Благодарим вас за посещение сайта Nature.com. Вы используете версию браузера с ограниченной поддержкой CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновленную версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В целях обеспечения дальнейшей поддержки мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Отображает карусель из трех слайдов одновременно. Используйте кнопки «Предыдущий» и «Следующий», чтобы переключаться между тремя слайдами за раз, или используйте ползунки в конце, чтобы переключаться между тремя слайдами за раз.
Быстрое развитие нанотехнологий и их интеграция в повседневные приложения могут представлять угрозу для окружающей среды. Хотя экологически чистые методы разложения органических загрязнителей хорошо разработаны, восстановление неорганических кристаллических загрязнителей вызывает серьезную озабоченность из-за их низкой чувствительности к биотрансформации и недостаточного понимания взаимодействия поверхности материала с биологическими веществами. В данной работе мы используем модель неорганических двумерных MXenes на основе Nb в сочетании с простым методом анализа параметров формы для отслеживания механизма биоремедиации двумерных керамических наноматериалов зелеными микроводорослями Raphidocelis subcapitata. Мы обнаружили, что микроводоросли разлагают MXenes на основе Nb за счет физико-химических взаимодействий, связанных с поверхностью. Первоначально к поверхности микроводорослей прикреплялись однослойные и многослойные наночастицы MXene, что несколько замедляло рост водорослей. Однако при длительном взаимодействии с поверхностью микроводоросли окисляли наночастицы MXene и далее разлагали их на NbO и Nb2O5. Поскольку эти оксиды нетоксичны для клеток микроводорослей, они поглощают наночастицы оксида ниобия посредством механизма абсорбции, который дополнительно восстанавливает микроводоросли после 72 часов обработки воды. Влияние питательных веществ, связанных с абсорбцией, также отражается в увеличении объема клеток, их гладкой форме и изменении скорости роста. На основании этих данных мы заключаем, что кратковременное и долговременное присутствие MXenes на основе ниобия в пресноводных экосистемах может оказывать лишь незначительное воздействие на окружающую среду. Следует отметить, что, используя двумерные наноматериалы в качестве модельных систем, мы демонстрируем возможность отслеживания трансформации формы даже в мелкозернистых материалах. В целом, это исследование отвечает на важный фундаментальный вопрос о процессах, связанных с взаимодействием с поверхностью, которые определяют механизм биоремедиации двумерных наноматериалов, и предоставляет основу для дальнейших краткосрочных и долгосрочных исследований воздействия неорганических кристаллических наноматериалов на окружающую среду.
Наноматериалы вызвали большой интерес с момента своего открытия, и различные нанотехнологии в последнее время вступили в фазу модернизации1. К сожалению, интеграция наноматериалов в повседневные приложения может привести к случайным выбросам из-за неправильной утилизации, небрежного обращения или неадекватной инфраструктуры безопасности. Поэтому разумно предположить, что наноматериалы, включая двумерные (2D) наноматериалы, могут попадать в природную среду, поведение и биологическая активность которых еще не до конца изучены. Следовательно, неудивительно, что опасения по поводу экотоксичности сосредоточены на способности 2D наноматериалов просачиваться в водные системы2,3,4,5,6. В этих экосистемах некоторые 2D наноматериалы могут взаимодействовать с различными организмами на разных трофических уровнях, включая микроводоросли.
Микроводоросли — это примитивные организмы, встречающиеся в природе в пресноводных и морских экосистемах, которые производят разнообразные химические продукты посредством фотосинтеза7. Таким образом, они имеют решающее значение для водных экосистем8,9,10,11,12, а также являются чувствительными, недорогими и широко используемыми индикаторами экотоксичности13,14. Поскольку клетки микроводорослей быстро размножаются и быстро реагируют на присутствие различных соединений, они перспективны для разработки экологически чистых методов очистки воды, загрязненной органическими веществами15,16.
Клетки водорослей способны удалять неорганические ионы из воды посредством биосорбции и накопления17,18. Было обнаружено, что некоторые виды водорослей, такие как Chlorella, Anabaena invar, Westiellopsis prolifica, Stigeoclonium tenue и Synechococcus sp., переносят и даже питают токсичные ионы металлов, такие как Fe2+, Cu2+, Zn2+ и Mn2+19. Другие исследования показали, что ионы Cu2+, Cd2+, Ni2+, Zn2+ или Pb2+ ограничивают рост Scenedesmus, изменяя морфологию клеток и разрушая их хлоропласты20,21.
Экологически чистые методы разложения органических загрязнителей и удаления ионов тяжелых металлов привлекают внимание ученых и инженеров по всему миру. Это в основном связано с тем, что эти загрязнители легко перерабатываются в жидкой фазе. Однако неорганические кристаллические загрязнители характеризуются низкой растворимостью в воде и низкой восприимчивостью к различным биотрансформациям, что создает большие трудности в очистке, и в этой области достигнут незначительный прогресс22,23,24,25,26. Таким образом, поиск экологически чистых решений для восстановления наноматериалов остается сложной и неизученной областью. Из-за высокой степени неопределенности в отношении эффектов биотрансформации 2D-наноматериалов нет простого способа выяснить возможные пути их деградации в процессе восстановления.
В данном исследовании мы использовали зеленые микроводоросли в качестве активного водного биоремедиационного агента для неорганических керамических материалов, в сочетании с мониторингом процесса деградации MXene in situ как представителя неорганических керамических материалов. Термин «MXene» отражает стехиометрию материала Mn+1XnTx, где M — ранний переходный металл, X — углерод и/или азот, Tx — поверхностный терминатор (например, -OH, -F, -Cl), а n = 1, 2, 3 или 427,28. С момента открытия MXenes Нагибом и др. Сенсорика, терапия рака и мембранная фильтрация 27,29,30. Кроме того, MXenes можно рассматривать как модельные 2D-системы благодаря их превосходной коллоидной стабильности и возможным биологическим взаимодействиям31,32,33,34,35,36.
