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ナノテクノロジーの急速な発展と日常応用への統合は、環境を脅かす可能性があります。有機汚染物質の分解のためのグリーン手法は確立されていますが、無機結晶汚染物質の回収は、生体内変化に対する感受性の低さや、材料表面と生物との相互作用に関する理解不足のために大きな懸念事項となっています。本研究では、Nbベースの無機2D MXenesモデルとシンプルな形状パラメータ解析手法を組み合わせることで、緑藻Raphidocelis subcapitataによる2Dセラミックナノ材料のバイオレメディエーション機構を追跡しました。その結果、微細藻類は表面に関連した物理化学的相互作用によりNbベースのMXenesを分解することがわかりました。当初、単層および多層のMXeneナノフレークが微細藻類の表面に付着し、藻類の成長をある程度抑制しました。しかし、表面との長期的な相互作用により、微細藻類はMXeneナノフレークを酸化し、さらにNbOとNb2O5に分解しました。これらの酸化物は微細藻類細胞に対して無毒であるため、吸収機構によってNb酸化物ナノ粒子を消費し、72時間の水処理後に微細藻類をさらに回復させます。吸収に関連する栄養素の影響も、細胞容積の増加、滑らかな形状、成長速度の変化に反映されています。これらの知見に基づき、淡水生態系におけるNbベースのMXeneの短期および長期の存在は、環境への影響はわずかであると結論付けています。2次元ナノ材料をモデルシステムとして使用することで、微粒子材料であっても形状変化を追跡できることを実証したことは注目に値します。全体として、本研究は、2Dナノ材料のバイオレメディエーション機構を駆動する表面相互作用関連プロセスに関する重要な基本的疑問に答えるものであり、無機結晶ナノ材料の環境影響に関する短期および長期の研究の基礎を提供します。
ナノマテリアルは発見以来、大きな関心を集めており、近年、様々なナノテクノロジーが近代化の段階に入っています1。しかしながら、ナノマテリアルを日常の用途に組み込むことで、不適切な廃棄、不注意な取り扱い、あるいは不十分な安全インフラによる事故的な放出につながる可能性があります。そのため、二次元（2D）ナノマテリアルを含むナノマテリアルが自然環境に放出される可能性は否定できませんが、その挙動や生物学的活性はまだ十分に解明されていません。そのため、生態毒性に関する懸念が、2Dナノマテリアルが水生系に浸出する能力に集中していることは驚くことではありません2,3,4,5,6。これらの生態系では、一部の2Dナノマテリアルが、微細藻類を含む様々な栄養段階の生物と相互作用する可能性があります。
微細藻類は、淡水および海洋生態系に自然に存在する原始的な生物であり、光合成によって様々な化学生成物を生成します7。そのため、水生生態系にとって極めて重要である8,9,10,11,12。また、生態毒性の指標として、感度が高く、安価で広く利用されています13,14。微細藻類細胞は急速に増殖し、様々な化合物の存在に迅速に反応するため、有機物で汚染された水を処理するための環境に優しい方法の開発に有望です15,16。
藻類細胞は、生物吸着と蓄積によって水中の無機イオンを除去することができます17,18。クロレラ、アナベナ・インバー、ウェスティエロプシス・プロリフィカ、スティゲオクロニウム・テヌエ、シネココッカス属などの一部の藻類は、Fe₂+、Cu₂+、Zn₂+、Mn₂+などの有毒金属イオンを運び、さらには栄養源として利用することが分かっています19。他の研究では、Cu₂+、Cd₂+、Ni₂+、Zn₂+、Pb₂+イオンが細胞形態を変化させ、葉緑体を破壊することで、セネデスムスの成長を制限することが示されています20,21。
有機汚染物質の分解と重金属イオンの除去のためのグリーンメソッドは、世界中の科学者や技術者の注目を集めています。これは主に、これらの汚染物質が液相で容易に処理できるという事実によるものです。しかし、無機結晶汚染物質は水溶性が低く、様々な生体内変換に対する感受性が低いという特徴があり、修復が非常に困難であり、この分野ではほとんど進展が見られません22,23,24,25,26。したがって、ナノ材料の修復のための環境に優しいソリューションの探索は、依然として複雑で未開拓の領域です。2Dナノ材料の生体内変換効果に関する不確実性が高いため、還元中にそれらの分解の可能性のある経路を容易に特定することはできません。
本研究では、無機セラミック材料の活性水性バイオレメディエーション剤として緑色微細藻類を用い、無機セラミック材料の代表例としてMXeneの分解プロセスのin situモニタリングを組み合わせました。「MXene」という用語は、Mn+1XnTx材料の化学量論を反映しており、Mは前期遷移金属、Xは炭素および/または窒素、Txは表面末端停止剤（例：-OH、-F、-Cl）、n = 1、2、3、または4です27.28。NaguibらによるMXeneの発見以来、センサ、癌治療、膜ろ過27,29,30においてMXenesが研究されてきました。さらに、MXenesは優れたコロイド安定性と生物学的相互作用の可能性から、モデル2Dシステムとして考えることができます31,32,33,34,35,36。
したがって、本稿で開発した方法論と我々の研究仮説を図1に示す。この仮説によれば、微細藻類は表面に関連した物理化学的相互作用によってNb系MXeneを無毒の化合物に分解し、藻類の回収を可能にする。この仮説を検証するために、初期のニオブ系遷移金属炭化物および／または窒化物（MXene）ファミリーからNb2CTxとNb4C3TXの2つの化合物を選択した。
