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微生物腐食（MIC）は、多くの産業において、莫大な経済的損失を引き起こす可能性があるため、深刻な問題となっています。2707スーパー二相ステンレス鋼（2707 HDSS）は、優れた耐薬品性のため、海洋環境で使用されています。しかし、MICに対する耐性は実験的に実証されていません。本研究では、海洋好気性細菌であるPseudomonas aeruginosaによって引き起こされる2707 HDSSのMIC挙動を調査しました。電気化学分析の結果、2216E培地中にPseudomonas aeruginosaバイオフィルムが存在すると、腐食電位が上昇し、腐食電流密度が増加することが示されました。X線光電子分光法（XPS）分析では、バイオフィルム下の試験片表面のCr含有量が減少していることが示されました。ピットの画像分析により、P. aeruginosaバイオフィルムは、14日間の培養中に最大0.69μmのピット深さを生成したことがわかりました。これは小さいですが、 2707 HDSS は、P. aeruginosa バイオフィルムの MIC に対して完全には耐性がありません。
二相ステンレス鋼 (DSS) は、優れた機械的特性と耐食性の理想的な組み合わせにより、さまざまな業界で幅広く使用されています1,2。ただし、局所的な孔食が依然として発生し、この鋼の完全性に影響を与えます3,4。DSS は微生物腐食 (MIC) に対して耐性がありません5,6。DSS の用途が広範囲にわたるにもかかわらず、DSS の耐食性が長期使用には不十分な環境が依然として存在します。つまり、耐食性が高く高価な材料が必要になります。Jeon ら7 は、スーパー二相ステンレス鋼 (SDSS) でも耐食性の点でいくつかの制限があることを発見しました。そのため、一部の用途では耐食性が高いスーパー二相ステンレス鋼 (HDSS) が必要です。これが高度に合金化された HDSS の開発につながりました。
DSS の耐食性は、アルファ相とガンマ相の比率と、第 2 相に隣接する Cr、Mo、W が枯渇した領域 8、9、10 に依存します。HDSS は Cr、Mo、N11 の含有量が高いため、優れた耐食性と、wt.% Cr + 3.3 (wt.% Mo + 0.5 wt% W) + 16 wt% N12 で決定される高い値 (45-50) の孔食抵抗当量数 (PREN) を備えています。その優れた耐食性は、約 50% のフェライト (α) 相と 50% のオーステナイト (γ) 相を含むバランスの取れた組成に依存しており、HDSS は従来の DSS13 よりも優れた機械的特性と高い耐性を備えています。塩化物腐食特性。耐食性の向上により、海洋環境などの腐食性の高い塩化物環境での HDSS の使用が拡大します。
MIC は、石油、ガス、水道などの多くの業界で大きな問題となっています14。MIC は、すべての腐食損傷の 20% を占めています15。MIC は、多くの環境で確認される生体電気化学的腐食です。金属表面に形成されるバイオフィルムは、電気化学的条件を変え、それによって腐食プロセスに影響を及ぼします。MIC 腐食はバイオフィルムによって引き起こされると広く考えられています。電気発生微生物は、生き残るための持続エネルギーを得るために金属を腐食します17。最近の MIC の研究では、EET (細胞外電子移動) が電気発生微生物によって誘発される MIC の律速因子であることが示されています。Zhang ら18 は、電子メディエーターが Desulfuro sessificans 細胞と 304 ステンレス鋼の間の電子移動を促進し、より深刻な MIC 攻撃につながることを実証しました。Enning ら19 および Venzlaff ら200 20 では、腐食性硫酸還元細菌 (SRB) バイオフィルムが金属基質から電子を直接吸収し、深刻な孔食腐食を引き起こす可能性があることが示されました。