Таким образом, разработанная в данной статье методология и наши исследовательские гипотезы представлены на рисунке 1. Согласно этой гипотезе, микроводоросли разлагают MXены на основе ниобия на нетоксичные соединения за счет физико-химических взаимодействий, связанных с поверхностью, что позволяет в дальнейшем восстанавливать водоросли. Для проверки этой гипотезы были выбраны два представителя семейства ранних карбидов и/или нитридов переходных металлов на основе ниобия (MXены), а именно Nb2CTx и Nb4C3TX.
Методология исследования и основанные на фактических данных гипотезы о восстановлении MXene зелеными микроводорослями Raphidocelis subcapitata. Обратите внимание, что это лишь схематическое представление основанных на фактических данных предположений. Озерная среда отличается используемой питательной средой и условиями (например, суточным циклом и ограничениями в доступности необходимых питательных веществ). Создано с помощью BioRender.com.
Таким образом, используя MXene в качестве модельной системы, мы открыли путь к изучению различных биологических эффектов, которые невозможно наблюдать с другими традиционными наноматериалами. В частности, мы демонстрируем возможность биоремедиации двумерных наноматериалов, таких как MXene на основе ниобия, с помощью микроводорослей Raphidocelis subcapitata. Микроводоросли способны разлагать Nb-MXene на нетоксичные оксиды NbO и Nb2O5, которые также обеспечивают питательные вещества за счет механизма поглощения ниобия. В целом, это исследование отвечает на важный фундаментальный вопрос о процессах, связанных с физико-химическими взаимодействиями на поверхности, которые определяют механизмы биоремедиации двумерных наноматериалов. Кроме того, мы разрабатываем простой метод, основанный на параметрах формы, для отслеживания тонких изменений формы двумерных наноматериалов. Это вдохновляет на дальнейшие краткосрочные и долгосрочные исследования различных воздействий неорганических кристаллических наноматериалов на окружающую среду. Таким образом, наше исследование расширяет понимание взаимодействия между поверхностью материала и биологическим материалом. Мы также закладываем основу для расширенных краткосрочных и долгосрочных исследований их возможного воздействия на пресноводные экосистемы, результаты которых теперь легко проверить.
MXены представляют собой интересный класс материалов с уникальными и привлекательными физическими и химическими свойствами, а следовательно, и с множеством потенциальных применений. Эти свойства в значительной степени зависят от их стехиометрии и химии поверхности. Поэтому в нашем исследовании мы изучили два типа иерархических однослойных (SL) MXенов на основе ниобия: Nb2CTx и Nb4C3TX, поскольку можно наблюдать различные биологические эффекты этих наноматериалов. MXены получают из исходных материалов путем селективного травления сверху вниз атомарно тонких слоев А-фазы MAX. Фаза MAX представляет собой тройную керамику, состоящую из «связанных» блоков карбидов переходных металлов и тонких слоев элементов «А», таких как Al, Si и Sn, со стехиометрией MnAXn-1. Морфология исходной фазы MAX была исследована с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и соответствовала результатам предыдущих исследований (см. дополнительную информацию, SI, рисунок S1). Многослойный (МЛ) Nb-MXene был получен после удаления слоя Al с помощью 48% HF (фтористоводородной кислоты). Морфология МЛ-Nb2CTx и МЛ-Nb4C3TX была исследована с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) (рисунки S1c и S1d соответственно), и наблюдалась типичная слоистая морфология MXene, подобная двумерным наночешуйкам, проходящим через вытянутые пористые щели. Оба Nb-MXene имеют много общего с фазами MXene, ранее синтезированными методом кислотного травления27,38. После подтверждения структуры MXene мы нанесли его слоями путем интеркаляции гидроксида тетрабутиламмония (TBAOH) с последующей промывкой и ультразвуковой обработкой, после чего получили однослойные или низкослойные (НЛ) двумерные наночешуйки Nb-MXene.
Для проверки эффективности травления и дальнейшего отслаивания мы использовали просвечивающую электронную микроскопию высокого разрешения (HRTEM) и рентгеновскую дифракцию (XRD). Результаты HRTEM, обработанные с помощью обратного быстрого преобразования Фурье (IFFT) и быстрого преобразования Фурье (FFT), показаны на рис. 2. Наночешуйки Nb-MXene были ориентированы ребром вверх для проверки структуры атомного слоя и измерения межплоскостных расстояний. Изображения HRTEM наночешуек MXene Nb2CTx и Nb4C3TX показали их атомарно тонкую слоистую природу (см. рис. 2a1, a2), как ранее сообщали Нагиб и др.27 и Ястшембска и др.38. Для двух соседних монослоев Nb2CTx и Nb4C3Tx мы определили межслоевые расстояния 0,74 и 1,54 нм соответственно (рис. 2b1,b2), что также согласуется с нашими предыдущими результатами38. Это было дополнительно подтверждено обратным быстрым преобразованием Фурье (рис. 2c1, c2) и быстрым преобразованием Фурье (рис. 2d1, d2), показывающими расстояние между монослоями Nb2CTx и Nb4C3Tx. Изображение показывает чередование светлых и темных полос, соответствующих атомам ниобия и углерода, что подтверждает слоистую природу исследуемых MXenes. Важно отметить, что спектры энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX), полученные для Nb2CTx и Nb4C3Tx (рис. S2a и S2b), не показали остатков исходной MAX-фазы, поскольку пик Al не был обнаружен.
Характеристика наночешуек SL Nb2CTx и Nb4C3Tx MXene, включая (a) изображение 2D наночешуек в режиме бокового обзора, полученное с помощью электронной микроскопии высокого разрешения (HRTEM), и соответствующие данные: (b) режим интенсивности, (c) обратное быстрое преобразование Фурье (IFFT), (d) быстрое преобразование Фурье (FFT), (e) рентгеновские дифракционные картины Nb-MXene. Для SL 2D Nb2CTx числа обозначены как (a1, b1, c1, d1, e1). Для SL 2D Nb4C3Tx числа обозначены как (a2, b2, c2, d2, e1).
