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ナノテクノロジーの急速な発展と日常生活への応用は、環境を脅かす可能性がある。有機汚染物質の分解のための環境に優しい方法は確立されているが、無機結晶性汚染物質の回収は、生体変換に対する感受性が低く、材料表面と生物表面との相互作用が理解されていないため、大きな懸念事項となっている。本研究では、Nbベースの無機2D MXeneモデルと単純な形状パラメータ解析法を組み合わせて、緑藻Raphidocelis subcapitataによる2Dセラミックナノ材料のバイオレメディエーションメカニズムを追跡した。その結果、微細藻類は表面関連の物理化学的相互作用によりNbベースのMXeneを分解することがわかった。最初は、単層および多層のMXeneナノフレークが微細藻類の表面に付着し、藻類の成長をある程度抑制した。しかし、表面との相互作用が長引くと、微細藻類はMXeneナノフレークを酸化し、さらにNbOとNb2O5に分解した。これらの酸化物は微細藻類細胞に対して無毒であるため、微細藻類は吸収機構によってNb酸化物ナノ粒子を消費し、72時間の水処理後に微細藻類をさらに回復させます。吸収に関連する栄養素の影響は、細胞体積の増加、滑らかな形状、および成長速度の変化にも反映されます。これらの知見に基づき、淡水生態系におけるNb系MXeneの短期および長期的な存在は、環境への影響はごくわずかであると結論付けます。注目すべきは、モデルシステムとして二次元ナノ材料を使用することで、微細粒材料においても形状変化を追跡できる可能性を示したことです。全体として、本研究は、2Dナノ材料の生物修復機構を駆動する表面相互作用関連プロセスに関する重要な基礎的疑問に答え、無機結晶ナノ材料の環境影響に関するさらなる短期および長期研究の基礎を提供します。
ナノ材料は発見以来大きな注目を集めており、様々なナノテクノロジーが近年近代化段階に入っています1。残念ながら、ナノ材料を日常的な用途に組み込むと、不適切な廃棄、不注意な取り扱い、または不十分な安全インフラにより、偶発的な放出につながる可能性があります。したがって、二次元（2D）ナノ材料を含むナノ材料が自然環境に放出される可能性があり、その挙動や生物学的活性はまだ十分に理解されていないと考えるのは妥当です。そのため、生態毒性の懸念が2Dナノ材料の水系への溶出能力に集中しているのは当然のことです2,3,4,5,6。これらの生態系では、一部の2Dナノ材料は微細藻類を含むさまざまな栄養段階のさまざまな生物と相互作用する可能性があります。
微細藻類は淡水および海洋生態系に自然に存在する原始的な生物であり、光合成によってさまざまな化学物質を生成します7。そのため、水生生態系にとって非常に重要です8,9,10,11,12が、生態毒性の感度が高く、安価で広く使用されている指標でもあります13,14。微細藻類細胞は急速に増殖し、さまざまな化合物の存在に迅速に反応するため、有機物で汚染された水を処理する環境に優しい方法の開発に有望です15,16。
藻類細胞は、生物吸着と蓄積によって水中の無機イオンを除去することができます17,18。クロレラ、アナベナ・インバー、ウェスティエロプシス・プロリフィカ、スティゲオクロニウム・テヌエ、シネココッカス属などの藻類種は、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+などの有毒金属イオンを運搬し、栄養を与えることがわかっています19。他の研究では、Cu2+、Cd2+、Ni2+、Zn2+、Pb2+イオンが細胞形態を変化させ、葉緑体を破壊することによって、Scenedesmusの成長を制限することが示されています20,21。
有機汚染物質の分解と重金属イオンの除去のためのグリーンな方法は、世界中の科学者や技術者の注目を集めています。これは主に、これらの汚染物質が液相で容易に処理できるという事実によるものです。しかし、無機結晶性汚染物質は、水溶性が低く、さまざまな生体変換に対する感受性が低いという特徴があり、修復に大きな困難をもたらし、この分野ではほとんど進歩が見られていません22,23,24,25,26。したがって、ナノ材料の修復のための環境に優しいソリューションの探索は、複雑で未開拓の分野のままです。2Dナノ材料の生体変換効果に関する不確実性が高いため、還元中にそれらの分解の可能な経路を見つける簡単な方法はありません。
この研究では、無機セラミック材料の活性な水性バイオレメディエーション剤として緑色微細藻類を使用し、無機セラミック材料の代表としてMXeneの分解プロセスのin situモニタリングを組み合わせました。 「MXene」という用語は、Mn+1XnTx材料の化学量論を反映しており、Mは初期遷移金属、Xは炭素および/または窒素、Txは表面終端（例：-OH、-F、-Cl）、n = 1、2、3または427.28です。 NaguibらによるMXeneの発見以来、センシング、癌治療、膜ろ過27,29,30。さらに、MXeneは、その優れたコロイド安定性と生物学的相互作用の可能性により、モデル2Dシステムとみなすことができます31,32,33,34,35,36。
したがって、本稿で開発した方法論と研究仮説を図 1 に示す。この仮説によれば、微細藻類は表面関連の物理化学的相互作用により Nb 系 MXene を無毒化合物に分解し、藻類のさらなる回収を可能にする。この仮説を検証するために、初期のニオブ系遷移金属炭化物および/または窒化物 (MXene) ファミリーの 2 つのメンバー、すなわち Nb2CTx と Nb4C3TX を選択した。
