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La corrosión microbiana (CMI) es un problema grave en muchas industrias, ya que puede causar enormes pérdidas económicas. El acero inoxidable superdúplex 2707 (2707 HDSS) se ha utilizado en ambientes marinos debido a su excelente resistencia química. Sin embargo, su resistencia a la CMI no se ha demostrado experimentalmente. En este estudio, se investigó el comportamiento de la CMI del 2707 HDSS causado por la bacteria marina aerobia Pseudomonas aeruginosa. El análisis electroquímico mostró que, en presencia de biopelícula de Pseudomonas aeruginosa en medio 2216E, hubo un cambio positivo en el potencial de corrosión y un aumento en la densidad de corriente de corrosión. El análisis de espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) mostró una disminución en el contenido de Cr en la superficie de la muestra debajo de la biopelícula. El análisis de imágenes de las picaduras mostró que la biopelícula de P. aeruginosa produjo una profundidad máxima de picadura de 0,69 μm durante 14 días de incubación. Aunque esto es pequeño, indica que el 2707 HDSS es no es totalmente inmune a la CMI de los biofilms de P. aeruginosa.
Los aceros inoxidables dúplex (DSS) se utilizan ampliamente en diversas industrias por su combinación ideal de excelentes propiedades mecánicas y resistencia a la corrosión1,2. Sin embargo, aún se produce picadura localizada y afecta la integridad de este acero3,4. El DSS no es resistente a la corrosión microbiana (MIC)5,6. A pesar de la amplia gama de aplicaciones del DSS, todavía existen entornos donde la resistencia a la corrosión del DSS no es suficiente para un uso a largo plazo. Esto significa que se requieren materiales más caros con mayor resistencia a la corrosión. Jeon et al7 encontraron que incluso los aceros inoxidables superdúplex (SDSS) tienen algunas limitaciones en términos de resistencia a la corrosión. Por lo tanto, en algunas aplicaciones se requieren aceros inoxidables superdúplex (HDSS) con mayor resistencia a la corrosión. Esto llevó al desarrollo de HDSS altamente aleados.
La resistencia a la corrosión del DSS depende de la proporción de las fases alfa y gamma y de las regiones empobrecidas en Cr, Mo y W 8, 9, 10 adyacentes a la segunda fase. El HDSS contiene un alto contenido de Cr, Mo y N11, por lo que tiene una excelente resistencia a la corrosión y un alto valor (45-50) de Número Equivalente de Resistencia a la Picadura (PREN), determinado por % en peso de Cr + 3,3 (% en peso de Mo + 0,5 % en peso de W) + 16 % en peso de N12. Su excelente resistencia a la corrosión se basa en una composición equilibrada que contiene aproximadamente 50 % de ferrita (α) y 50 % de fases austeníticas (γ), el HDSS tiene mejores propiedades mecánicas y mayor resistencia que el DSS convencional13. Propiedades de corrosión por cloruros. La resistencia a la corrosión mejorada amplía el uso del HDSS en entornos de cloruros más corrosivos, como los entornos marinos.
Las MIC son un problema importante en muchas industrias, como las de petróleo y gas y las de servicios de agua14. Las MIC representan el 20% de todos los daños por corrosión15. Las MIC son corrosión bioelectroquímica que se puede observar en muchos entornos. Las biopelículas que se forman en las superficies metálicas alteran las condiciones electroquímicas, afectando así el proceso de corrosión. Se cree ampliamente que la corrosión MIC es causada por biopelículas. Los microorganismos electrogénicos corroen los metales para obtener energía de sostenimiento para sobrevivir17. Estudios recientes sobre MIC han demostrado que la EET (transferencia de electrones extracelular) es el factor limitante de la velocidad en la MIC inducida por microorganismos electrogénicos. Zhang et al. 18 demostraron que los mediadores de electrones aceleran la transferencia de electrones entre las células de Desulfovibrio sessificans y el acero inoxidable 304, lo que conduce a un ataque MIC más severo. Enning et al. 19 y Venzlaff et al. 20 demostraron que las biopelículas de bacterias reductoras de sulfato (SRB) corrosivas pueden absorber directamente electrones de los sustratos metálicos, lo que resulta en una corrosión por picaduras severa.