Результаты рентгенодифракционных измерений однослойных MXene Nb2CTx и Nb4C3Tx показаны на рис. 2e1 и e2 соответственно. Пики (002) при 4,31 и 4,32 соответствуют ранее описанным слоистым MXene Nb2CTx и Nb4C3TX38,39,40,41 соответственно. Результаты рентгенодифракционного анализа также указывают на наличие некоторых остаточных многослойных структур и MAX-фаз, но в основном рентгенодифракционные картины связаны с однослойным Nb4C3Tx (рис. 2e2). Присутствие более мелких частиц MAX-фазы может объяснить более сильный пик MAX по сравнению со хаотично расположенными слоями Nb4C3Tx.
Дальнейшие исследования были сосредоточены на зеленых микроводорослях, принадлежащих к виду R. subcapitata. Мы выбрали микроводоросли, потому что они являются важными продуцентами, участвующими в основных пищевых цепях42. Они также являются одними из лучших индикаторов токсичности благодаря способности удалять токсичные вещества, переносимые на более высокие уровни пищевой цепи43. Кроме того, исследования R. subcapitata могут пролить свет на случайную токсичность SL Nb-MXenes для распространенных пресноводных микроорганизмов. Для иллюстрации этого исследователи предположили, что каждый микроб имеет различную чувствительность к токсичным соединениям, присутствующим в окружающей среде. Для большинства организмов низкие концентрации веществ не влияют на их рост, в то время как концентрации выше определенного предела могут подавлять их или даже вызывать гибель. Поэтому для наших исследований поверхностного взаимодействия между микроводорослями и MXenes и связанного с этим восстановления мы решили протестировать безвредные и токсичные концентрации Nb-MXenes. Для этого мы протестировали концентрации MXene 0 (в качестве эталона), 0,01, 0,1 и 10 мг/л, а также дополнительно заразили микроводоросли очень высокими концентрациями MXene (100 мг/л), которые могут быть экстремальными и смертельными для любой биологической среды.
Влияние SL Nb-MXenes на микроводоросли показано на рисунке 3, выраженное в процентах стимуляции роста (+) или ингибирования (-), измеренных для образцов с концентрацией 0 мг/л. Для сравнения были также протестированы фаза Nb-MAX и ML Nb-MXenes, результаты которых показаны в дополнительных материалах (см. рис. S3). Полученные результаты подтвердили, что SL Nb-MXenes практически полностью лишены токсичности в диапазоне низких концентраций от 0,01 до 10 мг/л, как показано на рис. 3a,b. В случае Nb2CTx мы наблюдали не более 5% экотоксичности в указанном диапазоне.
Стимуляция (+) или ингибирование (-) роста микроводорослей в присутствии MXene SL (a) Nb2CTx и (b) Nb4C3TX. Анализировались периоды взаимодействия MXene с микроводорослями 24, 48 и 72 часа. Значимые данные (t-критерий, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Значимые данные (t-критерий, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Значимые данные (t-критерии, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Значимые данные (t-критерий, p < 0,05) отмечены звездочкой (*).重要数据（t 检验，p < 0,05）用星号(*) 标记。重要数据（t 检验，p < 0,05）用星号(*) 标记。 Важные данные (t-критерий, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Важные данные (t-критерий, p < 0,05) отмечены звездочкой (*).Красные стрелки указывают на прекращение ингибирующей стимуляции.
С другой стороны, низкие концентрации Nb4C3TX оказались несколько более токсичными, но не превышали 7%. Как и ожидалось, мы наблюдали, что MXены обладали более высокой токсичностью и ингибированием роста микроводорослей при концентрации 100 мг/л. Интересно, что ни один из материалов не показал той же тенденции и зависимости атоксических/токсических эффектов от времени по сравнению с образцами MAX или ML (подробности см. в Приложении). В то время как для фазы MAX (см. рис. S3) токсичность достигала примерно 15–25% и увеличивалась со временем, для SL Nb2CTx и Nb4C3TX MXene наблюдалась обратная тенденция. Ингибирование роста микроводорослей уменьшалось со временем. Оно достигало примерно 17% через 24 часа и снижалось до менее 5% через 72 часа (рис. 3a, b соответственно).
Что еще более важно, для SL Nb4C3TX ингибирование роста микроводорослей достигло примерно 27% через 24 часа, но через 72 часа снизилось примерно до 1%. Поэтому мы обозначили наблюдаемый эффект как обратное ингибирование стимуляции, и этот эффект был сильнее для SL Nb4C3TX MXene. Стимуляция роста микроводорослей наблюдалась раньше с Nb4C3TX (взаимодействие при 10 мг/л в течение 24 ч) по сравнению с SL Nb2CTx MXene. Обратный эффект ингибирования-стимуляции также хорошо показан на кривой скорости удвоения биомассы (подробности см. на рис. S4). До сих пор экотоксичность Ti3C2TX MXene изучалась различными способами. Он не токсичен для эмбрионов данио-рерио44, но умеренно экотоксичен для микроводорослей Desmodesmus quadricauda и растений Sorghum saccharatum45. Другие примеры специфических эффектов включают более высокую токсичность для линий раковых клеток по сравнению с линиями нормальных клеток46,47. Можно предположить, что условия эксперимента будут влиять на изменения роста микроводорослей, наблюдаемые в присутствии Nb-MXenes. Например, pH около 8 в строме хлоропластов является оптимальным для эффективной работы фермента RuBisCO. Следовательно, изменения pH отрицательно влияют на скорость фотосинтеза48,49. Однако мы не наблюдали значительных изменений pH во время эксперимента (подробности см. в Приложении, рис. S5). В целом, культуры микроводорослей с Nb-MXenes незначительно снижали pH раствора с течением времени. Однако это снижение было аналогично изменению pH чистой среды. Кроме того, диапазон обнаруженных изменений был аналогичен диапазону, измеренному для чистой культуры микроводорослей (контрольный образец). Таким образом, мы заключаем, что фотосинтез не зависит от изменений pH с течением времени.