緑藻Raphidocelis subcapitataによるMXene回収に関する研究方法論とエビデンスに基づく仮説。これはエビデンスに基づく仮定を模式的に示したものに過ぎないことにご注意ください。湖の環境は、使用される栄養培地や条件（例えば、日周サイクルや利用可能な必須栄養素の制限）によって異なります。BioRender.comで作成。
したがって、MXeneをモデルシステムとして用いることで、従来のナノ材料では観察できない様々な生物学的効果の研究への扉が開かれました。特に、ニオブ系MXeneなどの二次元ナノ材料を、微細藻類Raphidocelis subcapitataによってバイオレメディエーション（生物修復）できる可能性を実証しました。微細藻類はNb-MXeneを無毒の酸化物NbOとNb₂O₃に分解することができ、これらはニオブの吸収機構を通じて栄養源としても機能します。全体として、本研究は、二次元ナノ材料のバイオレメディエーションのメカニズムを支配する表面物理化学的相互作用に関連するプロセスに関する重要な基礎的問いに答えるものです。さらに、二次元ナノ材料の形状の微妙な変化を追跡するための、形状パラメータに基づく簡便な手法を開発しています。これは、無機結晶ナノ材料の様々な環境影響に関する短期および長期の研究をさらに刺激するものであり、本研究は材料表面と生物材料との相互作用に関する理解を深めるものです。また、淡水生態系への潜在的な影響についての短期および長期の研究を拡大するための基盤も提供しており、これは今では簡単に検証できます。
MXene は、ユニークで魅力的な物理的・化学的特性を持ち、多くの用途が期待される興味深い材料群です。これらの特性は、その化学量論と表面化学に大きく依存します。そのため、本研究では、異なる生物学的効果が観察される Nb ベースの階層的単層 (SL) MXene、Nb2CTx と Nb4C3TX の 2 種類を調査しました。MXene は、出発材料から、原子レベルの薄さの MAX 相 A 層をトップダウンで選択エッチングすることによって生成されます。MAX 相は、遷移金属炭化物の「結合」ブロックと、MnAXn-1 化学量論の Al、Si、Sn などの「A」元素の薄層で構成される 3 元セラミックです。初期の MAX 相の形態は走査型電子顕微鏡 (SEM) によって観察され、以前の研究と一致していました (補足情報、SI、図 S1 を参照)。 48% HF（フッ化水素酸）でAl層を除去後、多層（ML）Nb-MXeneが得られた。ML-Nb2CTxおよびML-Nb4C3TXの形態を走査型電子顕微鏡（SEM）で調べたところ（それぞれ図S1cおよびS1d）、細長い細孔状のスリットを通過した2次元ナノフレークに似た、典型的な層状MXene形態が観察された。どちらのNb-MXeneも、以前に酸エッチングによって合成されたMXene相と多くの共通点がある27,38。MXeneの構造を確認した後、テトラブチルアンモニウムヒドロキシド（TBAOH）のインターカレーションで層状にし、洗浄および超音波処理を行った後、単層または低層（SL）2D Nb-MXeneナノフレークを得た。
エッチングとさらなる剥離の効率をテストするために、高解像度透過型電子顕微鏡（HRTEM）とX線回折（XRD）を使用しました。逆高速フーリエ変換（IFFT）と高速フーリエ変換（FFT）を使用して処理されたHRTEMの結果を図2に示します。Nb-MXeneナノフレークは、原子層の構造を確認し、面間距離を測定するために、エッジを上に向けて配向されました。MXene Nb2CTxおよびNb4C3TXナノフレークのHRTEM画像では、Naguibら27とJastrzębskaら38によって以前に報告されたように、原子的に薄い層状の性質が明らかになりました（図2a1、a2を参照）。隣接する2つのNb2CTxおよびNb4C3Tx単分子層については、層間距離をそれぞれ0.74および1.54 nmと決定しました（図2b1、b2）。これも以前の結果38と一致しています。このことは、逆高速フーリエ変換（図2c1、c2）および高速フーリエ変換（図2d1、d2）によってさらに確認され、Nb2CTxとNb4C3Txの単分子層間の距離が示されています。この画像では、ニオブ原子と炭素原子に対応する明るい帯と暗い帯が交互に現れており、研究対象のMXeneが層状構造を呈していることが確認できます。Nb2CTxとNb4C3Txについて得られたエネルギー分散型X線分光法（EDX）スペクトル（図S2aおよびS2b）では、Alピークが検出されなかったため、元のMAX相の痕跡は見られなかったことに注目すべきです。
SL Nb2CTxおよびNb4C3Tx MXeneナノフレークの特性評価。(a)高分解能電子顕微鏡（HRTEM）による側面2Dナノフレーク画像と、それに対応する(b)強度モード、(c)逆高速フーリエ変換（IFFT）、(d)高速フーリエ変換（FFT）、(e)Nb-MXenes X線パターンを含む。SL 2D Nb2CTxの場合、数字は(a1, b1, c1, d1, e1)で表される。SL 2D Nb4C3Txの場合、数字は(a2, b2, c2, d2, e1)で表される。
