Nature.comにご訪問いただきありがとうございます。お使いのブラウザのバージョンはCSSのサポートが制限されています。最適な閲覧体験のために、最新のブラウザをご利用いただくか、Internet Explorerの互換表示モードをオフにすることをお勧めします。当面の間、継続的なサポートを確保するため、スタイルシートとJavaScriptを使用せずにサイトを表示いたします。
微生物腐食（MIC）は、莫大な経済的損失を引き起こす可能性があるため、多くの産業で深刻な問題となっています。2707スーパーデュプレックスステンレス鋼（2707 HDSS）は、その優れた耐薬品性から海洋環境で使用されています。しかし、MICに対する耐性は実験的に実証されていません。本研究では、海洋好気性細菌である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）によって引き起こされる2707 HDSSのMIC挙動を調査しました。電気化学分析の結果、2216E培地中の緑膿菌バイオフィルムの存在下では、腐食電位が正に変化し、腐食電流密度が増加することが示されました。X線光電子分光法（XPS）分析の結果、バイオフィルム下の試料表面のCr含有量が減少していることが示されました。ピットの画像解析の結果、緑膿菌バイオフィルムは14日間の培養期間中に最大0.69 μmのピット深さを生成したことが示されました。これは小さい値ですが、2707 HDSSがMICに耐性があることを示唆しています。 HDSSは、緑膿菌バイオフィルムのMICに対して完全に免疫があるわけではない。
二相ステンレス鋼（DSS）は、優れた機械的特性と耐食性の理想的な組み合わせにより、さまざまな産業で広く使用されています1,2。しかし、局所的な孔食は依然として発生し、この鋼の完全性に影響を与えます3,4。DSSは微生物腐食（MIC）に耐性がありません5,6。DSSの用途は多岐にわたりますが、DSSの耐食性が長期使用に十分でない環境もまだ存在します。これは、より高い耐食性を持つより高価な材料が必要であることを意味します。Jeonら7は、スーパー二相ステンレス鋼（SDSS）でさえ、耐食性に関していくつかの制限があることを発見しました。したがって、一部の用途では、より高い耐食性を持つスーパー二相ステンレス鋼（HDSS）が必要です。これが、高合金HDSSの開発につながりました。
DSS の耐食性は、α 相と γ 相の比率、および第 2 相に隣接する Cr、Mo、W 欠乏領域 8、9、10 に依存します。HDSS は Cr、Mo、N を高濃度で含有するため、優れた耐食性と高い値 (45-50) の孔食抵抗当量数 (PREN) を持ち、これは wt.% Cr + 3.3 (wt.% Mo + 0.5 wt% W) + 16 wt% N で決定されます 12。その優れた耐食性は、約 50% のフェライト (α) 相と 50% のオーステナイト (γ) 相を含むバランスの取れた組成に依存しており、HDSS は従来の DSS よりも優れた機械的特性と高い耐性を持っています 13。塩化物腐食特性。耐食性の向上により、HDSS の使用範囲は海洋環境などのより腐食性の高い塩化物環境に拡大します。
MIC は、石油・ガスや水道事業など多くの産業で大きな問題となっています 14。MIC は、すべての腐食損傷の 20% を占めています 15。MIC は、多くの環境で観察される生物電気化学的腐食です。金属表面に形成されるバイオフィルムは電気化学的条件を変化させ、それによって腐食プロセスに影響を与えます。MIC 腐食はバイオフィルムによって引き起こされると広く信じられています。電気発生性微生物は、生存に必要なエネルギーを得るために金属を腐食します 17。最近の MIC 研究では、電気発生性微生物によって誘発される MIC の律速段階は EET (細胞外電子伝達) であることが示されています。Zhang ら 18 は、電子メディエーターが Desulfovibrio sessificans 細胞と 304 ステンレス鋼間の電子伝達を加速し、より深刻な MIC 攻撃につながることを実証しました。Enning ら 19 および Venzlaff ら20は、腐食性の硫酸還元細菌（SRB）バイオフィルムが金属基板から直接電子を吸収し、深刻な孔食を引き起こすことを示した。
