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El rápido desarrollo de la nanotecnología y su integración en aplicaciones cotidianas puede representar una amenaza para el medio ambiente. Si bien los métodos ecológicos para la degradación de contaminantes orgánicos están bien establecidos, la recuperación de contaminantes cristalinos inorgánicos es motivo de gran preocupación debido a su baja sensibilidad a la biotransformación y la falta de comprensión de las interacciones de la superficie del material con las biológicas. En este trabajo, utilizamos un modelo de MXenes 2D inorgánicos a base de Nb, combinado con un método simple de análisis de parámetros de forma, para rastrear el mecanismo de biorremediación de nanomateriales cerámicos 2D por la microalga verde Raphidocelis subcapitata. Descubrimos que la microalga degrada los MXenes a base de Nb debido a interacciones fisicoquímicas relacionadas con la superficie. Inicialmente, las nanoflakes de MXene monocapa y multicapa se adhirieron a la superficie de la microalga, lo que redujo ligeramente su crecimiento. Sin embargo, tras una interacción prolongada con la superficie, la microalga oxidó las nanoflakes de MXene y las descompuso aún más en NbO y Nb2O5. Debido a que estos óxidos no son tóxicos para las células de microalgas, estas consumen nanopartículas de óxido de Nb mediante un mecanismo de absorción que, tras 72 horas de tratamiento con agua, restaura aún más las microalgas. Los efectos de los nutrientes asociados a la absorción también se reflejan en el aumento del volumen celular, su forma más lisa y el cambio en la tasa de crecimiento. Con base en estos hallazgos, concluimos que la presencia a corto y largo plazo de MXenes a base de Nb en ecosistemas de agua dulce puede causar impactos ambientales mínimos. Cabe destacar que, utilizando nanomateriales bidimensionales como sistemas modelo, demostramos la posibilidad de rastrear la transformación de la forma incluso en materiales de grano fino. En resumen, este estudio responde a una importante pregunta fundamental sobre los procesos relacionados con la interacción superficial que impulsan el mecanismo de biorremediación de los nanomateriales 2D y proporciona una base para futuros estudios a corto y largo plazo sobre el impacto ambiental de los nanomateriales cristalinos inorgánicos.
Los nanomateriales han generado mucho interés desde su descubrimiento, y diversas nanotecnologías han entrado recientemente en una fase de modernización1. Desafortunadamente, la integración de nanomateriales en aplicaciones cotidianas puede provocar liberaciones accidentales debido a una eliminación inadecuada, una manipulación descuidada o una infraestructura de seguridad insuficiente. Por lo tanto, es razonable suponer que los nanomateriales, incluidos los nanomateriales bidimensionales (2D), pueden liberarse en el medio ambiente natural, cuyo comportamiento y actividad biológica aún no se comprenden completamente. Por consiguiente, no sorprende que las preocupaciones sobre ecotoxicidad se hayan centrado en la capacidad de los nanomateriales 2D para filtrarse en sistemas acuáticos2,3,4,5,6. En estos ecosistemas, algunos nanomateriales 2D pueden interactuar con diversos organismos en diferentes niveles tróficos, incluidas las microalgas.
Las microalgas son organismos primitivos que se encuentran de forma natural en ecosistemas de agua dulce y marinos y que producen diversos productos químicos mediante la fotosíntesis7. Por ello, son fundamentales para los ecosistemas acuáticos8,9,10,11,12, pero también son indicadores sensibles, económicos y ampliamente utilizados de ecotoxicidad13,14. Dado que las células de microalgas se multiplican rápidamente y responden con celeridad a la presencia de diversos compuestos, resultan prometedoras para el desarrollo de métodos ecológicos para el tratamiento de aguas contaminadas con sustancias orgánicas15,16.
Las células de algas pueden eliminar iones inorgánicos del agua mediante biosorción y acumulación17,18. Algunas especies de algas como Chlorella, Anabaena invar, Westiellopsis prolifica, Stigeoclonium tenue y Synechococcus sp. Se ha descubierto que transportan e incluso nutren iones de metales tóxicos como Fe2+, Cu2+, Zn2+ y Mn2+19. Otros estudios han demostrado que los iones Cu2+, Cd2+, Ni2+, Zn2+ o Pb2+ limitan el crecimiento de Scenedesmus al alterar la morfología celular y destruir sus cloroplastos20,21.
Los métodos ecológicos para la descomposición de contaminantes orgánicos y la eliminación de iones de metales pesados ​​han atraído la atención de científicos e ingenieros de todo el mundo. Esto se debe principalmente a que estos contaminantes se procesan fácilmente en fase líquida. Sin embargo, los contaminantes cristalinos inorgánicos se caracterizan por su baja solubilidad en agua y su baja susceptibilidad a diversas biotransformaciones, lo que causa grandes dificultades en la remediación, y se ha avanzado poco en este campo22,23,24,25,26. Por lo tanto, la búsqueda de soluciones respetuosas con el medio ambiente para la reparación de nanomateriales sigue siendo un área compleja e inexplorada. Debido al alto grado de incertidumbre con respecto a los efectos de biotransformación de los nanomateriales 2D, no hay una manera fácil de encontrar las posibles vías de su degradación durante la reducción.
En este estudio, utilizamos microalgas verdes como agente activo de biorremediación acuosa para materiales cerámicos inorgánicos, combinado con el monitoreo in situ del proceso de degradación de MXene como representante de materiales cerámicos inorgánicos. El término “MXene” refleja la estequiometría del material Mn+1XnTx, donde M es un metal de transición temprana, X es carbono y/o nitrógeno, Tx es un terminador de superficie (por ejemplo, -OH, -F, -Cl) y n = 1, 2, 3 o 427.28. Desde el descubrimiento de los MXenes por Naguib et al. Sensorics, terapia contra el cáncer y filtración por membrana 27,29,30. Además, los MXenes pueden considerarse como sistemas 2D modelo debido a su excelente estabilidad coloidal y posibles interacciones biológicas31,32,33,34,35,36.