SL Nb2CTxおよびNb4C3Tx MXeneのX線回折測定結果をそれぞれ図2e1およびe2に示す。4.31および4.32のピーク(002)は、それぞれ前述の層状MXene Nb2CTxおよびNb4C3TX38,39,40,41に対応する。XRD測定結果からは、残留ML構造およびMAX相の存在も示されているが、大部分はSL Nb4C3Txに関連するXRDパターンである（図2e2）。MAX相のより小さな粒子の存在は、ランダムに積層されたNb4C3Tx層と比較してMAXピークが強くなることを説明する可能性がある。
さらなる研究は、R. subcapitata 種に属する緑色微細藻類に焦点を当てています。微細藻類を選んだのは、主要な食物網に関与する重要な生産者であるためです42。また、食物連鎖の上位に運ばれる毒性物質を除去する能力があるため、毒性の最良の指標の 1 つでもあります43。さらに、R. subcapitata の研究は、SL Nb-MXene が一般的な淡水微生物に及ぼす偶発的な毒性を解明する助けとなる可能性があります。これを説明するために、研究者らは、環境中に存在する毒性化合物に対する感受性が微生物ごとに異なるという仮説を立てました。ほとんどの生物にとって、低濃度の物質は成長に影響を与えませんが、一定限度を超える濃度は生物の成長を阻害したり、死に至らしめたりする可能性があります。そのため、微細藻類と MXene の表面相互作用および関連する回収率を研究するために、Nb-MXene の無害濃度と毒性濃度を試験することにしました。これを実行するために、私たちは 0 (基準として)、0.01、0.1、および 10 mg l-1 MXene の濃度をテストし、さらに、あらゆる生物学的環境にとって極端かつ致命的となる可能性のある非常に高濃度の MXene (100 mg l-1 MXene) を微細藻類に感染させました。
SL Nb-MXenesの微細藻類への影響を図3に示します。これは、0 mg l-1サンプルで測定した成長促進（+）または阻害（-）のパーセンテージとして表されています。比較のために、Nb-MAX相およびML Nb-MXenesも試験し、その結果をSIで示しています（図S3を参照）。得られた結果から、図3a、bに示すように、SL Nb-MXenesは0.01～10 mg/lの低濃度範囲でほぼ完全に毒性がないことが確認されました。Nb2CTxの場合、指定された範囲で5%を超える生態毒性は認められませんでした。
SL (a) Nb2CTx および (b) Nb4C3TX MXene 存在下での微細藻類の成長の刺激 (+) または阻害 (-)。24、48、72 時間の MXene-微細藻類相互作用を分析しました。 有意なデータ（t検定、p < 0.05）にはアスタリスク（*）が付いています。 有意なデータ（t検定、p < 0.05）にはアスタリスク（*）が付いています。 Значимые данные (t-критерий, p < 0,05) отмечены звездочкой (*)。 有意なデータ（t検定、p < 0.05）にはアスタリスク（*）が付いています。重要なデータ（t 検査、p < 0.05）には星号 (*) が付けられています。重要なデータ（t 検査、p < 0.05）には星号 (*) が付けられています。 Важные данные (t 検定、p < 0,05) отмечены звездочкой (*)。 重要なデータ（t検定、p < 0.05）にはアスタリスク（*）が付いています。赤い矢印は抑制刺激の廃止を示しています。
一方、低濃度の Nb4C3TX では毒性がわずかに高かったが、7% を超えることはありませんでした。予想どおり、MXene は 100 mg L-1 で毒性と微細藻類の成長阻害が高かったことがわかりました。興味深いことに、MAX または ML サンプルと比較して、どの材料も無毒性/毒性効果の同じ傾向と時間依存性を示しませんでした (詳細は SI を参照)。MAX フェーズ (図 S3 を参照) では毒性が約 15～25% に達し、時間とともに増加しましたが、SL Nb2CTx および Nb4C3TX MXene では逆の傾向が見られました。微細藻類の成長阻害は時間の経過とともに減少しました。24 時間後には約 17% に達し、72 時間後には 5% 未満に低下しました (それぞれ図 3a、b)。
さらに重要なのは、SL Nb4C3TXの場合、微細藻類の成長阻害は24時間後に約27％に達したが、72時間後には約1％に減少したことです。したがって、観察された効果は刺激の逆阻害と名付け、その効果はSL Nb4C3TX MXeneの方が強かったです。微細藻類の成長刺激は、SL Nb2CTx MXeneと比較して、Nb4C3TX（10 mg L-1で24時間相互作用）でより早く観察されました。阻害-刺激逆転効果は、バイオマス倍増速度曲線でもよく示されました（詳細は図S4を参照）。これまでのところ、Ti3C2TX MXeneの生態毒性のみがさまざまな方法で研究されています。ゼブラフィッシュの胚には毒性がありませんが44、微細藻類のDesmodesmus quadricaudaとSorghum saccharatum植物には中程度の生態毒性があります45。その他の特異的な影響の例としては、正常細胞株よりも癌細胞株に対する毒性が高いことが挙げられる46,47。試験条件が、Nb-MXenes存在下で観察される微細藻類の成長の変化に影響を与えることが想定される。例えば、葉緑体ストロマのpHは約8がRuBisCO酵素の効率的な作動に最適である。したがって、pHの変化は光合成速度に悪影響を及ぼす48,49。しかし、実験中にpHの有意な変化は観察されなかった（詳細はSIの図S5を参照）。一般に、Nb-MXenesを添加した微細藻類の培養では、時間の経過とともに溶液のpHがわずかに低下する。しかし、この低下は純粋培地のpHの変化と同様であった。さらに、認められた変動範囲は、微細藻類の純粋培養（対照サンプル）で測定されたものと同様であった。したがって、光合成はpHの経時的変化の影響を受けないと結論付けられる。