DSS は、SRB、鉄還元細菌 (IRB) などが含まれる環境では MIC の影響を受けやすいことが知られています。21 これらの細菌は、バイオフィルムの下の DSS 表面に局所的なピットを引き起こします22,23。DSS とは異なり、HDSS の MIC 24 はあまりわかっていません。
緑膿菌は、自然界に広く分布するグラム陰性の運動性桿菌です25。緑膿菌は海洋環境における主要な微生物群でもあり、鋼鉄に対するMICを引き起こします。緑膿菌は腐食プロセスに深く関わっており、バイオフィルム形成時の先駆的なコロニー形成菌として知られています。Mahat et al. 28 とYuan et al. 29 は、緑膿菌が水性環境において軟鋼および合金の腐食速度を高める傾向があることを実証しました。
この研究の主な目的は、電気化学的方法、表面分析技術、腐食生成物の分析を使用して、海洋好気性細菌 Pseudomonas aeruginosa によって引き起こされる 2707 HDSS の MIC 特性を調べることでした。開回路電位 (OCP)、直線分極抵抗 (LPR)、電気化学インピーダンス分光法 (EIS)、および電位動的分極を含む電気化学的研究を実行して、2707 HDSS の MIC 挙動を調べました。エネルギー分散型分光計 (EDS) 分析を実行して、腐食表面の化学元素を検出しました。さらに、X 線光電子分光法 (XPS) 分析を使用して、Pseudomonas aeruginosa を含む海洋環境の影響下での酸化膜不動態化の安定性を判定しました。ピットの深さは、共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) で測定しました。
表 1 に 2707 HDSS の化学組成を示します。表 2 は、2707 HDSS が 650 MPa の降伏強度という優れた機械的特性を備えていることを示しています。図 1 は、溶体化熱処理された 2707 HDSS の光学ミクロ構造を示しています。約 50% のオーステナイト相と 50% のフェライト相を含むミク​​ロ構造には、二次相のないオーステナイト相とフェライト相の細長い帯が見られます。
図2aは、2707 HDSSを非生物的2216E培地とP. aeruginosaブロスに14日間、37℃で曝露させたときの開放回路電位（Eocp）と曝露時間の関係のデータを示しています。これは、Eocpの最大かつ顕著な変化が最初の24時間以内に発生することを示しています。両方のケースのEocp値は、約16時間で-145 mV（vs. SCE）でピークに達し、その後急激に低下し、非生物的サンプルとPでそれぞれ-477 mV（vs. SCE）と-236 mV（vs. SCE）に達しました。 24時間後、Pseudomonas aeruginosa の 2707 HDSS の Eocp 値は -228 mV (vs. SCE) で比較的安定していましたが、非生物学的サンプルの対応する値は約 -442 mV (vs. SCE) でした。P. aeruginosa 存在下での Eocp はかなり低かったです。
2707個のHDSS標本を非生物培地と緑膿菌培養液中で37℃で電気化学試験した。
(a) 露出時間の関数としての Eocp、(b) 14 日目の分極曲線、(c) 露出時間の関数としての Rp、および (d) 露出時間の関数としての icorr。
表3は、非生物的媒体と緑膿菌を接種した媒体に14日間曝露された2707個のHDSSサンプルの電気化学的腐食パラメータ値を示しています。陽極曲線と陰極曲線の接線を外挿して交点に到達し、標準的な方法30,31に従って腐食電流密度（icorr）、腐食電位（Ecorr）、およびターフェル勾配（βαおよびβc）が得られました。
図 2b に示すように、Pseudomonas aeruginosa 曲線の上方シフトにより、非生物的曲線と比較して Ecorr が増加しました。腐食速度に比例する icorr 値は、Pseudomonas aeruginosa サンプルでは 0.328 μA cm-2 に増加し、非生物的サンプル (0.087 μA cm-2) の 4 倍になりました。