Se sabe que el DSS es susceptible a la MIC en entornos que contienen SRB, bacterias reductoras de hierro (IRB), etc. 21. Estas bacterias causan picaduras localizadas en las superficies de DSS debajo de biopelículas22,23. A diferencia del DSS, la MIC del HDSS24 es poco conocida.
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria gramnegativa móvil con forma de bacilo que está ampliamente distribuida en la naturaleza25. Pseudomonas aeruginosa también es un grupo microbiano importante en el medio marino, causando MIC al acero. Pseudomonas está estrechamente involucrada en los procesos de corrosión y se reconoce como un colonizador pionero durante la formación de biopelículas. Mahat et al. 28 y Yuan et al. 29 demostraron que Pseudomonas aeruginosa tiene una tendencia a aumentar la tasa de corrosión del acero dulce y las aleaciones en ambientes acuosos.
El objetivo principal de este trabajo fue investigar las propiedades de corrosión inducida por microorganismos (MIC) del acero inoxidable dúplex 2707 (HDSS) causadas por la bacteria marina aerobia Pseudomonas aeruginosa, utilizando métodos electroquímicos, técnicas analíticas de superficie y análisis de productos de corrosión. Se realizaron estudios electroquímicos, incluyendo potencial de circuito abierto (OCP), resistencia a la polarización lineal (LPR), espectroscopia de impedancia electroquímica (EIS) y polarización dinámica de potencial, para estudiar el comportamiento MIC del HDSS 2707. Se realizó un análisis de espectrometría de energía dispersiva (EDS) para encontrar elementos químicos en la superficie corroída. Además, se utilizó un análisis de espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) para determinar la estabilidad de la pasivación de la película de óxido bajo la influencia de un ambiente marino que contiene Pseudomonas aeruginosa. La profundidad de la picadura se midió con un microscopio confocal de barrido láser (CLSM).
La Tabla 1 enumera la composición química del acero inoxidable 2707 HDSS. La Tabla 2 muestra que el acero inoxidable 2707 HDSS tiene excelentes propiedades mecánicas con una resistencia a la fluencia de 650 MPa. La Figura 1 muestra la microestructura óptica del acero inoxidable 2707 HDSS tratado térmicamente en solución. Se pueden observar bandas alargadas de fases de austenita y ferrita sin fases secundarias en la microestructura que contiene aproximadamente un 50 % de fases de austenita y un 50 % de fases de ferrita.
La figura 2a muestra el potencial de circuito abierto (Eocp) en función del tiempo de exposición para 2707 HDSS en medio abiótico 2216E y caldo de P. aeruginosa durante 14 días a 37 °C. Se observa que el cambio más grande y significativo en el Eocp ocurre dentro de las primeras 24 horas. Los valores de Eocp en ambos casos alcanzaron un pico de -145 mV (vs. SCE) alrededor de las 16 h y luego cayeron bruscamente, llegando a -477 mV (vs. SCE) y -236 mV (vs. SCE) para la muestra abiótica y P, respectivamente. cupones de Pseudomonas aeruginosa, respectivamente. Después de 24 horas, el valor de Eocp de 2707 HDSS para P. aeruginosa fue relativamente estable en -228 mV (vs. SCE), mientras que el valor correspondiente para muestras no biológicas fue aproximadamente -442 mV (vs. SCE). El Eocp en presencia de P. aeruginosa fue bastante bajo.
Pruebas electroquímicas de 2707 muestras HDSS en medio abiótico y caldo de Pseudomonas aeruginosa a 37 °C:
(a) Eocp en función del tiempo de exposición, (b) curvas de polarización en el día 14, (c) Rp en función del tiempo de exposición y (d) icorr en función del tiempo de exposición.