Por lo tanto, la metodología desarrollada en este artículo y nuestras hipótesis de investigación se muestran en la Figura 1. Según esta hipótesis, las microalgas degradan los MXenes a base de Nb en compuestos no tóxicos debido a interacciones fisicoquímicas superficiales, lo que permite la posterior recuperación de las algas. Para comprobar esta hipótesis, se seleccionaron dos miembros de la familia de carburos y/o nitruros de metales de transición tempranos a base de niobio (MXenes), a saber, Nb2CTx y Nb4C3TX.
Metodología de investigación e hipótesis basadas en evidencia para la recuperación de MXene por la microalga verde Raphidocelis subcapitata. Tenga en cuenta que esta es solo una representación esquemática de supuestos basados ​​en evidencia. El entorno del lago difiere en el medio nutritivo utilizado y las condiciones (por ejemplo, ciclo diurno y limitaciones en los nutrientes esenciales disponibles). Creado con BioRender.com.
Por lo tanto, al utilizar MXene como sistema modelo, hemos abierto la puerta al estudio de diversos efectos biológicos que no pueden observarse con otros nanomateriales convencionales. En particular, demostramos la posibilidad de biorremediación de nanomateriales bidimensionales, como los MXenes a base de niobio, mediante la microalga Raphidocelis subcapitata. Las microalgas son capaces de degradar los Nb-MXenes en los óxidos no tóxicos NbO y Nb2O5, que también proporcionan nutrientes a través del mecanismo de absorción de niobio. En general, este estudio responde a una importante pregunta fundamental sobre los procesos asociados a las interacciones fisicoquímicas superficiales que rigen los mecanismos de biorremediación de nanomateriales bidimensionales. Además, estamos desarrollando un método sencillo basado en parámetros de forma para rastrear cambios sutiles en la forma de los nanomateriales 2D. Esto inspira nuevas investigaciones a corto y largo plazo sobre los diversos impactos ambientales de los nanomateriales cristalinos inorgánicos. Así, nuestro estudio aumenta la comprensión de la interacción entre la superficie del material y el material biológico. También estamos sentando las bases para realizar estudios más amplios, tanto a corto como a largo plazo, sobre sus posibles impactos en los ecosistemas de agua dulce, que ahora pueden verificarse fácilmente.
Los MXenes representan una interesante clase de materiales con propiedades físicas y químicas únicas y atractivas, y por lo tanto, muchas aplicaciones potenciales. Estas propiedades dependen en gran medida de su estequiometría y química superficial. Por consiguiente, en nuestro estudio, investigamos dos tipos de MXenes monocapa (SL) jerárquicos basados ​​en Nb, Nb2CTx y Nb4C3TX, dado que se podrían observar diferentes efectos biológicos de estos nanomateriales. Los MXenes se producen a partir de sus materiales de partida mediante el grabado selectivo descendente de capas A de fase MAX de espesor atómico. La fase MAX es una cerámica ternaria compuesta por bloques "unidos" de carburos de metales de transición y capas delgadas de elementos "A" como Al, Si y Sn con estequiometría MnAXn-1. La morfología de la fase MAX inicial se observó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y fue consistente con estudios previos (véase la Información Suplementaria, SI, Figura S1). Se obtuvo Nb-MXene multicapa (ML) después de eliminar la capa de Al con HF al 48% (ácido fluorhídrico). La morfología de ML-Nb2CTx y ML-Nb4C3TX se examinó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) (Figuras S1c y S1d respectivamente) y se observó una morfología MXene laminar típica, similar a nanoflakes bidimensionales que atraviesan hendiduras alargadas en forma de poro. Ambos Nb-MXenes tienen mucho en común con las fases MXene sintetizadas previamente mediante grabado ácido27,38. Después de confirmar la estructura del MXene, lo laminaremos mediante intercalación de hidróxido de tetrabutilamonio (TBAOH) seguido de lavado y sonicación, después de lo cual obtuvimos nanoflakes de Nb-MXene 2D monocapa o de baja capa (SL).
Utilizamos microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) y difracción de rayos X (XRD) para probar la eficiencia del grabado y el posterior desprendimiento. Los resultados de HRTEM procesados ​​utilizando la Transformada Rápida de Fourier Inversa (IFFT) y la Transformada Rápida de Fourier (FFT) se muestran en la Fig. 2. Las nanoflakes de Nb-MXene se orientaron con el borde hacia arriba para verificar la estructura de la capa atómica y medir las distancias interplanares. Las imágenes HRTEM de las nanoflakes de MXene Nb2CTx y Nb4C3TX revelaron su naturaleza de capas atómicamente delgadas (ver Fig. 2a1, a2), como informaron previamente Naguib et al.27 y Jastrzębska et al.38. Para dos monocapas adyacentes de Nb2CTx y Nb4C3Tx, determinamos distancias interlaminares de 0,74 y 1,54 nm, respectivamente (Figs. 2b1,b2), lo que también concuerda con nuestros resultados anteriores38. Esto se confirmó aún más mediante la transformada rápida de Fourier inversa (Fig. 2c1, c2) y la transformada rápida de Fourier (Fig. 2d1, d2) que muestran la distancia entre las monocapas de Nb2CTx y Nb4C3Tx. La imagen muestra una alternancia de bandas claras y oscuras correspondientes a átomos de niobio y carbono, lo que confirma la naturaleza en capas de los MXenes estudiados. Es importante señalar que los espectros de espectroscopia de rayos X de energía dispersiva (EDX) obtenidos para Nb2CTx y Nb4C3Tx (Figuras S2a y S2b) no mostraron ningún remanente de la fase MAX original, ya que no se detectó ningún pico de Al.
Caracterización de nanoflakes de SL Nb2CTx y Nb4C3Tx MXene, incluyendo (a) imágenes de nanoflakes 2D de vista lateral por microscopía electrónica de alta resolución (HRTEM) y su correspondiente, (b) modo de intensidad, (c) transformada rápida inversa de Fourier (IFFT), (d) transformada rápida de Fourier (FFT), (e) patrones de rayos X de Nb-MXenes. Para SL 2D Nb2CTx, los números se expresan como (a1, b1, c1, d1, e1). Para SL 2D Nb4C3Tx, los números se expresan como (a2, b2, c2, d2, e1).
