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A corrosão microbiana (MIC) é um problema sério em muitas indústrias, pois pode levar a enormes perdas econômicas. O aço inoxidável super duplex 2707 (2707 HDSS) é usado em ambientes marinhos devido à sua excelente resistência química. No entanto, sua resistência à MIC não foi demonstrada experimentalmente. Este estudo examinou o comportamento da MIC 2707 HDSS causada pela bactéria aeróbica marinha Pseudomonas aeruginosa. A análise eletroquímica mostrou que, na presença de biofilme de Pseudomonas aeruginosa no meio 2216E, ocorre uma mudança positiva no potencial de corrosão e um aumento na densidade de corrente de corrosão. A análise da espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) mostrou uma diminuição no teor de Cr na superfície da amostra sob o biofilme. A análise visual dos pites mostrou que o biofilme de P. aeruginosa produziu uma profundidade máxima de pit de 0,69 µm durante 14 dias de incubação. Embora isso seja pequeno, indica que 2707 HDSS não é completamente imune ao MIC dos biofilmes de P. aeruginosa.
Aços inoxidáveis ​​duplex (DSS) são amplamente utilizados em diversas indústrias devido à combinação perfeita de excelentes propriedades mecânicas e resistência à corrosão1,2. No entanto, pites localizados ainda ocorrem e afetam a integridade deste aço3,4. O DSS não é resistente à corrosão microbiana (MIC)5,6. Apesar da ampla gama de aplicações para DSS, ainda existem ambientes onde a resistência à corrosão do DSS não é suficiente para uso a longo prazo. Isso significa que materiais mais caros com maior resistência à corrosão são necessários. Jeon et al7 descobriram que mesmo os aços inoxidáveis ​​super duplex (SDSS) têm algumas limitações em termos de resistência à corrosão. Portanto, em alguns casos, são necessários aços inoxidáveis ​​super duplex (HDSS) com maior resistência à corrosão. Isso levou ao desenvolvimento de HDSS altamente ligados.
A resistência à corrosão do aço inoxidável (SSD) depende da proporção das fases alfa e gama e é reduzida nas regiões 8, 9 e 10 de Cr, Mo e W, adjacentes à segunda fase. O SSHD contém alto teor de Cr, Mo e N11, portanto, apresenta excelente resistência à corrosão e um alto valor (45-50) do número equivalente de resistência à corrosão por pites (PREN), determinado pela % em peso de Cr + 3,3 (% em peso de Mo + 0,5% em peso) + 16% em peso de N12. Sua excelente resistência à corrosão depende de uma composição balanceada contendo aproximadamente 50% de fases ferríticas (α) e 50% de fases austeníticas (γ). O SSHD apresenta melhores propriedades mecânicas e maior resistência à corrosão por cloreto. A resistência à corrosão aprimorada amplia o uso do SSHD em ambientes com cloreto mais agressivo, como ambientes marinhos.
MICs são um grande problema em muitas indústrias, como as de petróleo, gás e água14. MIC é responsável por 20% de todos os danos por corrosão15. MIC é uma corrosão bioeletroquímica que pode ser observada em muitos ambientes. Biofilmes que se formam em superfícies metálicas alteram as condições eletroquímicas, afetando assim o processo de corrosão. Acredita-se amplamente que a corrosão MIC é causada por biofilmes. Microrganismos eletrogênicos corroem metais para obter a energia necessária para sobreviver17. Estudos recentes de MIC mostraram que a EET (transferência extracelular de elétrons) é o fator limitante da taxa de MIC induzida por microrganismos eletrogênicos. Zhang et al. 18 demonstraram que intermediários de elétrons aceleram a transferência de elétrons entre células de Desulfovibrio sessificans e aço inoxidável 304, resultando em ataque de MIC mais severo. Anning et al. 19 e Wenzlaff et al. 20 mostraram que biofilmes de bactérias redutoras de sulfato (SRBs) corrosivas podem absorver elétrons diretamente de substratos metálicos, resultando em corrosão por pites severa.
Sabe-se que o DSS é suscetível à CIM em meios contendo SRBs, bactérias redutoras de ferro (IRBs), etc. 21 . Essas bactérias causam corrosão localizada na superfície do DSS sob biofilmes 22,23. Ao contrário do DSS, a CIM do HDSS24 não é bem conhecida.
