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O rápido desenvolvimento da nanotecnologia e sua integração em aplicações cotidianas podem ameaçar o meio ambiente.Embora os métodos verdes para a degradação de contaminantes orgânicos estejam bem estabelecidos, a recuperação de contaminantes cristalinos inorgânicos é uma grande preocupação devido à sua baixa sensibilidade à biotransformação e falta de compreensão das interações da superfície do material com as biológicas.Aqui, usamos um modelo MXenes 2D inorgânico baseado em Nb combinado com um método simples de análise de parâmetros de forma para rastrear o mecanismo de biorremediação de nanomateriais cerâmicos 2D pela microalga verde Raphidocelis subcapitata.Descobrimos que as microalgas degradam MXenes baseados em Nb devido a interações físico-químicas relacionadas à superfície.Inicialmente, nanoflakes de MXene de camada única e multicamada foram anexados à superfície de microalgas, o que reduziu um pouco o crescimento de algas.No entanto, após interação prolongada com a superfície, as microalgas oxidaram os nanoflocos de MXeno e os decompuseram ainda mais em NbO e Nb2O5.Como esses óxidos não são tóxicos para as células das microalgas, eles consomem nanopartículas de óxido de Nb por um mecanismo de absorção que restaura ainda mais as microalgas após 72 horas de tratamento da água.Os efeitos dos nutrientes associados à absorção também se refletem no aumento do volume celular, sua forma lisa e alteração na taxa de crescimento.Com base nessas descobertas, concluímos que a presença de curto e longo prazo de MXenes baseados em Nb em ecossistemas de água doce pode causar apenas pequenos impactos ambientais.Vale ressaltar que, usando nanomateriais bidimensionais como sistemas modelo, demonstramos a possibilidade de rastrear a transformação da forma mesmo em materiais de granulação fina.No geral, este estudo responde a uma importante questão fundamental sobre processos relacionados à interação de superfície que conduzem o mecanismo de biorremediação de nanomateriais 2D e fornece uma base para estudos adicionais de curto e longo prazo sobre o impacto ambiental de nanomateriais cristalinos inorgânicos.
Os nanomateriais têm gerado muito interesse desde sua descoberta, e várias nanotecnologias entraram recentemente em uma fase de modernização1.Infelizmente, a integração de nanomateriais em aplicações cotidianas pode levar a liberações acidentais devido ao descarte inadequado, manuseio descuidado ou infraestrutura de segurança inadequada.Portanto, é razoável supor que nanomateriais, incluindo nanomateriais bidimensionais (2D), podem ser liberados no ambiente natural, cujo comportamento e atividade biológica ainda não são totalmente compreendidos.Portanto, não é de surpreender que as preocupações com a ecotoxicidade tenham se concentrado na capacidade dos nanomateriais 2D de lixiviar em sistemas aquáticos2,3,4,5,6.Nestes ecossistemas, alguns nanomateriais 2D podem interagir com vários organismos em diferentes níveis tróficos, incluindo microalgas.
As microalgas são organismos primitivos encontrados naturalmente em ecossistemas marinhos e de água doce que produzem uma variedade de produtos químicos através da fotossíntese7.Como tal, eles são críticos para os ecossistemas aquáticos8,9,10,11,12, mas também são indicadores de ecotoxicidade sensíveis, baratos e amplamente utilizados13,14.Como as células das microalgas se multiplicam rapidamente e respondem rapidamente à presença de vários compostos, elas são promissoras para o desenvolvimento de métodos ecologicamente corretos para o tratamento de águas contaminadas com substâncias orgânicas15,16.
As células de algas podem remover íons inorgânicos da água por meio de biossorção e acúmulo17,18.Algumas espécies de algas como Chlorella, Anabaena invar, Westiellopsis prolifica, Stigeoclonium tenue e Synechococcus sp.Verificou-se que carrega e até alimenta íons metálicos tóxicos, como Fe2+, Cu2+, Zn2+ e Mn2+19.Outros estudos mostraram que os íons Cu2+, Cd2+, Ni2+, Zn2+ ou Pb2+ limitam o crescimento de Scenedesmus alterando a morfologia celular e destruindo seus cloroplastos20,21.
Métodos verdes para a decomposição de poluentes orgânicos e remoção de íons de metais pesados ​​têm atraído a atenção de cientistas e engenheiros em todo o mundo.Isso se deve principalmente ao fato de que esses contaminantes são facilmente processados ​​na fase líquida.No entanto, os poluentes cristalinos inorgânicos são caracterizados por baixa solubilidade em água e baixa suscetibilidade a diversas biotransformações, o que causa grandes dificuldades na remediação, e pouco progresso tem sido feito nessa área22,23,24,25,26.Assim, a busca por soluções ecologicamente corretas para o reparo de nanomateriais continua sendo uma área complexa e inexplorada.Devido ao alto grau de incerteza em relação aos efeitos de biotransformação dos nanomateriais 2D, não há uma maneira fácil de descobrir os possíveis caminhos de sua degradação durante a redução.
Neste estudo, usamos microalgas verdes como um agente ativo de biorremediação aquosa para materiais cerâmicos inorgânicos, combinado com o monitoramento in situ do processo de degradação do MXene como representante de materiais cerâmicos inorgânicos.O termo "MXeno" reflete a estequiometria do material Mn+1XnTx, onde M é um metal de transição inicial, X é carbono e/ou nitrogênio, Tx é um terminador de superfície (por exemplo, -OH, -F, -Cl) e n = 1, 2, 3 ou 427,28.Desde a descoberta dos MXenes por Naguib et al.Sensoriamento, terapia do câncer e filtração por membrana 27,29,30.Além disso, os MXenes podem ser considerados como modelos de sistemas 2D devido à sua excelente estabilidade coloidal e possíveis interações biológicas31,32,33,34,35,36.
