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El rápido desarrollo de la nanotecnología y su integración en aplicaciones cotidianas puede amenazar el medio ambiente. Si bien los métodos verdes para la degradación de contaminantes orgánicos están bien establecidos, la recuperación de contaminantes cristalinos inorgánicos es de gran preocupación debido a su baja sensibilidad a la biotransformación y la falta de comprensión de las interacciones de la superficie del material con los biológicos. Aquí, utilizamos un modelo 2D MXenes inorgánicos basados ​​en Nb combinado con un método simple de análisis de parámetros de forma para rastrear el mecanismo de biorremediación de nanomateriales cerámicos 2D por la microalga verde Raphidocelis subcapitata. Descubrimos que las microalgas degradan los MXenes basados ​​en Nb debido a interacciones fisicoquímicas relacionadas con la superficie. Inicialmente, las nanoláminas de MXene de una sola capa y de múltiples capas se adhirieron a la superficie de las microalgas, lo que redujo algo el crecimiento de las algas. Sin embargo, tras una interacción prolongada con la superficie, las microalgas oxidaron las nanoláminas de MXene y las descompusieron aún más en NbO y Nb2O5. Debido a que estos óxidos no son tóxicos para las células de las microalgas, consumen nanopartículas de óxido de Nb mediante un mecanismo de absorción que restaura aún más las microalgas después de 72 horas de tratamiento con agua. Los efectos de los nutrientes asociados con la absorción también se reflejan en el aumento del volumen celular, su forma lisa y el cambio en la tasa de crecimiento. Con base en estos hallazgos, concluimos que la presencia a corto y largo plazo de MXenes basados ​​en Nb en ecosistemas de agua dulce puede causar solo impactos ambientales menores. Cabe destacar que, utilizando nanomateriales bidimensionales como sistemas modelo, demostramos la posibilidad de rastrear la transformación de la forma incluso en materiales de grano fino. En general, este estudio responde a una pregunta fundamental importante sobre los procesos relacionados con la interacción de la superficie que impulsan el mecanismo de biorremediación de los nanomateriales 2D y proporciona una base para futuros estudios a corto y largo plazo del impacto ambiental de los nanomateriales cristalinos inorgánicos.
Los nanomateriales han generado gran interés desde su descubrimiento, y diversas nanotecnologías han entrado recientemente en una fase de modernización1. Desafortunadamente, la integración de nanomateriales en aplicaciones cotidianas puede provocar liberaciones accidentales debido a una eliminación inadecuada, un manejo descuidado o una infraestructura de seguridad inadecuada. Por lo tanto, es razonable suponer que los nanomateriales, incluidos los bidimensionales (2D), pueden liberarse al medio ambiente natural, cuyo comportamiento y actividad biológica aún no se comprenden por completo. Por lo tanto, no es sorprendente que la preocupación por la ecotoxicidad se haya centrado en la capacidad de los nanomateriales 2D para filtrarse en los sistemas acuáticos2,3,4,5,6. En estos ecosistemas, algunos nanomateriales 2D pueden interactuar con diversos organismos en diferentes niveles tróficos, incluidas las microalgas.
Las microalgas son organismos primitivos que se encuentran de forma natural en ecosistemas de agua dulce y marinos y que producen diversos productos químicos mediante la fotosíntesis7. Por ello, son cruciales para los ecosistemas acuáticos8,9,10,11,12, pero también son indicadores de ecotoxicidad sensibles, económicos y ampliamente utilizados13,14. Dado que las células de las microalgas se multiplican rápidamente y responden con rapidez a la presencia de diversos compuestos, son prometedoras para el desarrollo de métodos ecológicos para el tratamiento de aguas contaminadas con sustancias orgánicas15,16.
Las células de algas pueden eliminar iones inorgánicos del agua mediante biosorción y acumulación17,18. Se ha descubierto que algunas especies de algas, como Chlorella, Anabaena invar, Westiellopsis prolifica, Stigeoclonium tenue y Synechococcus sp., transportan e incluso nutren iones metálicos tóxicos como Fe₂₄, Cu₂₄, Zn₂₄ y Mn₂₄₄. Otros estudios han demostrado que los iones Cu₂₄, Cd₂₄, Ni₂₄, Zn₂₄ o Pb₂₄ limitan el crecimiento de Scenedesmus al alterar la morfología celular y destruir sus cloroplastos20,21.
Los métodos ecológicos para la descomposición de contaminantes orgánicos y la eliminación de iones de metales pesados ​​han atraído la atención de científicos e ingenieros de todo el mundo. Esto se debe principalmente a que estos contaminantes se procesan fácilmente en fase líquida. Sin embargo, los contaminantes cristalinos inorgánicos se caracterizan por su baja solubilidad en agua y baja susceptibilidad a diversas biotransformaciones, lo que dificulta enormemente su remediación, y se ha avanzado poco en este ámbito22,23,24,25,26. Por lo tanto, la búsqueda de soluciones respetuosas con el medio ambiente para la reparación de nanomateriales sigue siendo un área compleja e inexplorada. Debido al alto grado de incertidumbre respecto a los efectos de la biotransformación de los nanomateriales 2D, no existe una manera sencilla de determinar las posibles vías de su degradación durante la reducción.
En este estudio, utilizamos microalgas verdes como un agente activo de biorremediación acuosa para materiales cerámicos inorgánicos, combinado con el monitoreo in situ del proceso de degradación de MXeno como un representante de materiales cerámicos inorgánicos. El término "MXeno" refleja la estequiometría del material Mn+1XnTx, donde M es un metal de transición temprana, X es carbono y/o nitrógeno, Tx es un terminador de superficie (p. ej., -OH, -F, -Cl) y n = 1, 2, 3 o 427,28. Desde el descubrimiento de MXenos por Naguib et al. Sensorics, cancer therapy and membrane filtring 27,29,30. Además, los MXenos pueden considerarse sistemas modelo 2D debido a su excelente estabilidad coloidal y posibles interacciones biológicas31,32,33,34,35,36.