Las mediciones de difracción de rayos X de los MXenes SL Nb2CTx y Nb4C3Tx se muestran en las figuras 2e1 y e2, respectivamente. Los picos (002) en 4,31 y 4,32 corresponden a los MXenes laminares Nb2CTx y Nb4C3TX38,39,40,41 descritos anteriormente, respectivamente. Los resultados de XRD también indican la presencia de algunas estructuras ML residuales y fases MAX, pero principalmente patrones de XRD asociados con SL Nb4C3Tx (Fig. 2e2). La presencia de partículas más pequeñas de la fase MAX puede explicar el pico MAX más intenso en comparación con las capas de Nb4C3Tx apiladas aleatoriamente.
Investigaciones posteriores se han centrado en microalgas verdes pertenecientes a la especie R. subcapitata. Elegimos las microalgas porque son importantes productores involucrados en las principales redes tróficas42. También son uno de los mejores indicadores de toxicidad debido a su capacidad para eliminar sustancias tóxicas que se transportan a niveles superiores de la cadena alimentaria43. Además, la investigación sobre R. subcapitata puede esclarecer la toxicidad incidental de SL Nb-MXenes para microorganismos comunes de agua dulce. Para ilustrar esto, los investigadores plantearon la hipótesis de que cada microbio tiene una sensibilidad diferente a los compuestos tóxicos presentes en el medio ambiente. Para la mayoría de los organismos, las bajas concentraciones de sustancias no afectan su crecimiento, mientras que las concentraciones superiores a cierto límite pueden inhibirlos o incluso causarles la muerte. Por lo tanto, para nuestros estudios de la interacción superficial entre microalgas y MXenes y la recuperación asociada, decidimos probar concentraciones inocuas y tóxicas de Nb-MXenes. Para ello, probamos concentraciones de 0 (como referencia), 0,01, 0,1 y 10 mg l-1 MXene y, además, infectamos microalgas con concentraciones muy altas de MXene (100 mg l-1 MXene), que pueden ser extremas y letales para cualquier entorno biológico.
Los efectos de SL Nb-MXenes sobre las microalgas se muestran en la Figura 3, expresados ​​como el porcentaje de promoción (+) o inhibición (-) del crecimiento medido para muestras de 0 mg l-1. Para comparar, también se probaron la fase Nb-MAX y ML Nb-MXenes, y los resultados se muestran en SI (véase la Fig. S3). Los resultados obtenidos confirmaron que SL Nb-MXenes carece casi por completo de toxicidad en el rango de bajas concentraciones de 0,01 a 10 mg/l, como se muestra en la Fig. 3a,b. En el caso de Nb2CTx, no observamos más del 5% de ecotoxicidad en el rango especificado.
Estimulación (+) o inhibición (-) del crecimiento de microalgas en presencia de SL (a) Nb2CTx y (b) Nb4C3TX MXene. Se analizaron 24, 48 y 72 horas de interacción MXene-microalgas. Los datos significativos (prueba t, p < 0,05) se marcaron con un asterisco (*). Los datos significativos (prueba t, p < 0,05) se marcaron con un asterisco (*). Значимые данные (t-критерий, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Los datos significativos (prueba t, p < 0,05) están marcados con un asterisco (*).重要数据（t 检验，p < 0.05）用星号(*) 标记。重要数据（t 检验，p < 0.05）用星号(*) 标记。 Важные данные (prueba t, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Los datos importantes (prueba t, p < 0,05) están marcados con un asterisco (*).Las flechas rojas indican la abolición de la estimulación inhibitoria.
Por otro lado, las bajas concentraciones de Nb4C3TX resultaron ser ligeramente más tóxicas, pero no más del 7%. Como era de esperar, observamos que los MXenes tenían mayor toxicidad e inhibición del crecimiento de microalgas a 100 mg L-1. Curiosamente, ninguno de los materiales mostró la misma tendencia y dependencia del tiempo de los efectos atóxicos/tóxicos en comparación con las muestras MAX o ML (ver SI para más detalles). Mientras que para la fase MAX (ver Fig. S3) la toxicidad alcanzó aproximadamente 15-25% y aumentó con el tiempo, se observó la tendencia inversa para SL Nb2CTx y Nb4C3TX MXene. La inhibición del crecimiento de microalgas disminuyó con el tiempo. Alcanzó aproximadamente 17% después de 24 horas y cayó a menos del 5% después de 72 horas (Fig. 3a, b, respectivamente).
Más importante aún, para SL Nb4C3TX, la inhibición del crecimiento de microalgas alcanzó aproximadamente el 27% después de 24 horas, pero después de 72 horas disminuyó a aproximadamente el 1%. Por lo tanto, etiquetamos el efecto observado como inhibición inversa de la estimulación, y el efecto fue más fuerte para SL Nb4C3TX MXene. La estimulación del crecimiento de microalgas se notó antes con Nb4C3TX (interacción a 10 mg L-1 durante 24 h) en comparación con SL Nb2CTx MXene. El efecto de reversión de la inhibición-estimulación también se mostró claramente en la curva de tasa de duplicación de biomasa (ver Fig. S4 para más detalles). Hasta ahora, solo se ha estudiado la ecotoxicidad de Ti3C2TX MXene de diferentes maneras. No es tóxico para embriones de pez cebra44 pero es moderadamente ecotóxico para las microalgas Desmodesmus quadricauda y las plantas Sorghum saccharatum45. Otros ejemplos de efectos específicos incluyen una mayor toxicidad para líneas celulares cancerosas que para líneas celulares normales46,47. Cabría suponer que las condiciones de ensayo influirían en los cambios observados en el crecimiento de las microalgas en presencia de Nb-MXenes. Por ejemplo, un pH de aproximadamente 8 en el estroma del cloroplasto es óptimo para el funcionamiento eficiente de la enzima RuBisCO. Por lo tanto, los cambios de pH afectan negativamente a la tasa de fotosíntesis48,49. Sin embargo, no observamos cambios significativos en el pH durante el experimento (véase la figura S5 del material suplementario para más detalles). En general, los cultivos de microalgas con Nb-MXenes redujeron ligeramente el pH de la solución con el tiempo. No obstante, esta disminución fue similar a la de un medio puro. Además, el rango de variaciones encontrado fue similar al medido para un cultivo puro de microalgas (muestra de control). Por consiguiente, concluimos que la fotosíntesis no se ve afectada por los cambios de pH a lo largo del tiempo.