Portanto, a metodologia desenvolvida neste artigo e nossas hipóteses de pesquisa são mostradas na Figura 1. De acordo com esta hipótese, as microalgas degradam MXenes à base de Nb em compostos não tóxicos devido a interações físico-químicas relacionadas à superfície, o que permite uma maior recuperação das algas.Para testar esta hipótese, foram selecionados dois membros da família de carbonetos e/ou nitretos (MXenes) de metais de transição à base de nióbio, a saber, Nb2CTx e Nb4C3TX.
Metodologia de pesquisa e hipóteses baseadas em evidências para a recuperação de MXene pela microalga verde Raphidocelis subcapitata.Observe que esta é apenas uma representação esquemática de suposições baseadas em evidências.O ambiente do lago difere no meio nutriente usado e nas condições (por exemplo, ciclo diurno e limitações na disponibilidade de nutrientes essenciais).Criado com BioRender.com.
Portanto, ao usar o MXene como sistema modelo, abrimos as portas para o estudo de vários efeitos biológicos que não podem ser observados com outros nanomateriais convencionais.Em particular, demonstramos a possibilidade de biorremediação de nanomateriais bidimensionais, como MXenes à base de nióbio, pela microalga Raphidocelis subcapitata.As microalgas são capazes de degradar Nb-MXenes nos óxidos não tóxicos NbO e Nb2O5, que também fornecem nutrientes através do mecanismo de absorção de nióbio.No geral, este estudo responde a uma importante questão fundamental sobre os processos associados às interações físico-químicas de superfície que governam os mecanismos de biorremediação de nanomateriais bidimensionais.Além disso, estamos desenvolvendo um método simples baseado em parâmetros de forma para rastrear mudanças sutis na forma de nanomateriais 2D.Isso inspira mais pesquisas de curto e longo prazo sobre os vários impactos ambientais dos nanomateriais cristalinos inorgânicos.Assim, nosso estudo aumenta a compreensão da interação entre a superfície do material e o material biológico.Também estamos fornecendo a base para estudos ampliados de curto e longo prazo de seus possíveis impactos nos ecossistemas de água doce, que agora podem ser facilmente verificados.
Os MXenes representam uma classe interessante de materiais com propriedades físicas e químicas únicas e atraentes e, portanto, muitas aplicações potenciais.Essas propriedades são amplamente dependentes de sua estequiometria e química de superfície.Portanto, em nosso estudo, investigamos dois tipos de MXenes hierárquicos de camada única (SL) baseados em Nb, Nb2CTx e Nb4C3TX, uma vez que diferentes efeitos biológicos desses nanomateriais podem ser observados.Os MXenes são produzidos a partir de seus materiais de partida por corrosão seletiva de cima para baixo de camadas MAX-phase A atomicamente finas.A fase MAX é uma cerâmica ternária composta por blocos “ligados” de carbonetos de metais de transição e finas camadas de elementos “A” como Al, Si e Sn com estequiometria MnAXn-1.A morfologia da fase MAX inicial foi observada por microscopia eletrônica de varredura (SEM) e foi consistente com estudos anteriores (consulte Informações Suplementares, SI, Figura S1).O Nb-MXeno multicamadas (ML) foi obtido após a remoção da camada de Al com 48% de HF (ácido fluorídrico).A morfologia de ML-Nb2CTx e ML-Nb4C3TX foi examinada por microscopia eletrônica de varredura (SEM) (Figuras S1c e S1d, respectivamente) e uma morfologia MXene em camadas típica foi observada, semelhante a nanoflocos bidimensionais passando por fendas semelhantes a poros alongados.Ambos os Nb-MXenes têm muito em comum com fases MXene previamente sintetizadas por ataque ácido27,38.Depois de confirmar a estrutura do MXene, nós o colocamos em camadas por intercalação de hidróxido de tetrabutilamônio (TBAOH) seguido de lavagem e sonicação, após o que obtivemos nanoflocos de Nb-MXene 2D de camada única ou camada baixa (SL).
Usamos microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM) e difração de raios-X (XRD) para testar a eficiência da corrosão e descamação posterior.Os resultados de HRTEM processados ​​usando a Transformada Rápida Inversa de Fourier (IFFT) e a Transformada Rápida de Fourier (FFT) são mostrados na Fig. 2. Nanoflakes de Nb-MXene foram orientados de ponta a ponta para verificar a estrutura da camada atômica e medir as distâncias interplanares.Imagens HRTEM de nanoflakes MXene Nb2CTx e Nb4C3TX revelaram sua natureza de camada atomicamente fina (ver Fig. 2a1, a2), conforme relatado anteriormente por Naguib et al.27 e Jastrzębska et al.38.Para duas monocamadas Nb2CTx e Nb4C3Tx adjacentes, determinamos distâncias intercamadas de 0,74 e 1,54 nm, respectivamente (Figs. 2b1,b2), o que também concorda com nossos resultados anteriores38.Isso foi ainda confirmado pela transformada de Fourier rápida inversa (Fig. 2c1, c2) e pela transformada de Fourier rápida (Fig. 2d1, d2) mostrando a distância entre as monocamadas Nb2CTx e Nb4C3Tx.A imagem mostra uma alternância de bandas claras e escuras correspondentes aos átomos de nióbio e carbono, o que confirma a natureza estratificada dos MXenes estudados.É importante notar que os espectros de espectroscopia de raios X por dispersão de energia (EDX) obtidos para Nb2CTx e Nb4C3Tx (Figuras S2a e S2b) não mostraram resquícios da fase MAX original, uma vez que nenhum pico de Al foi detectado.
Caracterização de nanoflakes SL Nb2CTx e Nb4C3Tx MXene, incluindo (a) imagem de nanoflake 2D de visão lateral de microscopia eletrônica de alta resolução (HRTEM) e correspondente, (b) modo de intensidade, (c) transformada de Fourier rápida inversa (IFFT), (d) transformada de Fourier rápida (FFT), (e) padrões de raios-X de Nb-MXenes.Para SL 2D Nb2CTx, os números são expressos como (a1, b1, c1, d1, e1).Para SL 2D Nb4C3Tx, os números são expressos como (a2, b2, c2, d2, e1).