Por lo tanto, la metodología desarrollada en este artículo y nuestras hipótesis de investigación se muestran en la Figura 1. Según esta hipótesis, las microalgas degradan los MXenos basados ​​en Nb en compuestos no tóxicos debido a interacciones fisicoquímicas superficiales, lo que permite una mayor recuperación de las algas. Para probar esta hipótesis, se seleccionaron dos miembros de la familia de carburos y/o nitruros de metales de transición (MXenos) basados ​​en niobio: Nb₂CTx y Nb₄C₃TX.
Metodología de investigación e hipótesis basadas en la evidencia para la recuperación de MXene por la microalga verde Raphidocelis subcapitata. Tenga en cuenta que esto es solo una representación esquemática de las suposiciones basadas en la evidencia. El entorno del lago difiere según el medio nutritivo utilizado y las condiciones (p. ej., ciclo diurno y limitaciones en la disponibilidad de nutrientes esenciales). Creado con BioRender.com.
Por lo tanto, al utilizar MXene como sistema modelo, hemos abierto la puerta al estudio de diversos efectos biológicos que no se pueden observar con otros nanomateriales convencionales. En particular, demostramos la posibilidad de biorremediación de nanomateriales bidimensionales, como los MXenes basados ​​en niobio, por la microalga Raphidocelis subcapitata. Las microalgas son capaces de degradar los Nb-MXenes en los óxidos no tóxicos NbO y Nb₂O₃, que también proporcionan nutrientes a través del mecanismo de absorción de niobio. En resumen, este estudio responde a una pregunta fundamental importante sobre los procesos asociados con las interacciones fisicoquímicas superficiales que rigen los mecanismos de biorremediación de nanomateriales bidimensionales. Además, estamos desarrollando un método simple basado en parámetros de forma para el seguimiento de cambios sutiles en la forma de nanomateriales 2D. Esto inspira futuras investigaciones a corto y largo plazo sobre los diversos impactos ambientales de los nanomateriales cristalinos inorgánicos. Por lo tanto, nuestro estudio mejora la comprensión de la interacción entre la superficie del material y el material biológico. También estamos proporcionando la base para realizar estudios ampliados a corto y largo plazo sobre sus posibles impactos en los ecosistemas de agua dulce, que ahora pueden verificarse fácilmente.
Los MXenos representan una clase interesante de materiales con propiedades físicas y químicas únicas y atractivas y, por lo tanto, muchas aplicaciones potenciales. Estas propiedades dependen en gran medida de su estequiometría y química de superficie. Por lo tanto, en nuestro estudio, investigamos dos tipos de MXenos monocapa (SL) jerárquicos basados ​​en Nb, Nb2CTx y Nb4C3TX, ya que se pudieron observar diferentes efectos biológicos de estos nanomateriales. Los MXenos se producen a partir de sus materiales de partida mediante grabado selectivo de arriba hacia abajo de capas A de fase MAX atómicamente delgadas. La fase MAX es una cerámica ternaria compuesta por bloques "enlazados" de carburos de metales de transición y capas delgadas de elementos "A" como Al, Si y Sn con estequiometría MnAXn-1. La morfología de la fase MAX inicial se observó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y fue consistente con estudios previos (Ver Información Suplementaria, SI, Figura S1). Se obtuvo Nb-MXeno multicapa (ML) tras eliminar la capa de Al con 48% de HF (ácido fluorhídrico). Se examinó la morfología de ML-Nb₂CTx y ML-Nb₄C3TX mediante microscopía electrónica de barrido (MEB) (Figuras S1c y S1d, respectivamente), observándose una morfología típica de MXeno en capas, similar a la de nanoláminas bidimensionales que pasan a través de ranuras alargadas similares a poros. Ambos Nb-MXenos tienen mucho en común con las fases de MXeno sintetizadas previamente mediante grabado ácido27,38. Tras confirmar la estructura del MXeno, lo estratificamos mediante intercalación de hidróxido de tetrabutilamonio (TBAOH), seguido de lavado y sonicación, tras lo cual obtuvimos nanoláminas de Nb-MXeno 2D de capa única o de capa baja (SL).
Utilizamos microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) y difracción de rayos X (XRD) para probar la eficiencia del grabado y pelado posterior. Los resultados de HRTEM procesados ​​utilizando la Transformada Rápida Inversa de Fourier (IFFT) y la Transformada Rápida de Fourier (FFT) se muestran en la Fig. 2. Las nanoláminas de Nb-MXene se orientaron con el borde hacia arriba para verificar la estructura de la capa atómica y medir las distancias interplanares. Las imágenes de HRTEM de las nanoláminas de MXene Nb2CTx y Nb4C3TX revelaron su naturaleza atómicamente delgada en capas (ver Fig. 2a1, a2), como lo informaron previamente Naguib et al.27 y Jastrzębska et al.38. Para dos monocapas adyacentes de Nb2CTx y Nb4C3Tx, determinamos distancias entre capas de 0,74 y 1,54 nm, respectivamente (Figs. 2b1, b2), lo que también concuerda con nuestros resultados previos38. Esto fue confirmado además por la transformada rápida inversa de Fourier (Fig. 2c1, c2) y la transformada rápida de Fourier (Fig. 2d1, d2) que muestran la distancia entre las monocapas de Nb₂CTx y Nb₃C3Tx. La imagen muestra una alternancia de bandas claras y oscuras correspondientes a átomos de niobio y carbono, lo que confirma la naturaleza estratificada de los MXenos estudiados. Es importante notar que los espectros de espectroscopia de rayos X de energía dispersiva (EDX) obtenidos para Nb₂CTx y Nb₃C3Tx (Figuras S2a y S2b) no mostraron remanentes de la fase MAX original, ya que no se detectó ningún pico de Al.
Caracterización de nanoláminas de MXeno Nb₂CTx y Nb₄C3Tx SL, incluyendo (a) microscopía electrónica de alta resolución (HRTEM) de imágenes 2D de vista lateral de las nanoláminas y su correspondiente análisis, (b) modo de intensidad, (c) transformada rápida inversa de Fourier (IFFT), (d) transformada rápida de Fourier (FFT), (e) patrones de rayos X de Nb-MXenos. Para Nb₂CTx SL 2D, los valores se expresan como (a₁, b₁, c₁, d₁, e₁). Para Nb₄C3Tx SL 2D, los valores se expresan como (a₂, b₂, c₂, d₂, e₁).