緑藻ラフィドセリス・サブカピタタによるMXene回収に関する研究方法論とエビデンスに基づく仮説。これはエビデンスに基づく仮定の概略図にすぎないことにご注意ください。湖の環境は、使用される栄養培地や条件（例えば、日周期や利用可能な必須栄養素の制限）が異なります。BioRender.comで作成。
したがって、MXeneをモデル系として用いることで、他の従来型ナノ材料では観察できない様々な生物学的影響の研究への道が開かれました。特に、微細藻類Raphidocelis subcapitataによるニオブ系MXeneなどの二次元ナノ材料のバイオレメディエーションの可能性を実証しました。微細藻類はNb-MXeneを無毒の酸化物NbOとNb2O5に分解することができ、ニオブの取り込み機構を通じて栄養素も供給します。全体として、この研究は、二次元ナノ材料のバイオレメディエーション機構を支配する表面の物理化学的相互作用に関連するプロセスに関する重要な基礎的疑問に答えるものです。さらに、2Dナノ材料の形状の微妙な変化を追跡するための、形状パラメータに基づくシンプルな手法を開発しています。これは、無機結晶性ナノ材料の様々な環境影響に関する短期および長期の研究をさらに促進するものです。このように、本研究は材料表面と生物材料との相互作用に関する理解を深めるものです。また、淡水生態系への潜在的な影響に関する、より広範な短期および長期の研究の基礎も提供しており、それらの影響は容易に検証できるようになっている。
MXeneは、ユニークで魅力的な物理的および化学的特性を持つ興味深い材料群であり、多くの潜在的な用途があります。これらの特性は、主にその化学量論と表面化学に依存します。したがって、本研究では、これらのナノ材料の異なる生物学的効果が観察される可能性があるため、Nbベースの階層的単層（SL）MXeneの2種類、Nb2CTxとNb4C3TXを調査しました。MXeneは、原子的に薄いMAX相A層を上から選択的にエッチングすることによって、出発材料から製造されます。MAX相は、遷移金属炭化物の「結合」ブロックと、MnAXn-1の化学量論を持つAl、Si、Snなどの「A」元素の薄い層で構成される三元セラミックです。初期MAX相の形態は走査型電子顕微鏡（SEM）で観察され、以前の研究と一致していました（補足情報、SI、図S1を参照）。 48% HF (フッ化水素酸) で Al 層を除去した後、多層 (ML) Nb-MXene が得られました。ML-Nb2CTx と ML-Nb4C3TX の形態を走査型電子顕微鏡 (SEM) (それぞれ図 S1c と S1d) で調べたところ、細長い孔のようなスリットを通過する二次元ナノフレークに似た、典型的な層状 MXene 形態が観察されました。両方の Nb-MXene は、以前に酸エッチングによって合成された MXene 相と多くの共通点があります 27,38。MXene の構造を確認した後、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド (TBAOH) をインターカレーションし、洗浄と超音波処理を行うことで層状にし、その後、単層または低層 (SL) 2D Nb-MXene ナノフレークを得ました。
我々は、高分解能透過型電子顕微鏡（HRTEM）とX線回折（XRD）を用いて、エッチングとさらなる剥離の効率をテストした。逆高速フーリエ変換（IFFT）と高速フーリエ変換（FFT）を用いて処理したHRTEMの結果を、図2に示す。Nb-MXeneナノフレークは、原子層の構造を確認し、面間距離を測定するために、エッジアップに配向した。MXene Nb2CTxおよびNb4C3TXナノフレークのHRTEM画像は、Naguibら27およびJastrzębskaら38によって以前に報告されたように、原子的に薄い層状構造であることを明らかにした（図2a1、a2参照）。隣接する2つのNb2CTxおよびNb4C3Tx単層について、層間距離をそれぞれ0.74 nmおよび1.54 nmと決定した（図2b1、b2）。これは、我々の以前の結果38とも一致する。これは、Nb2CTx と Nb4C3Tx の単層間の距離を示す逆高速フーリエ変換 (図 2c1、c2) および高速フーリエ変換 (図 2d1、d2) によってさらに確認されました。この画像には、ニオブ原子と炭素原子に対応する明暗のバンドが交互に現れており、研究対象の MXene が層状構造であることを示しています。Nb2CTx と Nb4C3Tx について得られたエネルギー分散型 X 線分光法 (EDX) スペクトル (図 S2a および S2b) には、Al ピークが検出されなかったため、元の MAX 相の痕跡は見られなかったことに注意することが重要です。
SL Nb2CTx および Nb4C3Tx MXene ナノフレークの特性評価には、(a) 高分解能電子顕微鏡 (HRTEM) による側面からの 2D ナノフレーク画像と、それに対応する (b) 強度モード、(c) 逆高速フーリエ変換 (IFFT)、(d) 高速フーリエ変換 (FFT)、(e) Nb-MXene の X 線パターンが含まれます。SL 2D Nb2CTx の場合、番号は (a1、b1、c1、d1、e1) で表されます。SL 2D Nb4C3Tx の場合、番号は (a2、b2、c2、d2、e1) で表されます。
