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미생물 부식(MIC)은 막대한 경제적 손실을 초래할 수 있는 심각한 문제로 많은 산업 분야에서 발생합니다. 2707 초듀플렉스 스테인리스강(2707 HDSS)은 우수한 내화학성으로 인해 해양 환경에서 사용되어 왔지만, MIC에 대한 저항성은 아직 실험적으로 입증되지 않았습니다. 본 연구에서는 해양 호기성 세균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 의한 2707 HDSS의 MIC 거동을 조사했습니다. 전기화학 분석 결과, 2216E 배지에서 녹농균 바이오필름이 존재할 경우 부식 전위가 양의 방향으로 변화하고 부식 전류 밀도가 증가하는 것을 확인했습니다. X선 광전자 분광법(XPS) 분석 결과, 바이오필름 아래 시편 표면에서 크롬(Cr) 함량이 감소한 것을 관찰했습니다. 피트 이미지 분석 결과, 녹농균 바이오필름은 14일 배양 기간 동안 최대 0.69 μm의 피트 깊이를 생성했습니다. 이 값은 작지만, 2707 HDSS가 해양 환경에 대한 내성을 가지고 있음을 시사합니다. 녹농균 바이오필름의 최소억제농도(MIC)에 완전히 면역된 것은 아닙니다.
듀플렉스 스테인리스강(DSS)은 우수한 기계적 특성과 내식성을 이상적으로 결합하여 다양한 산업 분야에서 널리 사용되고 있습니다.^1,2 그러나 국부적인 공식(pitting)이 발생하여 강재의 건전성에 영향을 미칠 수 있습니다.^3,4 또한 DSS는 미생물 부식(MIC)에 대한 저항성이 부족합니다.^5,6 DSS는 광범위한 응용 분야에 사용되지만, 장기간 사용에 필요한 내식성을 갖추지 못한 환경도 여전히 존재합니다. 이는 더 높은 내식성을 가진 고가의 재료가 필요함을 의미합니다. Jeon 등⁷은 초듀플렉스 스테인리스강(SDSS)조차도 내식성 측면에서 한계가 있음을 발견했습니다. 따라서 일부 응용 분야에서는 더 높은 내식성을 가진 초듀플렉스 스테인리스강(HDSS)이 요구됩니다. 이러한 배경에서 고합금 HDSS가 개발되었습니다.
DSS의 내식성은 알파상과 감마상의 비율 및 제2상에 인접한 Cr, Mo, W 결핍 영역(8, 9, 10)에 따라 달라집니다. HDSS는 Cr, Mo, N 함량이 높아 우수한 내식성과 높은 공식 저항 등가 지수(PREN) 값(45-50)을 가지며, 이 값은 Cr(wt.%) + 3.3(Mo(wt.%) + 0.5(wt%) W) + 16(wt%) N(12)으로 결정됩니다. 이러한 우수한 내식성은 약 50%의 페라이트(α)상과 50%의 오스테나이트(γ)상을 포함하는 균형 잡힌 조성에 기인하며, HDSS는 기존 DSS보다 우수한 기계적 특성과 높은 염화물 부식 저항성을 나타냅니다(13). 향상된 내식성으로 인해 HDSS는 해양 환경과 같이 부식성이 강한 염화물 환경에서도 사용 범위가 확대됩니다.
MIC는 석유 및 가스, 상수도 시설과 같은 여러 산업에서 주요 문제입니다.14 MIC는 모든 부식 손상의 20%를 차지합니다.15 MIC는 다양한 환경에서 관찰될 수 있는 생물전기화학적 부식입니다. 금속 표면에 형성되는 바이오필름은 전기화학적 조건을 변화시켜 부식 과정에 영향을 미칩니다. MIC 부식은 바이오필름에 의해 발생하는 것으로 널리 알려져 있습니다. 전기생성 미생물은 생존에 필요한 에너지를 얻기 위해 금속을 부식시킵니다.17 최근 MIC 연구에 따르면 EET(세포외 전자 전달)가 전기생성 미생물에 의해 유발되는 MIC의 속도 제한 인자입니다. Zhang et al.18은 전자 매개체가 Desulfovibrio sessificans 세포와 304 스테인리스강 사이의 전자 전달을 가속화하여 더 심각한 MIC 공격을 유발한다는 것을 입증했습니다. Enning et al.19 및 Venzlaff et al. 20번 문헌에서는 부식성 황산염 환원 박테리아(SRB) 바이오필름이 금속 기판에서 직접 전자를 흡수하여 심각한 점식 부식을 유발할 수 있음을 보여주었습니다.