LPR は、迅速な腐食分析のための古典的な非破壊電気化学的手法です。MIC32 の研究にも使用されました。図 2c は、露出時間の関数としての分極抵抗 (Rp) を示しています。Rp 値が高いほど、腐食が少ないことを意味します。最初の 24 時間以内に、2707 HDSS の Rp は、非生物サンプルの場合は最大値の 1955 kΩ cm2、Pseudomonas aeruginosa サンプルの場合は 1429 kΩ cm2 に達しました。図 2c は、Rp 値が 1 日後に急速に減少し、その後 13 日間は比較的変化がなかったことも示しています。Pseudomonas aeruginosa サンプルの Rp 値は約 40 kΩ cm2 で、非生物サンプルの 450 kΩ cm2 値よりもはるかに低くなっています。
icorr値は均一腐食速度に比例します。その値は、次のStern-Geary式から計算できます。
Zou et al. 33に従い、本研究におけるターフェル勾配Bの典型的な値は26 mV/decと仮定しました。図2dは、非生物学的サンプル2707のicorrが比較的安定しているのに対し、P. aeruginosaサンプルは最初の24時間後に大きく変動したことを示しています。P. aeruginosaサンプルのicorr値は、非生物学的コントロールよりも1桁高くなりました。この傾向は、分極抵抗の結果と一致しています。
EIS は、腐食した界面での電気化学反応の特性評価に使用されるもう 1 つの非破壊検査手法です。非生物的媒体および Pseudomonas aeruginosa 溶液にさらされた試験片のインピーダンス スペクトルと計算された静電容量値、試験片の表面に形成された不活性膜/バイオフィルムの Rb 抵抗、Rct 電荷移動抵抗、Cdl 電気二重層静電容量 (EDL)、および QCPE 定位相要素 (CPE) パラメータ。これらのパラメータは、等価回路 (EEC) モデルを使用してデータをフィッティングすることによりさらに分析されました。
図 3 は、異なる培養時間における非生物培地および P. aeruginosa ブロス中の 2707 個の HDSS サンプルの典型的なナイキスト線図 (a および b) とボード線図 (a' および b') を示しています。ナイキスト リングの直径は、Pseudomonas aeruginosa が存在すると減少します。ボード線図 (図 3b') は、合計インピーダンスの大きさの増加を示しています。緩和時間定数に関する情報は、位相最大値から得られます。図 4 は、単層 (a) および二重層 (b) に基づく物理構造と、それに対応する EEC を示しています。CPE は EEC モデルに導入されています。そのアドミタンスとインピーダンスは次のように表されます。
2707 HDSS 試験片のインピーダンス スペクトルをフィッティングするための 2 つの物理モデルと対応する等価回路:
ここで、Y0 は CPE の大きさ、j は虚数または (-1)1/2、ω は角周波数、n は 1 未満の CPE 電力指数です35。電荷移動抵抗の逆数 (つまり 1/Rct) は腐食速度に対応します。Rct が小さいほど、腐食速度が速いことを意味します27。14 日間の培養後、Pseudomonas aeruginosa サンプルの Rct は 32 kΩ cm2 に達し、非生物学的サンプルの 489 kΩ cm2 よりもはるかに小さくなりました (表 4)。
図 5 の CLSM 画像と SEM 画像を見ると、7 日後、2707 HDSS 標本の表面のバイオフィルムの被覆率が密であることがはっきりとわかります。ただし、14 日後には、バイオフィルムの被覆率はまばらになり、一部の死細胞が現れました。表 5 は、7 日間と 14 日間 P. aeruginosa に曝露した後の 2707 HDSS 標本のバイオフィルムの厚さを示しています。最大バイオフィルムの厚さは、7 日後の 23.4 μm から 14 日後には 18.9 μm に変化しました。平均バイオフィルムの厚さもこの傾向を裏付け、7 日後の 22.2 ± 0.7 μm から 14 日後には 17.8 ± 1.0 μm に減少しました。