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa, móvel e em forma de bastonete, amplamente distribuída na natureza25. Pseudomonas aeruginosa também é um importante grupo microbiano no ambiente marinho, causando concentrações elevadas de CIM. Pseudomonas está ativamente envolvida no processo de corrosão e é reconhecida como uma colonizadora pioneira durante a formação de biofilmes. Mahat et al.28 e Yuan et al.29 demonstraram que Pseudomonas aeruginosa tende a aumentar a taxa de corrosão de aço carbono e ligas em ambientes aquáticos.
O principal objetivo deste trabalho foi investigar as propriedades do MIC 2707 HDSS causadas pela bactéria aeróbica marinha Pseudomonas aeruginosa usando métodos eletroquímicos, métodos de análise de superfície e análise de produtos de corrosão. Estudos eletroquímicos, incluindo potencial de circuito aberto (OCP), resistência de polarização linear (LPR), espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e polarização dinâmica de potencial, foram realizados para estudar o comportamento do MIC 2707 HDSS. A análise espectrométrica de energia dispersiva (EDS) foi realizada para detectar elementos químicos em uma superfície corroída. Além disso, a espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) foi usada para determinar a estabilidade da passivação do filme de óxido sob a influência de um ambiente marinho contendo Pseudomonas aeruginosa. A profundidade dos pites foi medida em um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM).
A Tabela 1 mostra a composição química do 2707 HDSS. A Tabela 2 mostra que o 2707 HDSS apresenta excelentes propriedades mecânicas, com um limite de escoamento de 650 MPa. A Figura 1 mostra a microestrutura óptica do 2707 HDSS tratado termicamente em solução. Na microestrutura contendo cerca de 50% de fases austenita e 50% de ferrita, são visíveis faixas alongadas de fases austenita e ferrita sem fases secundárias.
A figura 2a mostra o potencial de circuito aberto (Eocp) versus tempo de exposição para 2707 HDSS em meio abiótico 2216E e caldo de P. aeruginosa por 14 dias a 37 °C. Isso mostra que a maior e mais significativa mudança no Eocp ocorre dentro das primeiras 24 horas. Os valores de Eocp em ambos os casos atingiram o pico em -145 mV (comparado ao SCE) em torno de 16 h e então caíram bruscamente, atingindo -477 mV (comparado ao SCE) e -236 mV (comparado ao SCE) para a amostra abiótica. e cupons P Pseudomonas aeruginosa, respectivamente). Após 24 horas, o valor de Eocp 2707 HDSS para P. aeruginosa foi relativamente estável em -228 mV (comparado ao SCE), enquanto o valor correspondente para amostras não biológicas foi de aproximadamente -442 mV (comparado ao SCE). O Eocp na presença de P. aeruginosa foi bastante baixo.
Estudo eletroquímico de 2707 amostras de HDSS em meio abiótico e caldo de Pseudomonas aeruginosa a 37 °C:
(a) Eocp em função do tempo de exposição, (b) curvas de polarização no dia 14, (c) Rp em função do tempo de exposição e (d) icorr em função do tempo de exposição.
A Tabela 3 mostra os parâmetros de corrosão eletroquímica de 2.707 amostras de HDSS expostas a meios abióticos e inoculados com Pseudomonas aeruginosa durante um período de 14 dias. As tangentes das curvas de ânodo e cátodo foram extrapoladas para obter interseções que fornecem a densidade de corrente de corrosão (icorr), o potencial de corrosão (Ecorr) e a inclinação de Tafel (βα e βc) de acordo com métodos padrão30,31.
Como mostrado na figura 2b, um deslocamento para cima na curva de P. aeruginosa resultou em um aumento na Ecorr em comparação com a curva abiótica. O valor de iCorr, que é proporcional à taxa de corrosão, aumentou para 0,328 µA cm-2 na amostra de Pseudomonas aeruginosa, quatro vezes maior do que na amostra não biológica (0,087 µA cm-2).