DSS는 SRB, 철 환원 박테리아(IRB) 등이 존재하는 환경에서 MIC에 취약한 것으로 알려져 있습니다.21 이러한 박테리아는 바이오필름 아래 DSS 표면에 국소적인 구멍을 유발합니다.22,23 DSS와 달리 HDSS24의 MIC는 잘 알려져 있지 않습니다.
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)은 자연계에 널리 분포하는 그람 음성 운동성 막대형 세균입니다.25 녹농균은 해양 환경에서도 주요 미생물군으로, 강철에 대한 최소 침식성 부식(MIC)을 유발합니다. 녹농균은 부식 과정과 밀접한 관련이 있으며, 생물막 형성 과정에서 선구적인 군집 형성자로 알려져 있습니다. Mahat 등28과 Yuan 등29은 녹농균이 수용액 환경에서 연강 및 합금의 부식 속도를 증가시키는 경향이 있음을 보여주었습니다.
본 연구의 주된 목적은 전기화학적 방법, 표면 분석 기술 및 부식 생성물 분석을 이용하여 해양 호기성 세균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 의한 2707 HDSS의 미생물 유도 부식(MIC) 특성을 조사하는 것이었다. 개방 회로 전위(OCP), 선형 분극 저항(LPR), 전기화학적 임피던스 분광법(EIS) 및 동적 전위 분극을 포함한 전기화학적 연구를 통해 2707 HDSS의 MIC 거동을 분석하였다. 에너지 분산 분광기(EDS) 분석을 통해 부식된 표면의 화학 원소를 분석하였다. 또한, X선 광전자 분광법(XPS) 분석을 이용하여 녹농균이 존재하는 해양 환경 하에서 산화막 부동태화의 안정성을 확인하였다. 마지막으로, 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 이용하여 피트 깊이를 측정하였다.
표 1은 2707 HDSS의 화학적 조성을 나타낸다. 표 2는 2707 HDSS가 650 MPa의 항복 강도를 갖는 우수한 기계적 특성을 나타낸다. 그림 1은 용체화 열처리된 2707 HDSS의 광학 미세 구조를 보여준다. 미세 구조에는 이차상 없이 오스테나이트와 페라이트 상의 길쭉한 띠가 관찰되며, 약 50%의 오스테나이트와 50%의 페라이트 상으로 구성되어 있다.
그림 2a는 37°C에서 14일 동안 무생물 2216E 배지와 녹농균 배양액에서 2707 HDSS의 개방 회로 전위(Eocp) 대 노출 시간 데이터를 보여줍니다. Eocp의 가장 크고 유의미한 변화는 처음 24시간 이내에 발생합니다. 두 경우 모두 Eocp 값은 약 16시간 후에 -145mV(vs. SCE)에서 최고치를 기록한 후 급격히 감소하여 무생물 시료의 경우 -477mV(vs. SCE), 녹농균 배양액의 경우 -236mV(vs. SCE)에 도달했습니다. 각각 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 쿠폰을 사용하였다. 24시간 후, 녹농균에 대한 2707 HDSS의 Eocp 값은 -228mV(vs. SCE)에서 비교적 안정적이었지만, 비생물학적 샘플의 해당 값은 약 -442mV(vs. SCE)였다. 녹농균이 존재할 때의 Eocp 값은 상당히 낮았다.
37°C에서 무생물 배지 및 녹농균 배양액 내 2707개 HDSS 시료의 전기화학적 테스트:
(a) 노출 시간에 따른 Eocp, (b) 14일째의 편광 곡선, (c) 노출 시간에 따른 Rp 및 (d) 노출 시간에 따른 icorr.