(a) 7日後の3D CLSM画像、(b) 14日後の3D CLSM画像、(c) 7日後のSEM画像、(d) 14日後のSEM画像。
EDS により、14 日間 P. aeruginosa に曝露されたサンプルのバイオフィルムと腐食生成物に含まれる化学元素が明らかになりました。図 6 は、バイオフィルムと腐食生成物の C、N、O、P の含有量が、地金よりもはるかに高いことを示しています。これは、これらの元素がバイオフィルムとその代謝産物に関係しているためです。微生物は、微量のクロムと鉄のみを必要とします。サンプルの表面のバイオフィルムと腐食生成物に含まれる Cr と Fe のレベルが高いことは、金属マトリックスが腐食により元素を失ったことを示しています。
14日後、2216E培地でP. aeruginosaの有無にかかわらずピットが観察されました。インキュベーション前は、試験片の表面は滑らかで欠陥はありませんでした（図7a）。インキュベーション後、バイオフィルムと腐食生成物を除去した後、図7bとcに示すように、試験片の表面の最も深いピットをCLSMで調べました。非生物学的コントロールサンプルの表面には明らかなピットは見つかりませんでした（最大ピット深度0.02μm）。Pseudomonas aeruginosaによる最大ピット深度は、7日後に0.52μm、14日後に0.69μmで、3つのサンプルの平均最大ピット深度（各サンプルに対して10の最大ピット深度値を選択）に基づいて、それぞれ0.42±0.12μmと0.52±0.15μmに達しました（表5）。これらのピット深度は、値は小さいですが重要です。
(a) 暴露前、(b) 非生物培地で 14 日間、(c) 緑膿菌ブロスで 14 日間。
図8は、異なるサンプル表面のXPSスペクトルを示しており、各表面で分析された化学組成は表6にまとめられています。表6では、P. aeruginosa（サンプルAおよびB）の存在下でのFeおよびCrの原子百分率は、非生物学的コントロールサンプル（サンプルCおよびD）のものよりもはるかに低かったです。P. aeruginosaサンプルの場合、Cr 2pコアレベルスペクトル曲線は、それぞれCr、Cr2O3、CrO3、およびCr（OH）3に起因する、結合エネルギー（BE）値が574.4、576.6、578.3、および586.8 eVの4つのピーク成分に適合しました（図9aおよびb）。非生物学的標本の場合、Cr 2pコアレベルスペクトルには、Cr（BEの573.80 eV）とCr2O3（575.90 eV）の2つの主要なピークが含まれています。非生物的サンプルとP. aeruginosaサンプルの最も顕著な違いは、バイオフィルム直下のCr6+の存在とCr(OH)3（BE 586.8 eV）の相対的割合の高さでした。
2 つの媒体における 2707 HDSS 試料の表面の広い XPS スペクトルは、それぞれ 7 日と 14 日です。
(a) P. aeruginosa への 7 日間の曝露、(b) P. aeruginosa への 14 日間の曝露、(c) 非生物的培地での 7 日間、および (d) 非生物的培地での 14 日間。
HDSS は、ほとんどの環境で高い耐食性を示します。Kim ら 2 は、UNS S32707 HDSS は PREN が 45 を超える高度に合金化された DSS として定義されていると報告しました。この研究における 2707 HDSS 試験片の PREN 値は 49 でした。これは、酸性および高塩化物環境で有益な、クロム含有量が高く、モリブデンおよび Ni レベルが高いためです。さらに、バランスの取れた組成と欠陥のない微細構造は、構造的安定性と耐食性に役立ちます。ただし、その優れた耐薬品性に​​もかかわらず、この研究の実験データでは、2707 HDSS が P. aeruginosa バイオフィルムの MIC に対して完全に耐性があるわけではないことが示唆されています。