Medições de difração de raios-X de SL Nb2CTx e Nb4C3Tx MXenes são mostradas nas Figs.2e1 e e2, respectivamente.Os picos (002) em 4,31 e 4,32 correspondem aos MXenes em camadas descritos anteriormente Nb2CTx e Nb4C3TX38,39,40,41, respectivamente.Os resultados de XRD também indicam a presença de algumas estruturas ML residuais e fases MAX, mas principalmente padrões de XRD associados a SL Nb4C3Tx (Fig. 2e2).A presença de partículas menores da fase MAX pode explicar o pico MAX mais forte em comparação com as camadas Nb4C3Tx empilhadas aleatoriamente.
Outras pesquisas têm se concentrado em microalgas verdes pertencentes à espécie R. subcapitata.Escolhemos as microalgas por serem importantes produtores envolvidos nas principais teias alimentares42.Eles também são um dos melhores indicadores de toxicidade devido à capacidade de remover substâncias tóxicas que são transportadas para níveis mais elevados da cadeia alimentar43.Além disso, a pesquisa sobre R. subcapitata pode lançar luz sobre a toxicidade incidental de SL Nb-MXenes para microrganismos comuns de água doce.Para ilustrar isso, os pesquisadores levantaram a hipótese de que cada micróbio tem uma sensibilidade diferente a compostos tóxicos presentes no ambiente.Para a maioria dos organismos, baixas concentrações de substâncias não afetam seu crescimento, enquanto concentrações acima de um certo limite podem inibi-los ou até causar a morte.Portanto, para nossos estudos da interação de superfície entre microalgas e MXenes e a recuperação associada, decidimos testar as concentrações inofensivas e tóxicas de Nb-MXenes.Para isso, testamos concentrações de 0 (como referência), 0,01, 0,1 e 10 mg l-1 de MXene e microalgas infectadas adicionalmente com concentrações muito altas de MXene (100 mg l-1 de MXene), que podem ser extremas e letais..para qualquer ambiente biológico.
Os efeitos de SL Nb-MXenes em microalgas são mostrados na Figura 3, expressos como a porcentagem de promoção de crescimento (+) ou inibição (-) medida para amostras de 0 mg l-1.Para comparação, a fase Nb-MAX e ML Nb-MXenes também foram testadas e os resultados são mostrados em SI (ver Fig. S3).Os resultados obtidos confirmaram que SL Nb-MXenes é quase completamente isento de toxicidade na faixa de baixas concentrações de 0,01 a 10 mg/l, conforme mostrado na Fig. 3a,b.No caso do Nb2CTx, observamos não mais do que 5% de ecotoxicidade na faixa especificada.
Estimulação (+) ou inibição (-) do crescimento de microalgas na presença de SL (a) Nb2CTx e (b) Nb4C3TX MXene.Foram analisadas 24, 48 e 72 horas de interação MXene-microalga. Dados significativos (teste t, p < 0,05) foram marcados com um asterisco (*). Dados significativos (teste t, p < 0,05) foram marcados com um asterisco (*). Значимые данные (t-критерий, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Dados significativos (teste t, p < 0,05) são marcados com um asterisco (*).重要数据（t 检验，p < 0,05）用星号(*) 标记。重要数据（t 检验，p < 0,05）用星号(*) 标记。 Важные данные (t-test, p < 0,05) отмечены звездочкой (*). Dados importantes (teste t, p < 0,05) são marcados com um asterisco (*).As setas vermelhas indicam a abolição da estimulação inibitória.
Por outro lado, baixas concentrações de Nb4C3TX mostraram-se ligeiramente mais tóxicas, mas não superiores a 7%.Como esperado, observamos que os MXenes tiveram maior toxicidade e inibição do crescimento de microalgas na dose de 100mg L-1.Curiosamente, nenhum dos materiais mostrou a mesma tendência e dependência temporal de efeitos atóxicos/tóxicos em comparação com as amostras MAX ou ML (consulte SI para obter detalhes).Enquanto para a fase MAX (ver Fig. S3) a toxicidade atingiu aproximadamente 15-25% e aumentou com o tempo, a tendência inversa foi observada para SL Nb2CTx e Nb4C3TX MXene.A inibição do crescimento de microalgas diminuiu ao longo do tempo.Atingiu aproximadamente 17% após 24 horas e caiu para menos de 5% após 72 horas (Fig. 3a, b, respectivamente).
Mais importante, para SL Nb4C3TX, a inibição do crescimento de microalgas atingiu cerca de 27% após 24 horas, mas após 72 horas diminuiu para cerca de 1%.Portanto, rotulamos o efeito observado como inibição inversa da estimulação, e o efeito foi mais forte para SL Nb4C3TX MXene.A estimulação do crescimento de microalgas foi observada mais cedo com Nb4C3TX (interação a 10 mg L-1 por 24 h) em comparação com SL Nb2CTx MXene.O efeito de reversão da estimulação-inibição também foi bem mostrado na curva de taxa de duplicação da biomassa (ver Fig. S4 para detalhes).Até agora, apenas a ecotoxicidade do Ti3C2TX MXene foi estudada de maneiras diferentes.Não é tóxico para embriões de zebrafish44, mas moderadamente ecotóxico para as plantas de microalgas Desmodesmus quadricauda e Sorghum saccharatum45.Outros exemplos de efeitos específicos incluem maior toxicidade para linhas de células cancerígenas do que para linhas de células normais46,47.Pode-se supor que as condições de teste influenciariam as mudanças no crescimento de microalgas observadas na presença de Nb-MXenes.Por exemplo, um pH de cerca de 8 no estroma do cloroplasto é ideal para a operação eficiente da enzima RuBisCO.Portanto, mudanças de pH afetam negativamente a taxa de fotossíntese48,49.No entanto, não observamos mudanças significativas no pH durante o experimento (ver SI, Fig. S5 para detalhes).Em geral, as culturas de microalgas com Nb-MXenes reduziram ligeiramente o pH da solução ao longo do tempo.No entanto, essa diminuição foi semelhante a uma mudança no pH de um meio puro.Além disso, o intervalo de variações encontrado foi semelhante ao medido para uma cultura pura de microalgas (amostra controle).Assim, concluímos que a fotossíntese não é afetada por mudanças no pH ao longo do tempo.