さらに、合成されたMXeneは表面末端（Txと表記）を有する。これらは主に官能基-O、-F、および-OHである。しかし、表面化学は合成方法に直接関連している。これらの基は表面上にランダムに分布することが知られており、MXeneの特性への影響を予測することは困難である50。Txはニオブの光酸化における触媒力である可能性があると主張できる。表面官能基は確かに、その下にある光触媒がヘテロ接合を形成するための複数のアンカー部位を提供する51。しかし、成長培地の組成は効果的な光触媒を提供しなかった（培地の詳細な組成はSI表S6を参照）。さらに、MXeneの生物学的活性は、層後処理、酸化、有機化合物および無機化合物の化学的表面改質52,53,54,55,56、または表面電荷工学38によって変化する可能性があるため、表面改質も非常に重要である。したがって、酸化ニオブが培地中の物質の不安定性と何らかの関係があるかどうかをテストするために、微細藻類の成長培地と脱イオン水（比較のため）のゼータ（ζ）電位の調査を実施しました。結果は、SL Nb-MXenesがかなり安定していることを示しています（MAXおよびMLの結果については、SIの図S6を参照）。SL MXenesのゼータ電位は約-10 mVです。SR Nb2CTxの場合、ζの値はNb4C3Txの値よりもやや負です。ζ値のこのような変化は、負に帯電したMXeneナノフレークの表面が培養培地から正に帯電したイオンを吸収することを示している可能性があります。培養培地中のNb-MXenesのゼータ電位と導電率の一時測定（詳細については、SIの図S7とS8を参照）は、私たちの仮説を裏付けているようです。
しかしながら、両方のNb-MXene SLはゼロからの変化は最小限でした。これは、微細藻類の成長培地中でのそれらの安定性を明確に示しています。さらに、緑色の微細藻類の存在が培地中のNb-MXeneの安定性に影響を与えるかどうかを評価しました。栄養培地および培養物中での微細藻類との相互作用後のMXeneのゼータ電位と導電率の経時変化の結果は、SI（図S9およびS10）に記載されています。興味深いことに、微細藻類の存在は両方のMXeneの分散を安定化させるように見えることに気付きました。Nb2CTx SLの場合、ゼータ電位は時間の経過とともにわずかに減少し、より負の値になりました（72時間のインキュベーション後、-15.8 mV対-19.1 mV）。 SL Nb4C3TX のゼータ電位はわずかに増加しましたが、72 時間後でも微細藻類が存在しないナノフレークよりも高い安定性を示しました (-18.1 mV 対 -9.1 mV)。
また、微細藻類存在下で培養したNb-MXene溶液の導電率が低下することも確認されました。これは、栄養培地中のイオン量が少ないことを示しています。注目すべきは、水中でのMXeneの不安定性は主に表面酸化に起因することです57。したがって、緑藻類は何らかの形でNb-MXeneの表面に形成された酸化物を除去し、さらには酸化物の発生（MXeneの酸化）を阻害していると考えられます。これは、微細藻類が吸収する物質の種類を調べることで明らかになります。
生態毒性研究では、微細藻類がNb-MXeneの毒性と刺激成長の異常な阻害を時間の経過とともに克服できることが示唆されていますが、本研究の目的は、その作用機序の可能性を調査することでした。藻類などの生物は、生態系に馴染みのない化合物や物質に曝露されると、様々な反応を示す可能性があります58,59。毒性金属酸化物が存在しない場合、微細藻類は自ら栄養を得て、継続的に成長することができます60。毒性物質を摂取すると、形態変化などの防御機構が活性化される可能性があります。吸収の可能性も考慮する必要があります58,59。特に、防御機構の兆候は、試験化合物の毒性を明確に示す指標となります。そこで、本研究では、SL Nb-MXeneナノフレークと微細藻類との間の潜在的な表面相互作用をSEMで観察し、Nb系MXeneの吸収の可能性をX線蛍光分光法（XRF）で調査しました。活性毒性の問題に対処するために、SEM および XRF 分析は MXene の最高濃度でのみ実行されたことに注意してください。
SEM観察結果を図4に示す。未処理の微細藻類細胞（図4a、参照サンプル）は、R. subcapitataの典型的な形態とクロワッサンのような細胞形状を明瞭に示している。細胞は扁平化し、やや乱雑に見えた。一部の微細藻類細胞は重なり合い、絡み合っていたが、これはサンプル調製工程に起因するものと考えられる。一般的に、純粋な微細藻類細胞は表面が滑らかで、形態変化は見られなかった。
極高濃度（100 mg L-1）で72時間相互作用させた緑色微細藻類とMXeneナノシートの表面相互作用を示すSEM画像。(a) SLとの相互作用後の未処理緑色微細藻類、(b) Nb2CTx、(c) Nb4C3TX MXene。Nb-MXeneナノフレークは赤い矢印で示されている。比較のために、光学顕微鏡写真も併記している。
