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O rápido desenvolvimento da nanotecnologia e sua integração em aplicações cotidianas podem representar uma ameaça ao meio ambiente. Embora métodos ecológicos para a degradação de contaminantes orgânicos estejam bem estabelecidos, a recuperação de contaminantes cristalinos inorgânicos é uma grande preocupação devido à sua baixa sensibilidade à biotransformação e à falta de compreensão das interações da superfície do material com os organismos vivos. Neste trabalho, utilizamos um modelo de MXenes 2D inorgânicos à base de Nb, combinado com um método simples de análise de parâmetros de forma, para investigar o mecanismo de biorremediação de nanomateriais cerâmicos 2D pela microalga verde Raphidocelis subcapitata. Descobrimos que as microalgas degradam os MXenes à base de Nb devido a interações físico-químicas relacionadas à superfície. Inicialmente, nanoflocos de MXene de camada única e multicamadas aderiram à superfície das microalgas, o que reduziu um pouco o crescimento das algas. No entanto, após interação prolongada com a superfície, as microalgas oxidaram os nanoflocos de MXene e os decompuseram em NbO e Nb₂O₅. Como esses óxidos não são tóxicos para as células de microalgas, elas consomem nanopartículas de óxido de Nb por um mecanismo de absorção que, após 72 horas de tratamento da água, promove a recuperação das microalgas. Os efeitos dos nutrientes associados à absorção também se refletem no aumento do volume celular, na sua forma mais uniforme e na alteração da taxa de crescimento. Com base nessas descobertas, concluímos que a presença de MXenes à base de Nb em ecossistemas de água doce, tanto a curto quanto a longo prazo, pode causar apenas impactos ambientais mínimos. É importante ressaltar que, utilizando nanomateriais bidimensionais como sistemas modelo, demonstramos a possibilidade de rastrear a transformação da forma mesmo em materiais de granulação fina. Em suma, este estudo responde a uma importante questão fundamental sobre os processos relacionados à interação superficial que impulsionam o mecanismo de biorremediação de nanomateriais 2D e fornece uma base para futuros estudos de curto e longo prazo sobre o impacto ambiental de nanomateriais cristalinos inorgânicos.
Os nanomateriais têm gerado grande interesse desde sua descoberta, e diversas nanotecnologias entraram recentemente em uma fase de modernização¹. Infelizmente, a integração de nanomateriais em aplicações cotidianas pode levar a liberações acidentais devido ao descarte inadequado, manuseio descuidado ou infraestrutura de segurança insuficiente. Portanto, é razoável supor que nanomateriais, incluindo nanomateriais bidimensionais (2D), possam ser liberados no meio ambiente, cujo comportamento e atividade biológica ainda não são totalmente compreendidos. Assim, não é surpreendente que as preocupações com a ecotoxicidade tenham se concentrado na capacidade dos nanomateriais 2D de se infiltrarem em sistemas aquáticos²,³,⁴,⁵,⁶. Nesses ecossistemas, alguns nanomateriais 2D podem interagir com diversos organismos em diferentes níveis tróficos, incluindo microalgas.
As microalgas são organismos primitivos encontrados naturalmente em ecossistemas de água doce e marinhos que produzem uma variedade de produtos químicos através da fotossíntese7. Como tal, são cruciais para os ecossistemas aquáticos8,9,10,11,12, mas também são indicadores de ecotoxicidade sensíveis, baratos e amplamente utilizados13,14. Como as células de microalgas se multiplicam rapidamente e respondem prontamente à presença de vários compostos, elas são promissoras para o desenvolvimento de métodos ecologicamente corretos para o tratamento de água contaminada com substâncias orgânicas15,16.
As células de algas podem remover íons inorgânicos da água por meio de biossorção e acumulação17,18. Algumas espécies de algas, como Chlorella, Anabaena invar, Westiellopsis prolifica, Stigeoclonium tenue e Synechococcus sp., demonstraram transportar e até mesmo nutrir íons metálicos tóxicos, como Fe2+, Cu2+, Zn2+ e Mn2+19. Outros estudos mostraram que os íons Cu2+, Cd2+, Ni2+, Zn2+ ou Pb2+ limitam o crescimento de Scenedesmus, alterando a morfologia celular e destruindo seus cloroplastos20,21.
Métodos ecológicos para a decomposição de poluentes orgânicos e a remoção de íons de metais pesados ​​têm atraído a atenção de cientistas e engenheiros em todo o mundo. Isso se deve principalmente ao fato de que esses contaminantes são facilmente processados ​​na fase líquida. No entanto, poluentes inorgânicos cristalinos são caracterizados por baixa solubilidade em água e baixa suscetibilidade a diversas biotransformações, o que causa grandes dificuldades na remediação, e pouco progresso tem sido feito nessa área.^{22,23,24,25,26} Assim, a busca por soluções ecologicamente corretas para o reparo de nanomateriais permanece uma área complexa e inexplorada. Devido ao alto grau de incerteza em relação aos efeitos da biotransformação de nanomateriais 2D, não há uma maneira fácil de descobrir as possíveis vias de sua degradação durante a redução.
Neste estudo, utilizamos microalgas verdes como agente ativo de biorremediação aquosa para materiais cerâmicos inorgânicos, em combinação com o monitoramento in situ do processo de degradação do MXene como representante de materiais cerâmicos inorgânicos. O termo “MXene” reflete a estequiometria do material Mn+1XnTx, onde M é um metal de transição inicial, X é carbono e/ou nitrogênio, Tx é um terminador de superfície (por exemplo, -OH, -F, -Cl) e n = 1, 2, 3 ou 427,28. Desde a descoberta dos MXenes por Naguib et al. Sensorics, cancer therapy and membrane filtration 27,29,30. Além disso, os MXenes podem ser considerados sistemas 2D modelo devido à sua excelente estabilidade coloidal e possíveis interações biológicas31,32,33,34,35,36.
