4).
As imagens de CLSM e MEV na Figura 5 mostram claramente que o revestimento de biofilme na superfície da amostra HDSS 2707 após 7 dias é denso. No entanto, após 14 dias, a cobertura do biofilme era escassa e algumas células mortas apareceram. A Tabela 5 mostra a espessura do biofilme nas amostras HDSS 2707 após exposição à P. aeruginosa por 7 e 14 dias. A espessura máxima do biofilme variou de 23,4 µm após 7 dias para 18,9 µm após 14 dias. A espessura média do biofilme também confirmou essa tendência, diminuindo de 22,2 ± 0,7 µm após 7 dias para 17,8 ± 1,0 µm após 14 dias.
(a) Imagem CLSM 3D aos 7 dias, (b) Imagem CLSM 3D aos 14 dias, (c) Imagem SEM aos 7 dias e (d) Imagem SEM aos 14 dias.
A análise por campos eletromagnéticos (CEM) revelou elementos químicos em biofilmes e produtos de corrosão em amostras expostas a *P. aeruginosa* por 14 dias. A Figura 6 mostra que o teor de C, N, O e P em biofilmes e produtos de corrosão é significativamente maior do que em metais puros, uma vez que esses elementos estão associados a biofilmes e seus metabólitos. Os microrganismos necessitam apenas de traços de cromo e ferro. Os altos níveis de Cr e Fe no biofilme e nos produtos de corrosão na superfície das amostras indicam que a matriz metálica perdeu elementos devido à corrosão.
Após 14 dias, observaram-se cavidades com e sem P. aeruginosa no meio 2216E. Antes da incubação, a superfície das amostras era lisa e sem defeitos (Fig. 7a). Após a incubação e remoção do biofilme e dos produtos de corrosão, as cavidades mais profundas na superfície das amostras foram examinadas por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM), como mostrado nas Figuras 7b e c. Não foram encontradas cavidades evidentes na superfície dos controles não biológicos (profundidade máxima de cavidade de 0,02 µm). A profundidade máxima da cavidade causada por P. aeruginosa foi de 0,52 µm em 7 dias e 0,69 µm em 14 dias, com base na média da profundidade máxima da cavidade de 3 amostras (10 profundidades máximas de cavidade foram selecionadas para cada amostra). Os valores obtidos foram de 0,42 ± 0,12 µm e 0,52 ± 0,15 µm, respectivamente (Tabela 5). Esses valores de profundidade do furo são pequenos, mas importantes.
(a) antes da exposição, (b) 14 dias em ambiente abiótico e (c) 14 dias em caldo de Pseudomonas aeruginosa.
Na Figura 8, são apresentados os espectros XPS de diversas superfícies de amostras, e a composição química analisada para cada superfície está resumida na Tabela 6. Na Tabela 6, as porcentagens atômicas de Fe e Cr na presença de P. aeruginosa (amostras A e B) foram muito menores do que as dos controles não biológicos (amostras C e D). Para uma amostra de P. aeruginosa, a curva espectral no nível do núcleo Cr 2p foi ajustada a quatro componentes de pico com energias de ligação (BE) de 574,4, 576,6, 578,3 e 586,8 eV, que podem ser atribuídas a Cr, Cr₂O₃, CrO₃ e Cr(OH)₃, respectivamente (Figuras 9a e b). Para as amostras não biológicas, o espectro do nível principal Cr 2p contém dois picos principais para Cr (BE de 573,80 eV) e Cr₂O₃ (BE de 575,90 eV) nas Figuras 9a e b. 9c e d, respectivamente. A diferença mais marcante entre as amostras abióticas e as amostras de P. aeruginosa foi a presença de Cr6+ e uma proporção relativa maior de Cr(OH)3 (BE 586,8 eV) sob o biofilme.
Os espectros XPS de ampla resolução da superfície da amostra 2707 HDSS em dois meios correspondem a 7 e 14 dias, respectivamente.
(a) 7 dias de exposição à P. aeruginosa, (b) 14 dias de exposição à P. aeruginosa, (c) 7 dias em um ambiente abiótico e (d) 14 dias em um ambiente abiótico.
O aço inoxidável duplex de alta resistência (HDSS) apresenta um alto nível de resistência à corrosão na maioria dos ambientes. Kim et al.² relataram que o HDSS UNS S32707 foi identificado como um aço inoxidável duplex altamente ligado, com um PREN superior a 45. O valor de PREN da amostra 2707 de HDSS neste trabalho foi de 49. Isso se deve ao alto teor de cromo e ao alto teor de molibdênio e níquel, que são úteis em ambientes ácidos e com alto teor de cloreto. Além disso, uma composição bem equilibrada e uma microestrutura livre de defeitos são benéficas para a estabilidade estrutural e a resistência à corrosão. No entanto, apesar de sua excelente resistência química, os dados experimentais deste trabalho sugerem que o HDSS 2707 não é completamente imune à corrosão microbiológica (MIC) causada por biofilmes de *P. aeruginosa*.
