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A corrosão microbiana (CIM) é um problema sério em muitas indústrias, pois pode causar enormes prejuízos econômicos. O aço inoxidável superduplex 2707 (2707 HDSS) tem sido utilizado em ambientes marinhos devido à sua excelente resistência química. No entanto, sua resistência à CIM ainda não foi demonstrada experimentalmente. Neste estudo, investigou-se o comportamento da CIM do 2707 HDSS causada pela bactéria aeróbica marinha Pseudomonas aeruginosa. A análise eletroquímica mostrou que, na presença de biofilme de Pseudomonas aeruginosa em meio 2216E, houve uma mudança positiva no potencial de corrosão e um aumento na densidade de corrente de corrosão. A análise por espectroscopia fotoeletrônica de raios X (XPS) mostrou uma diminuição no teor de cromo na superfície da amostra sob o biofilme. A análise de imagem das cavidades mostrou que o biofilme de P. aeruginosa produziu uma profundidade máxima de cavidade de 0,69 μm durante 14 dias de incubação. Embora pequena, essa profundidade indica que o 2707 HDSS é não totalmente imune à CIM (Concentração Inibitória Mínima) dos biofilmes de P. aeruginosa.
Os aços inoxidáveis ​​duplex (DSS) são amplamente utilizados em diversas indústrias devido à sua combinação ideal de excelentes propriedades mecânicas e resistência à corrosão^1,2. No entanto, a corrosão por pite localizada ainda ocorre e afeta a integridade desse aço^3,4. O DSS não é resistente à corrosão microbiana (MIC)^5,6. Apesar da ampla gama de aplicações do DSS, ainda existem ambientes onde a resistência à corrosão do DSS não é suficiente para uso a longo prazo. Isso significa que materiais mais caros com maior resistência à corrosão são necessários. Jeon et al.⁷ descobriram que mesmo os aços inoxidáveis ​​superduplex (SDSS) apresentam algumas limitações em termos de resistência à corrosão. Portanto, aços inoxidáveis ​​superduplex (HDSS) com maior resistência à corrosão são necessários em algumas aplicações. Isso levou ao desenvolvimento de HDSS altamente ligados.
A resistência à corrosão do aço inoxidável duplex (DSS) depende da proporção entre as fases alfa e gama e das regiões com depleção de Cr, Mo e W adjacentes à segunda fase. O aço inoxidável duplex de alta resistência (HDSS) contém alto teor de Cr, Mo e N, apresentando excelente resistência à corrosão e um alto valor (45-50) de Número Equivalente de Resistência à Corrosão por Pite (PREN), determinado por % em peso de Cr + 3,3 (% em peso de Mo + 0,5% em peso de W) + 16% em peso de N. Sua excelente resistência à corrosão se baseia em uma composição equilibrada contendo aproximadamente 50% de fases ferríticas (α) e 50% de austeníticas (γ). O HDSS possui melhores propriedades mecânicas e maior resistência à corrosão por cloretos do que o DSS convencional. A resistência à corrosão aprimorada amplia o uso do HDSS em ambientes com cloretos mais corrosivos, como ambientes marinhos.
A corrosão microbiológica (MIC) é um problema importante em muitas indústrias, como a de petróleo e gás e a de saneamento básico.¹⁴ A MIC é responsável por 20% de todos os danos por corrosão.¹⁵ A MIC é uma corrosão bioeletroquímica que pode ser observada em diversos ambientes. Biofilmes que se formam em superfícies metálicas alteram as condições eletroquímicas, afetando assim o processo de corrosão. Acredita-se amplamente que a corrosão por MIC seja causada por biofilmes. Microorganismos eletrogênicos corroem metais para obter energia para sobreviver.¹⁷ Estudos recentes sobre MIC mostraram que a transferência extracelular de elétrons (EET) é o fator limitante da taxa de MIC induzida por microorganismos eletrogênicos. Zhang et al.¹⁸ demonstraram que mediadores de elétrons aceleram a transferência de elétrons entre células de Desulfovibrio sessificans e aço inoxidável 304, levando a um ataque de MIC mais severo. Enning et al.¹⁹ e Venzlaff et al.²⁰ mostraram que biofilmes corrosivos de bactérias redutoras de sulfato (BRS) podem absorver elétrons diretamente de substratos metálicos, resultando em corrosão por pite severa.