La Tabla 3 enumera los valores de los parámetros de corrosión electroquímica de 2707 muestras de HDSS expuestas a un medio abiótico y a un medio inoculado con Pseudomonas aeruginosa durante 14 días. Las tangentes de las curvas anódicas y catódicas se extrapolaron para llegar a las intersecciones que producen la densidad de corriente de corrosión (icorr), el potencial de corrosión (Ecorr) y las pendientes de Tafel (βα y βc) de acuerdo con los métodos estándar30,31.
Como se muestra en la Figura 2b, el desplazamiento ascendente de la curva de P. aeruginosa resultó en un aumento de Ecorr en comparación con la curva abiótica. El valor de icorr, que es proporcional a la tasa de corrosión, aumentó a 0,328 μA cm-2 en la muestra de Pseudomonas aeruginosa, cuatro veces el de la muestra no biológica (0,087 μA cm-2).
LPR es un método electroquímico clásico no destructivo para el análisis rápido de la corrosión. También se utilizó para estudiar MIC32. La figura 2c muestra la resistencia a la polarización (Rp) en función del tiempo de exposición. Un valor de Rp más alto significa menos corrosión. Dentro de las primeras 24 horas, la Rp de 2707 HDSS alcanzó un valor máximo de 1955 kΩ cm2 para muestras abióticas y 1429 kΩ cm2 para muestras de Pseudomonas aeruginosa. La figura 2c también muestra que el valor de Rp disminuyó rápidamente después de un día y luego se mantuvo relativamente sin cambios durante los siguientes 13 días. El valor de Rp de la muestra de Pseudomonas aeruginosa es de aproximadamente 40 kΩ cm2, que es mucho menor que el valor de 450 kΩ cm2 de la muestra no biológica.
El valor de icorr es proporcional a la tasa de corrosión uniforme. Su valor se puede calcular a partir de la siguiente ecuación de Stern-Geary:
Siguiendo a Zou et al. 33, se asumió un valor típico de la pendiente de Tafel B en este trabajo de 26 mV/década. La figura 2d muestra que el icorr de la muestra no biológica 2707 se mantuvo relativamente estable, mientras que la muestra de P. aeruginosa fluctuó mucho después de las primeras 24 horas. Los valores de icorr de las muestras de P. aeruginosa fueron un orden de magnitud más altos que los controles no biológicos. Esta tendencia es consistente con los resultados de la resistencia a la polarización.
EIS es otra técnica no destructiva utilizada para caracterizar reacciones electroquímicas en interfaces corroídas. Espectros de impedancia y valores de capacitancia calculados de especímenes expuestos a medios abióticos y solución de Pseudomonas aeruginosa, Rb resistencia de película pasiva/biopelícula formada en la superficie del espécimen, Rct resistencia de transferencia de carga, Cdl capacitancia de doble capa eléctrica (EDL) y QCPE parámetros de elemento de fase constante (CPE). Estos parámetros se analizaron posteriormente ajustando los datos utilizando un modelo de circuito equivalente (EEC).
La Figura 3 muestra diagramas de Nyquist típicos (a y b) y diagramas de Bode (a' y b') de 2707 muestras HDSS en medio abiótico y caldo de P. aeruginosa para diferentes tiempos de incubación. El diámetro del anillo de Nyquist disminuye en presencia de Pseudomonas aeruginosa. El diagrama de Bode (Fig. 3b') muestra un aumento en la magnitud de la impedancia total. La información sobre la constante de tiempo de relajación puede ser proporcionada por los máximos de fase. La Figura 4 muestra las estructuras físicas basadas en monocapa (a) y bicapa (b) y sus correspondientes EEC. El CPE se introduce en el modelo EEC. Su admitancia e impedancia se expresan de la siguiente manera:
Dos modelos físicos y sus correspondientes circuitos equivalentes para ajustar el espectro de impedancia de la muestra HDSS 2707:
donde Y0 es la magnitud del CPE, j es el número imaginario o (-1)1/2, ω es la frecuencia angular y n es el índice de potencia del CPE menor que la unidad35. El inverso de la resistencia a la transferencia de carga (es decir, 1/Rct) corresponde a la tasa de corrosión. Un Rct más pequeño significa una tasa de corrosión más rápida27. Después de 14 días de incubación, el Rct de las muestras de Pseudomonas aeruginosa alcanzó 32 kΩ cm2, mucho menor que los 489 kΩ cm2 de las muestras no biológicas (Tabla 4).