Portanto, a metodologia desenvolvida neste artigo e nossas hipóteses de pesquisa são apresentadas na Figura 1. De acordo com essa hipótese, as microalgas degradam os MXenes à base de Nb em compostos não tóxicos devido a interações físico-químicas relacionadas à superfície, o que permite a recuperação posterior das algas. Para testar essa hipótese, foram selecionados dois membros da família de carbetos e/ou nitretos de metais de transição à base de nióbio (MXenes), nomeadamente Nb2CTx e Nb4C3TX.
Metodologia de pesquisa e hipóteses baseadas em evidências para a recuperação de MXene pela microalga verde Raphidocelis subcapitata. Observe que esta é apenas uma representação esquemática das suposições baseadas em evidências. O ambiente lacustre difere no meio de cultura utilizado e nas condições (por exemplo, ciclo diurno e limitações na disponibilidade de nutrientes essenciais). Criado com BioRender.com.
Portanto, ao utilizarmos o MXene como sistema modelo, abrimos caminho para o estudo de diversos efeitos biológicos que não podem ser observados com outros nanomateriais convencionais. Em particular, demonstramos a possibilidade de biorremediação de nanomateriais bidimensionais, como os MXenes à base de nióbio, pela microalga Raphidocelis subcapitata. As microalgas são capazes de degradar os Nb-MXenes em óxidos não tóxicos, NbO e Nb₂O₅, que também fornecem nutrientes por meio do mecanismo de absorção de nióbio. De modo geral, este estudo responde a uma importante questão fundamental sobre os processos associados às interações físico-químicas de superfície que governam os mecanismos de biorremediação de nanomateriais bidimensionais. Além disso, estamos desenvolvendo um método simples, baseado em parâmetros de forma, para rastrear mudanças sutis na forma de nanomateriais 2D. Isso inspira pesquisas adicionais, tanto de curto quanto de longo prazo, sobre os diversos impactos ambientais de nanomateriais cristalinos inorgânicos. Assim, nosso estudo amplia a compreensão da interação entre a superfície do material e o material biológico. Estamos também a fornecer a base para estudos alargados a curto e longo prazo sobre os seus possíveis impactos nos ecossistemas de água doce, que agora podem ser facilmente verificados.
Os MXenes representam uma classe interessante de materiais com propriedades físicas e químicas únicas e atraentes, e, portanto, com muitas aplicações potenciais. Essas propriedades dependem em grande parte de sua estequiometria e química de superfície. Assim, neste estudo, investigamos dois tipos de MXenes hierárquicos de camada única (SL) à base de Nb, Nb₂CTₓ e Nb₄C₃TX, visto que diferentes efeitos biológicos desses nanomateriais podem ser observados. Os MXenes são produzidos a partir de seus materiais de partida por meio de ataque seletivo de cima para baixo de camadas A de fase MAX atomicamente finas. A fase MAX é uma cerâmica ternária composta por blocos "ligados" de carbetos de metais de transição e camadas finas de elementos "A", como Al, Si e Sn, com estequiometria MnAXn₁. A morfologia da fase MAX inicial foi observada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e foi consistente com estudos anteriores (ver Informações Suplementares, SI, Figura S1). O Nb-MXene multicamadas (ML) foi obtido após a remoção da camada de Al com HF (ácido fluorídrico) a 48%. A morfologia do ML-Nb2CTx e do ML-Nb4C3TX foi examinada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) (Figuras S1c e S1d, respectivamente) e observou-se uma morfologia típica de MXene em camadas, semelhante a nanoflocos bidimensionais passando por fendas alongadas semelhantes a poros. Ambos os Nb-MXenes têm muito em comum com as fases de MXene sintetizadas anteriormente por ataque ácido27,38. Após a confirmação da estrutura do MXene, realizamos a estratificação por intercalação de hidróxido de tetrabutilamônio (TBAOH), seguida de lavagem e sonicação, obtendo-se, em seguida, nanoflocos de Nb-MXene bidimensionais de camada única ou com poucas camadas (SL).
Utilizamos microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM) e difração de raios X (XRD) para testar a eficiência da corrosão e posterior remoção da camada superficial. Os resultados da HRTEM, processados ​​utilizando a Transformada Rápida de Fourier Inversa (IFFT) e a Transformada Rápida de Fourier (FFT), são mostrados na Figura 2. Nanoflocos de Nb-MXene foram orientados com a borda para cima para verificar a estrutura da camada atômica e medir as distâncias interplanares. As imagens de HRTEM dos nanoflocos de MXene Nb2CTx e Nb4C3TX revelaram sua natureza de camada atomicamente fina (ver Figuras 2a1 e a2), como relatado anteriormente por Naguib et al.27 e Jastrzębska et al.38. Para duas monocamadas adjacentes de Nb2CTx e Nb4C3Tx, determinamos distâncias interplanares de 0,74 e 1,54 nm, respectivamente (Figuras 2b1 e b2), o que também concorda com nossos resultados anteriores38. Isso foi ainda confirmado pela transformada rápida de Fourier inversa (Fig. 2c1, c2) e pela transformada rápida de Fourier (Fig. 2d1, d2), que mostram a distância entre as monocamadas de Nb2CTx e Nb4C3Tx. A imagem mostra uma alternância de bandas claras e escuras correspondentes aos átomos de nióbio e carbono, o que confirma a natureza em camadas dos MXenes estudados. É importante notar que os espectros de espectroscopia de raios X por dispersão de energia (EDX) obtidos para Nb2CTx e Nb4C3Tx (Figuras S2a e S2b) não mostraram nenhum resquício da fase MAX original, visto que nenhum pico de Al foi detectado.
Caracterização de nanoflocos de MXene Nb2CTx e Nb4C3Tx em monocamada, incluindo (a) imagem 2D de microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM) em vista lateral e correspondente, (b) modo de intensidade, (c) transformada inversa rápida de Fourier (IFFT), (d) transformada rápida de Fourier (FFT), (e) padrões de raios X de Nb-MXenes. Para Nb2CTx 2D em monocamada, os números são expressos como (a1, b1, c1, d1, e1). Para Nb4C3Tx 2D em monocamada, os números são expressos como (a2, b2, c2, d2, e1).