Además, los MXenes sintetizados tienen terminaciones superficiales (denominadas Tx). Estas son principalmente grupos funcionales -O, -F y -OH. Sin embargo, la química de la superficie está directamente relacionada con el método de síntesis. Se sabe que estos grupos se distribuyen aleatoriamente sobre la superficie, lo que dificulta predecir su efecto en las propiedades del MXene50. Se puede argumentar que Tx podría ser la fuerza catalítica para la oxidación del niobio por la luz. Los grupos funcionales de la superficie proporcionan múltiples sitios de anclaje para que sus fotocatalizadores subyacentes formen heterouniones51. Sin embargo, la composición del medio de crecimiento no proporcionó un fotocatalizador eficaz (la composición detallada del medio se puede encontrar en la Tabla S6 del SI). Además, cualquier modificación de la superficie también es muy importante, ya que la actividad biológica de los MXenes puede alterarse debido al postprocesamiento de la capa, la oxidación, la modificación química de la superficie con compuestos orgánicos e inorgánicos52,53,54,55,56 o la ingeniería de carga superficial38. Por lo tanto, para comprobar si el óxido de niobio tiene alguna relación con la inestabilidad del material en el medio, realizamos estudios del potencial zeta (ζ) en el medio de cultivo de microalgas y en agua desionizada (para comparación). Nuestros resultados muestran que los Nb-MXenes SL son bastante estables (véase la figura S6 del material suplementario para los resultados MAX y ML). El potencial zeta de los MXenes SL es de aproximadamente -10 mV. En el caso del SR Nb2CTx, el valor de ζ es algo más negativo que el del Nb4C3Tx. Este cambio en el valor de ζ puede indicar que la superficie de las nanoflakes de MXene con carga negativa absorbe iones con carga positiva del medio de cultivo. Las mediciones temporales del potencial zeta y la conductividad de los Nb-MXenes en el medio de cultivo (véanse las figuras S7 y S8 del material suplementario para más detalles) parecen respaldar nuestra hipótesis.
Sin embargo, ambos Nb-MXene SL mostraron cambios mínimos respecto a cero. Esto demuestra claramente su estabilidad en el medio de cultivo de microalgas. Además, evaluamos si la presencia de nuestras microalgas verdes afectaría la estabilidad de los Nb-MXenes en el medio. Los resultados del potencial zeta y la conductividad de los MXenes después de la interacción con microalgas en medios nutritivos y cultivo a lo largo del tiempo se pueden encontrar en SI (Figuras S9 y S10). Curiosamente, observamos que la presencia de microalgas parecía estabilizar la dispersión de ambos MXenes. En el caso del Nb2CTx SL, el potencial zeta incluso disminuyó ligeramente con el tiempo a valores más negativos (-15,8 frente a -19,1 mV después de 72 h de incubación). El potencial zeta del SL Nb4C3TX aumentó ligeramente, pero después de 72 h todavía mostró mayor estabilidad que las nanoflakes sin la presencia de microalgas (-18,1 frente a -9,1 mV).
También observamos una menor conductividad en las soluciones de Nb-MXene incubadas en presencia de microalgas, lo que indica una menor cantidad de iones en el medio nutritivo. Cabe destacar que la inestabilidad de los MXenes en agua se debe principalmente a la oxidación superficial⁵⁷. Por lo tanto, sospechamos que las microalgas verdes eliminaron de alguna manera los óxidos formados en la superficie del Nb-MXene e incluso previnieron su aparición (oxidación del MXene). Esto se puede comprobar estudiando los tipos de sustancias absorbidas por las microalgas.
Si bien nuestros estudios ecotoxicológicos indicaron que las microalgas pudieron superar la toxicidad de los Nb-MXenes con el tiempo y la inusual inhibición del crecimiento estimulado, el objetivo de nuestro estudio fue investigar posibles mecanismos de acción. Cuando organismos como las algas se exponen a compuestos o materiales desconocidos para sus ecosistemas, pueden reaccionar de diversas maneras58,59. En ausencia de óxidos metálicos tóxicos, las microalgas pueden alimentarse por sí mismas, lo que les permite crecer continuamente60. Tras la ingestión de sustancias tóxicas, pueden activarse mecanismos de defensa, como cambios de forma o estructura. También debe considerarse la posibilidad de absorción58,59. Cabe destacar que cualquier signo de un mecanismo de defensa es un claro indicador de la toxicidad del compuesto de prueba. Por lo tanto, en nuestro trabajo posterior, investigamos la posible interacción superficial entre las nanoflakes de SL Nb-MXene y las microalgas mediante SEM y la posible absorción de MXene a base de Nb mediante espectroscopia de fluorescencia de rayos X (XRF). Cabe señalar que los análisis SEM y XRF se realizaron únicamente a la concentración más alta de MXene para abordar los problemas de toxicidad de la actividad.
Los resultados de la microscopía electrónica de barrido (SEM) se muestran en la figura 4. Las células de microalgas no tratadas (véase la figura 4a, muestra de referencia) mostraron claramente la morfología típica de R. subcapitata y una forma celular similar a un cruasán. Las células aparecen aplanadas y algo desorganizadas. Algunas células de microalgas se superponían y entrelazaban entre sí, pero esto probablemente se debió al proceso de preparación de la muestra. En general, las células de microalgas puras presentaban una superficie lisa y no mostraban cambios morfológicos.
Imágenes SEM que muestran la interacción superficial entre microalgas verdes y nanohojas de MXene después de 72 horas de interacción a una concentración extrema (100 mg L-1). (a) Microalgas verdes sin tratar después de la interacción con SL (b) Nb2CTx y (c) Nb4C3TX MXenes. Nótese que las nanoflakes de Nb-MXene están marcadas con flechas rojas. Para fines comparativos, también se incluyen fotografías de un microscopio óptico.