Las mediciones de difracción de rayos X de los MXenos SL Nb₂CTx y Nb₄C3Tx se muestran en las Figs. 2e1 y e2, respectivamente. Los picos (002) en 4.31 y 4.32 corresponden a los MXenos estratificados Nb₂CTx y Nb₄C3TX₃8, 39, 40 y 41 descritos previamente, respectivamente. Los resultados de XRD también indican la presencia de algunas estructuras ML residuales y fases MAX, pero principalmente patrones de XRD asociados con SL Nb₄C3Tx (Fig. 2e2). La presencia de partículas más pequeñas de la fase MAX podría explicar el pico MAX más intenso en comparación con las capas de Nb₄C3Tx apiladas aleatoriamente.
Investigaciones posteriores se han centrado en las microalgas verdes pertenecientes a la especie R. subcapitata. Elegimos las microalgas porque son importantes productoras involucradas en las principales redes tróficas42. También son uno de los mejores indicadores de toxicidad debido a su capacidad para eliminar sustancias tóxicas que se transportan a niveles superiores de la cadena trófica43. Además, la investigación sobre R. subcapitata puede arrojar luz sobre la toxicidad incidental de los Nb-MXenos SL para los microorganismos comunes de agua dulce. Para ilustrar esto, los investigadores plantearon la hipótesis de que cada microbio tiene una sensibilidad diferente a los compuestos tóxicos presentes en el medio ambiente. Para la mayoría de los organismos, las bajas concentraciones de sustancias no afectan su crecimiento, mientras que las concentraciones por encima de cierto límite pueden inhibirlos o incluso causar la muerte. Por lo tanto, para nuestros estudios de la interacción superficial entre las microalgas y los MXenos y la recuperación asociada, decidimos probar las concentraciones inocuas y tóxicas de Nb-MXenos. Para ello, probamos concentraciones de 0 (como referencia), 0,01, 0,1 y 10 mg l-1 de MXene y adicionalmente infectamos microalgas con concentraciones muy altas de MXene (100 mg l-1 de MXene), que pueden ser extremas y letales para cualquier ambiente biológico.
Los efectos de los Nb-MXenes SL en las microalgas se muestran en la Figura 3, expresados ​​como el porcentaje de promoción (+) o inhibición (-) del crecimiento medido para muestras de 0 mg l⁻¹. A modo de comparación, también se analizaron la fase Nb-MAX y los Nb-MXenes ML, cuyos resultados se muestran en SI (véase la Fig. S3). Los resultados obtenidos confirmaron que los Nb-MXenes SL carecen prácticamente de toxicidad en el rango de bajas concentraciones de 0,01 a 10 mg/l, como se muestra en las Fig. 3a,b. En el caso del Nb₂CTx, no se observó más del 5 % de ecotoxicidad en el rango especificado.
Estimulación (+) o inhibición (-) del crecimiento de microalgas en presencia de SL (a) Nb2CTx y (b) Nb4C3TX MXene. Se analizaron 24, 48 y 72 horas de interacción MXene-microalga. Los datos significativos (prueba t, p < 0,05) se marcaron con un asterisco (*). Los datos significativos (prueba t, p < 0,05) se marcaron con un asterisco (*). Значимые данные (t-критерий, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Los datos significativos (prueba t, p < 0,05) están marcados con un asterisco (*).重要数据（t 检验，p < 0.05）用星号(*) 标记。重要数据（t 检验，p < 0.05）用星号(*) 标记。 Важные данные (prueba t, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Los datos importantes (prueba t, p < 0,05) están marcados con un asterisco (*).Las flechas rojas indican la abolición de la estimulación inhibitoria.
Por otro lado, las bajas concentraciones de Nb4C3TX resultaron ser ligeramente más tóxicas, pero no superiores al 7%. Como se esperaba, observamos que los MXenes tuvieron mayor toxicidad e inhibición del crecimiento de microalgas a 100 mg L-1. Curiosamente, ninguno de los materiales mostró la misma tendencia y dependencia temporal de los efectos atóxicos/tóxicos en comparación con las muestras MAX o ML (ver SI para más detalles). Mientras que para la fase MAX (ver Fig. S3) la toxicidad alcanzó aproximadamente el 15-25% y aumentó con el tiempo, se observó la tendencia inversa para SL Nb2CTx y Nb4C3TX MXene. La inhibición del crecimiento de microalgas disminuyó con el tiempo. Alcanzó aproximadamente el 17% después de 24 horas y cayó a menos del 5% después de 72 horas (Fig. 3a, b, respectivamente).
Más importante aún, para SL Nb4C3TX, la inhibición del crecimiento de microalgas alcanzó aproximadamente el 27% después de 24 horas, pero después de 72 horas disminuyó a aproximadamente el 1%. Por lo tanto, etiquetamos el efecto observado como inhibición inversa de la estimulación, y el efecto fue más fuerte para SL Nb4C3TX MXene. La estimulación del crecimiento de microalgas se observó antes con Nb4C3TX (interacción a 10 mg L-1 durante 24 h) en comparación con SL Nb2CTx MXene. El efecto de reversión de inhibición-estimulación también se mostró bien en la curva de tasa de duplicación de biomasa (ver Fig. S4 para detalles). Hasta ahora, solo la ecotoxicidad de Ti3C2TX MXene se ha estudiado de diferentes maneras. No es tóxico para los embriones de pez cebra44 pero moderadamente ecotóxico para las plantas de microalgas Desmodesmus quadricauda y Sorghum saccharatum45. Otros ejemplos de efectos específicos incluyen una mayor toxicidad para las líneas celulares cancerosas que para las líneas celulares normales46,47. Podría asumirse que las condiciones de prueba influirían en los cambios en el crecimiento de las microalgas observados en presencia de Nb-MXenes. Por ejemplo, un pH de aproximadamente 8 en el estroma del cloroplasto es óptimo para el funcionamiento eficiente de la enzima RuBisCO. Por lo tanto, los cambios de pH afectan negativamente la tasa de fotosíntesis48,49. Sin embargo, no observamos cambios significativos en el pH durante el experimento (ver SI, Fig. S5 para más detalles). En general, los cultivos de microalgas con Nb-MXenes redujeron ligeramente el pH de la solución con el tiempo. Sin embargo, esta disminución fue similar a un cambio en el pH de un medio puro. Además, el rango de variaciones encontrado fue similar al medido para un cultivo puro de microalgas (muestra de control). Por lo tanto, concluimos que la fotosíntesis no se ve afectada por los cambios en el pH con el tiempo.