LPR é um método eletroquímico não destrutivo clássico para análise rápida de corrosão. Também foi usado para estudar MIC32. A figura 2c mostra a resistência à polarização (Rp) em função do tempo de exposição. Um valor de Rp mais alto significa menos corrosão. Nas primeiras 24 horas, o Rp 2707 HDSS atingiu o pico de 1955 kΩ cm2 para espécimes abióticos e 1429 kΩ cm2 para espécimes de Pseudomonas aeruginosa. A Figura 2c também mostra que o valor de Rp diminuiu rapidamente após um dia e permaneceu relativamente inalterado nos 13 dias seguintes. O valor de Rp de uma amostra de Pseudomonas aeruginosa é de cerca de 40 kΩ cm2, o que é muito menor do que o valor de 450 kΩ cm2 de uma amostra não biológica.
O valor de icorr é proporcional à taxa de corrosão uniforme. Seu valor pode ser calculado a partir da seguinte equação de Stern-Giri:
De acordo com Zoe et al. 33, o valor típico da inclinação Tafel B neste trabalho foi considerado como 26 mV/dec. A Figura 2d mostra que o icorr da amostra não biológica 2707 permaneceu relativamente estável, enquanto o da amostra de P. aeruginosa flutuou bastante após as primeiras 24 horas. Os valores de icorr das amostras de P. aeruginosa foram uma ordem de magnitude maiores do que os dos controles não biológicos. Essa tendência é consistente com os resultados da resistência à polarização.
EIS é outro método não destrutivo usado para caracterizar reações eletroquímicas em superfícies corroídas. Foram analisados ​​espectros de impedância e valores de capacitância calculados de amostras expostas a ambiente abiótico e solução de Pseudomonas aeruginosa, resistência do filme passivo/biofilme Rb formado na superfície da amostra, resistência à transferência de carga Rct, capacitância elétrica de dupla camada Cdl (EDL) e parâmetros do elemento de fase (CPE) QCPE constante. Esses parâmetros foram analisados ​​posteriormente por meio do ajuste dos dados usando um modelo de circuito equivalente (EEC).
A figura 3 mostra diagramas de Nyquist típicos (a e b) e diagramas de Bode (a' e b') para 2707 amostras de HDSS em meios abióticos e caldo de P. aeruginosa para diferentes tempos de incubação. O diâmetro do anel de Nyquist diminui na presença de Pseudomonas aeruginosa. O diagrama de Bode (figura 3b') mostra o aumento da impedância total. Informações sobre a constante de tempo de relaxação podem ser obtidas a partir dos máximos de fase. A figura 4 mostra as estruturas físicas baseadas em uma monocamada (a) e uma bicamada (b) e os EECs correspondentes. O CPE é introduzido no modelo de EEC. Sua admitância e impedância são expressas da seguinte forma:
Dois modelos físicos e circuitos equivalentes correspondentes para ajuste do espectro de impedância da amostra 2707 HDSS:
onde Y0 é o valor do KPI, j é o número imaginário ou (-1)1/2, ω é a frequência angular, n é o índice de potência do KPI menor que um35. A inversão da resistência de transferência de carga (ou seja, 1/Rct) corresponde à taxa de corrosão. Quanto menor o Rct, maior a taxa de corrosão27. Após 14 dias de incubação, o Rct das amostras de Pseudomonas aeruginosa atingiu 32 kΩ cm², valor muito inferior aos 489 kΩ cm² das amostras não biológicas (Tabela 4).
As imagens CLSM e SEM na Figura 5 mostram claramente que o revestimento de biofilme na superfície da amostra HDSS 2707 após 7 dias é denso. No entanto, após 14 dias, a cobertura do biofilme era pobre e algumas células mortas apareceram. A Tabela 5 mostra a espessura do biofilme em amostras HDSS 2707 após exposição a P. aeruginosa por 7 e 14 dias. A espessura máxima do biofilme mudou de 23,4 µm após 7 dias para 18,9 µm após 14 dias. A espessura média do biofilme também confirmou essa tendência. Ela diminuiu de 22,2 ± 0,7 µm após 7 dias para 17,8 ± 1,0 µm após 14 dias.
(a) Imagem CLSM 3D em 7 dias, (b) Imagem CLSM 3D em 14 dias, (c) Imagem SEM em 7 dias e (d) Imagem SEM em 14 dias.