표 3은 14일 동안 무생물 배지와 Pseudomonas aeruginosa 접종 배지에 노출된 2707개의 HDSS 샘플의 전기화학적 부식 매개변수 값을 나열합니다. 양극 및 음극 곡선의 접선을 외삽하여 표준 방법30,31에 따라 부식 전류 밀도(icorr), 부식 전위(Ecorr) 및 Tafel 기울기(βα 및 βc)를 산출하는 교점을 구했습니다.
그림 2b에서 볼 수 있듯이, 녹농균(P. aeruginosa) 곡선의 상향 이동은 무생물 곡선에 비해 Ecorr의 증가를 초래했습니다. 부식 속도에 비례하는 Ecorr 값은 녹농균 시료에서 0.328 μA cm⁻²로 증가했는데, 이는 무생물 시료(0.087 μA cm⁻²)의 4배에 해당합니다.
LPR은 부식 분석을 위한 대표적인 비파괴 전기화학적 방법으로, MIC32 연구에도 사용되었습니다. 그림 2c는 노출 시간에 따른 분극 저항(Rp)을 보여줍니다. Rp 값이 높을수록 부식 정도가 낮음을 의미합니다. 처음 24시간 이내에 2707 HDSS의 Rp는 무생물 시료의 경우 최대값인 1955 kΩ·cm²에 도달했고, 녹농균 시료의 경우 1429 kΩ·cm²에 도달했습니다. 그림 2c는 또한 Rp 값이 하루 후 급격히 감소한 후 다음 13일 동안 상대적으로 변화가 없음을 보여줍니다. 녹농균 시료의 Rp 값은 약 40 kΩ·cm²로, 무생물 시료의 450 kΩ·cm² 값보다 훨씬 낮습니다.
icorr 값은 균일 부식 속도에 비례합니다. 이 값은 다음 Stern-Geary 방정식을 사용하여 계산할 수 있습니다.
Zou et al. 33에 따라, 본 연구에서는 Tafel 기울기 B의 일반적인 값을 26 mV/dec로 가정했습니다. 그림 2d는 비생물학적 2707 샘플의 icorr이 비교적 안정적으로 유지된 반면, P. aeruginosa 샘플은 처음 24시간 이후 크게 변동했음을 보여줍니다. P. aeruginosa 샘플의 icorr 값은 비생물학적 대조군보다 한 자릿수 더 높았습니다. 이러한 경향은 분극 저항 결과와 일치합니다.
EIS는 부식된 계면에서의 전기화학적 반응을 특성화하는 데 사용되는 또 다른 비파괴 분석 기법입니다. 무생물 매체와 녹농균 용액에 노출된 시편의 임피던스 스펙트럼과 계산된 정전 용량 값, 시편 표면에 형성된 수동막/생물막의 저항 Rb, 전하 전달 저항 Rct, 전기 이중층 정전 용량(EDL) Cdl, 그리고 정위상 요소(CPE) 매개변수 QCPE를 측정했습니다. 이러한 매개변수들은 등가 회로(EEC) 모델을 사용하여 데이터를 피팅함으로써 추가적으로 분석되었습니다.
그림 3은 다양한 배양 시간 동안 무생물 배지 및 녹농균 배양액에서 2707개 HDSS 샘플의 전형적인 나이퀴스트 플롯(a 및 b)과 보드 플롯(a' 및 b')을 보여줍니다. 녹농균이 존재할 경우 나이퀴스트 링의 직경이 감소합니다. 보드 플롯(그림 3b')은 전체 임피던스의 크기가 증가하는 것을 보여줍니다. 위상 최대값은 이완 시간 상수에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 그림 4는 단층(a) 및 이중층(b) 기반 물리적 구조와 해당 EEC를 보여줍니다. CPE가 EEC 모델에 도입되었습니다. CPE의 어드미턴스와 임피던스는 다음과 같이 표현됩니다.
2707 HDSS 시편의 임피던스 스펙트럼을 맞추기 위한 두 가지 물리적 모델과 그에 상응하는 등가 회로:
여기서 Y0는 CPE의 크기이고, j는 허수 또는 (-1)¹/²이며, ω는 각주파수이고, n은 1보다 작은 CPE 전력 지수입니다.35 전하 전달 저항의 역수(즉, 1/Rct)는 부식 속도에 해당합니다. Rct가 작을수록 부식 속도가 빠릅니다.27 14일 배양 후, Pseudomonas aeruginosa 샘플의 Rct는 32 kΩ cm²에 도달했는데, 이는 비생물학적 샘플의 489 kΩ cm²보다 훨씬 작습니다(표 4).