Además, los MXenos sintetizados tienen terminaciones superficiales (denotadas como Tx). Estos son principalmente grupos funcionales -O, -F y -OH. Sin embargo, la química de la superficie está directamente relacionada con el método de síntesis. Se sabe que estos grupos se distribuyen aleatoriamente sobre la superficie, lo que dificulta predecir su efecto sobre las propiedades del MXeno50. Se puede argumentar que Tx podría ser la fuerza catalítica para la oxidación del niobio por la luz. Los grupos funcionales de la superficie de hecho proporcionan múltiples sitios de anclaje para que sus fotocatalizadores subyacentes formen heterouniones51. Sin embargo, la composición del medio de crecimiento no proporcionó un fotocatalizador efectivo (la composición detallada del medio se puede encontrar en la Tabla S6 del SI). Además, cualquier modificación de la superficie también es muy importante, ya que la actividad biológica de los MXenos puede alterarse debido al posprocesamiento de la capa, la oxidación, la modificación química de la superficie de compuestos orgánicos e inorgánicos52,53,54,55,56 o la ingeniería de carga superficial38. Por lo tanto, para probar si el óxido de niobio tiene algo que ver con la inestabilidad del material en el medio, realizamos estudios del potencial zeta (ζ) en medio de crecimiento de microalgas y agua desionizada (para comparación). Nuestros resultados muestran que los Nb-MXenes SL son bastante estables (ver SI Fig. S6 para resultados MAX y ML). El potencial zeta de los SL MXenes es de aproximadamente -10 mV. En el caso de SR Nb2CTx, el valor de ζ es algo más negativo que el de Nb4C3Tx. Tal cambio en el valor de ζ puede indicar que la superficie de nanoláminas de MXeno cargadas negativamente absorbe iones cargados positivamente del medio de cultivo. Las mediciones temporales del potencial zeta y la conductividad de los Nb-MXenes en medio de cultivo (ver Figuras S7 y S8 en SI para más detalles) parecen respaldar nuestra hipótesis.
Sin embargo, ambas nanoláminas de Nb-MXeno mostraron cambios mínimos desde cero. Esto demuestra claramente su estabilidad en el medio de cultivo de microalgas. Además, evaluamos si la presencia de nuestras microalgas verdes afectaría la estabilidad de las nanoláminas de Nb-MXeno en el medio. Los resultados del potencial zeta y la conductividad de las nanoláminas de MXeno tras la interacción con microalgas en medios nutritivos y cultivos a lo largo del tiempo se pueden encontrar en la Figura S9 y S10. Curiosamente, observamos que la presencia de microalgas pareció estabilizar la dispersión de ambas nanoláminas de MXeno. En el caso de la nanolámina de Nb₂CTx, el potencial zeta incluso disminuyó ligeramente con el tiempo hasta valores más negativos (-15,8 frente a -19,1 mV tras 72 h de incubación). El potencial zeta de la nanolámina de Nb₂C3TX aumentó ligeramente, pero tras 72 h seguía mostrando una mayor estabilidad que las nanoláminas sin microalgas (-18,1 frente a -9,1 mV).
También observamos una menor conductividad en las soluciones de Nb-MXeno incubadas en presencia de microalgas, lo que indica una menor cantidad de iones en el medio nutritivo. Cabe destacar que la inestabilidad de los MXenos en agua se debe principalmente a la oxidación superficial57. Por lo tanto, sospechamos que las microalgas verdes eliminaron de alguna manera los óxidos formados en la superficie del Nb-MXeno e incluso previnieron su formación (oxidación del MXeno). Esto se puede observar mediante el estudio de los tipos de sustancias absorbidas por las microalgas.
Si bien nuestros estudios ecotoxicológicos indicaron que las microalgas pudieron superar la toxicidad de los Nb-MXenos con el tiempo y la inusual inhibición del crecimiento estimulado, el objetivo de nuestro estudio fue investigar los posibles mecanismos de acción. Cuando organismos como las algas se exponen a compuestos o materiales desconocidos para sus ecosistemas, pueden reaccionar de diversas maneras58,59. En ausencia de óxidos metálicos tóxicos, las microalgas pueden alimentarse, lo que les permite crecer continuamente60. Tras la ingestión de sustancias tóxicas, pueden activarse mecanismos de defensa, como cambiar de forma. También debe considerarse la posibilidad de absorción58,59. En particular, cualquier signo de un mecanismo de defensa es un claro indicador de la toxicidad del compuesto de prueba. Por lo tanto, en nuestro trabajo posterior, investigamos la posible interacción superficial entre las nanoláminas de Nb-MXeno SL y las microalgas mediante SEM y la posible absorción de MXeno basado en Nb mediante espectroscopia de fluorescencia de rayos X (XRF). Tenga en cuenta que los análisis SEM y XRF solo se realizaron en la concentración más alta de MXene para abordar problemas de toxicidad de la actividad.
Los resultados del SEM se muestran en la Fig. 4. Las células de microalgas sin tratar (véase la Fig. 4a, muestra de referencia) mostraron claramente la morfología típica de R. subcapitata y una forma celular similar a la de un croissant. Las células se ven aplanadas y algo desorganizadas. Algunas células de microalgas se superpusieron y entrelazaron, probablemente debido al proceso de preparación de la muestra. En general, las células de microalgas puras presentaron una superficie lisa y no mostraron cambios morfológicos.