Sabe-se que o DSS é suscetível à MIC em ambientes que contêm SRB, bactérias redutoras de ferro (IRB), etc. 21 .Essas bactérias causam corrosão localizada nas superfícies do DSS sob biofilmes22,23.Ao contrário do DSS, a MIC do HDSS24 é pouco conhecida.
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa móvel em forma de bastonete, amplamente distribuída na natureza25. Pseudomonas aeruginosa também é um importante grupo microbiano no ambiente marinho, causando corrosão microbiológica (MIC) em aço. Pseudomonas está intimamente envolvida em processos de corrosão e é reconhecida como uma colonizadora pioneira durante a formação de biofilme. Mahat et al.28 e Yuan et al.29 demonstraram que Pseudomonas aeruginosa tem uma tendência a aumentar a taxa de corrosão de aços e ligas de baixo carbono em ambientes aquosos.
O principal objetivo deste trabalho foi investigar as propriedades de corrosão microbiológica (MIC) do aço inoxidável aditivado 2707 (HDSS) causadas pela bactéria aeróbica marinha Pseudomonas aeruginosa, utilizando métodos eletroquímicos, técnicas de análise de superfície e análise de produtos de corrosão. Estudos eletroquímicos, incluindo potencial de circuito aberto (OCP), resistência de polarização linear (LPR), espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e polarização dinâmica de potencial, foram realizados para estudar o comportamento da MIC do HDSS 2707. A análise por espectrometria de dispersão de energia (EDS) foi realizada para identificar os elementos químicos na superfície corroída. Além disso, a análise por espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) foi utilizada para determinar a estabilidade da passivação da película de óxido sob a influência de um ambiente marinho contendo Pseudomonas aeruginosa. A profundidade da corrosão foi medida por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM).
A Tabela 1 lista a composição química do aço inoxidável duplex 2707 (HDSS). A Tabela 2 mostra que o HDSS 2707 possui excelentes propriedades mecânicas, com uma resistência ao escoamento de 650 MPa. A Figura 1 mostra a microestrutura óptica do HDSS 2707 tratado termicamente em solução. Bandas alongadas de fases austeníticas e ferríticas, sem fases secundárias, podem ser observadas na microestrutura, que contém cerca de 50% de austenita e 50% de ferrita.
A Figura 2a mostra os dados de potencial de circuito aberto (Eocp) versus tempo de exposição para 2707 HDSS em meio abiótico 2216E e caldo de P. aeruginosa por 14 dias a 37 °C. Observa-se que a maior e mais significativa alteração no Eocp ocorre nas primeiras 24 horas. Os valores de Eocp, em ambos os casos, atingiram um pico de -145 mV (vs. SCE) por volta de 16 h e, em seguida, caíram acentuadamente, alcançando -477 mV (vs. SCE) e -236 mV (vs. SCE) para a amostra abiótica e P, respectivamente. cupons de Pseudomonas aeruginosa, respectivamente. Após 24 horas, o valor de Eocp de 2707 HDSS para P. aeruginosa foi relativamente estável em -228 mV (vs. SCE), enquanto o valor correspondente para amostras não biológicas foi de aproximadamente -442 mV (vs. SCE). O Eocp na presença de P. aeruginosa foi bastante baixo.
Testes eletroquímicos de 2707 amostras de HDSS em meio abiótico e caldo de Pseudomonas aeruginosa a 37 °C:
(a) Eocp em função do tempo de exposição, (b) curvas de polarização no dia 14, (c) Rp em função do tempo de exposição e (d) icorr em função do tempo de exposição.
A Tabela 3 lista os valores dos parâmetros de corrosão eletroquímica de 2707 amostras de HDSS expostas a meio abiótico e meio inoculado com Pseudomonas aeruginosa por 14 dias. As tangentes das curvas anódica e catódica foram extrapoladas para chegar às interseções que fornecem a densidade de corrente de corrosão (icorr), o potencial de corrosão (Ecorr) e as inclinações de Tafel (βα e βc) de acordo com os métodos padrão30,31.