Além disso, os MXenes sintetizados possuem terminações de superfície (denotadas como Tx).Estes são principalmente grupos funcionais -O, -F e -OH.No entanto, a química de superfície está diretamente relacionada ao método de síntese.Sabe-se que esses grupos estão distribuídos aleatoriamente na superfície, dificultando a previsão de seu efeito nas propriedades do MXene50.Pode-se argumentar que Tx poderia ser a força catalítica para a oxidação do nióbio pela luz.Os grupos funcionais de superfície realmente fornecem vários locais de ancoragem para seus fotocatalisadores subjacentes para formar heterojunções51.No entanto, a composição do meio de crescimento não forneceu um fotocatalisador eficaz (a composição detalhada do meio pode ser encontrada na Tabela S6 do SI).Além disso, qualquer modificação de superfície também é muito importante, pois a atividade biológica dos MXenes pode ser alterada devido ao pós-processamento da camada, oxidação, modificação química da superfície de compostos orgânicos e inorgânicos52,53,54,55,56 ou engenharia de carga de superfície38.Portanto, para testar se o óxido de nióbio tem algo a ver com a instabilidade do material no meio, realizamos estudos do potencial zeta (ζ) em meio de crescimento de microalgas e água deionizada (para comparação).Nossos resultados mostram que SL Nb-MXenes são razoavelmente estáveis ​​(ver SI Fig. S6 para resultados MAX e ML).O potencial zeta de SL MXenes é de cerca de -10 mV.No caso de SR Nb2CTx, o valor de ζ é um pouco mais negativo que o de Nb4C3Tx.Tal mudança no valor ζ pode indicar que a superfície dos nanoflocos de MXene carregados negativamente absorve íons carregados positivamente do meio de cultura.Medições temporais do potencial zeta e condutividade de Nb-MXenes em meio de cultura (ver Figuras S7 e S8 em SI para mais detalhes) parecem apoiar nossa hipótese.
No entanto, ambos Nb-MXene SLs mostraram mudanças mínimas de zero.Isso demonstra claramente sua estabilidade no meio de crescimento de microalgas.Além disso, avaliamos se a presença de nossa microalga verde afetaria a estabilidade dos Nb-MXenes no meio.Os resultados do potencial zeta e condutividade de MXenes após interação com microalgas em meio nutriente e cultura ao longo do tempo podem ser encontrados no SI (Figuras S9 e S10).Curiosamente, notamos que a presença de microalgas parecia estabilizar a dispersão de ambos os MXenes.No caso do Nb2CTx SL, o potencial zeta até diminuiu ligeiramente ao longo do tempo para valores mais negativos (-15,8 versus -19,1 mV após 72 h de incubação).O potencial zeta de SL Nb4C3TX aumentou ligeiramente, mas após 72 h ainda mostrou maior estabilidade do que os nanoflocos sem a presença de microalgas (-18,1 vs. -9,1 mV).
Também encontramos menor condutividade de soluções de Nb-MXene incubadas na presença de microalgas, indicando uma menor quantidade de íons no meio nutriente.Notavelmente, a instabilidade dos MXenes na água se deve principalmente à oxidação da superfície57.Portanto, suspeitamos que as microalgas verdes de alguma forma limparam os óxidos formados na superfície do Nb-MXene e até impediram sua ocorrência (oxidação do MXene).Isso pode ser visto estudando os tipos de substâncias absorvidas pelas microalgas.
Enquanto nossos estudos ecotoxicológicos indicaram que as microalgas foram capazes de superar a toxicidade de Nb-MXenes ao longo do tempo e a inibição incomum do crescimento estimulado, o objetivo de nosso estudo foi investigar possíveis mecanismos de ação.Quando organismos como algas são expostos a compostos ou materiais desconhecidos em seus ecossistemas, eles podem reagir de várias maneiras58,59.Na ausência de óxidos de metais tóxicos, as microalgas podem alimentar-se, permitindo-lhes crescer continuamente60.Após a ingestão de substâncias tóxicas, mecanismos de defesa podem ser ativados, como mudança de formato ou forma.A possibilidade de absorção também deve ser considerada58,59.Notavelmente, qualquer sinal de um mecanismo de defesa é um indicador claro da toxicidade do composto de teste.Portanto, em nosso trabalho posterior, investigamos a potencial interação de superfície entre nanoflakes SL Nb-MXene e microalgas por SEM e a possível absorção de MXene baseado em Nb por espectroscopia de fluorescência de raios-X (XRF).Observe que as análises de SEM e XRF foram realizadas apenas na concentração mais alta de MXene para abordar questões de toxicidade de atividade.
Os resultados SEM são mostrados na Fig.4.Células de microalgas não tratadas (ver Fig. 4a, amostra de referência) mostraram claramente morfologia típica de R. subcapitata e formato de célula semelhante a um croissant.As células parecem achatadas e um tanto desorganizadas.Algumas células de microalgas se sobrepuseram e se emaranharam, mas isso provavelmente foi causado pelo processo de preparação da amostra.Em geral, as células de microalgas puras tinham uma superfície lisa e não apresentavam nenhuma alteração morfológica.
Imagens de SEM mostrando interação de superfície entre microalgas verdes e nanofolhas de MXene após 72 horas de interação em concentração extrema (100 mg L-1).(a) Microalga verde não tratada após interação com SL (b) Nb2CTx e (c) Nb4C3TX MXenes.Observe que os nanoflakes Nb-MXene são marcados com setas vermelhas.Para comparação, também são adicionadas fotografias de um microscópio óptico.