SL Nb2CTx および Nb4C3Tx MXene の X 線回折測定結果をそれぞれ図 2e1 および e2 に示す。4.31 および 4.32 のピーク (002) は、それぞれ以前に説明した層状 MXene Nb2CTx および Nb4C3TX38,39,40,41 に対応する。XRD の結果は、残留 ML 構造および MAX 相の存在も示しているが、主に SL Nb4C3Tx に関連する XRD パターン (図 2e2) を示している。MAX 相のより小さな粒子の存在が、ランダムに積層された Nb4C3Tx 層と比較して MAX ピークが強い理由を説明できる可能性がある。
さらなる研究は、R. subcapitata 種に属する緑色微細藻類に焦点を当てています。微細藻類を選んだのは、主要な食物網に関与する重要な生産者であるためです42。また、食物連鎖の上位レベルに運ばれる有毒物質を除去する能力があるため、毒性の最良の指標の 1 つでもあります43。さらに、R. subcapitata の研究は、一般的な淡水微生物に対する SL Nb-MXene の偶発的な毒性を明らかにする可能性があります。これを説明するために、研究者らは、各微生物が環境中に存在する有毒化合物に対して異なる感受性を持っているという仮説を立てました。ほとんどの生物にとって、低濃度の物質は成長に影響を与えませんが、ある限界を超える濃度は成長を阻害したり、死に至らしめたりする可能性があります。したがって、微細藻類と MXene の表面相互作用とそれに伴う回復の研究のために、Nb-MXene の無害濃度と有毒濃度をテストすることにしました。このため、0（参照として）、0.01、0.1、10 mg l-1 の MXene 濃度をテストし、さらに、極めて高濃度の MXene（100 mg l-1 MXene）で微細藻類を感染させました。これは、あらゆる生物学的環境にとって極端で致命的になる可能性があります。
SL Nb-MXenes の微細藻類への影響を図 3 に示します。これは、0 mg l-1 サンプルで測定された成長促進 (+) または阻害 (-) の割合として表されます。比較のために、Nb-MAX 相と ML Nb-MXenes もテストされ、結果は SI (図 S3 を参照) に示されています。得られた結果は、図 3a、b に示すように、SL Nb-MXenes が 0.01 ～ 10 mg/l の低濃度範囲でほぼ完全に毒性がないことを確認しました。Nb2CTx の場合、指定された範囲で 5% を超える生態毒性は観察されませんでした。
SL (a) Nb2CTx および (b) Nb4C3TX MXene の存在下における微細藻類の成長促進 (+) または阻害 (-)。MXene と微細藻類の相互作用を 24 時間、48 時間、72 時間にわたって分析した。 有意なデータ（t検定、p < 0.05）にはアスタリスク（*）が付いています。 有意なデータ（t検定、p < 0.05）にはアスタリスク（*）が付いています。 Значимые данные (t-критерий, p < 0,05) отмечены звездочкой (*)。 有意なデータ（t検定、p < 0.05）にはアスタリスク（*）が付いています。重要なデータ（t 検査、p < 0.05）には星号 (*) が付けられています。重要なデータ（t 検査、p < 0.05）には星号 (*) が付けられています。 Важные данные (t 検定、p < 0,05) отмечены звездочкой (*)。 重要なデータ（t検定、p < 0.05）にはアスタリスク（*）が付いています。赤い矢印は、抑制刺激の消失を示しています。
一方、低濃度のNb4C3TXはわずかに毒性が高かったが、7%を超えることはなかった。予想通り、MXeneは100mg L-1でより高い毒性と微細藻類の増殖阻害を示した。興味深いことに、どの材料も、MAXまたはMLサンプルと比較して、無毒性/毒性効果の同じ傾向と時間依存性を示さなかった（詳細はSIを参照）。MAX相（図S3を参照）では毒性が約15～25%に達し、時間とともに増加したが、SL Nb2CTxおよびNb4C3TX MXeneでは逆の傾向が観察された。微細藻類の増殖阻害は時間とともに減少した。24時間後には約17%に達し、72時間後には5%未満に低下した（それぞれ図3a、b）。
さらに重要なことに、SL Nb4C3TX の場合、微細藻類の成長阻害は 24 時間後に約 27% に達しましたが、72 時間後には約 1% に減少しました。したがって、観察された効果を刺激の逆阻害と名付け、SL Nb4C3TX MXene ではその効果がより強くなりました。微細藻類の成長促進は、SL Nb2CTx MXene と比較して、Nb4C3TX (10 mg L-1 で 24 時間相互作用) でより早く観察されました。阻害-刺激の逆転効果は、バイオマス倍増速度曲線でもよく示されました (詳細は図 S4 を参照)。これまでのところ、さまざまな方法で研究されているのは Ti3C2TX MXene の生態毒性のみです。ゼブラフィッシュ胚には毒性はありませんが、微細藻類 Desmodesmus quadricauda と Sorghum saccharatum 植物には中程度の生態毒性があります。その他の具体的な影響の例としては、正常細胞株よりも癌細胞株に対する毒性が高いことが挙げられる46,47。試験条件がNb-MXeneの存在下で観察される微細藻類の成長の変化に影響を与えると考えられる。例えば、葉緑体ストロマのpHが約8は、RuBisCO酵素の効率的な動作に最適である。したがって、pHの変化は光合成速度に悪影響を及ぼす48,49。しかし、実験中にpHの有意な変化は観察されなかった（詳細はSI、図S5を参照）。一般的に、Nb-MXeneを含む微細藻類の培養では、時間の経過とともに溶液のpHがわずかに低下した。しかし、この低下は純粋な培地のpHの変化と同様であった。さらに、検出された変動の範囲は、微細藻類の純粋培養（対照サンプル）で測定されたものと同様であった。したがって、光合成は時間の経過に伴うpHの変化の影響を受けないと結論付けられる。