Las imágenes CLSM y SEM de la Figura 5 muestran claramente que la cobertura de biopelícula en la superficie de la muestra 2707 HDSS después de 7 días es densa. Sin embargo, después de 14 días, la cobertura de biopelícula era escasa y aparecieron algunas células muertas. La Tabla 5 muestra el espesor de la biopelícula en las muestras 2707 HDSS después de la exposición a P. aeruginosa durante 7 y 14 días. El espesor máximo de la biopelícula cambió de 23,4 μm después de 7 días a 18,9 μm después de 14 días. El espesor promedio de la biopelícula también confirmó esta tendencia. Disminuyó de 22,2 ± 0,7 μm después de 7 días a 17,8 ± 1,0 μm después de 14 días.
(a) Imagen CLSM 3D después de 7 días, (b) Imagen CLSM 3D después de 14 días, (c) Imagen SEM después de 7 días y (d) Imagen SEM después de 14 días.
El análisis EDS reveló la presencia de elementos químicos en biopelículas y productos de corrosión en muestras expuestas a P. aeruginosa durante 14 días. La Figura 6 muestra que el contenido de C, N, O y P en las biopelículas y los productos de corrosión es mucho mayor que en los metales desnudos, debido a que estos elementos están asociados con las biopelículas y sus metabolitos. Los microbios solo necesitan cantidades traza de cromo y hierro. Los altos niveles de Cr y Fe en la biopelícula y los productos de corrosión en la superficie de las muestras indican que la matriz metálica ha perdido elementos debido a la corrosión.
Después de 14 días, se observó picaduras con y sin P. aeruginosa en el medio 2216E. Antes de la incubación, la superficie de la muestra era lisa y sin defectos (Fig. 7a). Después de la incubación y la eliminación del biofilm y los productos de corrosión, las picaduras más profundas en la superficie de las muestras se examinaron bajo CLSM, como se muestra en la Figura 7b y c. No se encontraron picaduras evidentes en la superficie de las muestras de control no biológicas (profundidad máxima de la picadura 0,02 μm). La profundidad máxima de la picadura causada por Pseudomonas aeruginosa fue de 0,52 μm después de 7 días y de 0,69 μm después de 14 días, basándose en la profundidad máxima promedio de la picadura de 3 muestras (se seleccionaron 10 valores de profundidad máxima de la picadura para cada muestra) que alcanzó 0,42 ± 0,12 μm y 0,52 ± 0,15 μm, respectivamente (Tabla 5). Estos valores de profundidad de la picadura son pequeños pero importantes.
(a) Antes de la exposición, (b) 14 días en medio abiótico y (c) 14 días en caldo de Pseudomonas aeruginosa.