DSSは、SRB、鉄還元細菌（IRB）などを含む環境でMICに感受性があることが知られています21。これらの細菌は、バイオフィルムの下のDSS表面に局所的なピットを引き起こします22,23。DSSとは異なり、HDSS24のMICはよくわかっていません。
Pseudomonas aeruginosaは、自然界に広く分布するグラム陰性の運動性桿菌です25。Pseudomonas aeruginosaは、海洋環境における主要な微生物群でもあり、鋼材にMICを引き起こします。Pseudomonasは腐食プロセスに深く関与しており、バイオフィルム形成時の先駆的なコロニー形成者として認識されています。Mahatら28およびYuanら29は、Pseudomonas aeruginosaが水環境における軟鋼および合金の腐食速度を増加させる傾向があることを実証しました。
この研究の主な目的は、電気化学的方法、表面分析技術、腐食生成物分析を用いて、海洋好気性細菌 Pseudomonas aeruginosa によって引き起こされる 2707 HDSS の MIC 特性を調査することであった。2707 HDSS の MIC 挙動を調べるために、開回路電位 (OCP)、線形分極抵抗 (LPR)、電気化学インピーダンス分光法 (EIS)、電位動的分極などの電気化学的研究を行った。腐食した表面の化学元素を見つけるために、エネルギー分散型分光計 (EDS) 分析を行った。さらに、Pseudomonas aeruginosa を含む海洋環境の影響下での酸化膜不動態化の安定性を決定するために、X 線光電子分光法 (XPS) 分析を使用した。ピットの深さは、共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) で測定した。
表1は2707 HDSSの化学組成を示しています。表2は、2707 HDSSが650 MPaの降伏強度を持つ優れた機械的特性を有することを示しています。図1は、固溶化熱処理された2707 HDSSの光学顕微鏡組織を示しています。約50%のオーステナイト相と50%のフェライト相を含む組織には、二次相のないオーステナイト相とフェライト相の細長い帯が見られます。
図2aは、37℃で14日間、非生物的2216E培地およびP. aeruginosaブロス中の2707 HDSSの開回路電位（Eocp）と曝露時間の関係データを示しています。Eocpの最大かつ有意な変化は最初の24時間以内に発生することがわかります。両方のケースでEocp値は16時間頃に-145 mV（vs. SCE）でピークに達し、その後急激に低下し、非生物的サンプルでは-477 mV（vs. SCE）、P. aeruginosaブロスでは-236 mV（vs. SCE）に達しました。それぞれ緑膿菌クーポン。24 時間後、緑膿菌の 2707 HDSS の Eocp 値は -228 mV (vs. SCE) で比較的安定していたが、非生物学的サンプルの対応する値は約 -442 mV (vs. SCE) であった。緑膿菌が存在する場合の Eocp はかなり低かった。
37℃における非生物培地および緑膿菌培地での2707個のHDSS検体の電気化学的試験：
(a) 露光時間に対する Eocp、(b) 14 日目の分極曲線、(c) 露光時間に対する Rp、および (d) 露光時間に対する icorr。
表3は、14日間非生物培地および緑膿菌接種培地に曝露された2707個のHDSSサンプルの電気化学的腐食パラメータ値を示しています。陽極曲線と陰極曲線の接線を外挿して交点を求め、標準的な方法30,31に従って腐食電流密度（icorr）、腐食電位（Ecorr）、およびターフェル勾配（βαおよびβc）を算出しました。
図2bに示すように、P. aeruginosa曲線の上方シフトにより、非生物的曲線と比較してEcorrが増加しました。腐食速度に比例するicorr値は、Pseudomonas aeruginosaサンプルでは0.328 μA cm-2に増加し、非生物的サンプル（0.087 μA cm-2）の4倍になりました。