さらに、合成された MXene には表面末端 (Tx と表記) があります。これらは主に官能基 -O、-F、-OH です。ただし、表面化学は合成方法に直接関係しています。これらの基は表面にランダムに分布していることが知られており、MXene の特性への影響を予測することは困難です 50。Tx は光によるニオブの酸化の触媒力である可能性があると主張できます。表面官能基は、その下にある光触媒がヘテロ接合を形成するための複数のアンカーサイトを提供します 51。ただし、成長媒体の組成は効果的な光触媒を提供しませんでした (詳細な媒体組成は SI 表 S6 に記載されています)。さらに、MXene の生物学的活性は、層の後処理、酸化、有機および無機化合物の化学的表面修飾 52,53,54,55,56 または表面電荷エンジニアリング 38 によって変化する可能性があるため、あらゆる表面修飾も非常に重要です。したがって、ニオブ酸化物が培地中の材料の不安定性と関係があるかどうかを検証するために、微細藻類培養培地および脱イオン水（比較用）中のゼータ（ζ）電位の研究を実施しました。我々の結果は、SL Nb-MXeneがかなり安定していることを示しています（MAXおよびMLの結果については、SI図S6を参照）。SL MXeneのゼータ電位は約-10 mVです。SR Nb2CTxの場合、ζの値はNb4C3Txの値よりもやや負の値になります。このようなζ値の変化は、負に帯電したMXeneナノフレークの表面が培養培地から正に帯電したイオンを吸収することを示している可能性があります。培養培地中のNb-MXeneのゼータ電位と導電率の時間的測定（詳細については、SIの図S7およびS8を参照）は、我々の仮説を裏付けているようです。
しかし、両方の Nb-MXene SL はゼロからの変化が最小限でした。これは、微細藻類の培養培地での安定性を明確に示しています。さらに、緑色の微細藻類の存在が培地中の Nb-MXene の安定性に影響を与えるかどうかを評価しました。栄養培地および培養中の微細藻類との相互作用後の MXene のゼータ電位と導電率の結果は、SI (図 S9 および S10) に記載されています。興味深いことに、微細藻類の存在は両方の MXene の分散を安定化させるようであることがわかりました。Nb2CTx SL の場合、ゼータ電位は時間の経過とともにわずかに低下し、より負の値になりました (72 時間培養後、-15.8 mV 対 -19.1 mV)。 SL Nb4C3TXのゼータ電位はわずかに上昇したが、72時間後も微細藻類が存在しないナノフレークよりも高い安定性を示した（-18.1mV対-9.1mV）。
また、微細藻類の存在下で培養したNb-MXene溶液の導電率が低いことも分かりました。これは、栄養培地中のイオン量が少ないことを示しています。特に、水中でのMXeneの不安定性は主に表面酸化によるものです⁵⁷。したがって、緑色の微細藻類がNb-MXeneの表面に形成された酸化物を何らかの方法で除去し、さらには酸化物の発生（MXeneの酸化）を防いだのではないかと推測されます。これは、微細藻類が吸収する物質の種類を調べることで確認できます。
我々の生態毒性学的研究では、微細藻類が時間の経過とともにNb-MXeneの毒性と刺激成長の異常な阻害を克服できることが示されましたが、我々の研究の目的は、考えられる作用機序を調査することでした。藻類などの生物が、その生態系に馴染みのない化合物や物質に曝されると、さまざまな方法で反応する可能性があります58,59。有毒な金属酸化物がない場合、微細藻類は自ら栄養を摂取し、継続的に成長することができます60。有毒物質を摂取した後、形状や形態の変化などの防御機構が活性化される可能性があります。吸収の可能性も考慮する必要があります58,59。特に、防御機構の兆候は、試験化合物の毒性の明確な指標となります。したがって、我々のその後の研究では、SEMによるSL Nb-MXeneナノフレークと微細藻類との間の潜在的な表面相互作用と、X線蛍光分光法（XRF）によるNbベースのMXeneの吸収の可能性を調査しました。なお、活性毒性の問題に対処するため、SEMおよびXRF分析はMXeneの最高濃度でのみ実施されました。
SEMの結果を図4に示す。未処理の微細藻類細胞（図4a、参照サンプル参照）は、典型的なR. subcapitataの形態とクロワッサン状の細胞形状を明確に示していた。細胞は扁平で、やや不規則な形状をしていた。一部の微細藻類細胞は互いに重なり合って絡み合っていたが、これはおそらくサンプル調製過程によるものと考えられる。一般的に、純粋な微細藻類細胞は表面が滑らかで、形態変化は見られなかった。
極めて高濃度（100 mg L-1）で72時間相互作用させた後の、緑藻とMXeneナノシート間の表面相互作用を示すSEM画像。（a）SL、（b）Nb2CTx、および（c）Nb4C3TX MXeneと相互作用させた後の未処理の緑藻。Nb-MXeneナノフレークは赤い矢印で示されていることに注意してください。比較のために、光学顕微鏡で撮影した写真も追加されています。