Imágenes de SEM que muestran la interacción superficial entre microalgas verdes y nanoláminas de MXene tras 72 horas de interacción a una concentración extrema (100 mg L⁻¹). (a) Microalgas verdes sin tratar tras la interacción con los MXenes SL (b) Nb₂CTx y (c) Nb₄C₃TX. Nótese que las nanoláminas de Nb-MXene están marcadas con flechas rojas. Para fines comparativos, se incluyen fotografías de un microscopio óptico.
Por el contrario, las células de microalgas adsorbidas por nanoláminas de Nb-MXeno SL resultaron dañadas (véase la Fig. 4b, c, flechas rojas). En el caso del MXeno Nb2CTx (Fig. 4b), las microalgas tienden a crecer con nanoescalas bidimensionales adheridas, lo que puede cambiar su morfología. Cabe destacar que también observamos estos cambios bajo microscopía óptica (véase la Figura S11 de SI para más detalles). Esta transición morfológica tiene una base plausible en la fisiología de las microalgas y su capacidad de defenderse modificando la morfología celular, como el aumento del volumen celular61. Por lo tanto, es importante verificar el número de células de microalgas que están realmente en contacto con los Nb-MXenos. Los estudios de SEM mostraron que aproximadamente el 52 % de las células de microalgas estuvieron expuestas a los Nb-MXenos, mientras que el 48 % de estas células de microalgas evitaron el contacto. En el caso del MXene SL Nb₄C₃Tx, las microalgas intentan evitar el contacto con el MXene, localizándose y creciendo a partir de nanoescalas bidimensionales (Fig. 4c). Sin embargo, no se observó la penetración de nanoescalas en las células de las microalgas ni su daño.
La autoconservación también es un comportamiento de respuesta dependiente del tiempo al bloqueo de la fotosíntesis debido a la adsorción de partículas en la superficie celular y el llamado efecto de sombreado (shading)62. Está claro que cada objeto (por ejemplo, nanoláminas de Nb-MXeno) que se encuentra entre las microalgas y la fuente de luz limita la cantidad de luz absorbida por los cloroplastos. Sin embargo, no tenemos duda de que esto tiene un impacto significativo en los resultados obtenidos. Como lo muestran nuestras observaciones microscópicas, las nanoláminas 2D no estaban completamente envueltas ni adheridas a la superficie de las microalgas, incluso cuando las células de las microalgas estaban en contacto con Nb-MXenos. En cambio, las nanoláminas resultaron estar orientadas a las células de las microalgas sin cubrir su superficie. Tal conjunto de nanoláminas/microalgas no puede limitar significativamente la cantidad de luz absorbida por las células de las microalgas. Es más, algunos estudios incluso han demostrado una mejora en la absorción de luz por parte de los organismos fotosintéticos en presencia de nanomateriales bidimensionales63,64,65,66.
Dado que las imágenes SEM no pudieron confirmar directamente la captación de niobio por las células de microalgas, nuestro estudio posterior se centró en el análisis de fluorescencia de rayos X (XRF) y espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) para aclarar esta cuestión. Por lo tanto, comparamos la intensidad de los picos de Nb de muestras de microalgas de referencia que no interactuaron con MXenes, nanoláminas de MXene desprendidas de la superficie de las células de microalgas y células de microalgas después de la eliminación de MXenes adheridos. Vale la pena señalar que si no hay captación de Nb, el valor de Nb obtenido por las células de microalgas debe ser cero después de la eliminación de las nanoescamas adheridas. Por lo tanto, si ocurre captación de Nb, tanto los resultados de XRF como de XPS deben mostrar un pico de Nb claro.
En el caso de los espectros XRF, las muestras de microalgas mostraron picos de Nb para SL Nb2CTx y Nb4C3Tx MXene después de la interacción con SL Nb2CTx y Nb4C3Tx MXene (ver Fig. 5a, también note que los resultados para MAX y ML MXenes se muestran en SI, Figs S12–C17). Curiosamente, la intensidad del pico de Nb es la misma en ambos casos (barras rojas en la Fig. 5a). Esto indicó que las algas no pudieron absorber más Nb, y la capacidad máxima para la acumulación de Nb se logró en las células, aunque dos veces más Nb4C3Tx MXene se unió a las células de las microalgas (barras azules en la Fig. 5a). En particular, la capacidad de las microalgas para absorber metales depende de la concentración de óxidos metálicos en el ambiente67,68. Shamshada et al.67 encontraron que la capacidad de absorción de las algas de agua dulce disminuye con el aumento del pH. Raize et al.68 observaron que la capacidad de las algas para absorber metales era aproximadamente un 25 % mayor para Pb2+ que para Ni2+.
(a) Resultados de XRF de la captación basal de Nb por células de microalgas verdes incubadas a una concentración extrema de SL Nb-MXenes (100 mg L-1) durante 72 horas. Los resultados muestran la presencia de α en células de microalgas puras (muestra de control, columnas grises), nanoláminas 2D aisladas de células de microalgas superficiales (columnas azules) y células de microalgas tras la separación de nanoláminas 2D de la superficie (columnas rojas). La cantidad de Nb elemental, (b) porcentaje de la composición química de los componentes orgánicos de las microalgas (C=O y CHx/C–O) y óxidos de Nb presentes en las células de microalgas tras la incubación con SL Nb-MXenes, (c–e) Ajuste del pico composicional de los espectros XPS SL Nb2CTx y (fh) SL Nb4C3Tx MXene internalizado por las células de microalgas.