LPRは、迅速な腐食分析のための古典的な非破壊電気化学的手法です。MIC32の研究にも使用されました。図2cは、暴露時間の関数としての分極抵抗（Rp）を示しています。Rp値が高いほど、腐食が少ないことを意味します。最初の24時間以内に、2707 HDSSのRpは、非生物サンプルで1955 kΩ cm2、Pseudomonas aeruginosaサンプルで1429 kΩ cm2の最大値に達しました。図2cはまた、Rp値が1日後に急速に減少し、その後13日間は比較的変化しなかったことを示しています。Pseudomonas aeruginosaサンプルのRp値は約40 kΩ cm2で、非生物サンプルの450 kΩ cm2の値よりもはるかに低い値です。
icorr値は均一腐食速度に比例します。その値は、次のStern-Geary方程式から計算できます。
Zou et al. 33 に従い、本研究では Tafel 勾配 B の典型的な値を 26 mV/dec と仮定した。図 2d は、非生物学的 2707 サンプルの icorr が比較的安定しているのに対し、P. aeruginosa サンプルは最初の 24 時間後に大きく変動することを示している。P. aeruginosa サンプルの icorr 値は、非生物学的コントロールよりも 1 桁高い。この傾向は、分極抵抗の結果と一致している。
EISは、腐食した界面での電気化学反応を特徴付けるために使用されるもう1つの非破壊的手法です。非生物媒体および緑膿菌溶液に曝露された試料のインピーダンススペクトルと計算された容量値、試料表面に形成された不動態皮膜/バイオフィルムのRb抵抗、Rct電荷移動抵抗、Cdl電気二重層容量（EDL）、およびQCPE定位相要素（CPE）パラメータ。これらのパラメータは、等価回路（EEC）モデルを使用してデータをフィッティングすることによりさらに分析されました。
図 3 は、異なる培養時間における、非生物培地および P. aeruginosa ブロス中の 2707 HDSS サンプルの典型的なナイキスト線図 (a および b) とボード線図 (a' および b') を示しています。ナイキストリングの直径は、Pseudomonas aeruginosa の存在下で減少します。ボード線図 (図 3b') は、全インピーダンスの大きさの増加を示しています。緩和時定数に関する情報は、位相の最大値によって提供できます。図 4 は、単層 (a) および二層 (b) に基づく物理構造と、それらに対応する EEC を示しています。CPE が EEC モデルに導入されます。そのアドミタンスとインピーダンスは次のように表されます。
2707 HDSS試料のインピーダンススペクトルをフィッティングするための2つの物理モデルと対応する等価回路：
ここで、Y0 は CPE の大きさ、j は虚数または (-1)1/2、ω は角周波数、n は CPE の電力指数で、1 未満です 35。電荷移動抵抗の逆数 (つまり 1/Rct) は腐食速度に対応します。Rct が小さいほど腐食速度が速くなります 27。14 日間の培養後、Pseudomonas aeruginosa サンプルの Rct は 32 kΩ cm2 に達し、非生物学的サンプルの 489 kΩ cm2 よりはるかに小さくなりました (表 4)。
図5のCLSM画像とSEM画像は、7日後の2707 HDSS標本の表面のバイオフィルム被覆が密であることを明確に示しています。しかし、14日後にはバイオフィルム被覆はまばらになり、死細胞がいくつか現れました。表5は、P. aeruginosaに7日間および14日間曝露した後の2707 HDSS標本のバイオフィルムの厚さを示しています。最大バイオフィルム厚は、7日後の23.4 μmから14日後の18.9 μmに変化しました。平均バイオフィルム厚もこの傾向を確認しました。7日後の22.2 ± 0.7 μmから14日後の17.8 ± 1.0 μmに減少しました。
(a) 7日後の3D CLSM画像、(b) 14日後の3D CLSM画像、(c) 7日後のSEM画像、(d) 14日後のSEM画像。
EDS分析により、14日間緑膿菌に曝露されたサンプルのバイオフィルムおよび腐食生成物中の化学元素が明らかになった。図6は、バイオフィルムおよび腐食生成物中のC、N、O、Pの含有量が裸の金属中の含有量よりもはるかに高いことを示している。これは、これらの元素がバイオフィルムとその代謝物と関連しているためである。微生物は微量のクロムと鉄しか必要としない。試料表面のバイオフィルムおよび腐食生成物中のCrとFeの高濃度は、金属マトリックスが腐食により元素を失ったことを示している。