対照的に、SL Nb-MXene ナノフレークに吸着した微細藻類細胞は損傷を受けた (図 4b、c、赤い矢印を参照)。Nb2CTx MXene の場合 (図 4b)、微細藻類は付着した二次元ナノスケールとともに成長する傾向があり、形態が変化する可能性がある。注目すべきことに、我々はこれらの変化を光学顕微鏡でも観察した (詳細は SI 図 S11 を参照)。この形態変化は、微細藻類の生理機能と、細胞体積の増加などの細胞形態の変化によって自身を守る能力に妥当な根拠がある 61。したがって、実際に Nb-MXene と接触している微細藻類細胞の数を確認することが重要である。SEM 研究では、微細藻類細胞の約 52% が Nb-MXene に曝露され、これらの微細藻類細胞の 48% が接触を避けていることが示された。 SL Nb4C3Tx MXeneの場合、微細藻類はMXeneとの接触を避けようとし、それによって2次元ナノスケールで局所的に増殖します（図4c）。しかし、ナノスケールが微細藻類細胞に侵入して損傷を与える様子は観察されませんでした。
自己保存は、細胞表面への粒子の吸着と、いわゆる遮光（シェーディング）効果62による光合成の阻害に対する時間依存的な応答行動でもある。微細藻類と光源の間にある各物体（例えば、Nb-MXeneナノフレーク）が葉緑体による光吸収量を制限することは明らかである。しかし、これが得られた結果に大きな影響を与えることは疑いない。顕微鏡観察で示されたように、微細藻類細胞がNb-MXeneと接触している場合でも、2Dナノフレークは微細藻類の表面を完全に覆ったり付着したりしていなかった。代わりに、ナノフレークは微細藻類細胞の表面を覆うことなく細胞に向かって配向していた。このようなナノフレーク/微細藻類の組み合わせでは、微細藻類細胞による光吸収量を大幅に制限することはできない。さらに、いくつかの研究では、二次元ナノ材料の存在下で光合成生物による光吸収が改善されることも実証されています63,64,65,66。
SEM画像では微細藻類細胞によるニオブの取り込みを直接確認できなかったため、この問題を明らかにするために、X線蛍光分析（XRF）とX線光電子分光法（XPS）による分析を行った。そこで、MXeneと相互作用していない参照微細藻類サンプル、微細藻類細胞の表面から剥離したMXeneナノフレーク、および付着したMXeneを除去した後の微細藻類細胞のNbピークの強度を比較した。Nbの取り込みがない場合、付着したナノスケールを除去した後の微細藻類細胞から得られるNb値はゼロになるはずであることに留意すべきである。したがって、Nbの取り込みが起こる場合は、XRFとXPSの両方の結果に明確なNbピークが現れるはずである。
XRFスペクトルの場合、微細藻類サンプルはSL Nb2CTxおよびNb4C3Tx MXeneとの相互作用後、SL Nb2CTxおよびNb4C3Tx MXeneのNbピークを示しました（図5aを参照。また、MAXおよびML MXeneの結果はSI、図S12～C17に示されていることに注意してください）。興味深いことに、Nbピークの強度はどちらの場合も同じです（図5aの赤い棒）。これは、Nb4C3Tx MXeneが2倍多く微細藻類細胞に付着しているにもかかわらず（図5aの青い棒）、藻類はそれ以上Nbを吸収できず、細胞内でNb蓄積の最大容量に達したことを示しています。注目すべきは、微細藻類の金属吸収能力は環境中の金属酸化物の濃度に依存することです67,68。 Shamshadaら67は、淡水藻類の吸収能力はpHの上昇とともに低下することを発見した。Raizeら68は、海藻の金属吸収能力はPb2+の方がNi2+よりも約25%高いことを指摘した。
(a) SL Nb-MXene の極高濃度 (100 mg L-1) で 72 時間培養した緑色微細藻類細胞による基礎 Nb 取り込みの XRF 結果。結果は、純粋な微細藻類細胞 (コントロール サンプル、灰色の棒グラフ)、表面微細藻類細胞から分離された 2D ナノフレーク (青色の棒グラフ)、および表面から 2D ナノフレークを分離した後の微細藻類細胞 (赤色の棒グラフ) に α が存在することを示しています。元素 Nb の量、(b) SL Nb-MXene との培養後に微細藻類細胞中に存在する微細藻類有機成分 (C=O および CHx/C–O) と Nb 酸化物の化学組成の割合、(c–e) XPS SL Nb2CTx スペクトルの組成ピークのフィッティング、および (fh) 微細藻類細胞に取り込まれた SL Nb4C3Tx MXene。
したがって、Nb は酸化物の形で藻類細胞に吸収されると予想しました。これを検証するために、MXene Nb2CTx および Nb4C3TX と藻類細胞について XPS 研究を実施しました。微細藻類と Nb-MXene および藻類細胞から分離された MXene との相互作用の結果を図 5b に示します。予想どおり、微細藻類の表面から MXene を除去した後、微細藻類サンプルで Nb 3d ピークが検出されました。C=O、CHx/CO、および Nb 酸化物の定量的決定は、Nb2CTx SL (図 5c–e) および Nb4C3Tx SL (図 5c–e) で得られた Nb 3d、O 1s、および C 1s スペクトルに基づいて計算されました。) 培養した微細藻類から得られた。図 5f–h) MXene。表S1-3は、フィッティングによって得られたピークパラメータの詳細と全体の化学組成を示しています。Nb2CTx SLとNb4C3Tx SLのNb 3d領域（図5c、f）は、1つのNb2O5成分に対応していることに注目に値します。ここで、スペクトルにはMXene関連のピークは見られず、微細藻類細胞はNbの酸化物形態のみを吸収していることを示しています。さらに、C 1sスペクトルをC–C、CHx/C–O、C=O、および–COOH成分で近似しました。CHx/C–OおよびC=Oピークは、微細藻類細胞の有機成分に帰属しました。これらの有機成分は、Nb2CTx SLとNb4C3TX SLのC 1sピークのそれぞれ36%と41%を占めています。次に、SL Nb2CTxとSL Nb4C3TXのO 1sスペクトルをNb2O5、微細藻類の有機成分（CHx/CO）、および表面に吸着した水でフィッティングした。