A EMF revelou elementos químicos em biofilmes e produtos de corrosão em amostras expostas a P. aeruginosa por 14 dias. Na Figura 6, observa-se que o teor de C, N, O e P em biofilmes e produtos de corrosão é significativamente maior do que em metais puros, uma vez que esses elementos estão associados a biofilmes e seus metabólitos. Os microrganismos necessitam apenas de traços de cromo e ferro. Altos níveis de Cr e Fe no biofilme e produtos de corrosão na superfície das amostras indicam que a matriz metálica perdeu elementos devido à corrosão.
Após 14 dias, foram observadas cavidades com e sem P. aeruginosa no meio 2216E. Antes da incubação, a superfície das amostras era lisa e livre de defeitos (Fig. 7a). Após a incubação e remoção do biofilme e dos produtos de corrosão, as cavidades mais profundas na superfície das amostras foram examinadas usando CLSM, como mostrado nas Fig. 7b e c. Nenhuma cavidade óbvia foi encontrada na superfície dos controles não biológicos (profundidade máxima da cavidade 0,02 µm). A profundidade máxima da cavidade causada por P. aeruginosa foi de 0,52 µm aos 7 dias e 0,69 µm aos 14 dias, com base na profundidade máxima média da cavidade de 3 amostras (10 profundidades máximas de cavidade foram selecionadas para cada amostra). Obtenção de 0,42 ± 0,12 µm e 0,52 ± 0,15 µm, respectivamente (Tabela 5). Esses valores de profundidade do furo são pequenos, mas importantes.
(a) antes da exposição, (b) 14 dias em ambiente abiótico e (c) 14 dias em caldo de Pseudomonas aeruginosa.
Na Figura 8, a Tabela 8 mostra os espectros XPS de várias superfícies de amostra, e a composição química analisada para cada superfície está resumida na Tabela 6. Na Tabela 6, as porcentagens atômicas de Fe e Cr na presença de P. aeruginosa (amostras A e B) foram muito menores do que aquelas dos controles não biológicos (amostras C e D). Para uma amostra de P. aeruginosa, a curva espectral no nível do núcleo Cr 2p foi ajustada a quatro componentes de pico com energias de ligação (BE) de 574,4, 576,6, 578,3 e 586,8 eV, que podem ser atribuídas a Cr, Cr2O3, CrO3 e Cr(OH)3, respectivamente (Figura 9a e b). Para amostras não biológicas, o espectro do nível principal de Cr 2p apresenta dois picos principais para Cr (573,80 eV para BE) e Cr2O3 (575,90 eV para BE) nas Figuras 9c e d, respectivamente. A diferença mais marcante entre as amostras abióticas e as amostras de P. aeruginosa foi a presença de Cr6+ e uma maior proporção relativa de Cr(OH)3 (BE 586,8 eV) sob o biofilme.
Os amplos espectros XPS da superfície da amostra 2707 HDSS em dois meios são de 7 e 14 dias, respectivamente.
(a) 7 dias de exposição a P. aeruginosa, (b) 14 dias de exposição a P. aeruginosa, (c) 7 dias em um ambiente abiótico e (d) 14 dias em um ambiente abiótico.
O HDSS exibe um alto nível de resistência à corrosão na maioria dos ambientes. Kim et al. relataram que o HDSS UNS S32707 foi identificado como um DSS altamente ligado com um PREN maior que 45. O valor de PREN da amostra 2707 HDSS neste trabalho foi de 49. Isso se deve ao alto teor de cromo e ao alto teor de molibdênio e níquel, que são úteis em ambientes ácidos e ambientes com alto teor de cloreto. Além disso, uma composição bem balanceada e uma microestrutura livre de defeitos são benéficas para a estabilidade estrutural e a resistência à corrosão. No entanto, apesar de sua excelente resistência química, os dados experimentais neste trabalho sugerem que o 2707 HDSS não é completamente imune aos MICs de biofilme de P. aeruginosa.