그림 5의 CLSM 이미지와 SEM 이미지는 7일 후 2707 HDSS 시편 표면의 바이오필름이 조밀하게 덮여 있음을 명확히 보여줍니다. 그러나 14일 후에는 바이오필름이 드문드문 형성되었고 일부 사멸 세포가 관찰되었습니다. 표 5는 녹농균에 7일 및 14일 동안 노출시킨 후 2707 HDSS 시편의 바이오필름 두께를 나타냅니다. 최대 바이오필름 두께는 7일 후 23.4 μm에서 14일 후 18.9 μm로 감소했습니다. 평균 바이오필름 두께 또한 이러한 경향을 확인시켜 주었습니다. 평균 바이오필름 두께는 7일 후 22.2 ± 0.7 μm에서 14일 후 17.8 ± 1.0 μm로 감소했습니다.
(a) 7일 후 3D CLSM 이미지, (b) 14일 후 3D CLSM 이미지, (c) 7일 후 SEM 이미지, (d) 14일 후 SEM 이미지.
EDS 분석을 통해 14일 동안 P. aeruginosa에 노출된 시료의 바이오필름과 부식 생성물에서 화학 원소를 분석했습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 바이오필름과 부식 생성물의 C, N, O, P 함량은 순수 금속보다 훨씬 높습니다. 이는 이러한 원소들이 바이오필름 및 그 대사산물과 결합되어 있기 때문입니다. 미생물은 극소량의 크롬과 철만 필요로 합니다. 시료 표면의 바이오필름과 부식 생성물에서 높은 수준의 Cr과 Fe가 검출된 것은 금속 매트릭스가 부식으로 인해 원소를 손실했음을 나타냅니다.
14일 후, 2216E 배지에서 P. aeruginosa 유무에 따른 피팅 현상을 관찰하였다. 배양 전 시편 표면은 매끄럽고 결함이 없었다(그림 7a). 배양 후 바이오필름과 부식 생성물을 제거하고, 시편 표면의 가장 깊은 피팅을 CLSM으로 관찰하였다(그림 7b 및 7c). 비생물학적 대조군 시편 표면에서는 뚜렷한 피팅이 관찰되지 않았다(최대 피팅 깊이 0.02 μm). Pseudomonas aeruginosa에 의한 최대 피팅 깊이는 7일 후 0.52 μm, 14일 후 0.69 μm였다. 이는 3개 시편의 평균 최대 피팅 깊이(각 시편당 10개의 최대 피팅 깊이 값을 선택)를 기준으로 한 결과이며, 7일 후 피팅 깊이는 0.42 ± 0.12 μm, 14일 후 피팅 깊이는 0.52 ± 0.15 μm였다(표 5). 이러한 피팅 깊이 값은 작지만 중요한 의미를 갖는다.
(a) 노출 전, (b) 무생물 배지에서 14일 후, (c) 녹농균 배양액에서 14일 후.
그림 8은 다양한 시료 표면의 XPS 스펙트럼을 보여주고, 각 표면에 대해 분석된 화학 조성은 표 6에 요약되어 있다. 표 6에서 P. aeruginosa가 존재하는 시료(시료 A와 B)의 Fe와 Cr의 원자 백분율은 비생물학적 대조 시료(시료 C와 D)보다 훨씬 낮았다. P. aeruginosa 시료의 경우, Cr 2p 코어 레벨 스펙트럼 곡선은 결합 에너지(BE) 값이 574.4, 576.6, 578.3 및 586.8 eV인 네 개의 피크 성분으로 피팅되었으며, 이는 각각 Cr, Cr2O3, CrO3 및 Cr(OH)3에 기인할 수 있다(그림 9a 및 9b). 비생물학적 시료의 경우, Cr 2p 코어 레벨 스펙트럼은 Cr(BE 573.80 eV)과 Cr2O3(BE 575.90 eV)에 대한 두 개의 주요 피크를 포함한다(그림 9c). 그리고 각각 d입니다. 무생물 샘플과 P. aeruginosa 샘플 간의 가장 두드러진 차이점은 생물막 아래에 Cr6+가 존재하고 Cr(OH)3(결합 에너지 586.8 eV)의 상대적인 비율이 더 높다는 것이었습니다.