As medições de difração de raios X dos MXenes SL Nb2CTx e Nb4C3Tx são mostradas nas Figuras 2e1 e e2, respectivamente. Os picos (002) em 4,31 e 4,32 correspondem aos MXenes em camadas Nb2CTx e Nb4C3TX38,39,40,41 descritos anteriormente, respectivamente. Os resultados de DRX também indicam a presença de algumas estruturas ML residuais e fases MAX, mas principalmente padrões de DRX associados ao Nb4C3Tx SL (Figura 2e2). A presença de partículas menores da fase MAX pode explicar o pico MAX mais intenso em comparação com as camadas de Nb4C3Tx empilhadas aleatoriamente.
Pesquisas adicionais têm se concentrado em microalgas verdes pertencentes à espécie *R. subcapitata*. Escolhemos microalgas por serem importantes produtoras envolvidas em grandes cadeias alimentares⁴². Elas também são um dos melhores indicadores de toxicidade devido à capacidade de remover substâncias tóxicas que são transportadas para níveis mais altos da cadeia alimentar⁴³. Além disso, a pesquisa com *R. subcapitata* pode esclarecer a toxicidade incidental de Nb-MXenes de superfície para microrganismos comuns de água doce. Para ilustrar isso, os pesquisadores levantaram a hipótese de que cada microrganismo possui uma sensibilidade diferente a compostos tóxicos presentes no ambiente. Para a maioria dos organismos, baixas concentrações de substâncias não afetam seu crescimento, enquanto concentrações acima de um certo limite podem inibi-los ou até mesmo causar a morte. Portanto, para nossos estudos sobre a interação superficial entre microalgas e MXenes e a recuperação associada, decidimos testar concentrações inofensivas e tóxicas de Nb-MXenes. Para isso, testamos concentrações de 0 (como referência), 0,01, 0,1 e 10 mg l-1 de MXene e, adicionalmente, infectamos microalgas com concentrações muito altas de MXene (100 mg l-1 de MXene), que podem ser extremas e letais para qualquer ambiente biológico.
Os efeitos dos SL Nb-MXenes em microalgas são mostrados na Figura 3, expressos como a porcentagem de promoção (+) ou inibição (-) do crescimento, medida para amostras de 0 mg l-1. Para comparação, a fase Nb-MAX e os ML Nb-MXenes também foram testados e os resultados são mostrados no SI (ver Fig. S3). Os resultados obtidos confirmaram que os SL Nb-MXenes são praticamente isentos de toxicidade na faixa de baixas concentrações de 0,01 a 10 mg/l, como mostrado nas Figuras 3a e 3b. No caso do Nb2CTx, observamos ecotoxicidade de no máximo 5% na faixa especificada.
Estímulo (+) ou inibição (-) do crescimento de microalgas na presença de SL (a) Nb2CTx e (b) Nb4C3TX MXene. Foram analisadas as interações MXene-microalgas após 24, 48 e 72 horas. Dados significativos (teste t, p < 0,05) foram marcados com um asterisco (*). Dados significativos (teste t, p < 0,05) foram marcados com um asterisco (*). Значимые данные (t-критерий, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Dados significativos (teste t, p < 0,05) estão marcados com um asterisco (*).重要数据（t 检验，p < 0.05）用星号(*) 标记。重要数据（t 检验，p < 0.05）用星号(*) 标记。 Важные данные (teste t, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Dados importantes (teste t, p < 0,05) estão marcados com um asterisco (*).As setas vermelhas indicam a abolição da estimulação inibitória.
Por outro lado, baixas concentrações de Nb4C3TX mostraram-se ligeiramente mais tóxicas, mas não superiores a 7%. Como esperado, observamos que os MXenes apresentaram maior toxicidade e inibição do crescimento de microalgas a 100 mg L-1. Curiosamente, nenhum dos materiais apresentou a mesma tendência e dependência temporal dos efeitos atóxicos/tóxicos em comparação com as amostras MAX ou ML (ver SI para detalhes). Enquanto para a fase MAX (ver Fig. S3) a toxicidade atingiu aproximadamente 15–25% e aumentou com o tempo, a tendência inversa foi observada para os MXenes SL Nb2CTx e Nb4C3TX. A inibição do crescimento de microalgas diminuiu ao longo do tempo. Atingiu aproximadamente 17% após 24 horas e caiu para menos de 5% após 72 horas (Fig. 3a, b, respectivamente).
Mais importante ainda, para o SL Nb4C3TX, a inibição do crescimento de microalgas atingiu cerca de 27% após 24 horas, mas após 72 horas diminuiu para cerca de 1%. Portanto, denominamos o efeito observado como inibição inversa da estimulação, sendo o efeito mais forte para o SL Nb4C3TX MXene. A estimulação do crescimento de microalgas foi observada mais precocemente com o Nb4C3TX (interação a 10 mg L-1 por 24 h) em comparação com o SL Nb2CTx MXene. O efeito de reversão inibição-estimulação também foi bem demonstrado na curva da taxa de duplicação da biomassa (ver Fig. S4 para detalhes). Até o momento, apenas a ecotoxicidade do Ti3C2TX MXene foi estudada de diferentes maneiras. Ele não é tóxico para embriões de zebrafish44, mas é moderadamente ecotóxico para as microalgas Desmodesmus quadricauda e plantas de Sorghum saccharatum45. Outros exemplos de efeitos específicos incluem maior toxicidade para linhagens de células cancerígenas do que para linhagens de células normais46,47. Poder-se-ia supor que as condições do teste influenciariam as alterações no crescimento das microalgas observadas na presença de Nb-MXenes. Por exemplo, um pH em torno de 8 no estroma do cloroplasto é ideal para o funcionamento eficiente da enzima RuBisCO. Portanto, alterações de pH afetam negativamente a taxa de fotossíntese^48,49. Contudo, não observamos alterações significativas no pH durante o experimento (ver SI, Fig. S5 para detalhes). Em geral, as culturas de microalgas com Nb-MXenes apresentaram uma leve redução no pH da solução ao longo do tempo. Entretanto, essa redução foi semelhante à alteração no pH de um meio puro. Além disso, a amplitude das variações encontradas foi similar à medida para uma cultura pura de microalgas (amostra controle). Assim, concluímos que a fotossíntese não é afetada por alterações no pH ao longo do tempo.