対照的に、SL Nb-MXeneナノフレークに吸着された微細藻類細胞は損傷を受けていた（図4b、c、赤矢印参照）。Nb2CTx MXeneの場合（図4b）、微細藻類は2次元ナノスケールが付着した状態で成長する傾向があり、これにより形態が変化する可能性がある。注目すべきことに、我々は光学顕微鏡下でもこれらの変化を観察した（詳細はSI図S11参照）。この形態変化は、微細藻類の生理学と、細胞容積の増加など細胞形態を変化させることによって自己防衛する能力に、もっともらしい根拠がある61。したがって、実際にNb-MXeneと接触している微細藻類細胞の数を確認することが重要である。SEM研究では、約52％の微細藻類細胞がNb-MXeneに曝露され、48％の微細藻類細胞が接触を回避したことが示された。 SL Nb4C3Tx MXeneの場合、微細藻類はMXeneとの接触を避けようとし、2次元ナノスケールから局在化して成長します（図4c）。しかし、ナノスケールが微細藻類細胞に浸透し、細胞に損傷を与えることは観察されませんでした。
自己保存は、細胞表面への粒子の吸着といわゆるシェーディング（遮光）効果による光合成の阻害に対する時間依存の応答行動でもある62。微細藻類と光源の間にある各物体（たとえば、Nb-MXeneナノフレーク）が葉緑体によって吸収される光の量を制限していることは明らかです。しかし、これが得られた結果に大きな影響を与えることは間違いありません。顕微鏡観察で示されているように、微細藻類細胞がNb-MXeneと接触している場合でも、2Dナノフレークは微細藻類の表面に完全に包まれたり接着されたりしていませんでした。代わりに、ナノフレークは表面を覆うことなく微細藻類細胞に配向されていることがわかりました。このようなナノフレーク/微細藻類のセットは、微細藻類細胞によって吸収される光の量を大幅に制限することはできません。さらに、いくつかの研究では、2次元ナノマテリアルの存在下で光合成生物による光吸収が改善されることも実証されています63,64,65,66。
SEM像では微細藻類細胞によるニオブの取り込みを直接確認できなかったため、この問題を明らかにするために、X線蛍光（XRF）およびX線光電子分光法（XPS）分析を用いたさらなる研究が行われました。そこで、MXeneと相互作用していない参照用微細藻類サンプル、微細藻類細胞表面から剥離したMXeneナノフレーク、そして付着したMXeneを除去した後の微細藻類細胞のNbピークの強度を比較しました。注目すべきは、Nbの取り込みがない場合、付着したナノスケールを除去した後に微細藻類細胞によって得られたNb値はゼロになるはずだということです。したがって、Nbの取り込みが発生した場合、XRFとXPSの両方の結果に明確なNbピークが示されるはずです。
XRF スペクトルの場合、微細藻類サンプルは、SL Nb2CTx および Nb4C3Tx MXene との相互作用後に、SL Nb2CTx および Nb4C3Tx MXene の Nb ピークを示しました (図 5a を参照、また、MAX および ML MXene の結果は SI の図 S12～C17 に示されていることにも注意してください)。興味深いことに、Nb ピークの強度は両方のケースで同じです (図 5a の赤いバー)。これは、藻類がこれ以上 Nb を吸収できず、細胞内で Nb 蓄積の最大容量が達成されたことを示していますが、2 倍以上の Nb4C3Tx MXene が微細藻類細胞に付着していました (図 5a の青いバー)。特に、微細藻類の金属吸収能力は、環境中の金属酸化物の濃度に依存します67,68。 Shamshadaら67は、淡水藻類の吸収能力はpHの上昇に伴って低下することを発見しました。Raizeら68は、海藻の金属吸収能力はPb2+の場合がNi2+の場合よりも約25%高いことを指摘しました。
(a) 超高濃度SL Nb-MXene（100 mg L-1）で72時間培養した緑色微細藻類細胞によるNbの基礎吸収のXRF結果。結果は、純粋な微細藻類細胞（対照サンプル、灰色の列）、表面微細藻類細胞から単離した2Dナノフレーク（青色の列）、および表面から2Dナノフレークを分離した後の微細藻類細胞（赤色の列）におけるαの存在を示している。元素Nbの量、（b）SL Nb-MXeneとの培養後の微細藻類細胞に存在する微細藻類有機成分（C=OおよびCHx/C-O）とNb酸化物の化学組成の割合、（c～e）XPS SL Nb2CTxスペクトルの組成ピークのフィッティング、および（fh）微細藻類細胞に内部化されたSL Nb4C3Tx MXene。
したがって、Nb は酸化物の形で藻類細胞に吸収される可能性があると予想しました。これをテストするために、MXene Nb2CTx および Nb4C3TX と藻類細胞に対して XPS 研究を行いました。微細藻類と Nb-MXene および藻類細胞から単離された MXene との相互作用の結果を図 5b に示します。予想どおり、微細藻類の表面から MXene を除去した後に、微細藻類サンプルで Nb 3d ピークが検出されました。C=O、CHx/CO、および Nb 酸化物の定量は、Nb2CTx SL (図 5c–e) および Nb4C3Tx SL (図 5c–e) で得られた Nb 3d、O 1s、および C 1s スペクトルに基づいて計算されました。 図 5f–h) MXene。表S1-3は、フィッティングから得られたピークパラメータと全体的な化学組成の詳細を示しています。Nb2CTx SLとNb4C3Tx SLのNb 3d領域（図5c、f）が1つのNb2O5成分に対応していることは注目に値します。ここでは、スペクトルにMXene関連のピークは見られず、微細藻類細胞はNbの酸化物形態のみを吸収することを示しています。さらに、C 1 sスペクトルをC–C、CHx/C–O、C=O、および–COOH成分で近似しました。CHx/C–OおよびC=Oピークを微細藻類細胞の有機物寄与に割り当てました。これらの有機成分は、それぞれNb2CTx SLとNb4C3TX SLのC 1sピークの36％と41％を占めています。次に、SL Nb2CTx と SL Nb4C3TX の O 1s スペクトルを、Nb2O5、微細藻類の有機成分 (CHx/CO)、および表面吸着水とフィッティングしました。