Por lo tanto, esperábamos que Nb pudiera ser absorbido por las células de algas en forma de óxidos. Para probar esto, realizamos estudios XPS en MXenes Nb2CTx y Nb4C3TX y células de algas. Los resultados de la interacción de las microalgas con Nb-MXenes y MXenes aislados de células de algas se muestran en las Figs. 5b. Como se esperaba, detectamos picos de Nb 3d en las muestras de microalgas después de la eliminación de MXene de la superficie de la microalga. La determinación cuantitativa de C=O, CHx/CO y óxidos de Nb se calculó con base en los espectros de Nb 3d, O 1s y C 1s obtenidos con Nb2CTx SL (Fig. 5c–e) y Nb4C3Tx SL (Fig. 5c–e). ) obtenidos de microalgas incubadas. Figura 5f–h) MXenes. La Tabla S1-3 muestra los detalles de los parámetros de los picos y la química general resultante del ajuste. Cabe destacar que las regiones Nb 3d de Nb2CTx SL y Nb4C3Tx SL (Fig. 5c, f) corresponden a un componente Nb2O5. Aquí, no encontramos picos relacionados con MXene en los espectros, lo que indica que las células de microalgas solo absorben la forma de óxido de Nb. Además, aproximamos el espectro C 1 s con los componentes C–C, CHx/C–O, C=O y –COOH. Asignamos los picos CHx/C–O y C=O a la contribución orgánica de las células de microalgas. Estos componentes orgánicos representan el 36% y el 41% de los picos C 1s en Nb2CTx SL y Nb4C3TX SL, respectivamente. Luego ajustamos los espectros O 1s de SL Nb2CTx y SL Nb4C3TX con Nb2O5, componentes orgánicos de microalgas (CHx/CO) y agua adsorbida en la superficie.
Finalmente, los resultados de XPS indicaron claramente la forma del Nb, no solo su presencia. Según la posición de la señal 3D de Nb y los resultados de la deconvolución, confirmamos que el Nb se absorbe únicamente en forma de óxidos, no de iones ni del propio MXene. Además, los resultados de XPS mostraron que las células de microalgas tienen una mayor capacidad para absorber óxidos de Nb del SL Nb2CTx que del SL Nb4C3TX MXene.
Si bien nuestros resultados de captación de Nb son impresionantes y nos permiten identificar la degradación de MXene, no existe ningún método disponible para rastrear los cambios morfológicos asociados en nanoláminas 2D. Por lo tanto, también decidimos desarrollar un método adecuado que pueda responder directamente a cualquier cambio que ocurra en las nanoláminas 2D de Nb-MXene y en las células de microalgas. Es importante señalar que asumimos que si las especies que interactúan experimentan alguna transformación, descomposición o desfragmentación, esto debería manifestarse rápidamente como cambios en los parámetros de forma, como el diámetro del área circular equivalente, la redondez, el ancho de Feret o la longitud de Feret. Dado que estos parámetros son adecuados para describir partículas alargadas o nanoláminas bidimensionales, su seguimiento mediante el análisis dinámico de la forma de partículas nos brindará información valiosa sobre la transformación morfológica de las nanoláminas SL de Nb-MXene durante la reducción.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 6. Para la comparación, también probamos la fase MAX original y ML-MXenes (ver Figuras SI S18 y S19). El análisis dinámico de la forma de la partícula mostró que todos los parámetros de forma de dos SL de Nb-MXene cambiaron significativamente después de la interacción con microalgas. Como lo muestra el parámetro de diámetro del área circular equivalente (Fig. 6a, b), la intensidad de pico reducida de la fracción de nanoláminas grandes indica que tienden a desintegrarse en fragmentos más pequeños. En la fig. 6c, d muestra una disminución en los picos asociados con el tamaño transversal de las laminillas (elongación de las nanoláminas), lo que indica la transformación de las nanoláminas 2D en una forma más similar a la de una partícula. Las Figuras 6e-h muestran el ancho y la longitud del Feret, respectivamente. El ancho y la longitud del Feret son parámetros complementarios y, por lo tanto, deben considerarse juntos. Después de la incubación de nanoláminas 2D de Nb-MXene en presencia de microalgas, sus picos de correlación de Feret cambiaron y su intensidad disminuyó. Con base en estos resultados en combinación con la morfología, XRF y XPS, concluimos que los cambios observados están fuertemente relacionados con la oxidación, ya que los MXenos oxidados se vuelven más arrugados y se descomponen en fragmentos y partículas esféricas de óxido69,70.
Análisis de la transformación de MXeno tras la interacción con microalgas verdes. El análisis dinámico de la forma de las partículas considera parámetros como (a, b) diámetro del área circular equivalente, (c, d) redondez, (e, f) anchura de Feret y (g, h) longitud de Feret. Para ello, se analizaron dos muestras de microalgas de referencia junto con MXenos SL Nb2CTx y SL Nb4C3Tx primarios, MXenos SL Nb2CTx y SL Nb4C3Tx, microalgas degradadas y MXenos SL Nb2CTx y SL Nb4C3Tx de microalgas tratadas. Las flechas rojas muestran las transiciones de los parámetros de forma de las nanoláminas bidimensionales estudiadas.
Dado que el análisis de parámetros de forma es muy fiable, también puede revelar cambios morfológicos en las células de microalgas. Por lo tanto, analizamos el diámetro del área circular equivalente, la redondez y el ancho/largo de Feret de células de microalgas puras y de células tras la interacción con nanoláminas de Nb 2D. Las figuras 6a-h muestran cambios en los parámetros de forma de las células de algas, evidenciados por una disminución de la intensidad de pico y un desplazamiento de los máximos hacia valores más altos. En particular, los parámetros de redondez celular mostraron una disminución en las células alargadas y un aumento en las células esféricas (figuras 6a, b). Además, el ancho de las células de Feret aumentó varios micrómetros tras la interacción con SL Nb2CTx MXene (figura 6e) en comparación con SL Nb4C3TX MXene (figura 6f). Sospechamos que esto puede deberse a la fuerte absorción de óxidos de Nb por las microalgas tras la interacción con Nb2CTx SR. Una unión menos rígida de las laminillas de Nb a su superficie puede dar lugar a un crecimiento celular con un efecto de sombreado mínimo.
Nuestras observaciones de cambios en los parámetros de la forma y el tamaño de las microalgas complementan otros estudios. Las microalgas verdes pueden cambiar su morfología en respuesta al estrés ambiental modificando el tamaño, la forma o el metabolismo celular61. Por ejemplo, cambiar el tamaño de las células facilita la absorción de nutrientes71. Las células de algas más pequeñas muestran una menor absorción de nutrientes y una tasa de crecimiento reducida. Por el contrario, las células más grandes tienden a consumir más nutrientes, que luego se depositan intracelularmente72,73. Machado y Soares descubrieron que el fungicida triclosán puede aumentar el tamaño celular. También encontraron cambios profundos en la forma de las algas74. Además, Yin et al.9 también revelaron cambios morfológicos en las algas después de la exposición a nanocompuestos de óxido de grafeno reducido. Por lo tanto, está claro que los parámetros de tamaño/forma alterados de las microalgas son causados ​​por la presencia de MXene. Dado que este cambio de tamaño y forma es indicativo de cambios en la absorción de nutrientes, creemos que el análisis de los parámetros de tamaño y forma a lo largo del tiempo puede demostrar la absorción de óxido de niobio por parte de las microalgas en presencia de Nb-MXenes.