Os resultados eletroquímicos mostraram que a taxa de corrosão do HDSS 2707 em caldo de P. aeruginosa aumentou significativamente após 14 dias em comparação com o ambiente não biológico. Na Figura 2a, observou-se uma diminuição no Eocp tanto no meio abiótico quanto no caldo de P. aeruginosa durante as primeiras 24 horas. Após esse período, o biofilme cobre completamente a superfície da amostra e o Eocp torna-se relativamente estável36. No entanto, o nível de Eocp biológico foi muito maior do que o nível de Eocp não biológico. Há razões para acreditar que essa diferença esteja associada à formação de biofilmes de P. aeruginosa. Na Figura 2d, na presença de P. aeruginosa, o valor de icorr do HDSS 2707 atingiu 0,627 μA cm-2, o que é uma ordem de magnitude maior do que o do controle abiótico (0,063 μA cm-2), o que foi consistente com o valor de Rct medido por EIS. Durante os primeiros dias, os valores de impedância no caldo de P. aeruginosa aumentaram devido à adesão das células de P. aeruginosa e à formação de biofilmes. No entanto, quando o biofilme cobre completamente a superfície da amostra, a impedância diminui. A camada protetora é atacada principalmente pela formação de biofilmes e seus metabólitos. Consequentemente, a resistência à corrosão diminuiu ao longo do tempo e a adesão de P. aeruginosa causou corrosão localizada. As tendências em ambientes abióticos foram diferentes. A resistência à corrosão do controle não biológico foi muito maior do que o valor correspondente das amostras expostas ao caldo de P. aeruginosa. Além disso, para os acessos abióticos, o valor de Rct 2707 HDSS atingiu 489 kΩ cm² no 14º dia, o que é 15 vezes maior do que o valor de Rct (32 kΩ cm²) na presença de P. aeruginosa. Assim, o HDSS 2707 apresenta excelente resistência à corrosão em ambiente estéril, mas não é resistente a MICs de biofilmes de P. aeruginosa.
Esses resultados também podem ser observados nas curvas de polarização da Figura 2b. O ramificação anódica tem sido associada à formação de biofilme de Pseudomonas aeruginosa e a reações de oxidação do metal. Nesse caso, a reação catódica é a redução do oxigênio. A presença de P. aeruginosa aumentou significativamente a densidade de corrente de corrosão, cerca de uma ordem de magnitude maior do que no controle abiótico. Isso indica que o biofilme de P. aeruginosa intensifica a corrosão localizada do aço inoxidável duplex 2707. Yuan et al.²⁹ constataram que a densidade de corrente de corrosão da liga Cu-Ni 70/30 aumentou sob a ação do biofilme de P. aeruginosa. Isso pode ser devido à biocatálise da redução de oxigênio pelos biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. Essa observação também pode explicar a corrosão microbiológica (MIC) observada no aço inoxidável duplex 2707 neste trabalho. Pode haver também menos oxigênio disponível sob biofilmes aeróbicos. Portanto, a dificuldade de repassivação da superfície metálica com oxigênio pode ser um fator que contribui para a MIC neste estudo.
Dickinson et al. 38 sugeriram que a taxa de reações químicas e eletroquímicas pode ser diretamente afetada pela atividade metabólica de bactérias sésseis na superfície da amostra e pela natureza dos produtos de corrosão. Como mostrado na Figura 5 e na Tabela 5, o número de células e a espessura do biofilme diminuíram após 14 dias. Isso pode ser razoavelmente explicado pelo fato de que, após 14 dias, a maioria das células sésseis na superfície do HDSS 2707 morreu devido ao esgotamento de nutrientes no meio 2216E ou à liberação de íons metálicos tóxicos da matriz do HDSS 2707. Esta é uma limitação dos experimentos em lote.
Neste trabalho, um biofilme de P. aeruginosa contribuiu para a depleção local de Cr e Fe sob o biofilme na superfície do HDSS 2707 (Fig. 6). A Tabela 6 mostra a redução de Fe e Cr na amostra D em comparação com a amostra C, indicando que o Fe e o Cr dissolvidos pelo biofilme de P. aeruginosa persistiram durante os primeiros 7 dias. O ambiente 2216E foi utilizado para simular o ambiente marinho. Ele contém 17700 ppm de Cl-, valor comparável ao encontrado na água do mar natural. A presença de 17700 ppm de Cl- foi a principal razão para a diminuição de Cr nas amostras abióticas de 7 e 14 dias analisadas por XPS. Comparada às amostras com P. aeruginosa, a dissolução de Cr nas amostras abióticas foi muito menor devido à forte resistência do HDSS 2707 ao cloro em condições abióticas. A Fig. 9 mostra a presença de Cr6+ no filme passivante. Pode estar envolvido na remoção de cromo de superfícies de aço por biofilmes de P. aeruginosa, conforme sugerido por Chen e Clayton.