14日後、2216E培地で緑膿菌の有無にかかわらずピットが観察された。培養前、試料表面は滑らかで欠陥がなかった（図7a）。培養後、バイオフィルムと腐食生成物を除去し、図7bおよびcに示すように、試料表面の最も深いピットをCLSMで調べた。非生物学的対照試料の表面には明らかなピットは見られなかった（最大ピット深さ0.02μm）。緑膿菌によって引き起こされた最大ピット深さは、7日後に0.52μm、14日後に0.69μmであった。3つの試料の平均最大ピット深さ（各試料につき10個の最大ピット深さ値を選択した）に基づくと、それぞれ0.42±0.12μmおよび0.52±0.15μmに達した（表5）。小さいけれど重要です。
（a）暴露前、（b）非生物培地で14日間、（c）緑膿菌培地で14日間。
図8は、異なるサンプル表面のXPSスペクトルを示しており、各表面について分析された化学組成は表6にまとめられています。表6では、P. aeruginosaが存在する場合（サンプルAおよびB）のFeおよびCrの原子百分率は、非生物学的対照サンプル（サンプルCおよびD）のそれよりもはるかに低いことがわかりました。P. aeruginosaサンプルでは、​​Cr 2pコアレベルスペクトル曲線は、結合エネルギー（BE）値が574.4、576.6、578.3、および586.8 eVの4つのピーク成分にフィッティングされ、それぞれCr、Cr2O3、CrO3、およびCr(OH)3に帰属できます（図9aおよびb）。非生物学的サンプルでは、​​Cr 2pコアレベルスペクトルには、Cr（BEが573.80 eV）とCr2O3（BEが575.90 eV）の2つの主要ピークが含まれています。図9cおよびdにそれぞれ示されているように、非生物的サンプルとP. aeruginosaサンプルの最も顕著な違いは、バイオフィルムの下にCr6+が存在し、Cr(OH)3（BE 586.8 eV）の相対的な割合が高いことでした。
2707 HDSS試料の表面の広域XPSスペクトルは、2つの媒体中でそれぞれ7日と14日である。
(a) 緑膿菌に7日間曝露、(b) 緑膿菌に14日間曝露、(c) 非生物培地で7日間、(d) 非生物培地で14日間。
HDSSは、ほとんどの環境で高いレベルの耐食性を示します。Kimら2は、UNS S32707 HDSSがPRENが45を超える高合金DSSとして定義されていると報告しました。本研究の2707 HDSS試料のPREN値は49でした。これは、酸性および高塩化物環境で有益な高クロム含有量、高モリブデンおよびNiレベルによるものです。さらに、バランスの取れた組成と欠陥のない微細構造は、構造安定性と耐食性に役立ちます。しかし、優れた耐薬品性に​​もかかわらず、本研究の実験データは、2707 HDSSがP. aeruginosaバイオフィルムのMICに対して完全に免疫があるわけではないことを示唆しています。
電気化学的結果から、P. aeruginosa ブロス中の 2707 HDSS の腐食速度は、非生物学的培地と比較して 14 日後に著しく増加することが示されました。図 2a では、最初の 24 時間で非生物学的培地と P. aeruginosa ブロスの両方で Eocp の減少が観察されました。その後、バイオフィルムが試料の表面を完全に覆い、Eocp は比較的安定します 36。しかし、生物学的 Eocp のレベルは非生物学的 Eocp のレベルよりもはるかに高くなっています。この違いは P. aeruginosa バイオフィルムの形成によるものと考えられます。図 2d では、P. aeruginosa が存在する場合、2707 HDSS の icorr 値は 0.627 μA cm-2 に達し、これは非生物学的コントロール (0.063 μA cm-2) より 1 桁高い値であり、EIS で測定された Rct 値と一致しています。最初の 数日間で、 P. aeruginosa ブロス中のインピーダンス値は、P. aeruginosa 細胞の付着とバイオフィルムの形成により増加しました。しかし、バイオフィルムが試料表面を完全に覆うと、インピーダンスは減少します。バイオフィルムの形成とバイオフィルム代謝物により、保護層が最初に攻撃されます。