La Figura 8 muestra los espectros XPS de diferentes superficies de muestra, y las composiciones químicas analizadas para cada superficie se resumen en la Tabla 6. En la Tabla 6, los porcentajes atómicos de Fe y Cr en presencia de P. aeruginosa (muestras A y B) fueron mucho más bajos que los de las muestras de control no biológicas (muestras C y D). Para la muestra de P. aeruginosa, la curva espectral de nivel central Cr 2p se ajustó a cuatro componentes de pico con valores de energía de enlace (BE) de 574,4, 576,6, 578,3 y 586,8 eV, que pueden atribuirse a Cr, Cr2O3, CrO3 y Cr(OH)3, respectivamente (Fig. 9a y b). Para las muestras no biológicas, el espectro de nivel central Cr 2p contiene dos picos principales para Cr (573,80 eV para BE) y Cr2O3 (575,90 eV para BE) en las figuras 9c y 9d, respectivamente. La diferencia más llamativa entre las muestras abióticas y las de P. aeruginosa fue la presencia de Cr6+ y una fracción relativa más alta de Cr(OH)3 (BE de 586,8 eV) debajo de la biopelícula.
Los espectros XPS amplios de la superficie de la muestra 2707 HDSS en los dos medios son de 7 días y 14 días, respectivamente.
(a) 7 días de exposición a P. aeruginosa, (b) 14 días de exposición a P. aeruginosa, (c) 7 días en medio abiótico y (d) 14 días en medio abiótico.
El HDSS exhibe altos niveles de resistencia a la corrosión en la mayoría de los entornos. Kim et al. 2 informaron que el HDSS UNS S32707 se definió como un DSS altamente aleado con un PREN de más de 45. El valor PREN de la muestra de HDSS 2707 en este trabajo fue de 49. Esto se debe a su alto contenido de cromo y altos niveles de molibdeno y Ni, que son beneficiosos en entornos ácidos y con alto contenido de cloruro. Además, una composición bien equilibrada y una microestructura libre de defectos son útiles para la estabilidad estructural y la resistencia a la corrosión. Sin embargo, a pesar de su excelente resistencia química, los datos experimentales en este trabajo sugieren que el HDSS 2707 no es completamente inmune a la MIC de los biofilms de P. aeruginosa.
Los resultados electroquímicos mostraron que la tasa de corrosión del 2707 HDSS en caldo de P. aeruginosa aumentó significativamente después de 14 días en comparación con el medio no biológico. En la Figura 2a, se observó una reducción en Eocp tanto en el medio abiótico como en el caldo de P. aeruginosa durante las primeras 24 horas. Posteriormente, la biopelícula cubrió completamente la superficie de la muestra y el Eocp se volvió relativamente estable36. Sin embargo, el nivel de Eocp biológico fue mucho mayor que el de Eocp no biológico. Hay razones para creer que esta diferencia se debe a la formación de biopelícula de P. aeruginosa. En la Figura 2d, en presencia de P. aeruginosa, el valor de icorr del 2707 HDSS alcanzó 0,627 μA cm-2, que fue un orden de magnitud mayor que el del control abiótico (0,063 μA cm-2), lo que fue consistente con el valor de Rct medido por EIS. Durante los primeros días, los valores de impedancia En el caldo de P. aeruginosa, la resistencia a la corrosión aumentó debido a la adhesión de células de P. aeruginosa y la formación de biopelículas. Sin embargo, cuando la biopelícula cubre completamente la superficie de la muestra, la impedancia disminuye. La capa protectora es atacada primero debido a la formación de biopelículas y metabolitos de biopelículas. Por lo tanto, la resistencia a la corrosión disminuyó con el tiempo, y la adhesión de P. aeruginosa causó corrosión localizada. Las tendencias en medios abióticos fueron diferentes. La resistencia a la corrosión del control no biológico fue mucho mayor que el valor correspondiente de las muestras expuestas al caldo de P. aeruginosa. Además, para las muestras abióticas, el valor de Rct de 2707 HDSS alcanzó 489 kΩ cm2 el día 14, que fue 15 veces el valor de Rct (32 kΩ cm2) en presencia de P. aeruginosa. Por lo tanto, 2707 HDSS tiene una excelente resistencia a la corrosión en un ambiente estéril, pero no es resistente al ataque de MIC por P. aeruginosa. biopelículas.