Além disso, os MXenes sintetizados possuem terminações superficiais (denotadas como Tx). Estas são principalmente grupos funcionais -O, -F e -OH. No entanto, a química da superfície está diretamente relacionada ao método de síntese. Sabe-se que esses grupos estão distribuídos aleatoriamente sobre a superfície, dificultando a previsão de seu efeito sobre as propriedades do MXene50. Pode-se argumentar que Tx poderia ser a força catalítica para a oxidação do nióbio pela luz. Os grupos funcionais da superfície, de fato, fornecem múltiplos sítios de ancoragem para seus fotocatalisadores subjacentes, formando heterojunções51. Contudo, a composição do meio de crescimento não forneceu um fotocatalisador eficaz (a composição detalhada do meio pode ser encontrada na Tabela S6 do SI). Além disso, qualquer modificação da superfície também é muito importante, visto que a atividade biológica dos MXenes pode ser alterada devido ao pós-processamento da camada, oxidação, modificação química da superfície por compostos orgânicos e inorgânicos52,53,54,55,56 ou engenharia de carga superficial38. Portanto, para testar se o óxido de nióbio tem alguma relação com a instabilidade do material no meio, realizamos estudos do potencial zeta (ζ) em meio de cultura de microalgas e água deionizada (para comparação). Nossos resultados mostram que os Nb-MXenes de camada única (SL) são bastante estáveis ​​(veja a Figura S6 do SI para os resultados de MAX e ML). O potencial zeta dos SL MXenes é de aproximadamente -10 mV. No caso do Nb2CTx de camada única (SR), o valor de ζ é um pouco mais negativo do que o do Nb4C3Tx. Essa variação no valor de ζ pode indicar que a superfície dos nanoflocos de MXene carregados negativamente absorve íons carregados positivamente do meio de cultura. Medições temporais do potencial zeta e da condutividade dos Nb-MXenes em meio de cultura (veja as Figuras S7 e S8 no SI para mais detalhes) parecem corroborar nossa hipótese.
No entanto, ambas as monocamadas de Nb-MXene apresentaram alterações mínimas em relação a zero. Isso demonstra claramente sua estabilidade no meio de cultura de microalgas. Além disso, avaliamos se a presença de nossas microalgas verdes afetaria a estabilidade das Nb-MXenes no meio. Os resultados do potencial zeta e da condutividade das MXenes após a interação com as microalgas em meio nutritivo e em cultura ao longo do tempo podem ser encontrados no SI (Figuras S9 e S10). Curiosamente, observamos que a presença de microalgas pareceu estabilizar a dispersão de ambas as MXenes. No caso da monocamada Nb2CTx, o potencial zeta até diminuiu ligeiramente ao longo do tempo para valores mais negativos (-15,8 versus -19,1 mV após 72 h de incubação). O potencial zeta da monocamada Nb4C3TX aumentou ligeiramente, mas após 72 h ainda apresentou maior estabilidade do que as nanofolhas sem a presença de microalgas (-18,1 vs. -9,1 mV).
Também observamos menor condutividade em soluções de Nb-MXene incubadas na presença de microalgas, indicando uma menor quantidade de íons no meio de cultura. Notavelmente, a instabilidade dos MXenes em água deve-se principalmente à oxidação superficial⁵⁷. Portanto, suspeitamos que as microalgas verdes, de alguma forma, removeram os óxidos formados na superfície do Nb-MXene e até mesmo impediram sua ocorrência (oxidação do MXene). Isso pode ser comprovado pelo estudo dos tipos de substâncias absorvidas pelas microalgas.
Embora nossos estudos ecotoxicológicos tenham indicado que as microalgas foram capazes de superar a toxicidade dos Nb-MXenes ao longo do tempo e a inibição incomum do crescimento estimulado, o objetivo do nosso estudo foi investigar possíveis mecanismos de ação. Quando organismos como as algas são expostos a compostos ou materiais desconhecidos em seus ecossistemas, eles podem reagir de diversas maneiras^58,59. Na ausência de óxidos metálicos tóxicos, as microalgas podem se alimentar, permitindo seu crescimento contínuo⁶⁰. Após a ingestão de substâncias tóxicas, mecanismos de defesa podem ser ativados, como a mudança de forma. A possibilidade de absorção também deve ser considerada^58,59. Notavelmente, qualquer sinal de um mecanismo de defesa é um claro indicador da toxicidade do composto testado. Portanto, em nosso trabalho subsequente, investigamos a potencial interação superficial entre nanoflocos de Nb-MXene monocamada e microalgas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e a possível absorção do MXene à base de Nb por espectroscopia de fluorescência de raios X (FRX). Note-se que as análises SEM e XRF foram realizadas apenas na concentração mais elevada de MXene para abordar questões de toxicidade da atividade.
Os resultados da microscopia eletrônica de varredura (MEV) são mostrados na Figura 4. As células de microalgas não tratadas (ver Figura 4a, amostra de referência) apresentaram claramente a morfologia típica de R. subcapitata e formato celular semelhante a um croissant. As células parecem achatadas e um tanto desorganizadas. Algumas células de microalgas estavam sobrepostas e entrelaçadas umas com as outras, mas isso provavelmente foi causado pelo processo de preparação da amostra. Em geral, as células de microalgas puras apresentavam uma superfície lisa e não mostraram quaisquer alterações morfológicas.
Imagens de MEV mostrando a interação superficial entre microalgas verdes e nanofolhas de MXene após 72 horas de interação em concentração extrema (100 mg L⁻¹). (a) Microalgas verdes não tratadas após interação com SL (b) Nb₂CTₓ e (c) Nb₄C₃TX MXenes. Observe que as nanofolhas de Nb-MXene estão marcadas com setas vermelhas. Para comparação, fotografias de um microscópio óptico também foram adicionadas.