Кроме того, синтезированные MXены имеют поверхностные концевые группы (обозначаемые как Tx). В основном это функциональные группы -O, -F и -OH. Однако химия поверхности напрямую связана с методом синтеза. Известно, что эти группы случайным образом распределены по поверхности, что затрудняет прогнозирование их влияния на свойства MXена50. Можно предположить, что Tx может быть каталитической силой для окисления ниобия светом. Поверхностные функциональные группы действительно обеспечивают множество мест закрепления для нижележащих фотокатализаторов, образуя гетеропереходы51. Однако состав питательной среды не обеспечил эффективного фотокатализатора (подробный состав среды можно найти в таблице S6 в дополнительных материалах). Кроме того, любая модификация поверхности также очень важна, поскольку биологическая активность MXенов может изменяться из-за постобработки слоя, окисления, химической модификации поверхности органическими и неорганическими соединениями52,53,54,55,56 или инженерии поверхностного заряда38. Поэтому, чтобы проверить, имеет ли оксид ниобия какое-либо отношение к нестабильности материала в среде, мы провели исследования дзета-потенциала (ζ) в питательной среде для микроводорослей и деионизированной воде (для сравнения). Наши результаты показывают, что SL Nb-MXenes достаточно стабильны (см. рис. S6 в дополнительной информации для результатов MAX и ML). Дзета-потенциал SL MXenes составляет около -10 мВ. В случае SR Nb2CTx значение ζ несколько более отрицательное, чем у Nb4C3Tx. Такое изменение значения ζ может указывать на то, что поверхность отрицательно заряженных наночастиц MXene поглощает положительно заряженные ионы из культуральной среды. Временные измерения дзета-потенциала и проводимости Nb-MXenes в культуральной среде (см. рис. S7 и S8 в дополнительной информации для более подробной информации) подтверждают нашу гипотезу.
Однако оба образца Nb-MXene SL показали минимальные изменения относительно нуля. Это ясно демонстрирует их стабильность в питательной среде для микроводорослей. Кроме того, мы оценили, повлияет ли присутствие наших зеленых микроводорослей на стабильность Nb-MXene в среде. Результаты измерения дзета-потенциала и проводимости MXene после взаимодействия с микроводорослями в питательной среде и культивировании с течением времени можно найти в дополнительных материалах (рисунки S9 и S10). Интересно, что мы заметили, что присутствие микроводорослей, по-видимому, стабилизирует дисперсию обоих MXene. В случае образца Nb2CTx SL дзета-потенциал даже незначительно снизился со временем до более отрицательных значений (-15,8 против -19,1 мВ после 72 часов инкубации). Дзета-потенциал SL Nb4C3TX незначительно увеличился, но даже через 72 часа он все еще демонстрировал более высокую стабильность, чем наночешуйки без присутствия микроводорослей (-18,1 против -9,1 мВ).
Мы также обнаружили более низкую проводимость растворов Nb-MXene, инкубированных в присутствии микроводорослей, что указывает на меньшее количество ионов в питательной среде. Примечательно, что нестабильность MXene в воде в основном обусловлена ​​поверхностным окислением57. Поэтому мы предполагаем, что зеленые микроводоросли каким-то образом очистили оксиды, образовавшиеся на поверхности Nb-MXene, и даже предотвратили их появление (окисление MXene). Это можно увидеть, изучив типы веществ, поглощаемых микроводорослями.
Хотя наши экотоксикологические исследования показали, что микроводоросли способны преодолевать токсичность Nb-MXene с течением времени и необычное подавление стимулированного роста, целью нашего исследования было изучение возможных механизмов действия. Когда такие организмы, как водоросли, подвергаются воздействию соединений или материалов, незнакомых их экосистемам, они могут реагировать различными способами58,59. В отсутствие токсичных оксидов металлов микроводоросли могут питаться, что позволяет им непрерывно расти60. После поглощения токсичных веществ могут активироваться защитные механизмы, такие как изменение формы. Также необходимо учитывать возможность абсорбции58,59. Следует отметить, что любой признак защитного механизма является явным индикатором токсичности исследуемого соединения. Поэтому в нашей дальнейшей работе мы исследовали потенциальное поверхностное взаимодействие между наночастицами SL Nb-MXene и микроводорослями с помощью СЭМ и возможную абсорбцию Nb-содержащих MXene с помощью рентгенофлуоресцентной спектроскопии (РФС). Следует отметить, что анализы SEM и XRF проводились только при самой высокой концентрации MXene для решения вопросов токсичности и активности.
Результаты СЭМ показаны на рис. 4. Необработанные клетки микроводорослей (см. рис. 4а, контрольный образец) четко демонстрировали типичную морфологию R. subcapitata и форму клеток, напоминающую круассан. Клетки выглядят уплощенными и несколько дезорганизованными. Некоторые клетки микроводорослей перекрывали и переплетались друг с другом, но это, вероятно, было вызвано процессом подготовки образца. В целом, чистые клетки микроводорослей имели гладкую поверхность и не демонстрировали каких-либо морфологических изменений.
Изображения, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), показывают взаимодействие поверхности зеленых микроводорослей с нанолистами MXene после 72 часов взаимодействия при экстремальной концентрации (100 мг/л). (a) Необработанные зеленые микроводоросли после взаимодействия с MXene SL (b) Nb2CTx и (c) Nb4C3TX. Обратите внимание, что наночастицы Nb-MXene отмечены красными стрелками. Для сравнения также добавлены фотографии, полученные с помощью оптического микроскопа.