En contraste, las células de microalgas adsorbidas por nanoflakes de SL Nb-MXene resultaron dañadas (ver Fig. 4b, c, flechas rojas). En el caso de Nb2CTx MXene (Fig. 4b), las microalgas tienden a crecer con nanoescalas bidimensionales adheridas, lo que puede cambiar su morfología. Cabe destacar que también observamos estos cambios bajo microscopía óptica (ver SI Figura S11 para más detalles). Esta transición morfológica tiene una base plausible en la fisiología de las microalgas y su capacidad para defenderse mediante cambios en la morfología celular, como el aumento del volumen celular61. Por lo tanto, es importante verificar el número de células de microalgas que están realmente en contacto con Nb-MXenes. Los estudios SEM mostraron que aproximadamente el 52% de las células de microalgas estaban expuestas a Nb-MXenes, mientras que el 48% de estas células de microalgas evitaron el contacto. En el caso del MXene SL Nb4C3Tx, las microalgas intentan evitar el contacto con el MXene, localizándose y creciendo a partir de nanoescalas bidimensionales (Fig. 4c). Sin embargo, no observamos la penetración de las nanoescalas en las células de las microalgas ni daños en ellas.
La autopreservación es también una respuesta dependiente del tiempo al bloqueo de la fotosíntesis debido a la adsorción de partículas en la superficie celular y al llamado efecto de sombreado⁶². Es evidente que cada objeto (por ejemplo, nanoflakes de Nb-MXene) que se encuentra entre las microalgas y la fuente de luz limita la cantidad de luz absorbida por los cloroplastos. Sin embargo, no cabe duda de que esto tiene un impacto significativo en los resultados obtenidos. Como muestran nuestras observaciones microscópicas, los nanoflakes 2D no estaban completamente envueltos ni adheridos a la superficie de las microalgas, incluso cuando las células de microalgas estaban en contacto con los Nb-MXene. En cambio, los nanoflakes se orientaron hacia las células de microalgas sin cubrir su superficie. Tal conjunto de nanoflakes/microalgas no puede limitar significativamente la cantidad de luz absorbida por las células de microalgas. Además, algunos estudios incluso han demostrado una mejora en la absorción de luz por organismos fotosintéticos en presencia de nanomateriales bidimensionales63,64,65,66.
Dado que las imágenes SEM no pudieron confirmar directamente la absorción de niobio por las células de microalgas, nuestro estudio posterior se centró en el análisis de fluorescencia de rayos X (XRF) y espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) para aclarar este asunto. Por lo tanto, comparamos la intensidad de los picos de Nb de muestras de microalgas de referencia que no interactuaron con MXenes, nanoflakes de MXene desprendidos de la superficie de las células de microalgas y células de microalgas después de la eliminación de los MXenes adheridos. Cabe destacar que si no hay absorción de Nb, el valor de Nb obtenido por las células de microalgas debería ser cero después de la eliminación de las nanoescalas adheridas. Por lo tanto, si se produce la absorción de Nb, tanto los resultados de XRF como de XPS deberían mostrar un pico de Nb claro.
En el caso de los espectros XRF, las muestras de microalgas mostraron picos de Nb para SL Nb2CTx y Nb4C3Tx MXene después de la interacción con SL Nb2CTx y Nb4C3Tx MXene (ver Fig. 5a, también tenga en cuenta que los resultados para MAX y ML MXenes se muestran en SI, Figs. S12–C17). Curiosamente, la intensidad del pico de Nb es la misma en ambos casos (barras rojas en la Fig. 5a). Esto indicó que las algas no podían absorber más Nb, y la capacidad máxima para la acumulación de Nb se alcanzó en las células, aunque se unió el doble de Nb4C3Tx MXene a las células de microalgas (barras azules en la Fig. 5a). Cabe destacar que la capacidad de las microalgas para absorber metales depende de la concentración de óxidos metálicos en el medio67,68. Shamshada et al.67 encontraron que la capacidad de absorción de las algas de agua dulce disminuye con el aumento del pH. Raize et al.68 observaron que la capacidad de las algas marinas para absorber metales era aproximadamente un 25% mayor para el Pb2+ que para el Ni2+.
(a) Resultados de XRF de la absorción basal de Nb por células de microalgas verdes incubadas a una concentración extrema de SL Nb-MXenes (100 mg L-1) durante 72 horas. Los resultados muestran la presencia de α en células de microalgas puras (muestra de control, columnas grises), nanoflakes 2D aislados de células de microalgas superficiales (columnas azules) y células de microalgas después de la separación de nanoflakes 2D de la superficie (columnas rojas). La cantidad de Nb elemental, (b) porcentaje de composición química de componentes orgánicos de microalgas (C=O y CHx/C–O) y óxidos de Nb presentes en células de microalgas después de la incubación con SL Nb-MXenes, (c–e) Ajuste del pico composicional de espectros XPS SL Nb2CTx y (fh) SL Nb4C3Tx MXene internalizado por células de microalgas.
Por lo tanto, esperábamos que el Nb pudiera ser absorbido por las células de algas en forma de óxidos. Para probar esto, realizamos estudios XPS en MXenes Nb2CTx y Nb4C3TX y células de algas. Los resultados de la interacción de microalgas con Nb-MXenes y MXenes aislados de células de algas se muestran en las Figs. 5b. Como se esperaba, detectamos picos de Nb 3d en las muestras de microalgas después de la eliminación del MXene de la superficie de las microalgas. La determinación cuantitativa de C=O, CHx/CO y óxidos de Nb se calculó en base a los espectros Nb 3d, O 1s y C 1s obtenidos con Nb2CTx SL (Fig. 5c–e) y Nb4C3Tx SL (Fig. 5c–e). ) obtenidos de microalgas incubadas. Figura 5f–h) MXenes. La Tabla S1-3 muestra los detalles de los parámetros de pico y la química general resultante del ajuste. Es notable que las regiones Nb 3d de Nb2CTx SL y Nb4C3Tx SL (Fig. 5c, f) corresponden a un componente Nb2O5. Aquí, no encontramos picos relacionados con MXene en los espectros, lo que indica que las células de microalgas solo absorben la forma de óxido de Nb. Además, aproximamos el espectro C 1 s con los componentes C–C, CHx/C–O, C=O y –COOH. Asignamos los picos CHx/C–O y C=O a la contribución orgánica de las células de microalgas. Estos componentes orgánicos representan el 36% y el 41% de los picos C 1s en Nb2CTx SL y Nb4C3TX SL, respectivamente. Luego ajustamos los espectros O 1s de SL Nb2CTx y SL Nb4C3TX con Nb2O5, componentes orgánicos de microalgas (CHx/CO) y agua adsorbida en la superficie.