Resultados eletroquímicos mostraram que a taxa de corrosão de 2707 HDSS no caldo de P. aeruginosa aumentou significativamente após 14 dias em comparação ao ambiente não biológico. Na Figura 2a, uma diminuição no Eocp foi observada tanto no meio abiótico quanto no caldo de P. aeruginosa durante as primeiras 24 horas. Depois disso, o biofilme cobre completamente a superfície da amostra e o Eocp se torna relativamente estável36. No entanto, o nível biológico de Eocp foi muito maior do que o nível não biológico de Eocp. Há razões para acreditar que essa diferença esteja associada à formação de biofilmes de P. aeruginosa. Na figura 2d, na presença de P. aeruginosa, o valor de icorr 2707 HDSS atingiu 0,627 μA cm-2, o que é uma ordem de magnitude maior do que o do controle abiótico (0,063 μA cm-2), o que foi consistente com o valor de Rct medido por EIS. Durante os primeiros dias, os valores de impedância no caldo de P. aeruginosa aumentaram devido à fixação de células de P. aeruginosa e à formação de biofilmes. No entanto, quando o biofilme cobre completamente a superfície da amostra, a impedância diminui. A camada protetora é atacada principalmente devido à formação de biofilmes e metabólitos do biofilme. Consequentemente, a resistência à corrosão diminuiu ao longo do tempo e a fixação de P. aeruginosa causou corrosão localizada. As tendências em ambientes abióticos foram diferentes. A resistência à corrosão do controle não biológico foi muito maior do que o valor correspondente das amostras expostas ao caldo de P. aeruginosa. Além disso, para acessos abióticos, o valor Rct 2707 HDSS atingiu 489 kΩ cm2 no dia 14, o que é 15 vezes maior do que o valor Rct (32 kΩ cm2) na presença de P. aeruginosa. Assim, o 2707 HDSS tem excelente resistência à corrosão em ambiente estéril, mas não é resistente a MICs de biofilmes de P. aeruginosa.
Esses resultados também podem ser observados nas curvas de polarização nas Figuras 2b. A ramificação anódica tem sido associada à formação de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa e às reações de oxidação de metais. Nesse caso, a reação catódica é a redução de oxigênio. A presença de P. aeruginosa aumentou significativamente a densidade de corrente de corrosão, cerca de uma ordem de magnitude maior do que no controle abiótico. Isso indica que o biofilme de P. aeruginosa aumenta a corrosão localizada do 2707 HDSS. Yuan et al.29 descobriram que a densidade de corrente de corrosão da liga Cu-Ni 70/30 aumentou sob a ação do biofilme de P. aeruginosa. Isso pode ser devido à biocatálise da redução de oxigênio pelos biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. Essa observação também pode explicar a MIC do 2707 HDSS neste trabalho. Também pode haver menos oxigênio sob biofilmes aeróbicos. Portanto, a recusa em repassivar a superfície metálica com oxigênio pode ser um fator que contribui para a MIC neste trabalho.
Dickinson et al. 38 sugeriram que a taxa de reações químicas e eletroquímicas pode ser diretamente afetada pela atividade metabólica de bactérias sésseis na superfície da amostra e pela natureza dos produtos de corrosão. Conforme mostrado na Figura 5 e na Tabela 5, o número de células e a espessura do biofilme diminuíram após 14 dias. Isso pode ser razoavelmente explicado pelo fato de que, após 14 dias, a maioria das células sésseis na superfície do 2707 HDSS morreu devido à depleção de nutrientes no meio 2216E ou à liberação de íons metálicos tóxicos da matriz do 2707 HDSS. Esta é uma limitação dos experimentos em batelada.
Neste trabalho, um biofilme de P. aeruginosa contribuiu para a depleção local de Cr e Fe sob o biofilme na superfície do 2707 HDSS (Fig. 6). A Tabela 6 mostra a redução de Fe e Cr na amostra D em comparação com a amostra C, indicando que o Fe e o Cr dissolvidos causados ​​pelo biofilme de P. aeruginosa persistiram pelos primeiros 7 dias. O ambiente 2216E é usado para simular o ambiente marinho. Ele contém 17700 ppm de Cl-, o que é comparável ao seu conteúdo na água do mar natural. A presença de 17700 ppm de Cl- foi a principal razão para a diminuição de Cr em amostras abióticas de 7 e 14 dias analisadas por XPS. Comparado às amostras de P. aeruginosa, a dissolução de Cr em amostras abióticas foi muito menor devido à forte resistência do 2707 HDSS ao cloro em condições abióticas. Na fig. 9 mostra a presença de Cr6+ no filme passivador. Pode estar envolvido na remoção de cromo de superfícies de aço por biofilmes de P. aeruginosa, como sugerido por Chen e Clayton.