Напротив, клетки микроводорослей, адсорбированные на наночастицах SL Nb-MXene, были повреждены (см. рис. 4b, c, красные стрелки). В случае Nb2CTx MXene (рис. 4b) микроводоросли, как правило, растут с прикрепленными двумерными наночастицами, что может изменить их морфологию. Примечательно, что мы также наблюдали эти изменения под световым микроскопом (подробности см. на рис. S11 в дополнительных материалах). Этот морфологический переход имеет правдоподобную основу в физиологии микроводорослей и их способности защищаться путем изменения морфологии клеток, например, путем увеличения объема клеток61. Поэтому важно проверить количество клеток микроводорослей, которые фактически контактируют с Nb-MXene. Исследования с помощью СЭМ показали, что приблизительно 52% клеток микроводорослей подверглись воздействию Nb-MXene, в то время как 48% этих клеток микроводорослей избегали контакта. В случае с SL Nb4C3Tx MXene микроводоросли стараются избегать контакта с MXene, локализуясь и разрастаясь из двумерных наноразмеров (рис. 4c). Однако мы не наблюдали проникновения наноразмеров в клетки микроводорослей и их повреждения.
Самосохранение также является зависящим от времени ответным поведением на блокировку фотосинтеза из-за адсорбции частиц на поверхности клетки и так называемого эффекта затенения62. Очевидно, что каждый объект (например, наночастицы Nb-MXene), находящийся между микроводорослями и источником света, ограничивает количество света, поглощаемого хлоропластами. Однако мы не сомневаемся, что это оказывает существенное влияние на полученные результаты. Как показали наши микроскопические наблюдения, двумерные наночастицы не были полностью обернуты или приклеены к поверхности микроводорослей, даже когда клетки микроводорослей контактировали с Nb-MXene. Вместо этого наночастицы оказались ориентированы к клеткам микроводорослей, не покрывая их поверхность. Такой набор наночастиц/микроводорослей не может существенно ограничить количество света, поглощаемого клетками микроводорослей. Более того, некоторые исследования даже продемонстрировали улучшение поглощения света фотосинтезирующими организмами в присутствии двумерных наноматериалов63,64,65,66.
Поскольку изображения, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), не могли напрямую подтвердить поглощение ниобия клетками микроводорослей, в дальнейшем мы обратились к рентгенофлуоресцентному анализу (РФС) и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) для выяснения этого вопроса. Поэтому мы сравнили интенсивность пиков Nb в эталонных образцах микроводорослей, не взаимодействовавших с MXene, в наночастицах MXene, отделившихся от поверхности клеток микроводорослей, и в клетках микроводорослей после удаления прикрепленных MXene. Стоит отметить, что если поглощения Nb нет, то значение Nb, полученное клетками микроводорослей после удаления прикрепленных наночастиц, должно быть равно нулю. Следовательно, если поглощение Nb происходит, то результаты РФС и РФЭС должны показывать четкий пик Nb.
В случае рентгенофлуоресцентных спектров образцы микроводорослей показали пики Nb для SL Nb2CTx и Nb4C3Tx MXene после взаимодействия с SL Nb2CTx и Nb4C3Tx MXene (см. рис. 5a, также обратите внимание, что результаты для MAX и ML MXene показаны в дополнительной информации, рис. S12–C17). Интересно, что интенсивность пика Nb одинакова в обоих случаях (красные столбцы на рис. 5a). Это указывает на то, что водоросли не могли поглощать больше Nb, и максимальная способность к накоплению Nb была достигнута в клетках, несмотря на то, что к клеткам микроводорослей было прикреплено в два раза больше Nb4C3Tx MXene (синие столбцы на рис. 5a). Следует отметить, что способность микроводорослей поглощать металлы зависит от концентрации оксидов металлов в окружающей среде67,68. Шамшада и др.67 обнаружили, что абсорбционная способность пресноводных водорослей снижается с повышением pH. Райзе и др.68 отметили, что способность водорослей поглощать металлы примерно на 25% выше для Pb2+, чем для Ni2+.
(a) Результаты рентгенофлуоресцентного анализа (XRF) базального поглощения Nb клетками зеленых микроводорослей, инкубированными при экстремальной концентрации SL Nb-MXenes (100 мг/л) в течение 72 часов. Результаты показывают присутствие α в чистых клетках микроводорослей (контрольный образец, серые столбцы), 2D наночешуйках, выделенных из поверхностных клеток микроводорослей (синие столбцы), и клетках микроводорослей после отделения 2D наночешуек от поверхности (красные столбцы). Количество элементарного Nb, (b) процент химического состава органических компонентов микроводорослей (C=O и CHx/C–O) и оксидов Nb, присутствующих в клетках микроводорослей после инкубации с SL Nb-MXenes, (c–e) аппроксимация пика состава спектров XPS SL Nb2CTx и (fh) SL Nb4C3Tx MXene, поглощенного клетками микроводорослей.
Поэтому мы ожидали, что Nb может поглощаться клетками водорослей в виде оксидов. Для проверки этого мы провели исследования XPS на MXene Nb2CTx и Nb4C3TX и клетках водорослей. Результаты взаимодействия микроводорослей с Nb-MXene и MXene, выделенными из клеток водорослей, показаны на рис. 5b. Как и ожидалось, мы обнаружили пики Nb 3d в образцах микроводорослей после удаления MXene с поверхности микроводорослей. Количественное определение C=O, CHx/CO и оксидов Nb было рассчитано на основе спектров Nb 3d, O 1s и C 1s, полученных с Nb2CTx SL (рис. 5c–e) и Nb4C3Tx SL (рис. 5c–e). MXenes, полученные из инкубированных микроводорослей. Рис. 5f–h) В таблице S1-3 приведены подробные сведения о параметрах пиков и общей химической структуре, полученные в результате подгонки. Следует отметить, что области Nb 3d в Nb2CTx SL и Nb4C3Tx SL (рис. 5c, f) соответствуют одному компоненту Nb2O5. Здесь мы не обнаружили пиков, связанных с MXene, в спектрах, что указывает на то, что клетки микроводорослей поглощают только оксидную форму Nb. Кроме того, мы аппроксимировали спектр C 1s компонентами C–C, CHx/C–O, C=O и –COOH. Мы отнесли пики CHx/C–O и C=O к органическому вкладу клеток микроводорослей. На долю этих органических компонентов приходится 36% и 41% пиков C 1s в Nb2CTx SL и Nb4C3TX SL соответственно. Затем мы аппроксимировали спектры O 1s образцов SL Nb2CTx и SL Nb4C3TX с помощью Nb2O5, органических компонентов микроводорослей (CHx/CO) и адсорбированной на поверхности воды.