したがって、耐食性は時間とともに低下し、P. aeruginosa の付着により局所腐食が発生しました。非生物媒体での傾向は異なりました。非生物対照の耐食性は、P. aeruginosa ブロスに曝露された試料の対応する値よりもはるかに高くなりました。さらに、非生物試料の場合、2707 HDSS の Rct 値は 14 日目に 489 kΩ cm2 に達し、これは P. aeruginosa が存在する場合の Rct 値 (32 kΩ cm2) の 15 倍でした。したがって、2707 HDSS は無菌環境では優れた耐食性を示しますが、 MICは緑膿菌バイオフィルムによって攻撃される。
これらの結果は、図2bの分極曲線からも観察できます。陽極分岐は、緑膿菌バイオフィルムの形成と金属酸化反応に起因すると考えられます。同時に、陰極反応は酸素の還元です。緑膿菌の存在により腐食電流密度が大幅に増加し、非生物的対照よりも約1桁高くなりました。これは、緑膿菌バイオフィルムが2707 HDSSの局部腐食を増加させることを示しています。Yuanら29は、緑膿菌バイオフィルムの存在下で70/30 Cu-Ni合金の腐食電流密度が増加することを発見しました。これは、緑膿菌バイオフィルムによる酸素還元の生体触媒作用によるものと考えられます。この観察結果は、本研究における2707 HDSSのMICも説明できる可能性があります。好気性バイオフィルムは、その下の酸素濃度が低い可能性があります。したがって、酸素による金属表面の再不動態化の失敗が、本研究におけるMICの一因となっている可能性があります。 仕事。
ディキンソンら38は、化学反応および電気化学反応の速度は、試料表面の付着細菌の代謝活動と腐食生成物の性質によって直接影響を受ける可能性があると示唆した。図5および表5に示すように、14日後には細胞数とバイオフィルムの厚さの両方が減少した。これは、14日後には、2216E培地の栄養枯渇または2707 HDSSマトリックスからの有毒金属イオンの放出により、2707 HDSS表面の付着細胞のほとんどが死滅したと合理的に説明できる。これはバッチ実験の限界である。
本研究では、P. aeruginosaバイオフィルムが2707 HDSS表面上のバイオフィルム下のCrとFeの局所的な枯渇を促進した（図6）。表6では、サンプルDにおけるFeとCrの減少がサンプルCと比較して示されており、P. aeruginosaバイオフィルムによって引き起こされた溶解したFeとCrが最初の7日間を超えて持続したことを示している。2216E培地は海洋環境をシミュレートするために使用される。この培地には17700 ppmのCl-が含まれており、これは天然海水中の濃度に匹敵する。17700 ppmのCl-の存在は、XPSで分析した7日目と14日目の非生物的サンプルにおけるCrの減少の主な理由であった。P. aeruginosaサンプルと比較して、非生物的サンプルにおけるCrの溶解は、非生物的環境における2707 HDSSの強いCl−耐性のため、はるかに少なかった。図9は、不動態化膜中のCr6+の存在を示している。これは除去に関与している可能性がある。 ChenとClaytonが示唆したように、P. aeruginosaバイオフィルムによる鋼表面からのCrの除去。
細菌の増殖により、培養前後の培地のpH値はそれぞれ7.4と8.2でした。したがって、P. aeruginosaバイオフィルムの下では、バルク培地のpHが比較的高いため、有機酸腐食はこの研究の要因となる可能性は低いと考えられます。非生物学的コントロール培地のpHは、14日間の試験期間中に大きく変化しませんでした（初期7.4から最終7.5まで）。培養後の接種培地のpHの上昇はP. aeruginosaの代謝活動によるものであり、試験紙がない場合でもpHに同じ効果があることがわかりました。
図7に示すように、P. aeruginosaバイオフィルムによって引き起こされた最大ピット深さは0.69 μmであり、非生物培地（0.02 μm）よりもはるかに大きかった。これは、上述の電気化学データと一致している。0.69 μmのピット深さは、同じ条件下で2205 DSSについて報告された9.5 μmの値よりも10倍以上小さい。これらのデータは、2707 HDSSが2205 DSSと比較してMIC耐性が優れていることを示している。2707 HDSSはクロム含有量が高く、有害な二次沈殿物のないバランスのとれた相構造により、より長く持続する不動態化を提供し、P. aeruginosaが不動態化を解除して開始点を覆い隠すことが難しくなるため、これは驚くべきことではない。