Finalmente, los resultados de XPS indicaron claramente la forma del Nb, no solo su presencia. Según la posición de la señal Nb 3d y los resultados de la deconvolución, confirmamos que el Nb se absorbe únicamente en forma de óxidos y no de iones ni del propio MXene. Además, los resultados de XPS mostraron que las células de microalgas tienen una mayor capacidad para absorber óxidos de Nb del SL Nb2CTx en comparación con el MXene SL Nb4C3TX.
Si bien nuestros resultados de absorción de Nb son impresionantes y nos permiten identificar la degradación de MXene, no existe ningún método disponible para rastrear los cambios morfológicos asociados en nanoflakes 2D. Por lo tanto, también decidimos desarrollar un método adecuado que pueda responder directamente a cualquier cambio que ocurra en nanoflakes 2D de Nb-MXene y células de microalgas. Es importante señalar que asumimos que si las especies interactuantes experimentan alguna transformación, descomposición o desfragmentación, esto debería manifestarse rápidamente como cambios en parámetros de forma, tales como el diámetro del área circular equivalente, la redondez, el ancho de Feret o la longitud de Feret. Dado que estos parámetros son adecuados para describir partículas alargadas o nanoflakes bidimensionales, su seguimiento mediante análisis dinámico de la forma de las partículas nos proporcionará información valiosa sobre la transformación morfológica de los nanoflakes SL de Nb-MXene durante la reducción.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 6. Para comparar, también probamos la fase MAX original y los ML-MXenes (ver Figuras S18 y S19 del SI). El análisis dinámico de la forma de las partículas mostró que todos los parámetros de forma de dos SL de Nb-MXene cambiaron significativamente después de la interacción con microalgas. Como se muestra en el parámetro de diámetro de área circular equivalente (Fig. 6a, b), la intensidad de pico reducida de la fracción de nanoflakes grandes indica que tienden a descomponerse en fragmentos más pequeños. En la figura 6c, d se muestra una disminución en los picos asociados con el tamaño transversal de los flakes (elongación de los nanoflakes), lo que indica la transformación de nanoflakes 2D en una forma más parecida a una partícula. La Figura 6e-h muestra el ancho y la longitud de Feret, respectivamente. El ancho y la longitud de Feret son parámetros complementarios y, por lo tanto, deben considerarse juntos. Después de la incubación de nanoflakes de Nb-MXene 2D en presencia de microalgas, sus picos de correlación de Feret se desplazaron y su intensidad disminuyó. Basándonos en estos resultados en combinación con la morfología, XRF y XPS, concluimos que los cambios observados están fuertemente relacionados con la oxidación, ya que los MXenes oxidados se arrugan más y se descomponen en fragmentos y partículas de óxido esféricas69,70.
Análisis de la transformación de MXene tras la interacción con microalgas verdes. El análisis dinámico de la forma de las partículas tiene en cuenta parámetros como (a, b) diámetro del área circular equivalente, (c, d) redondez, (e, f) ancho de Feret y (g, h) longitud de Feret. Para ello, se analizaron dos muestras de microalgas de referencia junto con MXenes SL Nb2CTx y SL Nb4C3Tx primarios, MXenes SL Nb2CTx y SL Nb4C3Tx, microalgas degradadas y microalgas tratadas con MXenes SL Nb2CTx y SL Nb4C3Tx. Las flechas rojas muestran las transiciones de los parámetros de forma de las nanoflakes bidimensionales estudiadas.
Dado que el análisis de parámetros de forma es muy fiable, también puede revelar cambios morfológicos en las células de microalgas. Por lo tanto, analizamos el diámetro del área circular equivalente, la redondez y el ancho/longitud de Feret de células de microalgas puras y células después de la interacción con nanoflakes de Nb 2D. En la figura 6a-h se muestran cambios en los parámetros de forma de las células de algas, como lo demuestra una disminución en la intensidad del pico y un desplazamiento de los máximos hacia valores más altos. En particular, los parámetros de redondez celular mostraron una disminución en las células alargadas y un aumento en las células esféricas (Fig. 6a, b). Además, el ancho celular de Feret aumentó en varios micrómetros después de la interacción con SL Nb2CTx MXene (Fig. 6e) en comparación con SL Nb4C3TX MXene (Fig. 6f). Sospechamos que esto puede deberse a la fuerte absorción de óxidos de Nb por las microalgas al interactuar con Nb2CTx SR. La unión menos rígida de los flakes de Nb a su superficie puede resultar en el crecimiento celular con un efecto de sombreado mínimo.
Nuestras observaciones de cambios en los parámetros de forma y tamaño de las microalgas complementan otros estudios. Las microalgas verdes pueden cambiar su morfología en respuesta al estrés ambiental mediante cambios en el tamaño, la forma o el metabolismo celular61. Por ejemplo, el cambio de tamaño celular facilita la absorción de nutrientes71. Las células de algas más pequeñas muestran una menor absorción de nutrientes y una tasa de crecimiento reducida. Por el contrario, las células más grandes tienden a consumir más nutrientes, que luego se depositan intracelularmente72,73. Machado y Soares descubrieron que el fungicida triclosán puede aumentar el tamaño celular. También encontraron cambios profundos en la forma de las algas74. Además, Yin et al.9 también revelaron cambios morfológicos en las algas después de la exposición a nanocompuestos de óxido de grafeno reducido. Por lo tanto, es evidente que los parámetros alterados de tamaño/forma de las microalgas son causados ​​por la presencia de MXene. Dado que este cambio de tamaño y forma es indicativo de cambios en la absorción de nutrientes, creemos que el análisis de los parámetros de tamaño y forma a lo largo del tiempo puede demostrar la absorción de óxido de niobio por las microalgas en presencia de Nb-MXenes.