最後に、XPSの結果は、Nbの存在だけでなく、その形態も明確に示しました。Nb 3d信号の位置とデコンボリューションの結果から、Nbは酸化物としてのみ吸収され、イオンやMXene自体としては吸収されないことが確認されました。さらに、XPSの結果は、微細藻類細胞がSL Nb2CTxからNb酸化物を取り込む能力が、SL Nb4C3TX MXeneよりも高いことを示しました。
Nb 吸収の結果は印象的で、MXene の分解を特定できるようになりましたが、2D ナノフレークの関連する形態変化を追跡する方法はありません。そのため、2D Nb-MXene ナノフレークと微細藻類細胞に発生するあらゆる変化に直接対応できる適切な方法も開発することにしました。相互作用する種が何らかの変化、分解、または断片化を経験すると、等価円面積の直径、真円度、フェレー幅、フェレー長などの形状パラメータの変化としてすぐに現れると想定していることに注意することが重要です。これらのパラメータは細長い粒子や 2 次元ナノフレークを記述するのに適しているため、動的粒子形状分析によって追跡することで、還元中の SL Nb-MXene ナノフレークの形態変化に関する貴重な情報が得られます。
得られた結果を図 6 に示します。比較のために、元の MAX 相と ML-MXenes もテストしました (SI 図 S18 および S19 を参照)。粒子形状の動的解析により、2 つの Nb-MXene SL のすべての形状パラメータは、微細藻類との相互作用後に大幅に変化したことが示されました。等価円面積径パラメータ (図 6a、b) で示されるように、大きなナノフレークの割合のピーク強度の減少は、それらがより小さな断片に崩壊する傾向があることを示しています。図 6c の d は、フレークの横方向のサイズ (ナノフレークの伸長) に関連するピークの減少を示しており、2D ナノフレークがより粒子のような形状に変化していることを示しています。図 6e ～ h は、それぞれフェレットの幅と長さを示しています。フェレットの幅と長さは補完的なパラメータであるため、一緒に考慮する必要があります。 2D Nb-MXeneナノフレークを微細藻類存在下で培養したところ、フェレ相関ピークがシフトし、強度が低下しました。これらの結果と形態学的観察、XRF、XPSの結果を組み合わせた結果、観察された変化は酸化と強く関連していると結論付けられました。酸化されたMXeneはよりしわが寄り、破片や球状の酸化物粒子へと分解します69,70。
緑藻類との相互作用後のMXeneの変形解析。動的粒子形状解析では、(a, b) 等価円面積の直径、(c, d) 真円度、(e, f) フェレー幅、(g, h) フェレー長といったパラメータを考慮します。この解析のために、2種類の参照用微細藻類サンプルを、一次SL Nb2CTxおよびSL Nb4C3Tx MXene、SL Nb2CTxおよびSL Nb4C3Tx MXene、分解された微細藻類、そして処理後のSL Nb2CTxおよびSL Nb4C3Tx MXeneと共に解析しました。赤い矢印は、研究対象の2次元ナノフレークの形状パラメータの遷移を示しています。
形状パラメータ分析は非常に信頼性が高いため、微細藻類細胞の形態変化を明らかにすることもできます。そこで、純粋な微細藻類細胞と2D Nbナノフレークとの相互作用後の細胞の等価円面積径、円形度、フェレー幅/長さを分析しました。図6a～hは、ピーク強度の減少と最大値の高値へのシフトによって証明される、藻類細胞の形状パラメータの変化を示しています。特に、細胞の円形度パラメータは、細長い細胞の減少と球形細胞の増加を示しました（図6a、b）。さらに、SL Nb2CTx MXeneとの相互作用後（図6e）のフェレー細胞幅は、SL Nb4C3TX MXene（図6f）と比較して数マイクロメートル増加しました。これは、Nb2CTx SRとの相互作用により微細藻類がNb酸化物を強力に取り込むためであると考えられます。 Nb フレークが表面により強く付着しなくなるため、細胞の成長が最小限に抑えられ、遮光効果も最小限に抑えられます。
微細藻類の形状とサイズのパラメータの変化に関する我々の観察は、他の研究を補完するものである。緑藻類は、細胞の大きさ、形状、または代謝を変化させることで、環境ストレスに応じて形態を変えることができる61。例えば、細胞の大きさが変わると栄養素の吸収が促進される71。藻類の細胞が小さくなるほど、栄養素の吸収は低下し、成長速度も低下する。逆に、細胞が大きくなるほど、栄養素を消費する傾向があり、それが細胞内に蓄積される72,73。MachadoとSoaresは、殺菌剤トリクロサンが細胞の大きさを大きくすることができることを発見した。彼らはまた、藻類の形状に大きな変化があることも発見した74。さらに、Yinら9も、還元グラフェン酸化物ナノ複合材料に曝露された後の藻類の形態変化を明らかにした。したがって、微細藻類のサイズ/形状パラメータの変化は、MXeneの存在によって引き起こされることは明らかである。このサイズと形状の変化は栄養素の吸収の変化を示しているため、時間経過に伴うサイズと形状のパラメータの分析により、Nb-MXenes の存在下での微細藻類による酸化ニオブの吸収を実証できると考えています。