電気化学的結果から、2707 HDSSのP. aeruginosaブロスにおける腐食速度は、非生物学的培地と比較して14日後に大幅に増加したことが示されました。図2aでは、最初の24時間で非生物学的培地とP. aeruginosaブロスの両方でEocpの減少が観察されました。その後、バイオフィルムが試料の表面を完全に覆い、Eocpは比較的安定しました36。しかし、生物学的Eocpのレベルは非生物学的Eocpのレベルよりもはるかに高くなりました。この差はP. aeruginosaバイオフィルムの形成によるものであると考えられる理由があります。図2dでは、P. aeruginosaの存在下で、2707 HDSSのicorr値は0.627 μA cm-2に達し、これは非生物学的コントロール（0.063 μA cm-2）よりも1桁高く、EISによって測定されたRct値と一致していました。数日間、P. aeruginosa ブロス中のインピーダンス値は、P. aeruginosa 細胞の付着とバイオフィルムの形成により増加しました。しかし、バイオフィルムが試料の表面を完全に覆うと、インピーダンスは減少します。バイオフィルムとバイオフィルム代謝物の形成により、保護層が最初に攻撃されます。そのため、耐食性は時間の経過とともに低下し、P. aeruginosa の付着によって局所的な腐食が発生しました。非生物的媒体では傾向が異なりました。非生物学的コントロールの耐食性は、P. aeruginosa ブロスに曝露されたサンプルの対応する値よりもはるかに高かったです。さらに、非生物的サンプルの場合、2707 HDSSのRct値は14日目に489 kΩ cm2に達し、これはP. aeruginosa 存在下のRct値（32 kΩ cm2）の15倍でした。したがって、2707 HDSSは滅菌環境で優れた耐食性を備えていますが、 P. aeruginosa バイオフィルムによる MIC 攻撃に耐性があります。
これらの結果は、図2bの分極曲線からも確認できます。陽極分岐は、緑膿菌バイオフィルムの形成と金属の酸化反応に起因しています。同時に、陰極反応は酸素の還元です。緑膿菌の存在は、腐食電流密度を大幅に増加させ、非生物的対照よりも約1桁高くしました。これは、緑膿菌バイオフィルムが2707 HDSSの局所腐食を増加させることを示しています。Yuanら29は、70/30 Cu-Ni合金の腐食電流密度が緑膿菌バイオフィルムの攻撃下で増加することを発見しました。これは、緑膿菌バイオフィルムによる酸素還元の生体触媒作用によるものと考えられます。この観察結果は、本研究における2707 HDSSのMICを説明するものかもしれません。好気性バイオフィルムは、その下の酸素も少ない可能性があります。したがって、酸素による金属表面の再不動態化の失敗が、この作品のMIC。
Dickinson ら 38 は、化学反応と電気化学反応の速度は、試料表面の付着細菌の代謝活動と腐食生成物の性質によって直接影響を受ける可能性があることを示唆しています。図 5 と表 5 に示すように、細胞数とバイオフィルムの厚さは 14 日後には両方とも減少しました。これは、14 日後に 2216E 培地の栄養素枯渇または 2707 HDSS マトリックスからの有毒金属イオンの放出により、2707 HDSS 表面の付着細胞のほとんどが死んだためであると合理的に説明できます。これはバッチ実験の制限です。
この研究では、P. aeruginosaバイオフィルムは、2707 HDSS表面のバイオフィルム下のCrとFeの局所的な枯渇を促進しました（図6）。表6では、サンプルDのFeとCrの減少がサンプルCと比較して見られ、P. aeruginosaバイオフィルムによって引き起こされた溶解したFeとCrが最初の7日間を超えて持続したことを示しています。2216E培地は海洋環境をシミュレートするために使用されます。この培地には17700 ppmのCl-が含まれており、これは天然海水中の濃度に匹敵します。17700 ppmのCl-の存在は、XPSで分析された7日目と14日目の非生物サンプルにおけるCrの減少の主な原因でした。P. aeruginosaサンプルと比較して、非生物サンプル中のCrの溶解は、2707 HDSSの非生物環境における強いCl-耐性により、はるかに少なかったです。図9は、不動態膜中のCr6+の存在を示しています。これは、 Chen と Clayton が示唆したように、P. aeruginosa バイオフィルムによる鋼鉄表面からの Cr の除去。