Además, los MXenes pueden oxidarse en presencia de algas. Dalai et al.75 observaron que la morfología de las algas verdes expuestas a nano-TiO2 y Al2O376 no era uniforme. Aunque nuestras observaciones son similares a las del presente estudio, solo son relevantes para el estudio de los efectos de la biorremediación en términos de productos de degradación de MXene en presencia de nanoflakes 2D y no de nanopartículas. Dado que los MXenes pueden degradarse en óxidos metálicos,31,32,77,78 es razonable suponer que nuestros nanoflakes de Nb también pueden formar óxidos de Nb después de interactuar con células de microalgas.
Para explicar la reducción de nanoflakes de 2D-Nb a través de un mecanismo de descomposición basado en el proceso de oxidación, realizamos estudios utilizando microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM) (Fig. 7a,b) y espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) (Fig. 7c-i y tablas S4-5). Ambos enfoques son adecuados para estudiar la oxidación de materiales 2D y se complementan entre sí. La HRTEM permite analizar la degradación de estructuras laminares bidimensionales y la posterior aparición de nanopartículas de óxido metálico, mientras que la XPS es sensible a los enlaces superficiales. Para este propósito, probamos nanoflakes de 2D Nb-MXene extraídos de dispersiones de células de microalgas, es decir, su forma después de la interacción con células de microalgas (ver Fig. 7).
Imágenes HRTEM que muestran la morfología de los MXenes (a) SL Nb2CTx y (b) SL Nb4C3Tx oxidados, resultados del análisis XPS que muestran (c) la composición de los productos de óxido después de la reducción, (d–f) coincidencia de picos de los componentes de los espectros XPS de SL Nb2CTx y (g–i) Nb4C3Tx SL reparado con microalgas verdes.
Los estudios HRTEM confirmaron la oxidación de dos tipos de nanoflakes de Nb-MXene. Aunque los nanoflakes conservaron su morfología bidimensional en cierta medida, la oxidación dio lugar a la aparición de muchas nanopartículas que cubren la superficie de los nanoflakes de MXene (véase la Fig. 7a,b). El análisis XPS de las señales c Nb 3d y O 1s indicó que se formaron óxidos de Nb en ambos casos. Como se muestra en la Figura 7c, los MXene 2D Nb2CTx y Nb4C3TX tienen señales Nb 3d que indican la presencia de óxidos de NbO y Nb2O5, mientras que las señales O 1s indican el número de enlaces O–Nb asociados con la funcionalización de la superficie del nanoflake 2D. Observamos que la contribución del óxido de Nb es dominante en comparación con Nb-C y Nb3+-O.
En la figura. Las figuras 7g–i muestran los espectros XPS de Nb 3d, C 1s y O 1s SL Nb2CTx (ver Figs. 7d–f) y SL Nb4C3TX MXene aislado de células de microalgas. Los detalles de los parámetros de pico de Nb-MXenes se proporcionan en las Tablas S4–5, respectivamente. Primero analizamos la composición de Nb 3d. A diferencia del Nb absorbido por las células de microalgas, en el MXene aislado de células de microalgas, además de Nb2O5, se encontraron otros componentes. En el Nb2CTx SL, observamos la contribución de Nb3+-O en una cantidad del 15%, mientras que el resto del espectro de Nb 3d estaba dominado por Nb2O5 (85%). Además, la muestra SL Nb4C3TX contiene componentes de Nb-C (9%) y Nb2O5 (91%). Aquí, el Nb-C proviene de dos capas atómicas internas de carburo metálico en Nb4C3Tx SR. Luego, asignamos los espectros C 1s a cuatro componentes diferentes, como hicimos en las muestras internalizadas. Como era de esperar, el espectro C 1s está dominado por carbono grafítico, seguido de contribuciones de partículas orgánicas (CHx/CO y C=O) de células de microalgas. Además, en el espectro O 1s, observamos la contribución de formas orgánicas de células de microalgas, óxido de niobio y agua adsorbida.
Además, investigamos si la escisión de Nb-MXenes está asociada con la presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) en el medio nutritivo y/o las células de microalgas. Para ello, evaluamos los niveles de oxígeno singlete (1O2) en el medio de cultivo y glutatión intracelular, un tiol que actúa como antioxidante en las microalgas. Los resultados se muestran en SI (Figuras S20 y S21). Los cultivos con SL Nb2CTx y Nb4C3TX MXenes se caracterizaron por una cantidad reducida de 1O2 (véase la Figura S20). En el caso de SL Nb2CTx, el MXene 1O2 se reduce a aproximadamente un 83%. Para los cultivos de microalgas que utilizan SL, el Nb4C3TX 1O2 disminuyó aún más, a un 73%. Curiosamente, los cambios en 1O2 mostraron la misma tendencia que el efecto inhibitorio-estimulante observado previamente (véase la Fig. 3). Se puede argumentar que la incubación en luz brillante puede alterar la fotooxidación. Sin embargo, los resultados del análisis de control mostraron niveles casi constantes de 1O2 durante el experimento (Fig. S22). En el caso de los niveles intracelulares de ROS, también observamos la misma tendencia descendente (véase la Figura S21). Inicialmente, los niveles de ROS en las células de microalgas cultivadas en presencia de SL Nb2CTx y Nb4C3Tx superaron los niveles encontrados en cultivos puros de microalgas. Sin embargo, con el tiempo, pareció que las microalgas se adaptaron a la presencia de ambos Nb-MXenes, ya que los niveles de ROS disminuyeron al 85 % y al 91 % de los niveles medidos en cultivos puros de microalgas inoculadas con SL Nb2CTx y Nb4C3TX, respectivamente. Esto podría indicar que las microalgas se sienten más cómodas con el tiempo en presencia de Nb-MXene que en el medio nutritivo solo.