Estos resultados también se pueden observar en las curvas de polarización de la Fig. 2b. La ramificación anódica se atribuyó a la formación de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa y a las reacciones de oxidación del metal. Al mismo tiempo, la reacción catódica es la reducción de oxígeno. La presencia de P. aeruginosa aumentó considerablemente la densidad de corriente de corrosión, aproximadamente un orden de magnitud mayor que el control abiótico. Esto indica que la biopelícula de P. aeruginosa aumenta la corrosión localizada del 2707 HDSS. Yuan et al.29 encontraron que la densidad de corriente de corrosión de la aleación 70/30 Cu-Ni aumentó bajo el desafío de la biopelícula de P. aeruginosa. Esto puede deberse a la biocatálisis de la reducción de oxígeno por las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. Esta observación también puede explicar la MIC del 2707 HDSS en este trabajo. Las biopelículas aeróbicas también pueden tener menos oxígeno debajo de ellas. Por lo tanto, la falta de re-pasivación de la superficie del metal por oxígeno puede ser un factor que contribuya a la MIC en este trabajo.
Dickinson et al. 38 sugirieron que las tasas de reacciones químicas y electroquímicas pueden verse directamente afectadas por la actividad metabólica de las bacterias sésiles en la superficie de la muestra y la naturaleza de los productos de corrosión. Como se muestra en la Figura 5 y la Tabla 5, tanto el número de células como el espesor de la biopelícula disminuyeron después de 14 días. Esto puede explicarse razonablemente porque después de 14 días, la mayoría de las células sésiles en la superficie de 2707 HDSS murieron debido al agotamiento de nutrientes en el medio 2216E o a la liberación de iones de metales tóxicos de la matriz 2707 HDSS. Esta es una limitación de los experimentos por lotes.
En este trabajo, el biofilm de P. aeruginosa promovió el agotamiento local de Cr y Fe debajo del biofilm en la superficie 2707 HDSS (Fig. 6). En la Tabla 6, la reducción de Fe y Cr en la muestra D en comparación con la muestra C, indica que el Fe y Cr disueltos causados ​​por el biofilm de P. aeruginosa persistieron más allá de los primeros 7 días. El medio 2216E se utiliza para simular ambientes marinos. Contiene 17700 ppm de Cl-, que es comparable al que se encuentra en el agua de mar natural. La presencia de 17700 ppm de Cl- fue la razón principal de la reducción de Cr en las muestras abióticas de 7 y 14 días analizadas por XPS. En comparación con las muestras de P. aeruginosa, la disolución de Cr en las muestras abióticas fue mucho menor debido a la fuerte resistencia al Cl− del 2707 HDSS en ambientes abióticos. La Figura 9 muestra la presencia de Cr6+ en la película de pasivación. Puede estar involucrado en la eliminación de Cr de superficies de acero por biopelículas de P. aeruginosa, como sugieren Chen y Clayton.
Debido al crecimiento bacteriano, los valores de pH del medio antes y después del cultivo fueron 7,4 y 8,2, respectivamente. Por lo tanto, es poco probable que la corrosión por ácidos orgánicos debajo del biofilm de P. aeruginosa sea un factor que contribuya a este trabajo debido al pH relativamente alto en el medio a granel. El pH del medio de control no biológico no cambió significativamente (de un 7,4 inicial a un 7,5 final) durante el período de prueba de 14 días. El aumento del pH en el medio de inoculación después de la incubación se debió a la actividad metabólica de P. aeruginosa y se encontró que tenía el mismo efecto sobre el pH en ausencia de tiras reactivas.