細菌の増殖により、培養前後の培地のpH値はそれぞれ7.4と8.2でした。したがって、P. aeruginosaバイオフィルムの下では、バルク培地のpHが比較的高いため、有機酸腐食がこの研究に寄与する要因である可能性は低いです。非生物学的コントロール培地のpHは、14日間の試験期間中に大幅に変化しませんでした（最初の7.4から最終的な7.5まで）。インキュベーション後の接種培地のpHの上昇は、P. aeruginosaの代謝活動によるもので、試験ストリップがない場合でもpHに同じ影響を与えることがわかりました。
図 7 に示すように、P. aeruginosa バイオフィルムによって生じた最大のピット深さは 0.69 μm で、非生物的培地 (0.02 μm) のピット深さよりもはるかに大きかった。これは、上記の電気化学データと一致している。0.69 μm のピット深さは、同じ条件下で 2205 DSS に報告された 9.5 μm の値の 10 分の 1 以下である。これらのデータは、2707 HDSS が 2205 DSS と比較して優れた MIC 耐性を示すことを実証している。これは驚くことではない。2707 HDSS はクロム含有量が高く、有害な二次沈殿のないバランスの取れた相構造によって不動態化が長持ちし、P. aeruginosa が不動態化を解除して開始点を覆いにくくなるためである。
結論として、非生物的培地では無視できる程度のピット形成であったのに対し、P. aeruginosa ブロスでは 2707 HDSS の表面に MIC ピット形成が確認されました。この研究は、2707 HDSS は 2205 DSS よりも MIC 耐性が優れているものの、P. aeruginosa バイオフィルムが存在するため MIC に対して完全に耐性があるわけではないことを示しています。これらの知見は、海洋環境に適したステンレス鋼の選択と耐用年数の推定に役立ちます。
2707 HDSS のクーポンは、中国瀋陽の東北大学冶金学院から提供されています。2707 HDSS の元素組成は表 1 に示されており、NEU 材料分析および試験部門で分析されています。すべてのサンプルは、1180 °C で 1 時間溶解処理されました。腐食試験の前に、上部露出表面積が 1 cm2 のコイン型の 2707 HDSS をシリコンカーバイド紙で 2000 グリットに研磨し、さらに 0.05 μm Al2O3 粉末懸濁液で研磨しました。側面と底面は不活性塗料で保護されています。乾燥後、試験片を滅菌脱イオン水ですすぎ、75% (v/v) エタノールで 0.5 時間滅菌しました。次に、使用前に紫外線 (UV) 下で 0.5 時間風乾しました。
海洋性緑膿菌MCCC 1A00099株は、中国の厦門海洋培養コレクションセンター（MCCC）から購入しました。緑膿菌は、Marine 2216E液体培地（Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd.、中国青島）を使用して、250 mlフラスコおよび500 ml電気化学ガラスセルで37°Cで好気的に培養されました。培地（g/L）：19.45 NaCl、5.98 MgCl2、3.24 Na2SO4、1.8 CaCl2、0.55 KCl、0.16 Na2CO3、0.08 KBr、0.034 SrCl2、0.08 SrBr2、0.022 H3BO3、0.004 NaSiO3、0.0016 NH3、0.0016 NH3、0.16 NaH2PO4、5.0 ペプトン、1.0 酵母エキス、0.1 クエン酸鉄。接種前に 121°C で 20 分間オートクレーブ処理します。400 倍の倍率の光学顕微鏡下で血球計数器を使用して、固着細胞とプランクトン細胞を数えます。接種直後のプランクトン性緑膿菌の初期細胞濃度は、約 106 細胞/ml でした。