さらに、MXeneは藻類の存在下で酸化される可能性がある。Dalaiら75は、ナノTiO2およびAl2O376に曝露された緑藻の形態が均一ではないことを観察した。我々の観察結果は本研究と類似しているが、本研究はナノ粒子ではなく、2Dナノフレーク存在下でのMXene分解生成物に関するバイオレメディエーション効果の研究にのみ関連している。MXeneは金属酸化物に分解する可能性があるため31,32,77,78、我々のNbナノフレークも微細藻類細胞と相互作用した後にNb酸化物を形成する可能性があると推測するのは妥当である。
2D-Nbナノフレークの還元を酸化プロセスに基づく分解メカニズムで説明するために、高解像度透過型電子顕微鏡（HRTEM）（図7a、b）とX線光電子分光法（XPS）（図7、7c-iおよび表S4-5）を用いた研究を実施しました。 どちらのアプローチも2D材料の酸化の研究に適しており、互いに補完し合っています。 HRTEMは2次元層構造の劣化とそれに続く金属酸化物ナノ粒子の出現を分析できますが、XPSは表面結合に敏感です。 この目的のために、微細藻類細胞分散液から抽出した2D Nb-MXeneナノフレーク、つまり微細藻類細胞と相互作用した後の形状をテストしました（図7を参照）。
酸化された (a) SL Nb2CTx および (b) SL Nb4C3Tx MXene の形態を示す HRTEM 画像、(c) 還元後の酸化物生成物の組成を示す XPS 分析結果、(d–f) 緑藻で修復された SL Nb2CTx および (g–i) Nb4C3Tx SL の XPS スペクトルの成分のピークマッチング。
HRTEM 研究により、2 種類の Nb-MXene ナノフレークの酸化が確認されました。ナノフレークはある程度の二次元形態を維持していましたが、酸化により MXene ナノフレークの表面を覆う多数のナノ粒子が出現しました (図 7a、b を参照)。c Nb 3d および O 1s 信号の XPS 分析により、両方のケースで Nb 酸化物が形成されたことが示されました。図 7c に示すように、2D MXene Nb2CTx および Nb4C3TX には Nb 3d 信号があり、これは NbO および Nb2O5 酸化物の存在を示しています。一方、O 1s 信号は、2D ナノフレーク表面の機能化に関連する O–Nb 結合の数を示しています。Nb-C および Nb3+-O と比較して、Nb 酸化物の寄与が支配的であることがわかりました。
図 7g ～ i は、微細藻類細胞から単離された Nb 3d、C 1s、および O 1s SL Nb2CTx (図 7d ～ f を参照) および SL Nb4C3TX MXene の XPS スペクトルを示しています。 Nb-MXene のピーク パラメータの詳細は、それぞれ表 S4 ～ 5 に示されています。 最初に、Nb 3d の組成を分析しました。微細藻類細胞に吸収された Nb とは対照的に、微細藻類細胞から単離された MXene では、Nb2O5 の他に、他の成分が見つかりました。 Nb2CTx SL では、Nb3+-O の寄与が 15% であることが観察されましたが、Nb 3d スペクトルの残りは Nb2O5 (85%) によって支配されていました。 さらに、SL Nb4C3TX サンプルには、Nb-C (9%) および Nb2O5 (91%) の成分が含まれています。ここで、Nb-CはNb4C3Tx SR中の金属炭化物の内部2原子層に由来する。次に、内部化サンプルと同様に、C 1sスペクトルを4つの異なる成分にマッピングした。予想通り、C 1sスペクトルはグラファイト状炭素が支配的で、微細藻類細胞由来の有機粒子（CHx/COおよびC=O）の寄与がそれに続く。さらに、O 1sスペクトルでは、微細藻類細胞の有機形態、酸化ニオブ、そして吸着水の寄与が観察された。
さらに、Nb-MXenes の切断が栄養培地および/または微細藻類細胞中の活性酸素種 (ROS) の存在と関連しているかどうかを調査しました。この目的のために、培養培地中の一重項酸素 (1O2) のレベルと、微細藻類で抗酸化剤として働くチオールである細胞内グルタチオンのレベルを評価しました。結果は SI (図 S20 および S21) に示されています。SL Nb2CTx および Nb4C3TX MXenes を使用した培養では、1O2 の量が減少することが特徴でした (図 S20 を参照)。SL Nb2CTx の場合、MXene 1O2 は約 83% に減少しています。SL を使用した微細藻類培養では、Nb4C3TX 1O2 はさらに減少して 73% になりました。興味深いことに、1O2 の変化は、以前に観察された阻害刺激効果と同じ傾向を示しました (図 3 を参照)。明るい光の中での培養は光酸化を変化させる可能性があると主張できます。しかし、対照分析の結果は、実験中、1O2 のレベルがほぼ一定であることを示しました (図 S22)。細胞内 ROS レベルの場合も、同様の低下傾向が見られました (図 S21 を参照)。当初、Nb2CTx および Nb4C3Tx SL の存在下で培養された微細藻類細胞の ROS レベルは、微細藻類の純培養で見られるレベルを超えていました。しかし、最終的には、微細藻類は両方の Nb-MXene の存在に適応したようで、ROS レベルはそれぞれ SL Nb2CTx および Nb4C3TX を接種した微細藻類の純培養で測定されたレベルの 85% と 91% に減少しました。これは、微細藻類が、栄養培地のみの場合よりも Nb-MXene の存在下で時間の経過とともにより快適に感じるようになることを示している可能性があります。