Como se muestra en la Figura 7, la profundidad máxima de la cavidad causada por el biofilm de P. aeruginosa fue de 0,69 μm, que fue mucho mayor que la del medio abiótico (0,02 μm). Esto es consistente con los datos electroquímicos descritos anteriormente. La profundidad de la cavidad de 0,69 μm es más de diez veces menor que el valor de 9,5 μm reportado para el 2205 DSS en las mismas condiciones. Estos datos demuestran que el 2707 HDSS exhibe una mejor resistencia a la corrosión inducida por microorganismos (MIC) en comparación con el 2205 DSS. Esto no debería sorprender, ya que el 2707 HDSS tiene un mayor contenido de cromo, lo que proporciona una pasivación más duradera, debido a la estructura de fase equilibrada sin precipitados secundarios dañinos, lo que hace que sea más difícil para P. aeruginosa despasivar y los puntos de inicio eclipsen.
En conclusión, se observó corrosión por corrosión inducida por microorganismos (MIC) en la superficie del acero inoxidable 2707 HDSS en caldo de P. aeruginosa, en comparación con una corrosión prácticamente nula en medios abióticos. Este trabajo demuestra que el acero inoxidable 2707 HDSS tiene mayor resistencia a la corrosión inducida por microorganismos que el acero inoxidable 2205 DSS, pero no es completamente inmune a ella debido a la biopelícula de P. aeruginosa. Estos hallazgos contribuyen a la selección de aceros inoxidables adecuados y a la estimación de su vida útil en el entorno marino.
El cupón para 2707 HDSS es proporcionado por la Escuela de Metalurgia de la Universidad del Noreste (NEU) en Shenyang, China. La composición elemental de 2707 HDSS se muestra en la Tabla 1, que fue analizada por el Departamento de Análisis y Pruebas de Materiales de la NEU. Todas las muestras fueron tratadas en solución a 1180 °C durante 1 hora. Antes de la prueba de corrosión, 2707 HDSS en forma de moneda con un área de superficie expuesta superior de ​​1 cm2 se pulió a 2000 granos con papel de carburo de silicio y luego se pulió con una suspensión de polvo de Al2O3 de 0,05 μm. Los lados y la parte inferior están protegidos por pintura inerte. Después del secado, las muestras se enjuagaron con agua desionizada estéril y se esterilizaron con etanol al 75% (v/v) durante 0,5 h. Luego se secaron al aire bajo luz ultravioleta (UV) durante 0,5 horas antes de su uso.
La cepa marina Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099 se adquirió del Centro de Colección de Cultivos Marinos de Xiamen (MCCC), China. Pseudomonas aeruginosa se cultivó aeróbicamente a 37 °C en matraces de 250 ml y celdas electroquímicas de vidrio de 500 ml utilizando medio líquido Marine 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China). Medio (g/L): 19,45 NaCl, 5,98 MgCl2, 3,24 Na2SO4, 1,8 CaCl2, 0,55 KCl, 0,16 Na2CO3, 0,08 KBr, 0,034 SrCl2, 0,08 SrBr2, 0,022 H3BO3, 0,004 NaSiO3, 0,016 NH3, 0,016 NH3, 0,016 NaH2PO4, 5,0 peptona, 1,0 extracto de levadura y 0,1 citrato férrico. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 20 minutos antes de la inoculación. Contar las células sésiles y planctónicas utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio óptico con un aumento de 400X. La concentración celular inicial de Pseudomonas aeruginosa planctónica inmediatamente después de la inoculación fue de aproximadamente 10⁶ células/ml.