Em contraste, as células de microalgas adsorvidas por nanoflocos de Nb-MXene SL foram danificadas (ver Fig. 4b, c, setas vermelhas). No caso do Nb2CTx MXene (Fig. 4b), as microalgas tendem a crescer com nanoestruturas bidimensionais aderidas, o que pode alterar sua morfologia. Notavelmente, também observamos essas alterações sob microscopia óptica (ver Figura S11 do SI para detalhes). Essa transição morfológica tem uma base plausível na fisiologia das microalgas e em sua capacidade de se defenderem alterando a morfologia celular, como o aumento do volume celular⁶¹. Portanto, é importante verificar o número de células de microalgas que estão efetivamente em contato com os Nb-MXenes. Estudos de MEV mostraram que aproximadamente 52% das células de microalgas foram expostas aos Nb-MXenes, enquanto 48% dessas células evitaram o contato. No caso do MXene SL Nb4C3Tx, as microalgas tentam evitar o contato com o MXene, localizando-se e crescendo a partir de nanoescalas bidimensionais (Fig. 4c). No entanto, não observamos a penetração das nanoescalas nas células das microalgas nem danos a elas.
A autopreservação também é uma resposta temporal ao bloqueio da fotossíntese devido à adsorção de partículas na superfície celular e ao chamado efeito de sombreamento (shading)62. É evidente que cada objeto (por exemplo, nanoflocos de Nb-MXene) que se encontra entre a microalga e a fonte de luz limita a quantidade de luz absorvida pelos cloroplastos. Contudo, não temos dúvidas de que isso tem um impacto significativo nos resultados obtidos. Como demonstrado por nossas observações microscópicas, os nanoflocos 2D não envolveram ou aderiram completamente à superfície da microalga, mesmo quando as células da microalga estavam em contato com os Nb-MXenes. Em vez disso, os nanoflocos mostraram-se orientados em relação às células da microalga sem cobrir sua superfície. Tal conjunto nanoflocos/microalga não consegue limitar significativamente a quantidade de luz absorvida pelas células da microalga. Além disso, alguns estudos demonstraram até mesmo uma melhoria na absorção de luz por organismos fotossintéticos na presença de nanomateriais bidimensionais63,64,65,66.
Como as imagens de MEV não puderam confirmar diretamente a absorção de nióbio pelas células de microalgas, nosso estudo subsequente recorreu à análise de fluorescência de raios X (FRX) e espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) para esclarecer essa questão. Portanto, comparamos a intensidade dos picos de Nb em amostras de microalgas de referência que não interagiram com MXenes, em nanoflocos de MXene desprendidos da superfície das células de microalgas e em células de microalgas após a remoção dos MXenes aderidos. Vale ressaltar que, se não houver absorção de Nb, o valor de Nb obtido pelas células de microalgas deve ser zero após a remoção das nanopartículas aderidas. Portanto, se a absorção de Nb ocorrer, os resultados de FRX e XPS devem mostrar um pico de Nb nítido.
No caso dos espectros de XRF, as amostras de microalgas apresentaram picos de Nb para SL Nb2CTx e Nb4C3Tx MXene após interação com SL Nb2CTx e Nb4C3Tx MXene (ver Fig. 5a; observe também que os resultados para MAX e ML MXenes são mostrados no SI, Figs. S12–C17). Curiosamente, a intensidade do pico de Nb é a mesma em ambos os casos (barras vermelhas na Fig. 5a). Isso indica que as algas não conseguiram absorver mais Nb e a capacidade máxima de acúmulo de Nb foi atingida nas células, embora o dobro de Nb4C3Tx MXene tenha sido ligado às células de microalgas (barras azuis na Fig. 5a). Notavelmente, a capacidade das microalgas de absorver metais depende da concentração de óxidos metálicos no ambiente67,68. Shamshada et al.67 descobriram que a capacidade de absorção de algas de água doce diminui com o aumento do pH. Raize et al.68 observaram que a capacidade das algas marinhas de absorver metais era cerca de 25% maior para Pb2+ do que para Ni2+.
(a) Resultados de XRF da absorção basal de Nb por células de microalgas verdes incubadas em uma concentração extrema de SL Nb-MXenes (100 mg L-1) por 72 horas. Os resultados mostram a presença de α em células de microalgas puras (amostra controle, colunas cinza), nanoflocos 2D isolados da superfície das células de microalgas (colunas azuis) e células de microalgas após a separação dos nanoflocos 2D da superfície (colunas vermelhas). A quantidade de Nb elementar, (b) porcentagem da composição química dos componentes orgânicos das microalgas (C=O e CHx/C–O) e óxidos de Nb presentes nas células de microalgas após incubação com SL Nb-MXenes, (c–e) Ajuste do pico de composição dos espectros XPS de SL Nb2CTx e (fh) SL Nb4C3Tx MXene internalizado pelas células de microalgas.
Portanto, esperávamos que o Nb pudesse ser absorvido pelas células de algas na forma de óxidos. Para testar isso, realizamos estudos de XPS em MXenes Nb2CTx e Nb4C3TX e em células de algas. Os resultados da interação das microalgas com Nb-MXenes e MXenes isolados de células de algas são mostrados na Figura 5b. Como esperado, detectamos picos de Nb 3d nas amostras de microalgas após a remoção do MXene da superfície das microalgas. A determinação quantitativa de C=O, CHx/CO e óxidos de Nb foi calculada com base nos espectros de Nb 3d, O 1s e C 1s obtidos com Nb2CTx SL (Fig. 5c–e) e Nb4C3Tx SL (Fig. 5c–e). ) obtidos de microalgas incubadas. Figura 5f–h) MXenes. A Tabela S1-3 mostra os detalhes dos parâmetros de pico e a composição química geral resultante do ajuste. É importante notar que as regiões Nb 3d de Nb2CTx SL e Nb4C3Tx SL (Fig. 5c, f) correspondem a um componente Nb2O5. Aqui, não encontramos picos relacionados a MXene nos espectros, indicando que as células de microalgas absorvem apenas a forma oxidada de Nb. Além disso, aproximamos o espectro C 1s com os componentes C–C, CHx/C–O, C=O e –COOH. Atribuímos os picos CHx/C–O e C=O à contribuição orgânica das células de microalgas. Esses componentes orgânicos representam 36% e 41% dos picos C 1s em Nb2CTx SL e Nb4C3TX SL, respectivamente. Em seguida, ajustamos os espectros de O 1s de SL Nb2CTx e SL Nb4C3TX com Nb2O5, componentes orgânicos de microalgas (CHx/CO) e água adsorvida na superfície.