Además, los MXenos pueden oxidarse en presencia de algas. Dalai et al.75 observaron que la morfología de las algas verdes expuestas a nano-TiO₂ y Al₂O₃₄ no era uniforme. Si bien nuestras observaciones son similares a las del presente estudio, solo son relevantes para el estudio de los efectos de la biorremediación en términos de productos de degradación de MXenos en presencia de nanoláminas 2D y no de nanopartículas. Dado que los MXenos pueden degradarse en óxidos metálicos,31,32,77,78 es razonable suponer que nuestras nanoláminas de Nb también pueden formar óxidos de Nb tras interactuar con células de microalgas.
Para explicar la reducción de nanoláminas 2D-Nb mediante un mecanismo de descomposición basado en el proceso de oxidación, realizamos estudios mediante microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) (Fig. 7a,b) y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) (Fig. 7c-i y tablas S4-5). Ambos enfoques son adecuados para estudiar la oxidación de materiales 2D y se complementan entre sí. HRTEM puede analizar la degradación de estructuras laminares bidimensionales y la posterior aparición de nanopartículas de óxido metálico, mientras que XPS es sensible a los enlaces superficiales. Para este propósito, probamos nanoláminas 2D Nb-MXene extraídas de dispersiones de células de microalgas, es decir, su forma después de la interacción con las células de microalgas (ver Fig. 7).
Imágenes HRTEM que muestran la morfología de los MXenos oxidados (a) SL Nb2CTx y (b) SL Nb4C3Tx, resultados del análisis XPS que muestran (c) la composición de los productos de óxido después de la reducción, (d–f) coincidencia de picos de los componentes de los espectros XPS de SL Nb2CTx y (g–i) SL Nb4C3Tx reparados con microalgas verdes.
Los estudios de HRTEM confirmaron la oxidación de dos tipos de nanoláminas de Nb-MXene. Si bien las nanoláminas conservaron su morfología bidimensional en cierta medida, la oxidación resultó en la aparición de numerosas nanopartículas que cubrían su superficie (véanse las figuras 7a y 7b). El análisis XPS de las señales de c Nb 3d y O 1s indicó la formación de óxidos de Nb en ambos casos. Como se muestra en la figura 7c, las nanoláminas de MXene 2D Nb2CTx y Nb4C3TX presentan señales de Nb 3d que indican la presencia de óxidos de NbO y Nb2O5, mientras que las señales de O 1s indican el número de enlaces O–Nb asociados a la funcionalización de la superficie de las nanoláminas 2D. Observamos que la contribución del óxido de Nb es predominante en comparación con la de Nb-C y Nb3+-O.
En la fig. Las figuras 7g–i muestran los espectros XPS de Nb 3d, C 1s y O 1s SL Nb2CTx (véanse las figuras 7d–f) y SL Nb4C3TX MXene aislado de células de microalgas. Los detalles de los parámetros de pico de Nb-MXenes se proporcionan en las tablas S4–5, respectivamente. Primero analizamos la composición de Nb 3d. A diferencia del Nb absorbido por las células de microalgas, en el MXene aislado de células de microalgas, aparte de Nb2O5, se encontraron otros componentes. En el SL Nb2CTx, observamos la contribución de Nb3+-O en una cantidad del 15%, mientras que el resto del espectro de Nb 3d estaba dominado por Nb2O5 (85%). Además, la muestra SL Nb4C3TX contiene componentes Nb-C (9%) y Nb2O5 (91%). En este caso, el Nb-C proviene de dos capas atómicas internas de carburo metálico en la reacción de refracción (SR) de Nb₄C₃Tx. A continuación, mapeamos los espectros de C₁₀ a cuatro componentes diferentes, al igual que en las muestras internalizadas. Como era de esperar, el espectro de C₁₀ está dominado por el carbono grafítico, seguido de las contribuciones de partículas orgánicas (CH₁/CO y C=O) de las células de microalgas. Además, en el espectro de O₁₀, observamos la contribución de las formas orgánicas de las células de microalgas, el óxido de niobio y el agua adsorbida.
Además, investigamos si la escisión de Nb-MXenes está asociada con la presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el medio nutritivo y/o células de microalgas. Para este fin, evaluamos los niveles de oxígeno singlete (1O2) en el medio de cultivo y glutatión intracelular, un tiol que actúa como antioxidante en microalgas. Los resultados se muestran en SI (Figuras S20 y S21). Los cultivos con SL Nb2CTx y Nb4C3TX MXenes se caracterizaron por una cantidad reducida de 1O2 (ver Figura S20). En el caso de SL Nb2CTx, MXene 1O2 se reduce a aproximadamente 83%. Para cultivos de microalgas que utilizan SL, Nb4C3TX 1O2 disminuyó aún más, a 73%. Curiosamente, los cambios en 1O2 mostraron la misma tendencia que el efecto inhibidor-estimulante observado previamente (ver Fig. 3). Se puede argumentar que la incubación en luz brillante puede alterar la fotooxidación. Sin embargo, los resultados del análisis de control mostraron niveles casi constantes de 1O2 durante el experimento (Fig. S22). En el caso de los niveles intracelulares de ROS, también observamos la misma tendencia descendente (véase la Figura S21). Inicialmente, los niveles de ROS en células de microalgas cultivadas en presencia de SLs Nb2CTx y Nb4C3Tx excedieron los niveles encontrados en cultivos puros de microalgas. Eventualmente, sin embargo, pareció que las microalgas se adaptaron a la presencia de ambos Nb-MXenes, ya que los niveles de ROS disminuyeron al 85% y 91% de los niveles medidos en cultivos puros de microalgas inoculadas con SL Nb2CTx y Nb4C3TX, respectivamente. Esto puede indicar que las microalgas se sienten más cómodas con el tiempo en presencia de Nb-MXene que en medio nutritivo solo.