Em contraste, as células de microalgas adsorvidas pelos nanoflocos SL Nb-MXene foram danificadas (ver Fig. 4b, c, setas vermelhas).No caso do Nb2CTx MXene (Fig. 4b), as microalgas tendem a crescer com nanoescalas bidimensionais aderidas, que podem alterar sua morfologia.Notavelmente, também observamos essas mudanças sob microscopia de luz (ver SI Figura S11 para detalhes).Essa transição morfológica tem uma base plausível na fisiologia das microalgas e sua capacidade de se defender, alterando a morfologia celular, como o aumento do volume celular61.Portanto, é importante verificar o número de células de microalgas que estão realmente em contato com os Nb-MXenes.Estudos SEM mostraram que aproximadamente 52% das células de microalgas foram expostas a Nb-MXenes, enquanto 48% dessas células de microalgas evitaram o contato.Para SL Nb4C3Tx MXene, as microalgas tentam evitar o contato com o MXene, localizando e crescendo a partir de nanoescalas bidimensionais (Fig. 4c).No entanto, não observamos a penetração de nanoescalas nas células das microalgas e seus danos.
A autopreservação também é um comportamento de resposta dependente do tempo ao bloqueio da fotossíntese devido à adsorção de partículas na superfície celular e ao chamado efeito de sombreamento (shading)62.É claro que cada objeto (por exemplo, nanoflocos de Nb-MXene) que está entre a microalga e a fonte de luz limita a quantidade de luz absorvida pelos cloroplastos.No entanto, não temos dúvidas de que isso tem um impacto significativo nos resultados obtidos.Conforme mostrado por nossas observações microscópicas, os nanoflocos 2D não foram completamente envolvidos ou aderidos à superfície da microalga, mesmo quando as células da microalga estavam em contato com os Nb-MXenes.Em vez disso, os nanoflakes mostraram-se orientados para células de microalgas sem cobrir sua superfície.Tal conjunto de nanoflocos/microalgas não pode limitar significativamente a quantidade de luz absorvida pelas células das microalgas.Além disso, alguns estudos demonstraram, inclusive, melhora na absorção de luz por organismos fotossintéticos na presença de nanomateriais bidimensionais63,64,65,66.
Como as imagens de SEM não puderam confirmar diretamente a absorção de nióbio pelas células de microalgas, nosso estudo posterior voltou-se para a análise de fluorescência de raios-X (XRF) e espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS) para esclarecer esse problema.Portanto, comparamos a intensidade dos picos de Nb de amostras de microalgas de referência que não interagiram com MXenes, nanoflocos de MXene destacados da superfície de células de microalgas e células de microalgas após a remoção de MXenes anexados.Vale ressaltar que se não houver absorção de Nb, o valor de Nb obtido pelas células da microalga deve ser zero após a remoção das nanoescalas anexadas.Portanto, se ocorrer absorção de Nb, os resultados de XRF e XPS devem mostrar um claro pico de Nb.
No caso dos espectros de XRF, as amostras de microalgas mostraram picos de Nb para SL Nb2CTx e Nb4C3Tx MXene após interação com SL Nb2CTx e Nb4C3Tx MXene (ver Fig. 5a, observe também que os resultados para MAX e ML MXenes são mostrados em SI, Figs S12–C17).Curiosamente, a intensidade do pico de Nb é a mesma em ambos os casos (barras vermelhas na Fig. 5a).Isso indicou que as algas não conseguiam absorver mais Nb, e a capacidade máxima de acúmulo de Nb foi alcançada nas células, embora duas vezes mais Nb4C3Tx MXene estivesse ligado às células da microalga (barras azuis na Fig. 5a).Notavelmente, a capacidade das microalgas de absorver metais depende da concentração de óxidos metálicos no ambiente67,68.Shamshada et al.67 descobriram que a capacidade de absorção de algas de água doce diminui com o aumento do pH.Raize et al.68 observaram que a capacidade das algas em absorver metais era cerca de 25% maior para Pb2+ do que para Ni2+.
(a) Resultados de XRF da absorção basal de Nb por células de microalgas verdes incubadas em uma concentração extrema de SL Nb-MXenes (100 mg L-1) por 72 horas.Os resultados mostram a presença de α em células de microalgas puras (amostra de controle, colunas cinza), nanoflocos 2D isolados de células de microalgas de superfície (colunas azuis) e células de microalgas após a separação de nanoflocos 2D da superfície (colunas vermelhas).A quantidade de Nb elementar, (b) porcentagem da composição química dos componentes orgânicos das microalgas (C=O e CHx/C–O) e óxidos de Nb presentes nas células das microalgas após incubação com SL Nb-MXenes, (c–e) Ajuste do pico composicional dos espectros XPS SL Nb2CTx e (fh) SL Nb4C3Tx MXene internalizado pelas células das microalgas.
Portanto, esperávamos que o Nb pudesse ser absorvido pelas células das algas na forma de óxidos.Para testar isso, realizamos estudos XPS em MXenes Nb2CTx e Nb4C3TX e células de algas.Os resultados da interação de microalgas com Nb-MXenes e MXenes isolados de células de algas são mostrados nas Figs.5b.Como esperado, detectamos picos de Nb 3d nas amostras de microalgas após a remoção de MXene da superfície das microalgas.A determinação quantitativa dos óxidos de C=O, CHx/CO e Nb foi calculada com base nos espectros de Nb 3d, O 1s e C 1s obtidos com Nb2CTx SL (Fig. 5c–e) e Nb4C3Tx SL (Fig. 5c–e).) obtido a partir de microalgas incubadas.Figura 5f–h) MXenes.A Tabela S1-3 mostra os detalhes dos parâmetros de pico e a química geral resultante do ajuste.Vale ressaltar que as regiões Nb 3d de Nb2CTx SL e Nb4C3Tx SL (Fig. 5c, f) correspondem a um componente Nb2O5.Aqui, não encontramos picos relacionados a MXene nos espectros, indicando que as células de microalgas absorvem apenas a forma de óxido de Nb.Além disso, aproximamos o espectro C 1 s com os componentes C–C, CHx/C–O, C=O e –COOH.Atribuímos os picos CHx/C–O e C=O à contribuição orgânica das células de microalgas.Esses componentes orgânicos respondem por 36% e 41% dos picos C 1s em Nb2CTx SL e Nb4C3TX SL, respectivamente.Em seguida, ajustamos os espectros de O 1s de SL Nb2CTx e SL Nb4C3TX com Nb2O5, componentes orgânicos de microalgas (CHx/CO) e água adsorvida na superfície.