Finalmente, os resultados de XPS indicaram claramente a forma do Nb, e não apenas sua presença. De acordo com a posição do sinal Nb 3d e os resultados da deconvolução, confirmamos que o Nb é absorvido apenas na forma de óxidos e não como íons ou no próprio MXene. Além disso, os resultados de XPS mostraram que as células de microalgas têm maior capacidade de absorver óxidos de Nb do SL Nb2CTx em comparação com o SL Nb4C3TX MXene.
Embora nossos resultados de absorção de Nb sejam impressionantes e nos permitam identificar a degradação do MXene, não existe um método disponível para rastrear as mudanças morfológicas associadas em nanoflocos 2D. Portanto, decidimos também desenvolver um método adequado que possa responder diretamente a quaisquer mudanças que ocorram em nanoflocos 2D de Nb-MXene e células de microalgas. É importante notar que assumimos que, se as espécies interagentes sofrerem qualquer transformação, decomposição ou fragmentação, isso deverá se manifestar rapidamente como mudanças nos parâmetros de forma, como o diâmetro da área circular equivalente, a circularidade, a largura de Feret ou o comprimento de Feret. Como esses parâmetros são adequados para descrever partículas alongadas ou nanoflocos bidimensionais, seu rastreamento por análise dinâmica da forma das partículas nos fornecerá informações valiosas sobre a transformação morfológica de nanoflocos de Nb-MXene SL durante a redução.
Os resultados obtidos são mostrados na Figura 6. Para comparação, também testamos a fase MAX original e os ML-MXenes (ver Figuras S18 e S19 do SI). A análise dinâmica da forma das partículas mostrou que todos os parâmetros de forma dos dois SLs de Nb-MXene mudaram significativamente após a interação com microalgas. Como mostrado pelo parâmetro de diâmetro da área circular equivalente (Fig. 6a, b), a intensidade reduzida do pico da fração de nanoflocos grandes indica que eles tendem a se decompor em fragmentos menores. Nas figuras 6c e d, observa-se uma diminuição nos picos associados ao tamanho transversal dos flocos (alongamento dos nanoflocos), indicando a transformação dos nanoflocos 2D em uma forma mais semelhante a partículas. As Figuras 6e-h mostram a largura e o comprimento da correlação de Feret, respectivamente. A largura e o comprimento da correlação de Feret são parâmetros complementares e, portanto, devem ser considerados em conjunto. Após a incubação dos nanoflocos 2D de Nb-MXene na presença de microalgas, seus picos de correlação de Feret se deslocaram e sua intensidade diminuiu. Com base nesses resultados, em combinação com morfologia, XRF e XPS, concluímos que as mudanças observadas estão fortemente relacionadas à oxidação, uma vez que os MXenes oxidados se tornam mais enrugados e se decompõem em fragmentos e partículas esféricas de óxido69,70.
Análise da transformação do MXene após interação com microalgas verdes. A análise dinâmica da forma das partículas leva em consideração parâmetros como (a, b) diâmetro da área circular equivalente, (c, d) circularidade, (e, f) largura de Feret e (g, h) comprimento de Feret. Para isso, duas amostras de referência de microalgas foram analisadas juntamente com MXenes primários SL Nb2CTx e SL Nb4C3Tx, MXenes SL Nb2CTx e SL Nb4C3Tx, microalgas degradadas e MXenes SL Nb2CTx e SL Nb4C3Tx de microalgas tratadas. As setas vermelhas mostram as transições dos parâmetros de forma dos nanoflocos bidimensionais estudados.
Como a análise de parâmetros de forma é muito confiável, ela também pode revelar alterações morfológicas em células de microalgas. Portanto, analisamos o diâmetro da área circular equivalente, a circularidade e a largura/comprimento de Feret de células de microalgas puras e células após interação com nanoflocos de Nb 2D. As figuras 6a–h mostram alterações nos parâmetros de forma das células de algas, evidenciadas por uma diminuição na intensidade do pico e um deslocamento dos máximos para valores mais altos. Em particular, os parâmetros de circularidade celular mostraram uma diminuição em células alongadas e um aumento em células esféricas (Fig. 6a, b). Além disso, a largura de Feret da célula aumentou em vários micrômetros após a interação com o MXene SL Nb2CTx (Fig. 6e) em comparação com o MXene SL Nb4C3TX (Fig. 6f). Suspeitamos que isso possa ser devido à forte absorção de óxidos de Nb pelas microalgas após a interação com o Nb2CTx SR. A menor rigidez na ligação dos flocos de Nb à sua superfície pode resultar em crescimento celular com efeito de sombreamento mínimo.
Nossas observações de alterações nos parâmetros de forma e tamanho das microalgas complementam outros estudos. Microalgas verdes podem alterar sua morfologia em resposta ao estresse ambiental, modificando o tamanho, a forma ou o metabolismo celular⁶¹. Por exemplo, a alteração no tamanho das células facilita a absorção de nutrientes⁷¹. Células de algas menores apresentam menor absorção de nutrientes e taxa de crescimento reduzida. Por outro lado, células maiores tendem a consumir mais nutrientes, que são então depositados intracelularmente^72,73. Machado e Soares descobriram que o fungicida triclosan pode aumentar o tamanho celular. Eles também observaram mudanças significativas na forma das algas⁷⁴. Além disso, Yin et al.⁹ também revelaram alterações morfológicas em algas após exposição a nanocompósitos de óxido de grafeno reduzido. Portanto, fica claro que a alteração nos parâmetros de tamanho/forma das microalgas é causada pela presença de MXene. Como essa mudança no tamanho e na forma é indicativa de alterações na absorção de nutrientes, acreditamos que a análise dos parâmetros de tamanho e forma ao longo do tempo pode demonstrar a absorção de óxido de nióbio por microalgas na presença de Nb-MXenes.