Se realizaron pruebas electroquímicas en una celda de vidrio clásica de tres electrodos con un volumen medio de 500 ml. Una lámina de platino y un electrodo de calomelanos saturado (ECS) se conectaron al reactor a través de capilares de Luggin llenos de puentes salinos, sirviendo como contraelectrodo y electrodo de referencia, respectivamente. Para hacer los electrodos de trabajo, se unió un alambre de cobre recubierto de caucho a cada muestra y se cubrió con epoxi, dejando aproximadamente 1 cm2 de área superficial expuesta de una sola cara para el electrodo de trabajo. Durante las mediciones electroquímicas, las muestras se colocaron en medio 2216E y se mantuvieron a una temperatura de incubación constante (37 °C) en un baño de agua. Los datos de OCP, LPR, EIS y polarización dinámica de potencial se midieron utilizando un potenciostato Autolab (Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., EE. UU.). Las pruebas LPR se registraron a una velocidad de barrido de 0,125 mV s-1 en el rango de -5 y 5 mV con Eocp y una frecuencia de muestreo de 1 Hz. El EIS se realizó con un onda sinusoidal en el rango de frecuencia de 0,01 a 10 000 Hz utilizando un voltaje aplicado de 5 mV en estado estacionario Eocp. Antes del barrido de potencial, los electrodos estuvieron en modo de circuito abierto hasta que se alcanzó un valor estable de potencial de corrosión libre. Luego se realizaron curvas de polarización de -0,2 a 1,5 V frente a Eocp a una velocidad de barrido de 0,166 mV/s. Cada prueba se repitió 3 veces con y sin P. aeruginosa.
Las muestras para análisis metalográfico se pulieron mecánicamente con papel de SiC húmedo de grano 2000 y luego se pulieron aún más con una suspensión de polvo de Al2O3 de 0,05 μm para observación óptica. El análisis metalográfico se realizó utilizando un microscopio óptico. Las muestras se atacaron con una solución de hidróxido de potasio al 10 % en peso 43.
Después de la incubación, las muestras se lavaron 3 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) y luego se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % (v/v) durante 10 horas para fijar las biopelículas. Posteriormente se deshidrataron con una serie gradual (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % y 100 % v/v) de etanol antes del secado al aire. Finalmente, la superficie de la muestra se recubrió con una película de oro para proporcionar conductividad para la observación mediante SEM. Las imágenes SEM se enfocaron en los puntos con la mayor cantidad de células sésiles de P. aeruginosa en la superficie de cada muestra. Se realizó un análisis EDS para encontrar elementos químicos. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser Zeiss (CLSM) (LSM 710, Zeiss, Alemania) para medir la profundidad de las picaduras. Para observar las picaduras de corrosión debajo de la biopelícula, la pieza de prueba En primer lugar, se limpió de acuerdo con la Norma Nacional China (CNS) GB/T4334.4-2000 para eliminar los productos de corrosión y la biopelícula de la superficie de la pieza de prueba.
Se realizó un análisis de espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS, sistema de análisis de superficie ESCALAB250, Thermo VG, EE. UU.) utilizando una fuente de rayos X monocromática (línea Kα de aluminio a 1500 eV de energía y 150 W de potencia) en un amplio rango de energía de enlace de 0 a 1350 eV en condiciones estándar. Se registraron espectros de alta resolución utilizando una energía de paso de 50 eV y un tamaño de paso de 0,2 eV.
Las muestras incubadas se retiraron y se enjuagaron suavemente con PBS (pH 7,4 ± 0,2) durante 15 s45. Para observar la viabilidad bacteriana de las biopelículas en las muestras, las biopelículas se tiñeron utilizando el kit de viabilidad bacteriana LIVE/DEAD BacLight (Invitrogen, Eugene, OR, EE. UU.). El kit tiene dos colorantes fluorescentes, un colorante fluorescente verde SYTO-9 y un colorante fluorescente rojo de yoduro de propidio (PI). Bajo CLSM, los puntos con fluorescencia verde y roja representan células vivas y muertas, respectivamente. Para la tinción, una mezcla de 1 ml que contenía 3 μl de SYTO-9 y 3 μl de solución de PI se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente (23 °C) en la oscuridad. Posteriormente, las muestras teñidas se observaron a dos longitudes de onda (488 nm para células vivas y 559 nm para células muertas) utilizando una máquina CLSM Nikon (C2 Plus, Nikon, Japón). El espesor de la biopelícula se midió en Modo de escaneo 3D.
Cómo citar este artículo: Li, H. et al.Corrosión microbiana del acero inoxidable superdúplex 2707 por biopelícula marina de Pseudomonas aeruginosa.science.Rep. 6, 20190; doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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