두 매체에서 2707 HDSS 시편 표면의 광범위한 XPS 스펙트럼은 각각 7일과 14일 후에 측정되었다.
(a) 녹농균에 7일 노출, (b) 녹농균에 14일 노출, (c) 무생물 배지에서 7일, (d) 무생물 배지에서 14일.
HDSS는 대부분의 환경에서 높은 수준의 내식성을 나타냅니다. Kim et al.²은 UNS S32707 HDSS를 PREN이 45 이상인 고합금 DSS로 정의했습니다. 본 연구에서 2707 HDSS 시편의 PREN 값은 49였습니다. 이는 높은 크롬 함량과 몰리브덴 및 니켈 함량 때문이며, 이러한 요소들은 산성 및 고염화물 환경에 유리합니다. 또한, 균형 잡힌 조성과 결함 없는 미세구조는 구조적 안정성과 내식성에 도움이 됩니다. 그러나 우수한 내화학성에도 불구하고, 본 연구의 실험 결과는 2707 HDSS가 녹농균(P. aeruginosa) 바이오필름의 미생물 유도 부식(MIC)에 완전히 면역되지는 않는다는 것을 시사합니다.
전기화학적 분석 결과, 2707 HDSS의 부식 속도는 P. aeruginosa 배지에서 14일 후 비생물학적 배지에 비해 현저히 증가한 것으로 나타났습니다. 그림 2a에서, 처음 24시간 동안은 비생물학적 배지와 P. aeruginosa 배지 모두에서 Eocp가 감소하는 것이 관찰되었습니다. 이후, 바이오필름이 시편 표면을 완전히 덮으면서 Eocp는 상대적으로 안정화되었습니다.36 그러나 생물학적 Eocp 수준은 비생물학적 Eocp보다 훨씬 높았습니다. 이러한 차이는 P. aeruginosa 바이오필름 형성에 기인하는 것으로 추정됩니다. 그림 2d에서, P. aeruginosa가 존재할 때 2707 HDSS의 icorr 값은 0.627 μA cm⁻²에 도달했는데, 이는 비생물학적 대조군(0.063 μA cm⁻²)보다 한 자릿수 높은 값이며, EIS로 측정한 Rct 값과 일치합니다. 처음 며칠 동안 P. aeruginosa 배지에서의 임피던스 값은... 녹농균 배양액에서는 녹농균 세포의 부착 및 바이오필름 형성으로 인해 저항이 증가했습니다. 그러나 바이오필름이 시편 표면을 완전히 덮으면 임피던스가 감소했습니다. 보호층은 바이오필름 형성 및 바이오필름 대사산물에 의해 먼저 공격받습니다. 따라서 시간이 지남에 따라 내식성이 감소하고, 녹농균의 부착은 국부 부식을 유발합니다. 무생물 환경에서는 경향이 달랐습니다. 비생물학적 대조군의 내식성은 녹농균 배양액에 노출된 시편의 해당 값보다 훨씬 높았습니다. 또한, 무생물 환경에서 2707 HDSS의 Rct 값은 14일째에 489 kΩ·cm²에 도달했는데, 이는 녹농균이 존재할 때의 Rct 값(32 kΩ·cm²)보다 15배 높은 수치입니다. 따라서 2707 HDSS는 무균 환경에서는 우수한 내식성을 보이지만, 녹농균 바이오필름에 의한 미생물 부식(MIC) 공격에는 저항성이 없습니다.