Finalmente, os resultados do XPS indicaram claramente a forma do Nb, não apenas sua presença.De acordo com a posição do sinal Nb 3d e os resultados da deconvolução, confirmamos que o Nb é absorvido apenas na forma de óxidos e não de íons ou do próprio MXeno.Além disso, os resultados do XPS mostraram que as células de microalgas têm uma maior capacidade de absorver óxidos de Nb de SL Nb2CTx em comparação com SL Nb4C3TX MXene.
Embora nossos resultados de absorção de Nb sejam impressionantes e nos permitam identificar a degradação de MXene, não há nenhum método disponível para rastrear alterações morfológicas associadas em nanoflakes 2D.Portanto, também decidimos desenvolver um método adequado que possa responder diretamente a quaisquer alterações que ocorram em nanoflocos 2D Nb-MXene e células de microalgas.É importante notar que assumimos que se as espécies em interação sofrerem qualquer transformação, decomposição ou desfragmentação, isso deve se manifestar rapidamente como mudanças nos parâmetros de forma, como o diâmetro da área circular equivalente, arredondamento, largura Feret ou comprimento Feret.Como esses parâmetros são adequados para descrever partículas alongadas ou nanoflocos bidimensionais, seu rastreamento por análise dinâmica da forma da partícula nos dará informações valiosas sobre a transformação morfológica dos nanoflocos SL Nb-MXene durante a redução.
Os resultados obtidos são mostrados na Figura 6. Para comparação, também testamos a fase MAX original e ML-MXenes (ver SI Figuras S18 e S19).A análise dinâmica da forma da partícula mostrou que todos os parâmetros de forma de dois Nb-MXene SLs mudaram significativamente após a interação com microalgas.Conforme mostrado pelo parâmetro de diâmetro de área circular equivalente (Fig. 6a, b), a intensidade de pico reduzida da fração de grandes nanoflocos indica que eles tendem a decair em fragmentos menores.Na fig.6c, d mostra uma diminuição nos picos associados ao tamanho transversal dos flocos (alongamento dos nanoflocos), indicando a transformação dos nanoflocos 2D em uma forma mais semelhante a partícula.A Figura 6e-h mostra a largura e o comprimento do Feret, respectivamente.A largura e o comprimento do feret são parâmetros complementares e devem, portanto, ser considerados em conjunto.Após a incubação de nanoflocos 2D Nb-MXene na presença de microalgas, seus picos de correlação Feret mudaram e sua intensidade diminuiu.Com base nesses resultados em combinação com morfologia, XRF e XPS, concluímos que as alterações observadas estão fortemente relacionadas à oxidação, pois os MXenes oxidados tornam-se mais enrugados e se decompõem em fragmentos e partículas esféricas de óxido69,70.
Análise da transformação de MXene após interação com microalgas verdes.A análise dinâmica da forma da partícula leva em consideração parâmetros como (a, b) diâmetro da área circular equivalente, (c, d) circularidade, (e, f) largura de Feret e (g, h) comprimento de Feret.Para tanto, duas amostras de microalgas de referência foram analisadas juntamente com SL Nb2CTx e SL Nb4C3Tx MXenes primários, SL Nb2CTx e SL Nb4C3Tx MXenes, microalgas degradadas e microalgas tratadas SL Nb2CTx e SL Nb4C3Tx MXenes.As setas vermelhas mostram as transições dos parâmetros de forma dos nanoflocos bidimensionais estudados.
Como a análise de parâmetros de forma é muito confiável, ela também pode revelar alterações morfológicas nas células de microalgas.Portanto, analisamos o diâmetro da área circular equivalente, arredondamento e largura/comprimento de Feret de células de microalgas puras e células após interação com nanoflocos de Nb 2D.Na fig.6a-h mostram mudanças nos parâmetros de forma das células de algas, como evidenciado por uma diminuição na intensidade de pico e uma mudança de máximos em direção a valores mais altos.Em particular, os parâmetros de arredondamento celular mostraram uma diminuição nas células alongadas e um aumento nas células esféricas (Fig. 6a, b).Além disso, a largura da célula Feret aumentou em vários micrômetros após a interação com SL Nb2CTx MXene (Fig. 6e) em comparação com SL Nb4C3TX MXene (Fig. 6f).Suspeitamos que isso pode ser devido à forte absorção de óxidos de Nb pelas microalgas após a interação com Nb2CTx SR.A fixação menos rígida dos flocos de Nb à sua superfície pode resultar em crescimento celular com efeito de sombreamento mínimo.
Nossas observações de mudanças nos parâmetros de forma e tamanho de microalgas complementam outros estudos.As microalgas verdes podem mudar sua morfologia em resposta ao estresse ambiental, alterando o tamanho, a forma ou o metabolismo celular61.Por exemplo, alterar o tamanho das células facilita a absorção de nutrientes71.Células de algas menores mostram menor absorção de nutrientes e taxa de crescimento prejudicada.Por outro lado, células maiores tendem a consumir mais nutrientes, que são então depositados intracelularmente72,73.Machado e Soares constataram que o fungicida triclosan pode aumentar o tamanho das células.Eles também encontraram mudanças profundas na forma das algas74.Além disso, Yin et al.9 também revelaram alterações morfológicas em algas após exposição a nanocompósitos de óxido de grafeno reduzido.Portanto, é claro que os parâmetros de tamanho/forma alterados das microalgas são causados ​​pela presença de MXene.Como essa mudança de tamanho e forma é indicativa de mudanças na absorção de nutrientes, acreditamos que a análise dos parâmetros de tamanho e forma ao longo do tempo pode demonstrar a absorção de óxido de nióbio por microalgas na presença de Nb-MXenes.