Наконец, результаты рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) четко показали форму Nb, а не просто его присутствие. Согласно положению сигнала Nb 3d и результатам деконволюции, мы подтверждаем, что Nb поглощается только в форме оксидов, а не ионов или самого MXene. Кроме того, результаты XPS показали, что клетки микроводорослей обладают большей способностью поглощать оксиды Nb из SL Nb2CTx по сравнению с SL Nb4C3TX MXene.
Хотя наши результаты по поглощению Nb впечатляют и позволяют нам идентифицировать деградацию MXene, в настоящее время нет метода, позволяющего отслеживать связанные с этим морфологические изменения в двумерных наночешуйках. Поэтому мы также решили разработать подходящий метод, который мог бы напрямую реагировать на любые изменения, происходящие в двумерных наночешуйках Nb-MXene и клетках микроводорослей. Важно отметить, что мы предполагаем, что если взаимодействующие частицы подвергаются какой-либо трансформации, разложению или дефрагментации, это должно быстро проявляться в виде изменений параметров формы, таких как диаметр эквивалентной круговой области, округлость, ширина Феррета или длина Феррета. Поскольку эти параметры подходят для описания вытянутых частиц или двумерных наночешуек, их отслеживание с помощью динамического анализа формы частиц даст нам ценную информацию о морфологической трансформации однослойных наночешуек Nb-MXene в процессе восстановления.
Полученные результаты показаны на рисунке 6. Для сравнения мы также протестировали исходную MAX-фазу и ML-MXene (см. дополнительные материалы, рисунки S18 и S19). Динамический анализ формы частиц показал, что все параметры формы двух Nb-MXene SL значительно изменились после взаимодействия с микроводорослями. Как показано параметром эквивалентного диаметра круговой области (рис. 6a, b), уменьшение пиковой интенсивности фракции крупных наночешуек указывает на их тенденцию к распаду на более мелкие фрагменты. На рис. 6c, d показано уменьшение пиков, связанных с поперечным размером чешуек (удлинение наночешуек), что указывает на трансформацию 2D наночешуек в более частицеподобную форму. На рисунках 6e-h показаны ширина и длина Феррета соответственно. Ширина и длина Феррета являются взаимодополняющими параметрами и поэтому должны рассматриваться вместе. После инкубации 2D Nb-MXene наночешуек в присутствии микроводорослей их пики корреляции Феррета сместились, а их интенсивность уменьшилась. На основании этих результатов в сочетании с морфологией, рентгенофлуоресцентным анализом и рентгеноспектральным анализом мы пришли к выводу, что наблюдаемые изменения тесно связаны с окислением, поскольку окисленные MXены становятся более морщинистыми и распадаются на фрагменты и сферические частицы оксида69,70.
Анализ трансформации MXene после взаимодействия с зелеными микроводорослями. Динамический анализ формы частиц учитывает такие параметры, как (a, b) диаметр эквивалентной круговой области, (c, d) округлость, (e, f) ширина Феррета и (g, h) длина Феррета. Для этого были проанализированы два эталонных образца микроводорослей вместе с первичными MXene SL Nb2CTx и SL Nb4C3Tx, MXene SL Nb2CTx и SL Nb4C3Tx, деградированными микроводорослями и обработанными микроводорослями MXene SL Nb2CTx и SL Nb4C3Tx. Красными стрелками показаны переходы параметров формы исследуемых двумерных наночастиц.
Поскольку анализ параметров формы является очень надежным методом, он также может выявлять морфологические изменения в клетках микроводорослей. Поэтому мы проанализировали эквивалентный диаметр круговой области, округлость и ширину/длину Феррета чистых клеток микроводорослей и клеток после взаимодействия с двумерными наночастицами Nb. На рис. 6a–h показаны изменения параметров формы клеток водорослей, о чем свидетельствует уменьшение интенсивности пиков и смещение максимумов в сторону больших значений. В частности, параметры округлости клеток показали уменьшение у вытянутых клеток и увеличение у сферических клеток (рис. 6a, b). Кроме того, ширина клетки Феррета увеличилась на несколько микрометров после взаимодействия с SL Nb2CTx MXene (рис. 6e) по сравнению с SL Nb4C3TX MXene (рис. 6f). Мы предполагаем, что это может быть связано с сильным поглощением оксидов Nb микроводорослями при взаимодействии с Nb2CTx SR. Менее жесткое прикрепление хлопьев Nb к их поверхности может привести к росту клеток с минимальным эффектом затенения.
Наши наблюдения за изменениями параметров формы и размера микроводорослей дополняют другие исследования. Зеленые микроводоросли могут изменять свою морфологию в ответ на стресс окружающей среды, изменяя размер, форму или метаболизм клеток61. Например, изменение размера клеток облегчает поглощение питательных веществ71. Более мелкие клетки водорослей демонстрируют меньшее поглощение питательных веществ и замедление скорости роста. И наоборот, более крупные клетки, как правило, потребляют больше питательных веществ, которые затем откладываются внутриклеточно72,73. Мачадо и Соарес обнаружили, что фунгицид триклозан может увеличивать размер клеток. Они также обнаружили значительные изменения формы водорослей74. Кроме того, Инь и др.9 также выявили морфологические изменения водорослей после воздействия на них нанокомпозитов восстановленного оксида графена. Таким образом, очевидно, что изменение параметров размера/формы микроводорослей вызвано присутствием MXene. Поскольку это изменение размера и формы указывает на изменения в поглощении питательных веществ, мы считаем, что анализ параметров размера и формы во времени может продемонстрировать поглощение оксида ниобия микроводорослями в присутствии Nb-MXenes.