Devido ao crescimento bacteriano, os valores de pH do meio antes e depois do cultivo foram de 7,4 e 8,2, respectivamente. Assim, abaixo do biofilme de P. aeruginosa, é improvável que a corrosão por ácido orgânico contribua para este trabalho devido ao pH relativamente alto no meio em geral. O pH do meio de controle não biológico não apresentou alterações significativas (de 7,4 inicial para 7,5 final) durante o período de teste de 14 dias. O aumento do pH no meio de inoculação após a incubação deveu-se à atividade metabólica de P. aeruginosa e apresentou o mesmo efeito sobre o pH na ausência das tiras de teste.
Como mostrado na Figura 7, a profundidade máxima de corrosão causada pelo biofilme de P. aeruginosa foi de 0,69 µm, muito maior do que a do meio abiótico (0,02 µm). Isso está de acordo com os dados eletroquímicos descritos anteriormente. A profundidade de corrosão de 0,69 µm é mais de dez vezes menor do que o valor de 9,5 µm relatado para o aço inoxidável duplex 2205 nas mesmas condições. Esses dados mostram que o aço inoxidável duplex 2707 apresenta melhor resistência a microincrustações do que o aço inoxidável duplex 2205. Isso não deve ser uma surpresa, visto que o aço inoxidável duplex 2707 possui níveis mais altos de cromo, o que proporciona maior passivação, dificultando a despassivação de P. aeruginosa e, devido à sua estrutura de fase balanceada, não causa precipitação secundária prejudicial que cause corrosão por pite.
Em conclusão, foram encontradas cavidades de corrosão microbiológica (MIC) na superfície do aço inoxidável duplex 2707 em caldo de *P. aeruginosa*, em comparação com a insignificância das cavidades observadas no ambiente abiótico. Este trabalho demonstra que o aço inoxidável duplex 2707 apresenta melhor resistência à corrosão microbiológica do que o aço inoxidável duplex 2205, porém não é completamente imune à corrosão microbiológica devido à presença de biofilme de *P. aeruginosa*. Esses resultados auxiliam na seleção de aços inoxidáveis ​​adequados e na estimativa de sua vida útil em ambientes marinhos.
Cupom para o aço inoxidável duplex 2707 fornecido pela Escola de Metalurgia da Universidade do Nordeste (NEU) em Shenyang, China. A composição elementar do aço inoxidável duplex 2707 é apresentada na Tabela 1, analisada pelo Departamento de Análise e Teste de Materiais da NEU. Todas as amostras foram submetidas a tratamento de solubilização a 1180 °C por 1 hora. Antes do teste de corrosão, um disco de aço inoxidável duplex 2707 com área de superfície superior exposta de 1 cm² foi polido com lixa de carbeto de silício de granulação 2000 e, em seguida, com uma pasta de pó de Al₂O₃ de 0,05 µm. As laterais e a base foram protegidas com tinta inerte. Após a secagem, as amostras foram lavadas com água deionizada estéril e esterilizadas com etanol 75% (v/v) por 0,5 h. Em seguida, foram secas ao ar sob luz ultravioleta (UV) por 0,5 h antes do uso.
A cepa marinha de Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099 foi adquirida do Centro de Coleção de Culturas Marinhas de Xiamen (MCCC), China. Pseudomonas aeruginosa foi cultivada em condições aeróbicas a 37 °C em frascos de 250 ml e células eletroquímicas de vidro de 500 ml, utilizando o meio líquido Marine 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China). O meio contém (g/l): 19,45 NaCl, 5,98 MgCl2, 3,24 Na2SO4, 1,8 CaCl2, 0,55 KCl, 0,16 Na2CO3, 0,08 KBr, 0,034 SrCl2, 0,08 SrBr2, 0,022 H3BO3, 0,004 NaSiO3, 0,0016 6NH26NH3, 3,0016 NH3, 5,0 peptona, 1,0 extrato de levedura e 0,1 citrato de ferro. Autoclave a 121 °C por 20 minutos antes da inoculação. Conte as células sésseis e planctônicas com um hemocitômetro sob microscópio óptico com aumento de 400x. A concentração inicial de Pseudomonas aeruginosa planctônica imediatamente após a inoculação foi de aproximadamente 106 células/ml.