이러한 결과는 그림 2b의 분극 곡선에서도 확인할 수 있습니다. 양극 분기는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 바이오필름 형성 및 금속 산화 반응에 기인합니다. 동시에 음극 반응은 산소 환원입니다. 녹농균의 존재는 부식 전류 밀도를 크게 증가시켰으며, 무생물 대조군보다 약 10배 높은 값을 나타냈습니다. 이는 녹농균 바이오필름이 2707 HDSS의 국부 부식을 증가시킨다는 것을 의미합니다. Yuan 등29은 70/30 Cu-Ni 합금의 부식 전류 밀도가 녹농균 바이오필름의 존재 하에서 증가한다는 것을 발견했습니다. 이는 녹농균 바이오필름에 의한 산소 환원의 생촉매 작용 때문일 수 있습니다. 이러한 관찰 결과는 본 연구에서 2707 HDSS의 최소 부식성(MIC) 현상을 설명할 수 있습니다. 호기성 바이오필름은 또한 그 아래에 산소가 더 적을 수 있습니다. 따라서 산소에 의한 금속 표면의 재부동태화 실패가 본 연구에서 MIC 현상의 원인 중 하나일 수 있습니다.
Dickinson 등38은 화학적 및 전기화학적 반응 속도가 시편 표면의 부착성 세균의 대사 활동과 부식 생성물의 특성에 직접적인 영향을 받을 수 있다고 제안했습니다. 그림 5와 표 5에서 볼 수 있듯이, 세포 수와 바이오필름 두께 모두 14일 후 감소했습니다. 이는 14일 후 2707 HDSS 표면의 부착성 세포 대부분이 2216E 배지의 영양분 고갈 또는 2707 HDSS 매트릭스에서 방출되는 독성 금속 이온으로 인해 사멸했기 때문으로 합리적으로 설명할 수 있습니다. 이는 배치 실험의 한계입니다.
본 연구에서 P. aeruginosa 바이오필름은 2707 HDSS 표면의 바이오필름 아래에서 Cr과 ​​Fe의 국부적인 감소를 촉진했습니다(그림 6). 표 6에서 샘플 D의 Fe와 Cr 감소량은 샘플 C와 비교했을 때, P. aeruginosa 바이오필름에 의해 용해된 Fe와 Cr이 처음 7일 이상 지속되었음을 보여줍니다. 2216E 배지는 해양 환경을 모사하기 위해 사용되었으며, 17700 ppm의 Cl-을 함유하고 있는데, 이는 자연 해수에서 발견되는 농도와 유사합니다. 17700 ppm의 Cl- 존재는 XPS로 분석한 7일 및 14일 무생물 샘플에서 Cr 감소의 주요 원인이었습니다. P. aeruginosa 샘플과 비교했을 때, 무생물 샘플에서 Cr의 용해는 2707 HDSS의 강한 Cl- 저항성으로 인해 훨씬 ​​적었습니다. 그림 9는 부동태 피막에 Cr6+가 존재함을 보여줍니다. 이는 강철 표면에서 Cr을 제거하는 데 관여할 수 있습니다. Chen과 Clayton이 제안한 바와 같이 P. aeruginosa 바이오필름에 의해 발생합니다.
세균 증식으로 인해 배양 전후 배지의 pH는 각각 7.4와 8.2였습니다. 따라서, P. aeruginosa 바이오필름 아래에서는 배지 전체의 pH가 비교적 높기 때문에 유기산 부식이 본 연구 결과에 영향을 미쳤을 가능성은 낮습니다. 비생물학적 대조 배지의 pH는 14일간의 실험 기간 동안 크게 변화하지 않았습니다(초기 7.4에서 최종 7.5). 배양 후 접종 배지의 pH 증가는 P. aeruginosa의 대사 활동 때문이며, 시험 스트립이 없는 경우에도 pH에 동일한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.
그림 7에서 볼 수 있듯이, P. aeruginosa 바이오필름에 의해 발생한 최대 피트 깊이는 0.69 μm로, 무생물 배지(0.02 μm)보다 훨씬 컸습니다. 이는 앞서 설명한 전기화학적 데이터와 일치합니다. 0.69 μm의 피트 깊이는 동일 조건에서 2205 DSS에 대해 보고된 9.5 μm 값보다 10배 이상 작습니다. 이러한 데이터는 2707 HDSS가 2205 DSS에 비해 더 우수한 MIC 저항성을 나타낸다는 것을 보여줍니다. 이는 2707 HDSS가 더 높은 크롬 함량을 가지고 있어 유해한 이차 침전물 없이 균형 잡힌 상 구조를 제공함으로써 더 오래 지속되는 부동태화를 형성하고, P. aeruginosa가 부동태화를 깨뜨리고 시작점을 가리는 것을 더 어렵게 만들기 때문에 당연한 결과입니다.