Более того, MXены могут окисляться в присутствии водорослей. Далай и др.75 наблюдали, что морфология зеленых водорослей, подвергнутых воздействию наночастиц TiO2 и Al2O376, была неоднородной. Хотя наши наблюдения аналогичны результатам настоящего исследования, они актуальны только для изучения влияния биоремедиации на продукты разложения MXенов в присутствии двумерных наночешуек, а не наночастиц. Поскольку MXены могут разлагаться на оксиды металлов31,32,77,78, разумно предположить, что наши наночешуйки Nb также могут образовывать оксиды Nb после взаимодействия с клетками микроводорослей.
Для объяснения восстановления двумерных наночешуек Nb посредством механизма разложения, основанного на процессе окисления, мы провели исследования с использованием просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (HRTEM) (рис. 7a,b) и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) (рис. 7). 7c-i и таблицы S4-5). Оба подхода подходят для изучения окисления двумерных материалов и дополняют друг друга. HRTEM позволяет анализировать деградацию двумерных слоистых структур и последующее появление наночастиц оксидов металлов, в то время как XPS чувствительна к поверхностным связям. С этой целью мы исследовали двумерные наночешуйки Nb-MXene, извлеченные из дисперсий клеток микроводорослей, то есть их форму после взаимодействия с клетками микроводорослей (см. рис. 7).
Изображения HRTEM, демонстрирующие морфологию окисленных (a) SL Nb2CTx и (b) SL Nb4C3Tx MXenes, результаты анализа XPS, показывающие (c) состав оксидных продуктов после восстановления, (d–f) совпадение пиков компонентов спектров XPS SL Nb2CTx и (g–i) Nb4C3Tx SL, восстановленного с помощью зеленых микроводорослей.
Исследования методом HRTEM подтвердили окисление двух типов наночешуек Nb-MXene. Хотя наночешуйки в некоторой степени сохранили свою двумерную морфологию, окисление привело к появлению множества наночастиц, покрывающих поверхность наночешуек MXene (см. рис. 7a,b). Анализ XPS сигналов c Nb 3d и O 1s показал, что в обоих случаях образовались оксиды Nb. Как показано на рисунке 7c, двумерные MXene Nb2CTx и Nb4C3TX имеют сигналы Nb 3d, указывающие на присутствие оксидов NbO и Nb2O5, в то время как сигналы O 1s указывают на количество связей O–Nb, связанных с функционализацией поверхности двумерных наночешуек. Мы заметили, что вклад оксида Nb является доминирующим по сравнению с Nb-C и Nb3+-O.
На рисунках 7g–i показаны спектры XPS Nb 3d, C 1s и O 1s SL Nb2CTx (см. рис. 7d–f) и SL Nb4C3TX MXene, выделенного из клеток микроводорослей. Подробные параметры пиков Nb-MXene приведены в таблицах S4–5 соответственно. Сначала мы проанализировали состав Nb 3d. В отличие от Nb, поглощенного клетками микроводорослей, в MXene, выделенном из клеток микроводорослей, помимо Nb2O5, были обнаружены и другие компоненты. В образце Nb2CTx SL мы наблюдали вклад Nb3+-O в количестве 15%, в то время как остальная часть спектра Nb 3d была представлена ​​преимущественно Nb2O5 (85%). Кроме того, образец SL Nb4C3TX содержит компоненты Nb-C (9%) и Nb2O5 (91%). Здесь Nb-C происходит из двух внутренних атомных слоев карбида металла в Nb4C3Tx SR. Затем мы сопоставляем спектры C 1s с четырьмя различными компонентами, как и в образцах, подвергнутых интернализации. Как и ожидалось, в спектре C 1s преобладает графитовый углерод, за которым следуют вклады органических частиц (CHx/CO и C=O) из клеток микроводорослей. Кроме того, в спектре O 1s мы наблюдали вклад органических форм клеток микроводорослей, оксида ниобия и адсорбированной воды.
Кроме того, мы исследовали, связано ли расщепление Nb-MXenes с присутствием активных форм кислорода (АФК) в питательной среде и/или клетках микроводорослей. Для этого мы оценили уровни синглетного кислорода (¹O₂) в культуральной среде и внутриклеточного глутатиона, тиола, который действует как антиоксидант в микроводорослях. Результаты представлены в дополнительных материалах (рисунки S20 и S21). Культуры с SL Nb2CTx и Nb4C3TX MXenes характеризовались сниженным количеством ¹O₂ (см. рисунок S20). В случае SL Nb2CTx содержание ¹O₂ в MXene снижается примерно до 83%. В культурах микроводорослей с использованием SL содержание ¹O₂ в Nb4C3TX снижается еще больше, до 73%. Интересно, что изменения в ¹O₂ демонстрируют ту же тенденцию, что и ранее наблюдавшийся ингибирующе-стимулирующий эффект (см. рис. 3). Можно утверждать, что инкубация при ярком свете может изменять фотоокисление. Однако результаты контрольного анализа показали практически постоянный уровень 1O2 на протяжении всего эксперимента (рис. S22). В случае внутриклеточных уровней АФК мы также наблюдали ту же тенденцию к снижению (см. рис. S21). Первоначально уровни АФК в клетках микроводорослей, культивируемых в присутствии Nb2CTx и Nb4C3Tx SL, превышали уровни, обнаруженные в чистых культурах микроводорослей. Однако со временем оказалось, что микроводоросли адаптировались к присутствию обоих Nb-MXene, поскольку уровни АФК снизились до 85% и 91% от уровней, измеренных в чистых культурах микроводорослей, инокулированных SL Nb2CTx и Nb4C3TX, соответственно. Это может указывать на то, что микроводоросли со временем чувствуют себя более комфортно в присутствии Nb-MXene, чем в одной только питательной среде.