結論として、P. aeruginosa培養液中では2707 HDSSの表面にMICによる腐食が認められたが、非生物培地中では腐食はほとんど見られなかった。この研究により、2707 HDSSは2205 DSSよりもMIC耐性が優れているものの、P. aeruginosaバイオフィルムの影響でMICに対して完全に耐性があるわけではないことが示された。これらの知見は、海洋環境に適したステンレス鋼の選定と耐用年数の推定に役立つ。
2707 HDSS のクーポンは、中国瀋陽の東北大学 (NEU) 冶金学部から提供された。2707 HDSS の元素組成は表 1 に示されており、NEU 材料分析試験部によって分析された。すべてのサンプルは 1180 °C で 1 時間溶体化処理された。腐食試験の前に、上面露出面積 1 cm2 のコイン形状の 2707 HDSS を炭化ケイ素紙で 2000 グリットまで研磨し、さらに 0.05 μm Al2O3 粉末懸濁液で研磨した。側面と底面は不活性塗料で保護されている。乾燥後、試験片を滅菌脱イオン水ですすぎ、75% (v/v) エタノールで 0.5 時間滅菌した。その後、使用前に紫外線 (UV) 光の下で 0.5 時間自然乾燥させた。
海洋性Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099株は、中国の厦門海洋培養コレクションセンター（MCCC）から購入した。Pseudomonas aeruginosaは、Marine 2216E液体培地（青島ホープバイオテクノロジー株式会社、中国青島）を使用して、250 mlフラスコおよび500 ml電気化学ガラスセルで37℃で好気的に培養した。培地（g/L）：19.45 NaCl、5.98 MgCl2、3.24 Na2SO4、1.8 CaCl2、0.55 KCl、0.16 Na2CO3、0.08 KBr、0.034 SrCl2、0.08 SrBr2、0.022 H3BO3、0.004 NaSiO3、0.016 NH3、0.016 NH3、 0016 NaH2PO4、5.0 ペプトン、1.0 酵母エキス、0.1 クエン酸第二鉄。接種前に 121 ℃で 20 分間オートクレーブする。血球計算盤を使用して、光学顕微鏡で 400 倍の倍率で付着細胞と浮遊細胞を数える。接種直後の浮遊性 Pseudomonas aeruginosa の初期細胞濃度は約 106 細胞/ml であった。
電気化学試験は、容量500 mlの古典的な3電極ガラスセルで実施した。白金板と飽和カロメル電極（SCE）は、塩橋を充填したルギン毛細管を介して反応器に接続され、それぞれ対極と参照電極として機能した。作用電極を作成するために、ゴム被覆銅線を各試料に取り付け、エポキシで覆い、作用電極用に約1 cm2の片面表面積を露出させた。電気化学測定中は、試料を2216E培地に入れ、水浴中で一定のインキュベーション温度（37 °C）に保った。OCP、LPR、EIS、および電位動的分極データは、Autolabポテンショスタット（Reference 600TM、Gamry Instruments, Inc.、米国）を使用して測定した。LPR試験は、Eocpで-5～5 mVの範囲で0.125 mV s-1の走査速度、サンプリング周波数1 Hzで記録した。EISは正弦波を用いて実施した。定常状態の Eocp で 5 mV の印加電圧を使用して、0.01 ～ 10,000 Hz の周波数範囲の波を印加した。電位掃引の前に、電極は安定した自由腐食電位値に達するまで開回路モードであった。次に、分極曲線は、Eocp に対して -0.2 ～ 1.5 V の範囲で、0.166 mV/s の走査速度で実行された。各テストは、P. aeruginosa の有無で 3 回繰り返された。
金属組織分析用の試料は、2000 グリットの湿式 SiC 紙で機械的に研磨した後、光学観察のために 0.05 μm Al2O3 粉末懸濁液でさらに研磨した。金属組織分析は光学顕微鏡を使用して行った。試料は 10 wt.% 水酸化カリウム溶液 43 でエッチングした。