Devido ao crescimento bacteriano, os valores de pH do meio antes e depois do cultivo foram de 7,4 e 8,2, respectivamente. Portanto, abaixo do biofilme de P. aeruginosa, é improvável que a corrosão por ácidos orgânicos contribua para este trabalho devido ao pH relativamente alto no meio em massa. O pH do meio de controle não biológico não se alterou significativamente (de 7,4 inicial para 7,5 final) durante o período de teste de 14 dias. O aumento do pH no meio de cultura após a incubação foi devido à atividade metabólica de P. aeruginosa e demonstrou ter o mesmo efeito no pH na ausência de tiras de teste.
Conforme mostrado na Figura 7, a profundidade máxima do poço causada pelo biofilme de P. aeruginosa foi de 0,69 µm, que é muito maior do que a do meio abiótico (0,02 µm). Isso é consistente com os dados eletroquímicos descritos acima. A profundidade do poço de 0,69 µm é mais de dez vezes menor do que o valor de 9,5 µm relatado para 2205 DSS sob as mesmas condições. Esses dados mostram que 2707 HDSS exibe melhor resistência a MICs do que 2205 DSS. Isso não deve ser uma surpresa, uma vez que 2707 HDSS tem níveis de Cr mais altos que fornecem passivação mais longa, mais difícil de despassivar P. aeruginosa, e por causa de sua estrutura de fase equilibrada sem precipitação secundária prejudicial causa corrosão.
Em conclusão, foram encontradas cavidades de MIC na superfície do 2707 HDSS em caldo de P. aeruginosa, em comparação com cavidades insignificantes no ambiente abiótico. Este trabalho demonstra que o 2707 HDSS apresenta melhor resistência à MIC do que o 2205 DSS, mas não é completamente imune à MIC devido ao biofilme de P. aeruginosa. Esses resultados auxiliam na seleção de aços inoxidáveis ​​adequados e na expectativa de vida útil para o ambiente marinho.
Cupom para 2707 HDSS fornecido pela Escola de Metalurgia da Universidade Northeastern (NEU) em Shenyang, China. A composição elementar do 2707 HDSS é mostrada na Tabela 1, que foi analisada pelo Departamento de Análise e Teste de Materiais da NEU. Todas as amostras foram tratadas para solução sólida a 1180 °C por 1 hora. Antes do teste de corrosão, um 2707 HDSS em formato de moeda com uma área de superfície aberta superior de 1 cm² foi polido até a granulação 2000 com lixa de carboneto de silício e, em seguida, polido com uma pasta de pó de Al2O3 de 0,05 µm. As laterais e a base foram protegidas com tinta inerte. Após a secagem, as amostras foram lavadas com água deionizada estéril e esterilizadas com etanol 75% (v/v) por 0,5 h. Em seguida, foram secas ao ar sob luz ultravioleta (UV) por 0,5 h antes do uso.
A cepa marinha de Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099 foi adquirida do Centro de Coleta de Culturas Marinhas de Xiamen (MCCC), China. A Pseudomonas aeruginosa foi cultivada em condições aeróbicas a 37°C em frascos de 250 ml e células eletroquímicas de vidro de 500 ml, utilizando meio líquido marinho 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China). O meio contém (g/l): 19,45 NaCl, 5,98 MgCl2, 3,24 Na2SO4, 1,8 CaCl2, 0,55 KCl, 0,16 Na2CO3, 0,08 KBr, 0,034 SrCl2, 0,08 SrBr2, 0,022 H3BO3, 0,004 NaSiO3, 0,016 6NH26NH3, 3,0016 NH3, 5,0 peptona, 1,0 extrato de levedura e 0,1 citrato de ferro. Autoclave a 121 °C por 20 minutos antes da inoculação. Conte as células sésseis e planctônicas com um hemocitômetro sob um microscópio de luz com ampliação de 400x. A concentração inicial de Pseudomonas aeruginosa planctônica imediatamente após a inoculação foi de aproximadamente 106 células/ml.