Микроводоросли представляют собой разнообразную группу фотосинтезирующих организмов. В процессе фотосинтеза они превращают атмосферный углекислый газ (CO2) в органический углерод. Продуктами фотосинтеза являются глюкоза и кислород79. Мы предполагаем, что образующийся таким образом кислород играет решающую роль в окислении Nb-MXene. Одно из возможных объяснений этого заключается в том, что параметр дифференциальной аэрации формируется при низком и высоком парциальном давлении кислорода вне и внутри наночастиц Nb-MXene. Это означает, что везде, где есть области с различным парциальным давлением кислорода, область с самым низким уровнем будет образовывать анод80, 81, 82. Здесь микроводоросли способствуют созданию клеток с дифференциальной аэрацией на поверхности хлопьев MXene, которые производят кислород благодаря своим фотосинтетическим свойствам. В результате образуются продукты биокоррозии (в данном случае, оксиды ниобия). Другой аспект заключается в том, что микроводоросли могут производить органические кислоты, которые выделяются в воду83,84. Таким образом, формируется агрессивная среда, что приводит к изменению свойств Nb-MXenes. Кроме того, микроводоросли могут изменять pH среды на щелочной за счет поглощения углекислого газа, что также может вызывать коррозию79.
Что еще более важно, используемый в нашем исследовании фотопериод «темнота/свет» имеет решающее значение для понимания полученных результатов. Этот аспект подробно описан в работе Джемаи-Зоглаче и др. 85 Они намеренно использовали 12-часовой фотопериод для демонстрации биокоррозии, связанной с биообрастанием, вызываемым красными микроводорослями Porphyridium purpureum. Они показали, что фотопериод связан с изменением потенциала без биокоррозии, проявляющимся в виде псевдопериодических колебаний около 24:00. Эти наблюдения были подтверждены Даулингом и др. 86 Они продемонстрировали фотосинтетические биопленки цианобактерий Anabaena. Растворенный кислород образуется под действием света, что связано с изменением или колебаниями свободного потенциала биокоррозии. Важность фотопериода подчеркивается тем фактом, что свободный потенциал биокоррозии увеличивается в светлой фазе и уменьшается в темной фазе. Это происходит из-за кислорода, вырабатываемого фотосинтезирующими микроводорослями, который влияет на катодную реакцию посредством парциального давления, создаваемого вблизи электродов87.
Кроме того, для выяснения изменений в химическом составе клеток микроводорослей после взаимодействия с Nb-MXenes была проведена инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR). Полученные результаты сложны и представлены в дополнительных материалах (рисунки S23-S25, включая результаты для стадии MAX и ML MXenes). Вкратце, полученные эталонные спектры микроводорослей предоставляют нам важную информацию о химических характеристиках этих организмов. Наиболее вероятные колебания расположены на частотах 1060 см⁻¹ (CO), 1540 см⁻¹, 1640 см⁻¹ (C=C), 1730 см⁻¹ (C=O), 2850 см⁻¹, 2920 см⁻¹ (C–H) и 3280 см⁻¹ (O–H). Для SL Nb-MXenes мы обнаружили характерный сигнал растяжения связи CH, который согласуется с нашим предыдущим исследованием38. Однако мы заметили, что некоторые дополнительные пики, связанные со связями C=C и CH, исчезли. Это указывает на то, что химический состав микроводорослей может претерпевать незначительные изменения из-за взаимодействия с SL Nb-MXenes.
При рассмотрении возможных изменений в биохимии микроводорослей необходимо пересмотреть накопление неорганических оксидов, таких как оксид ниобия59. Он участвует в поглощении металлов клеточной поверхностью, их транспорте в цитоплазму, их связывании с внутриклеточными карбоксильными группами и их накоплении в полифосфосомах микроводорослей20,88,89,90. Кроме того, связь между микроводорослями и металлами поддерживается функциональными группами клеток. По этой причине поглощение также зависит от химического состава поверхности микроводорослей, который довольно сложен9,91. В целом, как и ожидалось, химический состав зеленых микроводорослей незначительно изменился из-за поглощения оксида ниобия.
Интересно, что наблюдаемое первоначальное подавление роста микроводорослей со временем оказалось обратимым. Как мы заметили, микроводоросли преодолели первоначальное изменение окружающей среды и в конечном итоге вернулись к нормальным темпам роста и даже увеличились в размерах. Исследования дзета-потенциала показывают высокую стабильность при введении в питательную среду. Таким образом, поверхностное взаимодействие между клетками микроводорослей и наночастицами Nb-MXene сохранялось на протяжении всех экспериментов по восстановлению. В нашем дальнейшем анализе мы обобщим основные механизмы действия, лежащие в основе этого замечательного поведения микроводорослей.
Наблюдения с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) показали, что микроводоросли склонны прикрепляться к Nb-MXene. Используя динамический анализ изображений, мы подтвердили, что этот эффект приводит к трансформации двумерных наночастиц Nb-MXene в более сферические частицы, тем самым демонстрируя, что разложение наночастиц связано с их окислением. Для проверки нашей гипотезы мы провели ряд материаловедения и биохимических исследований. После тестирования наночастицы постепенно окислялись и разлагались на продукты NbO и Nb2O5, которые не представляли угрозы для зеленых микроводорослей. С помощью ИК-спектроскопии мы не обнаружили существенных изменений в химическом составе микроводорослей, инкубированных в присутствии двумерных наночастиц Nb-MXene. Учитывая возможность поглощения оксида ниобия микроводорослями, мы провели рентгенофлуоресцентный анализ. Эти результаты ясно показывают, что исследуемые микроводоросли питаются оксидами ниобия (NbO и Nb2O5), которые нетоксичны для исследуемых микроводорослей.