Além disso, os MXenes podem ser oxidados na presença de algas.Dalai et al.75 observaram que a morfologia das algas verdes expostas ao nano-TiO2 e Al2O376 não era uniforme.Embora nossas observações sejam semelhantes ao presente estudo, elas são relevantes apenas para o estudo dos efeitos da biorremediação em termos de produtos de degradação do MXeno na presença de nanoflocos 2D e não de nanopartículas.Como os MXenes podem se degradar em óxidos metálicos,31,32,77,78 é razoável supor que nossos nanoflocos de Nb também possam formar óxidos de Nb após interagir com células de microalgas.
Para explicar a redução de nanoflocos 2D-Nb por meio de um mecanismo de decomposição baseado no processo de oxidação, realizamos estudos usando microscopia eletrônica de transmissão de alta resolução (HRTEM) (Fig. 7a,b) e espectroscopia de fotoelétrons de raios-X (XPS) (Fig. 7).7c-i e tabelas S4-5).Ambas as abordagens são adequadas para estudar a oxidação de materiais 2D e se complementam.O HRTEM é capaz de analisar a degradação de estruturas em camadas bidimensionais e o subsequente aparecimento de nanopartículas de óxido metálico, enquanto o XPS é sensível a ligações superficiais.Para isso, testamos nanoflakes 2D Nb-MXene extraídos de dispersões de células de microalgas, ou seja, sua forma após interação com células de microalgas (ver Fig. 7).
Imagens HRTEM mostrando a morfologia de (a) SL Nb2CTx e (b) SL Nb4C3Tx MXenes oxidados, resultados da análise XPS mostrando (c) a composição de produtos de óxido após a redução, (d-f) correspondência de pico dos componentes dos espectros XPS de SL Nb2CTx e (g- i) Nb4C3Tx SL reparados com microalgas verdes.
Estudos de HRTEM confirmaram a oxidação de dois tipos de nanoflocos de Nb-MXene.Embora os nanoflocos retivessem sua morfologia bidimensional até certo ponto, a oxidação resultou no aparecimento de muitas nanopartículas cobrindo a superfície dos nanoflocos de MXene (ver Fig. 7a,b).A análise XPS dos sinais c Nb 3d e O 1s indicou que os óxidos de Nb foram formados em ambos os casos.Conforme mostrado na Figura 7c, 2D MXene Nb2CTx e Nb4C3TX têm sinais Nb 3d indicando a presença de óxidos NbO e Nb2O5, enquanto os sinais O 1s indicam o número de ligações O-Nb associadas à funcionalização da superfície de nanoflocos 2D.Notamos que a contribuição do óxido de Nb é dominante em comparação com Nb-C e Nb3+-O.
Na fig.As Figuras 7g–i mostram os espectros XPS de Nb 3d, C 1s e O 1s SL Nb2CTx (ver Figs. 7d–f) e SL Nb4C3TX MXene isolados de células de microalgas.Detalhes dos parâmetros de pico de Nb-MXenes são fornecidos nas Tabelas S4–5, respectivamente.Primeiro analisamos a composição do Nb 3d.Ao contrário do Nb absorvido pelas células da microalga, no MXene isolado das células da microalga, além do Nb2O5, outros componentes foram encontrados.No Nb2CTx SL, observamos a contribuição do Nb3+-O no valor de 15%, enquanto o restante do espectro do Nb 3d foi dominado pelo Nb2O5 (85%).Além disso, a amostra SL Nb4C3TX contém componentes Nb-C (9%) e Nb2O5 (91%).Aqui Nb-C vem de duas camadas atômicas internas de carboneto de metal em Nb4C3Tx SR.Em seguida, mapeamos os espectros C 1s para quatro componentes diferentes, como fizemos nas amostras internalizadas.Como esperado, o espectro C 1s é dominado por carbono grafítico, seguido por contribuições de partículas orgânicas (CHx/CO e C=O) de células de microalgas.Além disso, no espectro de O 1s, observamos a contribuição de formas orgânicas de células de microalgas, óxido de nióbio e água adsorvida.
Além disso, investigamos se a clivagem de Nb-MXenes está associada à presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) no meio nutriente e/ou células de microalgas.Para tanto, avaliamos os níveis de oxigênio singleto (1O2) no meio de cultura e glutationa intracelular, um tiol que atua como antioxidante em microalgas.Os resultados são apresentados em SI (Figuras S20 e S21).Culturas com SL Nb2CTx e Nb4C3TX MXenes foram caracterizadas por uma quantidade reduzida de 1O2 (ver Figura S20).No caso do SL Nb2CTx, o MXene 1O2 é reduzido para cerca de 83%.Para culturas de microalgas usando SL, Nb4C3TX 1O2 diminuiu ainda mais, para 73%.Curiosamente, as mudanças em 1O2 mostraram a mesma tendência que o efeito inibitório-estimulatório observado anteriormente (ver Fig. 3).Pode-se argumentar que a incubação sob luz forte pode alterar a fotooxidação.No entanto, os resultados da análise de controle mostraram níveis quase constantes de 1O2 durante o experimento (Fig. S22).No caso dos níveis intracelulares de ROS, também observamos a mesma tendência de queda (ver Figura S21).Inicialmente, os níveis de ROS em células de microalgas cultivadas na presença de Nb2CTx e Nb4C3Tx SLs excederam os níveis encontrados em culturas puras de microalgas.Eventualmente, no entanto, parece que a microalga se adaptou à presença de ambos os Nb-MXenes, pois os níveis de ROS diminuíram para 85% e 91% dos níveis medidos em culturas puras de microalgas inoculadas com SL Nb2CTx e Nb4C3TX, respectivamente.Isso pode indicar que as microalgas se sentem mais confortáveis ​​ao longo do tempo na presença de Nb-MXene do que apenas em meio nutriente.