Além disso, os MXenes podem ser oxidados na presença de algas. Dalai et al.75 observaram que a morfologia de algas verdes expostas a nano-TiO2 e Al2O376 não era uniforme. Embora nossas observações sejam semelhantes às do presente estudo, elas são relevantes apenas para o estudo dos efeitos da biorremediação em termos de produtos de degradação de MXene na presença de nanoflocos 2D e não de nanopartículas. Como os MXenes podem se degradar em óxidos metálicos,31,32,77,78 é razoável supor que nossos nanoflocos de Nb também possam formar óxidos de Nb após interagirem com células de microalgas.
Para explicar a redução de nanoflocos de Nb-2D por meio de um mecanismo de decomposição baseado no processo de oxidação, realizamos estudos utilizando microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM) (Fig. 7a,b) e espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) (Fig. 7c-i e tabelas S4-5). Ambas as abordagens são adequadas para o estudo da oxidação de materiais 2D e se complementam. A HRTEM permite analisar a degradação de estruturas bidimensionais em camadas e o subsequente aparecimento de nanopartículas de óxido metálico, enquanto a XPS é sensível às ligações superficiais. Para isso, testamos nanoflocos de Nb-MXene 2D extraídos de dispersões de células de microalgas, ou seja, sua forma após a interação com as células de microalgas (ver Fig. 7).
Imagens HRTEM mostrando a morfologia dos MXenes SL Nb2CTx (a) e Nb4C3Tx (b) oxidados, resultados da análise XPS mostrando (c) a composição dos produtos de óxido após a redução, (d–f) correspondência de picos dos componentes dos espectros XPS de SL Nb2CTx e (g–i) Nb4C3Tx SL reparados com microalgas verdes.
Estudos de HRTEM confirmaram a oxidação de dois tipos de nanoflocos de Nb-MXene. Embora os nanoflocos tenham mantido sua morfologia bidimensional até certo ponto, a oxidação resultou no aparecimento de muitas nanopartículas cobrindo a superfície dos nanoflocos de MXene (ver Fig. 7a,b). A análise XPS dos sinais de Nb 3d e O 1s indicou que óxidos de Nb foram formados em ambos os casos. Como mostrado na Figura 7c, os MXene 2D Nb2CTx e Nb4C3TX apresentam sinais de Nb 3d indicando a presença de óxidos de NbO e Nb2O5, enquanto os sinais de O 1s indicam o número de ligações O–Nb associadas à funcionalização da superfície do nanofloco 2D. Observamos que a contribuição do óxido de Nb é dominante em comparação com Nb-C e Nb3+-O.
As Figuras 7g–i mostram os espectros XPS de Nb 3d, C 1s e O 1s do Nb2CTx monocamada (ver Figuras 7d–f) e do MXene Nb4C3TX monocamada isolado de células de microalgas. Os detalhes dos parâmetros dos picos dos Nb-MXenes são fornecidos nas Tabelas S4–5, respectivamente. Inicialmente, analisamos a composição do Nb 3d. Ao contrário do Nb absorvido pelas células de microalgas, no MXene isolado dessas células, além do Nb2O5, outros componentes foram encontrados. No Nb2CTx monocamada, observamos a contribuição de Nb3+-O em 15%, enquanto o restante do espectro de Nb 3d foi dominado por Nb2O5 (85%). Além disso, a amostra de Nb4C3TX monocamada contém os componentes Nb-C (9%) e Nb2O5 (91%). Aqui, o Nb-C provém de duas camadas atômicas internas de carbeto metálico no Nb4C3Tx SR. Em seguida, mapeamos os espectros de C 1s em quatro componentes diferentes, como fizemos nas amostras internalizadas. Como esperado, o espectro de C 1s é dominado por carbono grafítico, seguido por contribuições de partículas orgânicas (CHx/CO e C=O) de células de microalgas. Além disso, no espectro de O 1s, observamos a contribuição de formas orgânicas de células de microalgas, óxido de nióbio e água adsorvida.
Além disso, investigamos se a clivagem dos Nb-MXenes está associada à presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) no meio de cultura e/ou nas células de microalgas. Para isso, avaliamos os níveis de oxigênio singlete (¹O₂) no meio de cultura e de glutationa intracelular, um tiol que atua como antioxidante em microalgas. Os resultados são mostrados no SI (Figuras S20 e S21). Culturas com MXenes SL Nb2CTx e Nb4C3TX foram caracterizadas por uma quantidade reduzida de ¹O₂ (ver Figura S20). No caso do SL Nb2CTx, o ¹O₂ do MXene foi reduzido para cerca de 83%. Para culturas de microalgas usando SL, o ¹O₂ do Nb4C3TX diminuiu ainda mais, para 73%. Curiosamente, as alterações no ¹O₂ mostraram a mesma tendência do efeito inibitório-estimulatório observado anteriormente (ver Fig. 3). Pode-se argumentar que a incubação sob luz intensa pode alterar a foto-oxidação. No entanto, os resultados da análise de controle mostraram níveis quase constantes de 1O2 durante o experimento (Fig. S22). No caso dos níveis de ROS intracelulares, também observamos a mesma tendência de queda (ver Figura S21). Inicialmente, os níveis de ROS em células de microalgas cultivadas na presença de SLs Nb2CTx e Nb4C3Tx excederam os níveis encontrados em culturas puras de microalgas. Eventualmente, porém, pareceu que as microalgas se adaptaram à presença de ambos os Nb-MXenes, uma vez que os níveis de ROS diminuíram para 85% e 91% dos níveis medidos em culturas puras de microalgas inoculadas com SL Nb2CTx e Nb4C3TX, respectivamente. Isso pode indicar que as microalgas se sentem mais confortáveis ​​ao longo do tempo na presença de Nb-MXene do que em meio de cultura isolado.