Os testes eletroquímicos foram realizados em uma célula de vidro clássica de três eletrodos com um volume médio de 500 ml. A lâmina de platina e o eletrodo de calomelano saturado (ECS) foram conectados ao reator por meio de capilares de Luggin preenchidos com pontes salinas, que serviram como contraeletrodo e eletrodo de referência, respectivamente. Para a fabricação dos eletrodos de trabalho, um fio de cobre revestido com borracha foi fixado a cada amostra e coberto com resina epóxi, deixando cerca de 1 cm² de área desprotegida para o eletrodo de trabalho em um dos lados. Durante as medições eletroquímicas, as amostras foram colocadas no meio 2216E e mantidas a uma temperatura de incubação constante (37 °C) em banho-maria. Os dados de potencial de circuito aberto (OCP), potencial de referência linear (LPR), espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e polarização dinâmica de potencial foram medidos usando um potenciostato Autolab (Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., EUA). Os testes de LPR foram registrados a uma taxa de varredura de 0,125 mV s⁻¹ na faixa de -5 a 5 mV com potencial de circuito aberto (Eocp) e uma taxa de amostragem de 1 Hz. A espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) foi realizada com uma onda senoidal em uma faixa de frequência de 0,01 a 10.000 Hz, utilizando uma tensão aplicada de 5 mV em potencial de corrosão em estado estacionário (Eocp). Antes da varredura de potencial, os eletrodos permaneceram em repouso até que um valor estável do potencial de corrosão livre fosse atingido. As curvas de polarização foram então medidas de -0,2 a 1,5 V em função do Eocp a uma taxa de varredura de 0,166 mV/s. Cada teste foi repetido 3 vezes, com e sem P. aeruginosa.
As amostras para análise metalográfica foram polidas mecanicamente com lixa de SiC de grão 2000 úmida e, em seguida, polidas com uma suspensão de pó de Al2O3 de 0,05 µm para observação óptica. A análise metalográfica foi realizada utilizando um microscópio óptico. As amostras foram atacadas com uma solução de hidróxido de potássio a 10% em peso.
Após a incubação, as amostras foram lavadas 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) e fixadas com glutaraldeído a 2,5% (v/v) por 10 horas para fixação dos biofilmes. Em seguida, foram desidratadas com etanol em concentrações crescentes (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100% v/v) antes da secagem ao ar. Finalmente, uma camada de ouro foi depositada sobre a superfície da amostra para conferir condutividade para observação por microscopia eletrônica de varredura (MEV). As imagens de MEV foram focadas nos pontos com maior concentração de células de *P. aeruginosa* sésseis na superfície de cada amostra. Uma análise de espectroscopia de dispersão de energia de raios X (EDS) foi realizada para identificar os elementos químicos. Um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) Zeiss (LSM 710, Zeiss, Alemanha) foi utilizado para medir a profundidade das cavidades. Para observar as cavidades de corrosão sob o biofilme, a amostra de teste foi primeiramente limpa de acordo com a Norma Nacional Chinesa (CNS) GB/T4334.4-2000 para remover os produtos de corrosão e o biofilme da superfície da amostra.
A análise por espectroscopia fotoeletrônica de raios X (XPS, sistema de análise de superfície ESCALAB250, Thermo VG, EUA) foi realizada utilizando uma fonte de raios X monocromática (linha Kα do alumínio com energia de 1500 eV e potência de 150 W) em uma ampla faixa de energias de ligação, de 0 a -1350 eV, sob condições padrão. Espectros de alta resolução foram registrados utilizando uma energia de transmissão de 50 eV e um passo de 0,2 eV.
As amostras incubadas foram removidas e lavadas delicadamente com PBS (pH 7,4 ± 0,2) por 15 segundos. Para observar a viabilidade bacteriana dos biofilmes nas amostras, os biofilmes foram corados utilizando o kit de viabilidade bacteriana LIVE/DEAD BacLight (Invitrogen, Eugene, OR, EUA). O kit contém dois corantes fluorescentes: o corante verde fluorescente SYTO-9 e o corante vermelho fluorescente iodeto de propídio (PI). Em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM), os pontos fluorescentes verdes e vermelhos representam células vivas e mortas, respectivamente. Para a coloração, 1 ml de uma mistura contendo 3 µl de solução de SYTO-9 e 3 µl de solução de PI foi incubado por 20 minutos à temperatura ambiente (23 °C) no escuro. Posteriormente, as amostras coradas foram examinadas em dois comprimentos de onda (488 nm para células vivas e 559 nm para células mortas) utilizando um aparelho CLSM da Nikon (C2 Plus, Nikon, Japão). A espessura do biofilme foi medida no modo de digitalização 3D.
Como citar este artigo: Li, H. et al. Corrosão microbiana do aço inoxidável super duplex 2707 por biofilme marinho de Pseudomonas aeruginosa. The Science. 6, 2019. doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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