As microalgas são um grupo diverso de organismos fotossintéticos.Durante a fotossíntese, eles convertem o dióxido de carbono atmosférico (CO2) em carbono orgânico.Os produtos da fotossíntese são glicose e oxigênio79.Suspeitamos que o oxigênio assim formado desempenhe um papel crítico na oxidação de Nb-MXenes.Uma possível explicação para isso é que o parâmetro de aeração diferencial é formado em baixas e altas pressões parciais de oxigênio fora e dentro dos nanoflocos de Nb-MXene.Isso significa que onde houver áreas de diferentes pressões parciais de oxigênio, a área com o nível mais baixo formará o ânodo 80, 81, 82. Aqui, as microalgas contribuem para a criação de células aeradas diferencialmente na superfície dos flocos de MXene, que produzem oxigênio devido às suas propriedades fotossintéticas.Como resultado, são formados produtos de biocorrosão (neste caso, óxidos de nióbio).Outro aspecto é que as microalgas podem produzir ácidos orgânicos que são liberados na água83,84.Portanto, um ambiente agressivo é formado, alterando assim os Nb-MXenes.Além disso, as microalgas podem alterar o pH do ambiente para alcalino devido à absorção de dióxido de carbono, que também pode causar corrosão79.
Mais importante ainda, o fotoperíodo claro/escuro usado em nosso estudo é fundamental para a compreensão dos resultados obtidos.Este aspecto é descrito em detalhes em Djemai-Zoghlache et al.85 Eles usaram deliberadamente um fotoperíodo de 12/12 horas para demonstrar a biocorrosão associada à bioincrustação pela microalga vermelha Porphyridium purpureum.Eles mostram que o fotoperíodo está associado à evolução do potencial sem biocorrosão, manifestando-se como oscilações pseudoperiódicas por volta das 24h.Essas observações foram confirmadas por Dowling et al.86 Eles demonstraram biofilmes fotossintéticos da cianobactéria Anabaena.O oxigênio dissolvido é formado sob a ação da luz, que está associada a uma mudança ou flutuações no potencial de biocorrosão livre.A importância do fotoperíodo é enfatizada pelo fato de que o potencial livre de biocorrosão aumenta na fase clara e diminui na fase escura.Isso se deve ao oxigênio produzido pelas microalgas fotossintéticas, que influencia a reação catódica através da pressão parcial gerada próximo aos eletrodos87.
Além disso, a espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) foi realizada para descobrir se alguma alteração ocorreu na composição química das células de microalgas após a interação com Nb-MXenes.Esses resultados obtidos são complexos e os apresentamos em SI (Figuras S23-S25, incluindo os resultados do estágio MAX e ML MXenes).Em suma, os espectros de referência obtidos de microalgas nos fornecem informações importantes sobre as características químicas desses organismos.Essas vibrações mais prováveis ​​estão localizadas nas frequências de 1060 cm-1 (CO), 1540 cm-1, 1640 cm-1 (C=C), 1730 cm-1 (C=O), 2850 cm-1, 2920 cm-1.um.1 1 (C–H) e 3280 cm–1 (O–H).Para SL Nb-MXenes, encontramos uma assinatura de alongamento da ligação CH que é consistente com nosso estudo anterior38.No entanto, observamos que alguns picos adicionais associados às ligações C=C e CH desapareceram.Isso indica que a composição química das microalgas pode sofrer pequenas alterações devido à interação com SL Nb-MXenes.
Ao considerar possíveis alterações na bioquímica de microalgas, o acúmulo de óxidos inorgânicos, como o óxido de nióbio, precisa ser reconsiderado59.Está envolvido na captação de metais pela superfície celular, seu transporte para o citoplasma, sua associação com grupos carboxila intracelulares e seu acúmulo em polifosfosomas de microalgas20,88,89,90.Além disso, a relação entre microalgas e metais é mantida por grupos funcionais de células.Por esta razão, a absorção também depende da química da superfície da microalga, que é bastante complexa9,91.Em geral, como esperado, a composição química das microalgas verdes mudou ligeiramente devido à absorção de óxido de Nb.
Curiosamente, a inibição inicial observada de microalgas foi reversível ao longo do tempo.Conforme observamos, as microalgas superaram a mudança ambiental inicial e acabaram voltando às taxas normais de crescimento e até aumentando.Estudos do potencial zeta mostram alta estabilidade quando introduzidos em meios nutrientes.Assim, a interação de superfície entre células de microalgas e nanoflocos de Nb-MXene foi mantida ao longo dos experimentos de redução.Em nossa análise posterior, resumimos os principais mecanismos de ação subjacentes a esse notável comportamento das microalgas.
Observações SEM mostraram que as microalgas tendem a se ligar aos Nb-MXenes.Usando análise dinâmica de imagens, confirmamos que esse efeito leva à transformação de nanoflocos bidimensionais de Nb-MXene em partículas mais esféricas, demonstrando assim que a decomposição dos nanoflocos está associada à sua oxidação.Para testar nossa hipótese, realizamos uma série de estudos de materiais e bioquímicos.Após o teste, os nanoflakes foram gradualmente oxidados e decompostos em produtos NbO e Nb2O5, que não representam uma ameaça para as microalgas verdes.Usando observação FTIR, não encontramos mudanças significativas na composição química de microalgas incubadas na presença de nanoflakes 2D Nb-MXene.Levando em conta a possibilidade de absorção de óxido de nióbio por microalgas, realizamos uma análise de fluorescência de raios-X.Estes resultados mostram claramente que as microalgas estudadas se alimentam de óxidos de nióbio (NbO e Nb2O5), que não são tóxicos para as microalgas estudadas.