Testes eletroquímicos foram realizados em uma célula de vidro clássica de três eletrodos com um volume médio de 500 ml. A folha de platina e o eletrodo de calomelano saturado (SAE) foram conectados ao reator através de capilares de Luggin preenchidos com pontes salinas, que serviram como eletrodos de contra e referência, respectivamente. Para a fabricação dos eletrodos de trabalho, fio de cobre emborrachado foi fixado a cada amostra e coberto com resina epóxi, deixando cerca de 1 cm² de área desprotegida para o eletrodo de trabalho em um dos lados. Durante as medições eletroquímicas, as amostras foram colocadas no meio 2216E e mantidas a uma temperatura de incubação constante (37 °C) em banho-maria. Os dados de OCP, LPR, EIS e polarização dinâmica potencial foram medidos usando um potenciostato Autolab (Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., EUA). Os testes de LPR foram registrados a uma taxa de varredura de 0,125 mV s-1 na faixa de -5 a 5 mV com Eocp e uma taxa de amostragem de 1 Hz. A EIS foi realizada com uma onda senoidal em uma faixa de frequência de 0,01 a 10.000 Hz usando uma tensão aplicada de 5 mV em estado estacionário Eocp. Antes da varredura de potencial, os eletrodos estavam em modo inativo até que um valor estável do potencial de corrosão livre fosse atingido. As curvas de polarização foram então medidas de -0,2 a 1,5 V em função de Eocp a uma taxa de varredura de 0,166 mV/s. Cada teste foi repetido 3 vezes com e sem P. aeruginosa.
As amostras para análise metalográfica foram polidas mecanicamente com lixa de SiC úmida de granulação 2000 e, em seguida, polidas com uma suspensão de pó de Al2O3 de 0,05 µm para observação óptica. A análise metalográfica foi realizada em microscópio óptico. As amostras foram atacadas com uma solução de hidróxido de potássio 43 a 10% em peso.
Após a incubação, as amostras foram lavadas 3 vezes com solução salina tamponada em fosfato (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) e então fixadas com glutaraldeído 2,5% (v/v) por 10 horas para fixar os biofilmes. Elas foram então desidratadas com etanol em lotes (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100% em volume) antes da secagem ao ar. Finalmente, um filme de ouro é depositado na superfície da amostra para fornecer condutividade para observação por MEV. As imagens de MEV foram focadas em pontos com as células de P. aeruginosa mais sésseis na superfície de cada amostra. Realize uma análise de EDS para encontrar elementos químicos. Um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss (CLSM) (LSM 710, Zeiss, Alemanha) foi usado para medir a profundidade do poço. Para observar pontos de corrosão sob o biofilme, a amostra de teste foi primeiro limpa de acordo com o Padrão Nacional Chinês (CNS) GB/T4334.4-2000 para remover produtos de corrosão e biofilme da superfície da amostra de teste.
A análise por espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS, sistema de análise de superfície ESCALAB250, Thermo VG, EUA) foi realizada utilizando uma fonte de raios X monocromática (linha de alumínio Kα com energia de 1500 eV e potência de 150 W) em uma ampla faixa de energias de ligação 0 sob condições padrão de –1350 eV. Espectros de alta resolução foram registrados utilizando uma energia de transmissão de 50 eV e um passo de 0,2 eV.
As amostras incubadas foram removidas e lavadas suavemente com PBS (pH 7,4 ± 0,2) por 15 s45. Para observar a viabilidade bacteriana dos biofilmes nas amostras, os biofilmes foram corados usando o kit LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen, Eugene, OR, EUA). O kit contém dois corantes fluorescentes: corante fluorescente verde SYTO-9 e corante fluorescente vermelho iodeto de propídio (PI). No CLSM, os pontos fluorescentes verde e vermelho representam células vivas e mortas, respectivamente. Para a coloração, 1 ml de uma mistura contendo 3 µl de SYTO-9 e 3 µl de solução de PI foi incubado por 20 minutos à temperatura ambiente (23 °C) no escuro. Em seguida, as amostras coradas foram examinadas em dois comprimentos de onda (488 nm para células vivas e 559 nm para células mortas) usando um aparelho Nikon CLSM (C2 Plus, Nikon, Japão). A espessura do biofilme foi medida no modo de escaneamento 3D.
Como citar este artigo: Li, H. et al. Corrosão microbiana do aço inoxidável super duplex 2707 por biofilme marinho de Pseudomonas aeruginosa. a ciência. 6, 20190. doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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