Las microalgas son un grupo diverso de organismos fotosintéticos. Durante la fotosíntesis, convierten el dióxido de carbono atmosférico (CO₂) en carbono orgánico. Los productos de la fotosíntesis son glucosa y oxígeno79. Sospechamos que el oxígeno así formado desempeña un papel crucial en la oxidación de los Nb-MXenos. Una posible explicación es que el parámetro de aireación diferencial se forma a presiones parciales de oxígeno bajas y altas, tanto en el exterior como en el interior de las nanoláminas de Nb-MXeno. Esto significa que, dondequiera que haya áreas con diferentes presiones parciales de oxígeno, la zona con el nivel más bajo formará el ánodo80, 81, 82. En este caso, las microalgas contribuyen a la creación de células con aireación diferencial en la superficie de las láminas de MXeno, que producen oxígeno gracias a sus propiedades fotosintéticas. Como resultado, se forman productos de biocorrosión (en este caso, óxidos de niobio). Otro aspecto es que las microalgas pueden producir ácidos orgánicos que se liberan al agua83,84. Por lo tanto, se forma un ambiente agresivo, modificando así los Nb-MXenos. Además, las microalgas pueden alcalinizar el pH del ambiente debido a la absorción de dióxido de carbono, lo que también puede causar corrosión79.
Más importante aún, el fotoperiodo oscuro/claro usado en nuestro estudio es crítico para entender los resultados obtenidos. Este aspecto se describe en detalle en Djemai-Zoghlache et al. 85 Ellos usaron deliberadamente un fotoperiodo de 12/12 horas para demostrar la biocorrosión asociada con la bioincrustación por la microalga roja Porphyridium purpureum. Ellos muestran que el fotoperiodo está asociado con la evolución del potencial sin biocorrosión, manifestándose como oscilaciones pseudoperiódicas alrededor de las 24:00. Estas observaciones fueron confirmadas por Dowling et al. 86 Ellos demostraron biopelículas fotosintéticas de la cianobacteria Anabaena. El oxígeno disuelto se forma bajo la acción de la luz, la cual se asocia con un cambio o fluctuaciones en el potencial de biocorrosión libre. La importancia del fotoperiodo se enfatiza por el hecho de que el potencial libre para la biocorrosión aumenta en la fase luminosa y disminuye en la fase oscura. Esto se debe al oxígeno producido por las microalgas fotosintéticas, que influye en la reacción catódica a través de la presión parcial generada cerca de los electrodos87.
Además, se realizó espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) para determinar si se produjeron cambios en la composición química de las células de microalgas después de la interacción con Nb-MXenes. Estos resultados obtenidos son complejos y los presentamos en SI (Figuras S23-S25, incluyendo los resultados de la etapa MAX y ML MXenes). En resumen, los espectros de referencia obtenidos de microalgas nos proporcionan información importante sobre las características químicas de estos organismos. Estas vibraciones más probables se encuentran en frecuencias de 1060 cm-1 (CO), 1540 cm-1, 1640 cm-1 (C=C), 1730 cm-1 (C=O), 2850 cm-1, 2920 cm-1. 1 1 (C–H) y 3280 cm–1 (O–H). Para SL Nb-MXenes, encontramos una firma de estiramiento de enlace CH que es consistente con nuestro estudio previo38. Sin embargo, observamos que algunos picos adicionales asociados con los enlaces C=C y CH desaparecieron. Esto indica que la composición química de las microalgas podría experimentar cambios menores debido a la interacción con SL Nb-MXenes.
Al considerar los posibles cambios en la bioquímica de las microalgas, es necesario reconsiderar la acumulación de óxidos inorgánicos, como el óxido de niobio59. Este óxido participa en la captación de metales por la superficie celular, su transporte al citoplasma, su asociación con grupos carboxilo intracelulares y su acumulación en los polifosfosomas de las microalgas20,88,89,90. Además, la relación entre las microalgas y los metales se mantiene mediante grupos funcionales de las células. Por esta razón, la absorción también depende de la química superficial de las microalgas, que es bastante compleja9,91. En general, como se esperaba, la composición química de las microalgas verdes cambió ligeramente debido a la absorción de óxido de Nb.
Curiosamente, la inhibición inicial observada en las microalgas fue reversible con el tiempo. Como observamos, las microalgas superaron el cambio ambiental inicial y finalmente recuperaron sus tasas de crecimiento normales, incluso aumentando. Los estudios del potencial zeta muestran una alta estabilidad al introducirse en medios nutritivos. Por lo tanto, la interacción superficial entre las células de las microalgas y las nanoláminas de Nb-MXene se mantuvo durante los experimentos de reducción. En nuestro análisis posterior, resumimos los principales mecanismos de acción que subyacen a este notable comportamiento de las microalgas.
Las observaciones mediante SEM han demostrado que las microalgas tienden a adherirse a los Nb-MXenos. Mediante análisis dinámico de imágenes, confirmamos que este efecto provoca la transformación de nanoláminas bidimensionales de Nb-MXeno en partículas más esféricas, lo que demuestra que la descomposición de las nanoláminas está asociada a su oxidación. Para comprobar nuestra hipótesis, realizamos una serie de estudios bioquímicos y de materiales. Tras las pruebas, las nanoláminas se oxidaron y descompusieron gradualmente en productos de NbO y Nb₂O₃, que no representaron una amenaza para las microalgas verdes. Mediante observación por FTIR, no se observaron cambios significativos en la composición química de las microalgas incubadas en presencia de nanoláminas bidimensionales de Nb-MXeno. Considerando la posibilidad de absorción de óxido de niobio por las microalgas, realizamos un análisis de fluorescencia de rayos X. Estos resultados demuestran claramente que las microalgas estudiadas se alimentan de óxidos de niobio (NbO y Nb₂O₃), que no son tóxicos para ellas.