電気化学試験は、培地容量500mlの標準的な3電極ガラスセルで実施しました。白金シートと飽和カロメル電極（SCE）は、塩橋を充填したルギン毛細管を介してリアクターに接続され、それぞれ対極と参照電極として機能しました。作用電極を作成するために、各試料にゴム被覆銅線を取り付け、エポキシで覆い、作用電極用に約1cm2の露出片面表面積を残しました。電気化学測定中、サンプルは2216E培地に置かれ、ウォーターバスで一定のインキュベーション温度（37℃）に維持されました。OCP、LPR、EIS、および電位動的分極データは、Autolabポテンショスタット（Reference 600TM、Gamry Instruments, Inc.、米国）を使用して測定されました。LPR試験は、Eocpで-5～5mVの範囲で0.125mV s-1のスキャン速度で記録され、サンプリング周波数は1Hzでした。EISは、定常状態の Eocp で 5 mV の印加電圧を使用して、周波数範囲 0.01 ～ 10,000 Hz の正弦波を生成しました。電位スイープの前に、安定した自由腐食電位値に達するまで電極は開回路モードになっていました。次に、スキャン速度 0.166 mV/s で、Eocp に対して -0.2 ～ 1.5 V の分極曲線が実行されました。各テストは、P. aeruginosa の有無で 3 回繰り返されました。
組織学的分析用の試料は、2000グリットの湿式SiC紙で機械研磨され、その後、光学観察のために0.05μmのAl2O3粉末懸濁液でさらに研磨されました。組織学的分析は光学顕微鏡を使用して実施されました。試料は10重量％水酸化カリウム溶液43でエッチングされました。
インキュベーション後、サンプルはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（pH 7.4 ± 0.2）で3回洗浄し、2.5%（v/v）グルタルアルデヒドで10時間固定してバイオフィルムを固定しました。その後、段階的な一連の（50%、60%、70%、80%、90%、95%、および100% v/v）エタノールで脱水し、風乾しました。最後に、サンプルの表面に金の薄膜を蒸着してSEM観察のための導電性を確保しました。SEM画像は、各標本の表面で最も付着性のP. aeruginosa細胞が多い部分に焦点を合わせました。EDS分析を実行して化学元素を検出しました。Zeiss共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）（LSM 710、Zeiss、ドイツ）を使用してピットの深さを測定しました。バイオフィルムを除去するために、まず試験片を中国国家規格（CNS）GB/T4334.4-2000に従って洗浄し、試験片の表面の腐食生成物とバイオフィルムを除去しました。
X線光電子分光法（XPS、ESCALAB250表面分析システム、Thermo VG、米国）分析は、標準条件下で0～1350 eVの広い結合エネルギー範囲にわたって単色X線源（1500 eVエネルギーおよび150 W出力のアルミニウムKα線）を使用して実行されました。高解像度スペクトルは、50 eVパスエネルギーおよび0.2 eVステップサイズを使用して記録されました。
インキュベートした標本を取り出し、PBS（pH 7.4 ± 0.2）で15秒間穏やかにすすいだ45。サンプル上のバイオフィルムの細菌生存率を観察するために、バイオフィルムはLIVE / DEAD BacLight Bacterial Viability Kit（Invitrogen、オレゴン州ユージーン、米国）を使用して染色された。キットには、緑色蛍光SYTO-9色素と赤色蛍光ヨウ化プロピジウム（PI）色素の2つの蛍光色素が含まれている。CLSMでは、緑色と赤色の蛍光の点はそれぞれ生細胞と死細胞を表す。染色のために、3μlのSYTO-9と3μlのPI溶液を含む1mlの混合物を暗所で室温（23℃）で20分間インキュベートした。その後、染色されたサンプルは、Nikon CLSM装置（C2 Plus、ニコン（日本）バイオフィルムの厚さは3Dスキャンモードで測定されました。
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