결론적으로, 2707 HDSS 표면에서는 P. aeruginosa 배양액에서 미세 부식(MIC)으로 인한 피팅이 관찰되었지만, 무생물 배지에서는 피팅이 거의 나타나지 않았습니다. 본 연구는 2707 HDSS가 2205 DSS보다 우수한 MIC 저항성을 가지고 있지만, P. aeruginosa 바이오필름으로 인한 MIC에 완전히 면역된 것은 아님을 보여줍니다. 이러한 연구 결과는 해양 환경에 적합한 스테인리스강을 선정하고 예상 수명을 예측하는 데 도움이 될 것입니다.
2707 HDSS 시편은 중국 선양에 위치한 동북대학교(NEU) 금속공학과에서 제공받았습니다. 2707 HDSS의 원소 조성은 표 1에 나타냈으며, 이는 NEU 재료 분석 및 시험 부서에서 분석한 결과입니다. 모든 시편은 1180°C에서 1시간 동안 용체화 처리를 했습니다. 부식 시험 전, 상단 노출 면적이 1cm²인 동전 모양의 2707 HDSS 시편을 탄화규소 연마지(2000 grit)로 연마한 후, 0.05μm Al₂O₃ 분말 현탁액으로 추가 연마했습니다. 측면과 바닥면은 불활성 페인트로 보호했습니다. 건조 후, 시편을 멸균 탈이온수로 헹구고 75%(v/v) 에탄올에 0.5시간 동안 담가 살균했습니다. 그런 다음 사용 전 자외선(UV) 조사 하에서 0.5시간 동안 공기 건조했습니다.
해양 Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099 균주는 중국 샤먼 해양 미생물 배양 컬렉션 센터(MCCC)에서 구입했습니다. Pseudomonas aeruginosa는 ​​250ml 플라스크와 500ml 전기화학 유리 셀에서 Marine 2216E 액체 배지(칭다오 호프 바이오테크놀로지 유한회사, 칭다오, 중국)를 사용하여 37°C에서 호기적으로 배양했습니다. 배지 조성(g/L): 19.45 NaCl, 5.98 MgCl2, 3.24 Na2SO4, 1.8 CaCl2, 0.55 KCl, 0.16 Na2CO3, 0.08 KBr, 0.034 SrCl2, 0.08 SrBr2, 0.022 H3BO3, 0.004 NaSiO3, 0.0016 NH3, 0.0016 NH3, 0.0016 NaH2PO4, 펩톤 5.0, 효모 추출물 1.0, 구연산철 0.1을 혼합한 배지를 121°C에서 20분간 고압멸균한 후 접종합니다. 광학 현미경(400배율) 하에서 혈구계산기를 이용하여 부착성 및 부유성 세포 수를 측정합니다. 접종 직후 부유성 녹농균의 초기 세포 농도는 약 10⁶ 세포/ml였습니다.
전기화학적 테스트는 500ml의 중간 용량을 가진 일반적인 3전극 유리 셀에서 수행되었습니다. 백금 시트와 포화 칼로멜 전극(SCE)은 염다리로 채워진 루긴 모세관을 통해 반응기에 연결되어 각각 상대 전극과 기준 전극 역할을 했습니다. 작업 전극을 만들기 위해 고무 코팅된 구리선을 각 시편에 부착하고 에폭시로 덮어 작업 전극으로 사용할 약 1cm2의 노출된 단면적을 남겼습니다. 전기화학적 측정 동안 샘플은 2216E 배지에 넣고 수조에서 일정한 배양 온도(37°C)를 유지했습니다. OCP, LPR, EIS 및 전위 동적 분극 데이터는 Autolab 전위차계(Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., USA)를 사용하여 측정했습니다. LPR 테스트는 Eocp 및 1Hz의 샘플링 주파수에서 -5~5mV 범위에서 0.125mV s⁻¹의 스캔 속도로 기록했습니다. EIS는 정상 상태 Eocp에서 5mV의 인가 전압을 사용하여 0.01~10,000Hz 주파수 범위의 사인파로 실험을 수행했습니다. 전위 스캔 전에 전극은 안정적인 자유 부식 전위 값에 도달할 때까지 개방 회로 모드였습니다. 그런 다음 0.166mV/s의 스캔 속도로 -0.2V에서 1.5V(vs. Eocp)까지 분극 곡선을 측정했습니다. 각 실험은 녹농균(P. aeruginosa)의 존재 유무에 따라 3회 반복했습니다.