Las microalgas son un grupo diverso de organismos fotosintéticos. Durante la fotosíntesis, convierten el dióxido de carbono atmosférico (CO2) en carbono orgánico. Los productos de la fotosíntesis son glucosa y oxígeno79. Sospechamos que el oxígeno así formado juega un papel crítico en la oxidación de los Nb-MXenes. Una posible explicación es que el parámetro de aireación diferencial se forma a bajas y altas presiones parciales de oxígeno fuera y dentro de las nanoflakes de Nb-MXene. Esto significa que dondequiera que haya áreas con diferentes presiones parciales de oxígeno, el área con el nivel más bajo formará el ánodo80, 81, 82. Aquí, las microalgas contribuyen a la creación de células con aireación diferencial en la superficie de las láminas de MXene, que producen oxígeno debido a sus propiedades fotosintéticas. Como resultado, se forman productos de biocorrosión (en este caso, óxidos de niobio). Otro aspecto es que las microalgas pueden producir ácidos orgánicos que se liberan al agua83,84. Por lo tanto, se forma un ambiente agresivo, lo que altera los Nb-MXenes. Además, las microalgas pueden modificar el pH del ambiente, haciéndolo alcalino debido a la absorción de dióxido de carbono, lo que también puede provocar corrosión79.
Más importante aún, el fotoperiodo oscuro/luz utilizado en nuestro estudio es fundamental para comprender los resultados obtenidos. Este aspecto se describe en detalle en Djemai-Zoghlache et al. 85 Ellos utilizaron deliberadamente un fotoperiodo de 12/12 horas para demostrar la biocorrosión asociada con la bioincrustación por la microalga roja Porphyridium purpureum. Muestran que el fotoperiodo está asociado con la evolución del potencial sin biocorrosión, manifestándose como oscilaciones pseudoperiódicas alrededor de las 24:00. Estas observaciones fueron confirmadas por Dowling et al. 86 Ellos demostraron biopelículas fotosintéticas de la cianobacteria Anabaena. El oxígeno disuelto se forma bajo la acción de la luz, lo que está asociado con un cambio o fluctuaciones en el potencial libre de biocorrosión. La importancia del fotoperiodo se enfatiza por el hecho de que el potencial libre para la biocorrosión aumenta en la fase de luz y disminuye en la fase oscura. Esto se debe al oxígeno producido por las microalgas fotosintéticas, que influye en la reacción catódica a través de la presión parcial generada cerca de los electrodos87.
Además, se realizó espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) para determinar si se produjeron cambios en la composición química de las células de microalgas después de la interacción con Nb-MXenes. Estos resultados obtenidos son complejos y los presentamos en SI (Figuras S23-S25, incluyendo los resultados de la etapa MAX y ML MXenes). En resumen, los espectros de referencia obtenidos de las microalgas nos proporcionan información importante sobre las características químicas de estos organismos. Estas vibraciones más probables se encuentran en las frecuencias de 1060 cm-1 (CO), 1540 cm-1, 1640 cm-1 (C=C), 1730 cm-1 (C=O), 2850 cm-1, 2920 cm-1. one. 1 1 (C–H) y 3280 cm–1 (O–H). Para SL Nb-MXenes, encontramos una señal de estiramiento del enlace CH que es consistente con nuestro estudio anterior38. Sin embargo, observamos que algunos picos adicionales asociados con los enlaces C=C y CH desaparecieron. Esto indica que la composición química de las microalgas puede sufrir cambios menores debido a la interacción con los SL Nb-MXenes.
Al considerar posibles cambios en la bioquímica de las microalgas, es necesario reconsiderar la acumulación de óxidos inorgánicos, como el óxido de niobio59. Este participa en la absorción de metales por la superficie celular, su transporte al citoplasma, su asociación con grupos carboxilo intracelulares y su acumulación en los polifosfosomas de las microalgas20,88,89,90. Además, la relación entre las microalgas y los metales se mantiene mediante grupos funcionales de las células. Por esta razón, la absorción también depende de la química de la superficie de las microalgas, que es bastante compleja9,91. En general, como era de esperar, la composición química de las microalgas verdes cambió ligeramente debido a la absorción de óxido de Nb.
Curiosamente, la inhibición inicial observada en las microalgas fue reversible con el tiempo. Como observamos, las microalgas superaron el cambio ambiental inicial y finalmente recuperaron sus tasas de crecimiento normales, e incluso las incrementaron. Los estudios del potencial zeta muestran una alta estabilidad al introducirse en medios nutritivos. Por lo tanto, la interacción superficial entre las células de microalgas y las nanoflakes de Nb-MXene se mantuvo durante todos los experimentos de reducción. En nuestro análisis posterior, resumimos los principales mecanismos de acción que subyacen a este notable comportamiento de las microalgas.
Las observaciones mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) han demostrado que las microalgas tienden a adherirse a los Nb-MXenes. Mediante análisis dinámico de imágenes, confirmamos que este efecto conduce a la transformación de nanoflakes bidimensionales de Nb-MXene en partículas más esféricas, lo que demuestra que la descomposición de los nanoflakes está asociada a su oxidación. Para comprobar nuestra hipótesis, realizamos una serie de estudios de materiales y bioquímicos. Tras las pruebas, los nanoflakes se oxidaron gradualmente y se descompusieron en productos de NbO y Nb2O5, que no supusieron una amenaza para las microalgas verdes. Mediante observación por espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), no encontramos cambios significativos en la composición química de las microalgas incubadas en presencia de nanoflakes bidimensionales de Nb-MXene. Teniendo en cuenta la posibilidad de absorción de óxido de niobio por las microalgas, realizamos un análisis de fluorescencia de rayos X. Estos resultados muestran claramente que las microalgas estudiadas se alimentan de óxidos de niobio (NbO y Nb2O5), que no son tóxicos para ellas.