最後に、XPSの結果は、Nbの存在だけでなく、その形態を明確に示しました。Nb 3d信号の位置とデコンボリューションの結果から、NbはイオンやMXene自体ではなく、酸化物の形でのみ吸収されていることが確認されました。さらに、XPSの結果は、微細藻類細胞がSL Nb2CTxからNb酸化物を取り込む能力が、SL Nb4C3TX MXeneから取り込む能力よりも高いことを示しました。
ニオブの取り込み結果は印象的で、MXeneの分解を特定できるものの、2Dナノフレークにおける関連する形態変化を追跡する方法は存在しません。そこで、2D Nb-MXeneナノフレークと微細藻類細胞で発生するあらゆる変化に直接対応できる適切な方法を開発することにしました。相互作用する物質が何らかの変換、分解、または断片化を受けた場合、等価円形領域の直径、真円度、フェレット幅、フェレット長などの形状パラメータの変化として速やかに現れると想定していることに注意することが重要です。これらのパラメータは細長い粒子や2次元ナノフレークを記述するのに適しているため、動的粒子形状解析によるこれらのパラメータの追跡は、還元中のSL Nb-MXeneナノフレークの形態変化に関する貴重な情報を提供します。
得られた結果を図 6 に示します。比較のために、元の MAX 相と ML-MXene もテストしました (SI 図 S18 および S19 を参照)。粒子形状の動的解析により、2 つの Nb-MXene SL のすべての形状パラメータが微細藻類との相互作用後に大きく変化したことが示されました。等価円形面積直径パラメータ (図 6a、b) で示されているように、大きなナノフレークの割合のピーク強度の減少は、それらがより小さな断片に崩壊する傾向があることを示しています。図 6c、d では、フレークの横方向のサイズ (ナノフレークの伸長) に関連するピークの減少が示されており、2D ナノフレークがより粒子のような形状に変化していることを示しています。図 6e-h は、それぞれフェレットの幅と長さを示しています。フェレットの幅と長さは相補的なパラメータであるため、一緒に考慮する必要があります。微細藻類の存在下で 2D Nb-MXene ナノフレークをインキュベートした後、フェレット相関ピークがシフトし、強度が減少しました。これらの結果を形態、XRF、XPSと組み合わせることで、観察された変化は酸化と強く関連しており、酸化されたMXeneはよりしわが寄り、断片や球状の酸化物粒子に分解されると結論付けました69,70。
緑色微細藻類との相互作用後のMXeneの変化の分析。動的粒子形状分析では、(a、b)等価円形領域の直径、(c、d)真円度、(e、f)フェレット幅、(g、h)フェレット長などのパラメータを考慮します。この目的のために、2つの参照微細藻類サンプルを、一次SL Nb2CTxおよびSL Nb4C3Tx MXene、SL Nb2CTxおよびSL Nb4C3Tx MXene、分解微細藻類、および処理済み微細藻類SL Nb2CTxおよびSL Nb4C3Tx MXeneとともに分析しました。赤い矢印は、研究対象の2次元ナノフレークの形状パラメータの遷移を示しています。
形状パラメータ解析は非常に信頼性が高いため、微細藻類細胞の形態変化も明らかにすることができます。そこで、純粋な微細藻類細胞と2D Nbナノフレークとの相互作用後の細胞の等価円形面積直径、真円度、フェレット幅/長さを分析しました。図6a～hは、ピーク強度の低下と最大値の高値へのシフトによって示されるように、藻類細胞の形状パラメータの変化を示しています。特に、細胞の真円度パラメータは、細長い細胞では減少し、球形細胞では増加しました（図6a、b）。さらに、SL Nb2CTx MXeneとの相互作用後（図6e）のフェレット細胞幅は、SL Nb4C3TX MXene（図6f）と比較して数マイクロメートル増加しました。これは、Nb2CTx SRとの相互作用時に微細藻類がNb酸化物を強く取り込んだためではないかと推測されます。Nbフレークの表面への付着が緩やかになることで、遮光効果が最小限に抑えられた細胞の成長が可能になります。
微細藻類の形状とサイズのパラメータの変化に関する我々の観察は、他の研究を補完するものである。緑色微細藻類は、細胞のサイズ、形状、または代謝を変化させることによって、環境ストレスに応じて形態を変化させることができる61。たとえば、細胞のサイズの変化は栄養素の吸収を促進する71。藻類の細胞が小さいほど、栄養素の取り込みが少なくなり、成長速度が低下する。逆に、細胞が大きいほど、より多くの栄養素を消費し、それが細胞内に蓄積される傾向がある72,73。MachadoとSoaresは、殺菌剤トリクロサンが細胞サイズを増加させることを発見した。彼らはまた、藻類の形状に大きな変化があることも発見した74。さらに、Yinら9も、還元型酸化グラフェンナノコンポジットに曝露された後の藻類の形態変化を明らかにした。したがって、微細藻類のサイズ/形状パラメータの変化は、MXeneの存在によって引き起こされていることは明らかである。サイズと形状の変化は栄養素の取り込みの変化を示しているため、時間経過に伴うサイズと形状のパラメータの分析によって、Nb-MXeneの存在下での微細藻類による酸化ニオブの取り込みを実証できると考えています。