금속 조직 분석용 시편은 2000 그릿 습식 SiC 페이퍼로 기계적으로 연마한 후 광학 관찰을 위해 0.05 μm Al2O3 분말 현탁액으로 추가 연마했습니다. 금속 조직 분석은 광학 현미경을 사용하여 수행했습니다. 시편은 10 wt.% 수산화칼륨 용액으로 에칭했습니다.
배양 후, 시료를 인산염 완충 식염수(PBS) 용액(pH 7.4 ± 0.2)으로 3회 세척한 다음, 2.5%(v/v) 글루타르알데히드 용액에 10시간 동안 고정하여 바이오필름을 고정시켰습니다. 이후, 에탄올의 농도를 단계적으로 증가시킨 용액(50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% v/v)으로 탈수시킨 후 공기 건조시켰습니다. 마지막으로, SEM 관찰을 위한 전도성을 부여하기 위해 시료 표면에 금 박막을 스퍼터링했습니다. SEM 이미지는 각 시료 표면에서 가장 부착성이 높은 P. aeruginosa 세포가 있는 부분에 초점을 맞추어 촬영했습니다. EDS 분석을 통해 화학 원소를 분석했습니다. 부식 구덩이 깊이는 Zeiss 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)(LSM 710, Zeiss, 독일)을 사용하여 측정했습니다. 바이오필름 아래의 부식 구덩이를 관찰하기 위해, 시험편을 먼저 다음과 같이 세척했습니다. 중국 국가 표준(CNS) GB/T4334.4-2000에 따라 시험편 표면의 부식 생성물과 생물막을 제거합니다.
X선 광전자 분광법(XPS, ESCALAB250 표면 분석 시스템, Thermo VG, USA) 분석은 단색 X선 소스(알루미늄 Kα선, 에너지 1500 eV, 출력 150 W)를 사용하여 표준 조건에서 넓은 결합 에너지 범위 0 ~ 1350 eV에 걸쳐 수행되었습니다. 고해상도 스펙트럼은 50 eV 통과 에너지와 0.2 eV 스텝 크기로 기록되었습니다.
배양된 시료를 꺼내어 PBS(pH 7.4 ± 0.2)로 15초 동안 부드럽게 헹구었습니다. 시료 표면의 바이오필름 세균 생존력을 관찰하기 위해 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit(Invitrogen, Eugene, OR, USA)를 사용하여 바이오필름을 염색했습니다. 이 키트에는 녹색 형광 SYTO-9 염료와 적색 형광 프로피디움 요오드화물(PI) 염료, 두 가지 형광 염료가 포함되어 있습니다. CLSM에서 녹색 형광점은 살아있는 세포를, 적색 형광점은 죽은 세포를 나타냅니다. 염색을 위해 SYTO-9 용액 3μl와 PI 용액 3μl를 혼합한 1ml 용액을 실온(23°C)에서 어두운 곳에 20분 동안 배양했습니다. 그 후, Nikon CLSM 장비(C2 Plus, Nikon, Japan)를 사용하여 두 가지 파장(살아있는 세포는 488nm, 죽은 세포는 559nm)에서 염색된 시료를 관찰했습니다. 바이오필름 두께는 3D 스캐닝을 통해 측정했습니다. 모드.
이 논문을 인용하는 방법: Li, H. et al. 해양 Pseudomonas aeruginosa 생물막에 의한 2707 슈퍼 듀플렉스 스테인리스강의 미생물 부식.science.Rep. 6, 20190; doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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