微細藻類は多様な光合成生物群です。光合成の過程で、大気中の二酸化炭素（CO2）を有機炭素に変換します。光合成の生成物はグルコースと酸素です79。このように生成された酸素は、Nb-MXeneの酸化において重要な役割を果たしていると考えられます。その一つの説明として、Nb-MXeneナノフレークの外側と内側の酸素分圧が低い場合と高い場合で、差次的通気パラメータが形成されることが挙げられます。これは、酸素分圧が異なる領域がある場合、最も酸素分圧が低い領域が陽極となることを意味します80, 81, 82。ここで、微細藻類はMXeneフレーク表面に差次的通気細胞を形成することに寄与し、これらの細胞は光合成特性によって酸素を生成します。その結果、生物腐食生成物（この場合はニオブ酸化物）が形成されます。もう一つの特徴は、微細藻類が生成する有機酸が水中に放出される可能性があることです83, 84。その結果、腐食性の高い環境が形成され、Nb-MXenesが変化します。さらに、微細藻類は二酸化炭素を吸収することで環境のpHをアルカリ性に変化させ、これも腐食を引き起こす可能性があります79。
さらに重要なのは、本研究で使用した明暗の光周期が、得られた結果を理解する上で極めて重要であることです。この点については、Djemai-Zoghlache ら 85 が詳細に説明しています。彼らは、意図的に 12/12 時間の光周期を使用して、紅色微細藻類 Porphyridium purpureum による生物付着に関連する生物腐食を実証しました。彼らは、光周期が生物腐食のない電位の変化と関連しており、24:00 付近で擬似周期振動として現れることを示しています。これらの観察結果は、Dowling ら 86 によって確認されました。彼らは、シアノバクテリア Anabaena の光合成バイオフィルムを実証しました。溶存酸素は光の作用下で生成され、自由生物腐食電位の変化または変動と関連しています。生物腐食の自由電位は明期に増加し、暗期に減少するという事実によって、光周期の重要性が強調されています。これは光合成微細藻類によって生成される酸素によるもので、電極付近に生成される分圧によって陰極反応に影響を及ぼします87。
さらに、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）を実施し、Nb-MXenesとの相互作用後に微細藻類細胞の化学組成に変化があったかどうかを調べました。得られた結果は複雑であるため、SIで示します（図S23〜S25、MAXステージおよびML MXenesの結果を含む）。つまり、得られた微細藻類の参照スペクトルは、これらの生物の化学的特性に関する重要な情報を提供します。これらの最も可能性の高い振動は、1060 cm-1（CO）、1540 cm-1、1640 cm-1（C = C）、1730 cm-1（C = O）、2850 cm-1、2920 cm-1、11（C–H）、および3280 cm–1（O–H）の周波数に位置します。SL Nb-MXenesについては、以前の研究38と一致するCH結合伸縮シグネチャを発見しました。しかしながら、C=CおよびCH結合に関連するいくつかの追加ピークが消失していることが観察されました。これは、SL Nb-MXeneとの相互作用により、微細藻類の化学組成がわずかに変化する可能性があることを示唆しています。
微細藻類の生化学における変化の可能性を考慮すると、酸化ニオブなどの無機酸化物の蓄積について再考する必要がある59。これは、細胞表面による金属の吸収、細胞質への輸送、細胞内カルボキシル基との結合、そして微細藻類ポリホスホソームへの蓄積に関与している20,88,89,90。さらに、微細藻類と金属の関係は、細胞の官能基によって維持されている。そのため、吸収は微細藻類の表面化学にも依存しており、これは非常に複雑である9,91。一般的に、予想通り、緑藻類の化学組成は酸化ニオブの吸収によってわずかに変化した。
興味深いことに、観察された微細藻類の初期阻害は時間の経過とともに可逆的でした。観察されたように、微細藻類は初期の環境変化を克服し、最終的には通常の成長速度に戻り、さらには増加しました。ゼータ電位の研究では、栄養培地に導入された際に高い安定性が示されています。したがって、微細藻類細胞とNb-MXeneナノフレークとの表面相互作用は、還元実験全体を通して維持されました。さらなる分析では、微細藻類のこの注目すべき挙動の背後にある主要な作用メカニズムをまとめます。
SEM観察により、微細藻類はNb-MXeneに付着する傾向があることが示されています。動画像解析を用いて、この効果により2次元Nb-MXeneナノフレークがより球状の粒子へと変化することが確認され、ナノフレークの分解は酸化を伴うことが実証されました。この仮説を検証するために、一連の材料および生化学研究を実施しました。試験後、ナノフレークは徐々に酸化され、NbOおよびNb2O5生成物に分解されましたが、緑藻類に害を及ぼすことはありません。FTIR観察では、2D Nb-MXeneナノフレーク存在下で培養した微細藻類の化学組成に大きな変化は見られませんでした。微細藻類による酸化ニオブの吸収の可能性を考慮し、蛍光X線分析を実施しました。これらの結果は、研究対象の微細藻類が、研究対象の微細藻類に対して無毒なニオブ酸化物（NbO および Nb2O5）を餌としていることを明確に示しています。