さらに、MXeneは藻類の存在下で酸化される可能性がある。Dalaiら75は、ナノTiO2とAl2O376に曝露された緑藻の形態が均一ではないことを観察した。我々の観察は本研究と類似しているが、2Dナノフレークの存在下でのMXene分解生成物の観点からのバイオレメディエーションの影響の研究にのみ関連しており、ナノ粒子には関連していない。MXeneは金属酸化物に分解する可能性があるため、31,32,77,78 我々のNbナノフレークも微細藻類細胞と相互作用した後、Nb酸化物を形成できると考えるのは妥当である。
酸化プロセスに基づく分解メカニズムによる 2D-Nb ナノフレークの還元を説明するために、高分解能透過型電子顕微鏡 (HRTEM) (図 7a、b) および X 線光電子分光法 (XPS) (図 7c-i および表 S4-5) を用いた研究を実施しました。どちらのアプローチも 2D 材料の酸化の研究に適しており、互いに補完し合います。HRTEM は、2 次元層状構造の劣化とそれに続く金属酸化物ナノ粒子の出現を分析できますが、XPS は表面結合に敏感です。この目的のために、微細藻類細胞分散液から抽出した 2D Nb-MXene ナノフレーク、つまり微細藻類細胞との相互作用後の形状をテストしました (図 7 を参照)。
酸化された(a) SL Nb2CTxおよび(b) SL Nb4C3Tx MXeneの形態を示すHRTEM画像、還元後の酸化物生成物の組成を示すXPS分析結果(c)、緑色微細藻類で修復されたSL Nb2CTxおよび(g–i) Nb4C3Tx SLのXPSスペクトルの成分のピークマッチング。
HRTEM研究により、2種類のNb-MXeneナノフレークの酸化が確認されました。ナノフレークはある程度2次元形態を保持していましたが、酸化によりMXeneナノフレークの表面を覆う多数のナノ粒子が現れました（図7a、b参照）。Nb 3dおよびO 1s信号のXPS分析により、どちらの場合もNb酸化物が形成されていることが示されました。図7cに示すように、2D MXene Nb2CTxおよびNb4C3TXはNb 3d信号を示し、NbOおよびNb2O5酸化物の存在を示していますが、O 1s信号は2Dナノフレーク表面の機能化に関連するO-Nb結合の数を示しています。Nb酸化物の寄与はNb-CおよびNb3+-Oと比較して支配的であることがわかりました。
図7g～iには、微細藻類細胞から分離されたSL Nb2CTx（図7d～f参照）およびSL Nb4C3TX MXeneのNb 3d、C 1s、およびO 1sのXPSスペクトルが示されています。Nb-MXeneのピークパラメータの詳細は、それぞれ表S4～5に記載されています。まず、Nb 3dの組成を分析しました。微細藻類細胞に吸収されたNbとは対照的に、微細藻類細胞から分離されたMXeneでは、Nb2O5の他に他の成分が見つかりました。Nb2CTx SLでは、Nb3+-Oの寄与が15%であることが観察され、Nb 3dスペクトルの残りはNb2O5（85%）が支配的でした。さらに、SL Nb4C3TXサンプルには、Nb-C（9%）とNb2O5（91%）の成分が含まれています。ここでNb-Cは、Nb4C3Tx SR中の金属炭化物の2つの内側原子層に由来します。次に、内部サンプルで行ったように、C 1sスペクトルを4つの異なる成分にマッピングします。予想どおり、C 1sスペクトルはグラファイト炭素が支配的で、続いて微細藻類細胞由来の有機粒子（CHx/COおよびC=O）の寄与が見られます。さらに、O 1sスペクトルでは、微細藻類細胞の有機形態、酸化ニオブ、および吸着水の寄与が観察されました。
さらに、Nb-MXeneの切断が、栄養培地および/または微細藻類細胞中の活性酸素種（ROS）の存在と関連しているかどうかを調査しました。この目的のために、培養培地中の一重項酸素（1O2）と、微細藻類で抗酸化物質として作用するチオールである細胞内グルタチオンのレベルを評価しました。結果はSI（図S20およびS21）に示されています。SL Nb2CTxおよびNb4C3TX MXeneを使用した培養では、1O2の量が減少していることが特徴でした（図S20を参照）。SL Nb2CTxの場合、MXene 1O2は約83%に減少しました。SLを使用した微細藻類培養では、Nb4C3TX 1O2はさらに減少し、73%になりました。興味深いことに、1O2の変化は、以前に観察された阻害-促進効果と同じ傾向を示しました（図3を参照）。明るい光での培養は光酸化を変化させる可能性があると主張できる。しかし、コントロール分析の結果は、実験中に 1O2 のレベルがほぼ一定であることを示した (図 S22)。細胞内 ROS レベルの場合も、同様の減少傾向が観察された (図 S21 を参照)。当初、Nb2CTx および Nb4C3Tx SL の存在下で培養された微細藻類細胞の ROS レベルは、微細藻類の純粋培養で見られるレベルを超えていた。しかし、最終的には、微細藻類は両方の Nb-MXene の存在に適応したようで、ROS レベルは、SL Nb2CTx および Nb4C3TX を接種した微細藻類の純粋培養で測定されたレベルのそれぞれ 85% および 91% に減少した。これは、微細藻類が栄養培地のみの場合よりも、Nb-MXene の存在下で時間とともに快適になることを示している可能性がある。