As microalgas são um grupo diverso de organismos fotossintéticos. Durante a fotossíntese, elas convertem o dióxido de carbono atmosférico (CO2) em carbono orgânico. Os produtos da fotossíntese são glicose e oxigênio79. Suspeitamos que o oxigênio assim formado desempenhe um papel crucial na oxidação dos Nb-MXenes. Uma possível explicação para isso é que o parâmetro de aeração diferencial se forma em pressões parciais de oxigênio baixas e altas, tanto no exterior quanto no interior das nanofolhas de Nb-MXene. Isso significa que, onde houver áreas com diferentes pressões parciais de oxigênio, a área com o nível mais baixo formará o ânodo80,81,82. Nesse caso, as microalgas contribuem para a criação de células diferencialmente aeradas na superfície das nanofolhas de MXene, que produzem oxigênio devido às suas propriedades fotossintéticas. Como resultado, formam-se produtos de biocorrosão (neste caso, óxidos de nióbio). Outro aspecto é que as microalgas podem produzir ácidos orgânicos que são liberados na água83,84. Portanto, forma-se um ambiente agressivo, alterando assim os Nb-MXenes. Além disso, as microalgas podem alterar o pH do ambiente para alcalino devido à absorção de dióxido de carbono, o que também pode causar corrosão79.
Mais importante ainda, o fotoperíodo claro/escuro utilizado em nosso estudo é crucial para a compreensão dos resultados obtidos. Esse aspecto é descrito em detalhes por Djemai-Zoghlache et al.⁸⁵ Eles utilizaram deliberadamente um fotoperíodo de 12/12 horas para demonstrar a biocorrosão associada à bioincrustação pela microalga vermelha Porphyridium purpureum. Eles mostram que o fotoperíodo está associado à evolução do potencial sem biocorrosão, manifestando-se como oscilações pseudoperiódicas em torno das 24h. Essas observações foram confirmadas por Dowling et al.⁸⁶ Eles demonstraram biofilmes fotossintéticos da cianobactéria Anabaena. O oxigênio dissolvido é formado sob a ação da luz, o que está associado a uma mudança ou flutuações no potencial livre de biocorrosão. A importância do fotoperíodo é enfatizada pelo fato de que o potencial livre para biocorrosão aumenta na fase clara e diminui na fase escura. Isso se deve ao oxigênio produzido pelas microalgas fotossintéticas, que influencia a reação catódica através da pressão parcial gerada perto dos eletrodos87.
Além disso, a espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foi realizada para verificar se ocorreram alterações na composição química das células de microalgas após a interação com Nb-MXenes. Os resultados obtidos são complexos e os apresentamos no SI (Figuras S23-S25, incluindo os resultados dos MXenes MAX e ML). Em resumo, os espectros de referência obtidos para as microalgas fornecem informações importantes sobre as características químicas desses organismos. As vibrações mais prováveis ​​estão localizadas nas frequências de 1060 cm⁻¹ (C=O), 1540 cm⁻¹, 1640 cm⁻¹ (C=C), 1730 cm⁻¹ (C=O), 2850 cm⁻¹, 2920 cm⁻¹ (C–H) e 3280 cm⁻¹ (O–H). Para os Nb-MXenes SL, encontramos uma assinatura de estiramento da ligação C-H que está de acordo com nosso estudo anterior³⁸. No entanto, observamos que alguns picos adicionais associados às ligações C=C e CH desapareceram. Isso indica que a composição química das microalgas pode sofrer pequenas alterações devido à interação com os SL Nb-MXenes.
Ao considerar possíveis alterações na bioquímica das microalgas, a acumulação de óxidos inorgânicos, como o óxido de nióbio, precisa ser reavaliada59. Este está envolvido na captação de metais pela superfície celular, no seu transporte para o citoplasma, na sua associação com grupos carboxílicos intracelulares e na sua acumulação em polifosfossomas de microalgas20,88,89,90. Além disso, a relação entre as microalgas e os metais é mantida por grupos funcionais das células. Por esta razão, a absorção também depende da química da superfície das microalgas, que é bastante complexa9,91. Em geral, como esperado, a composição química das microalgas verdes sofreu pequenas alterações devido à absorção do óxido de Nb.
Curiosamente, a inibição inicial observada nas microalgas foi reversível ao longo do tempo. Como observamos, as microalgas superaram a alteração ambiental inicial e eventualmente retornaram às taxas de crescimento normais, chegando até mesmo a aumentar. Estudos do potencial zeta mostram alta estabilidade quando introduzidas em meios de cultura. Assim, a interação superficial entre as células de microalgas e os nanoflocos de Nb-MXene foi mantida durante os experimentos de redução. Em nossa análise subsequente, resumimos os principais mecanismos de ação subjacentes a esse comportamento notável das microalgas.
Observações por microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostraram que as microalgas tendem a se aderir aos Nb-MXenes. Utilizando análise dinâmica de imagens, confirmamos que esse efeito leva à transformação de nanoflocos bidimensionais de Nb-MXene em partículas mais esféricas, demonstrando que a decomposição dos nanoflocos está associada à sua oxidação. Para testar nossa hipótese, realizamos uma série de estudos bioquímicos e de materiais. Após os testes, os nanoflocos oxidaram-se e decompuseram-se gradualmente em produtos como NbO e Nb₂O₅, que não representaram uma ameaça para as microalgas. Por meio de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), não encontramos alterações significativas na composição química das microalgas incubadas na presença de nanoflocos bidimensionais de Nb-MXene. Considerando a possibilidade de absorção de óxido de nióbio pelas microalgas, realizamos uma análise de fluorescência de raios X. Esses resultados mostram claramente que as microalgas estudadas se alimentam de óxidos de nióbio (NbO e Nb₂O₅), que não são tóxicos para elas.