インキュベーション後、サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（pH 7.4 ± 0.2）で3回洗浄し、バイオフィルムを固定するために2.5%（v/v）グルタルアルデヒドで10時間固定した。その後、空気乾燥する前に、段階的エタノール系列（50%、60%、70%、80%、90%、95%、100% v/v）で脱水した。最後に、SEM観察のための導電性を確保するために、サンプルの表面に金膜をスパッタリングした。SEM画像は、各試料の表面で最も付着性の高いP. aeruginosa細胞が存在するスポットに焦点を合わせた。化学元素を見つけるためにEDS分析を行った。ピットの深さを測定するために、Zeiss共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）（LSM 710、Zeiss、ドイツ）を使用した。バイオフィルムの下の腐食ピットを観察するために、試験片の表面にある腐食生成物やバイオフィルムを除去するため、まず中国国家規格（CNS）GB/T4334.4-2000に従って試験片を洗浄した。
X線光電子分光法（XPS、ESCALAB250表面分析システム、Thermo VG、米国）分析は、標準条件下で0～1350 eVの広い結合エネルギー範囲で、単色X線源（エネルギー1500 eV、出力150 WのアルミニウムKα線）を使用して実施されました。高分解能スペクトルは、50 eVのパスエネルギーと0.2 eVのステップサイズを使用して記録されました。
インキュベートしたサンプルを取り出し、PBS (pH 7.4 ± 0.2) で 15 秒間優しくすすいだ。45.サンプル上のバイオフィルムの細菌生存率を観察するために、バイオフィルムを LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen、ユージーン、オレゴン州、米国) を使用して染色した。このキットには、緑色蛍光 SYTO-9 色素と赤色蛍光ヨウ化プロピジウム (PI) 色素の 2 つの蛍光色素が含まれている。CLSM では、緑色と赤色の蛍光ドットはそれぞれ生細胞と死細胞を表す。染色には、3 μl の SYTO-9 と 3 μl の PI 溶液を含む 1 ml の混合液を、暗所で室温 (23 ℃) で 20 分間インキュベートした。その後、染色したサンプルを Nikon CLSM 装置 (C2 Plus、Nikon、日本）。バイオフィルムの厚さは3Dスキャンモードで測定した。
この記事の引用方法: Li, H. et al.海洋性緑膿菌バイオフィルムによる2707スーパーデュプレックスステンレス鋼の微生物腐食.science.Rep. 6, 20190; doi: 10.1038/srep20190 (2016).
Zanotto, F., Grassi, V., Balbo, A., Monticelli, C. & Zucchi, F. チオ硫酸塩存在下における塩化物溶液中のLDX 2101二相ステンレス鋼の応力腐食割れ。coros.science.80, 205–212 (2014).
Kim, ST、Jang, SH、Lee, IS、Park, YS「スーパーデュプレックスステンレス鋼溶接部の孔食耐性に対する固溶熱処理とシールドガス中の窒素の影響」coros.science.53, 1939–1947 (2011)。
Shi, X., Avci, R., Geiser, M. & Lewandowski, Z. 316Lステンレス鋼における微生物および電気化学的に誘発される孔食の比較化学的研究。coros.science.45, 2577–2595 (2003).
Luo, H., Dong, CF, Li, XG & Xiao, K. 塩化物存在下における異なるpHのアルカリ溶液中での2205二相ステンレス鋼の電気化学的挙動。Electrochim.Journal.64, 211–220 (2012).
Little, BJ、Lee, JS、Ray, RI「海洋バイオフィルムが腐食に及ぼす影響：簡潔なレビュー」Electrochim.Journal.54, 2-7 (2008)。