微細藻類は多様な光合成生物群です。光合成の過程で、大気中の二酸化炭素（CO2）を有機炭素に変換します。光合成の生成物はグルコースと酸素です79。このようにして生成された酸素がNb-MXeneの酸化に重要な役割を果たしていると考えられます。考えられる説明の一つは、Nb-MXeneナノフレークの外側と内側で酸素分圧が低い場合と高い場合に、差動通気パラメータが形成されることです。つまり、酸素分圧が異なる領域がある場所では、最も低いレベルの領域が陽極を形成します80、81、82。ここで、微細藻類はMXeneフレークの表面に差動通気セルの形成に寄与し、これらのセルは光合成特性により酸素を生成します。その結果、生物腐食生成物（この場合はニオブ酸化物）が形成されます。もう一つの側面は、微細藻類が水中に放出される有機酸を生成できることです83、84。そのため、攻撃的な環境が形成され、Nb-MXenesが変化します。さらに、微細藻類は二酸化炭素を吸収することで環境のpHをアルカリ性に変化させることができ、これも腐食を引き起こす可能性があります79。
さらに重要なことに、本研究で使用した明暗周期は、得られた結果を理解する上で極めて重要です。この点については、Djemai-Zoghlache ら 85 が詳細に説明しています。彼らは、紅藻 Porphyridium purpureum による生物付着に伴う生物腐食を実証するために、意図的に 12 時間/12 時間の光周期を使用しました。彼らは、光周期が生物腐食のない電位の変化と関連しており、24:00 付近で擬似周期振動として現れることを示しています。これらの観察結果は、Dowling ら 86 によって確認されました。彼らは、シアノバクテリア Anabaena の光合成バイオフィルムを実証しました。溶存酸素は光の作用によって生成され、これは自由生物腐食電位の変化または変動と関連しています。生物腐食の自由電位が明期に増加し、暗期に減少するという事実によって、光周期の重要性が強調されます。これは、光合成を行う微細藻類によって生成される酸素が、電極付近で発生する分圧を介して陰極反応に影響を与えるためである87。
さらに、Nb-MXene との相互作用後に微細藻類細胞の化学組成に変化が生じたかどうかを調べるために、フーリエ変換赤外分光法 (FTIR) を実施しました。得られた結果は複雑で、SI (図 S23-S25、MAX ステージと ML MXene の結果を含む) に示します。要するに、得られた微細藻類の参照スペクトルは、これらの生物の化学的特性に関する重要な情報を提供します。これらの最も可能性の高い振動は、1060 cm-1 (CO)、1540 cm-1、1640 cm-1 (C=C)、1730 cm-1 (C=O)、2850 cm-1、2920 cm-1、1 1 (C–H)、および 3280 cm-1 (O–H) の周波数にあります。SL Nb-MXene については、以前の研究 38 と一致する CH 結合伸縮シグネチャが見つかりました。しかしながら、C=C結合およびCH結合に関連するいくつかのピークが消失していることが観察された。これは、微細藻類の化学組成がSL Nb-MXeneとの相互作用によりわずかな変化を受ける可能性があることを示唆している。
微細藻類の生化学における変化の可能性を検討する際には、ニオブ酸化物などの無機酸化物の蓄積を再検討する必要がある59。これは、細胞表面による金属の取り込み、細胞質への輸送、細胞内カルボキシル基との結合、および微細藻類ポリホスホソームへの蓄積に関与している20,88,89,90。さらに、微細藻類と金属の関係は、細胞の機能グループによって維持されている。このため、吸収は微細藻類の表面化学にも依存しており、これは非常に複雑である9,91。一般的に、予想どおり、緑藻の化学組成はニオブ酸化物の吸収によりわずかに変化した。
興味深いことに、観察された微細藻類の初期阻害は時間とともに可逆的であった。我々の観察によれば、微細藻類は初期の環境変化を克服し、最終的には正常な成長速度に戻り、さらに増加し​​た。ゼータ電位の研究では、栄養培地に導入された際に高い安定性が示された。したがって、微細藻類細胞とNb-MXeneナノフレーク間の表面相互作用は、還元実験全体を通して維持された。我々のさらなる分析では、微細藻類のこの注目すべき挙動の根底にある主な作用機序をまとめる。
SEM観察により、微細藻類はNb-MXeneに付着する傾向があることがわかった。動的画像解析を用いて、この効果により2次元Nb-MXeneナノフレークがより球状の粒子に変化することが確認され、ナノフレークの分解は酸化と関連していることが実証された。この仮説を検証するために、一連の材料および生化学的研究を行った。試験後、ナノフレークは徐々に酸化され、緑色微細藻類に脅威を与えないNbOおよびNb2O5生成物に分解した。FTIR観察により、2D Nb-MXeneナノフレークの存在下で培養した微細藻類の化学組成に有意な変化は見られなかった。微細藻類による酸化ニオブの吸収の可能性を考慮して、X線蛍光分析を行った。これらの結果は、研究対象の微細藻類が、研究対象の微細藻類に対して無毒な酸化ニオブ（NbOおよびNb2O5）を栄養源としていることを明確に示している。