Como mostrado na Figura 2b, o deslocamento ascendente da curva de P. aeruginosa resultou em um aumento no Ecorr em comparação com a curva abiótica. O valor de icorr, que é proporcional à taxa de corrosão, aumentou para 0,328 μA cm-2 na amostra de Pseudomonas aeruginosa, quatro vezes maior que o da amostra não biológica (0,087 μA cm-2).
A LPR é um método eletroquímico clássico não destrutivo para análise rápida de corrosão. Também foi utilizada para estudar o MIC32. A Figura 2c mostra a resistência de polarização (Rp) em função do tempo de exposição. Um valor de Rp mais alto significa menor corrosão. Nas primeiras 24 horas, o Rp do HDSS 2707 atingiu um valor máximo de 1955 kΩ cm² para amostras abióticas e 1429 kΩ cm² para amostras com Pseudomonas aeruginosa. A Figura 2c também mostra que o valor de Rp diminuiu rapidamente após um dia e permaneceu relativamente inalterado nos 13 dias seguintes. O valor de Rp da amostra com Pseudomonas aeruginosa é de cerca de 40 kΩ cm², muito inferior ao valor de 450 kΩ cm² da amostra não biológica.
O valor de icorr é proporcional à taxa de corrosão uniforme. Seu valor pode ser calculado a partir da seguinte equação de Stern-Geary:
Seguindo Zou et al. 33, um valor típico da inclinação de Tafel B neste trabalho foi assumido como 26 mV/década. A Figura 2d mostra que o icorr da amostra não biológica 2707 permaneceu relativamente estável, enquanto a amostra de P. aeruginosa flutuou bastante após as primeiras 24 horas. Os valores de icorr das amostras de P. aeruginosa foram uma ordem de magnitude maiores do que os controles não biológicos. Essa tendência é consistente com os resultados da resistência de polarização.
A EIS (Espectroscopia de Impedância Eletroquímica) é outra técnica não destrutiva utilizada para caracterizar reações eletroquímicas em interfaces corroídas. Foram obtidos os espectros de impedância e os valores de capacitância calculados para amostras expostas a meios abióticos e à solução de Pseudomonas aeruginosa, a resistência Rb do filme passivo/biofilme formado na superfície da amostra, a resistência de transferência de carga Rct, a capacitância da dupla camada elétrica (EDL) Cdl e os parâmetros do elemento de fase constante (CPE) QCPE. Esses parâmetros foram posteriormente analisados ​​por meio do ajuste dos dados utilizando um modelo de circuito equivalente (EEC).
A Figura 3 mostra diagramas de Nyquist típicos (a e b) e diagramas de Bode (a' e b') de 2707 amostras de HDSS em meio abiótico e caldo de P. aeruginosa para diferentes tempos de incubação. O diâmetro do anel de Nyquist diminui na presença de Pseudomonas aeruginosa. O diagrama de Bode (Fig. 3b') mostra um aumento na magnitude da impedância total. Informações sobre a constante de tempo de relaxação podem ser obtidas pelos máximos de fase. A Figura 4 mostra as estruturas físicas baseadas em monocamada (a) e bicamada (b) e seus respectivos EECs. O CPE é introduzido no modelo EEC. Sua admitância e impedância são expressas da seguinte forma:
Dois modelos físicos e respectivos circuitos equivalentes para o ajuste do espectro de impedância da amostra HDSS 2707:
onde Y0 é a magnitude do CPE, j é o número imaginário ou (-1)1/2, ω é a frequência angular e n é o índice de potência do CPE menor que a unidade35. O inverso da resistência de transferência de carga (ou seja, 1/Rct) corresponde à taxa de corrosão. Um Rct menor significa uma taxa de corrosão mais rápida27. Após 14 dias de incubação, o Rct das amostras de Pseudomonas aeruginosa atingiu 32 kΩ cm2, muito menor que os 489 kΩ cm2 das amostras não biológicas (Tabela 4).
As imagens de CLSM e MEV na Figura 5 mostram claramente que a cobertura do biofilme na superfície da amostra HDSS 2707 após 7 dias é densa. No entanto, após 14 dias, a cobertura do biofilme tornou-se esparsa e algumas células mortas apareceram. A Tabela 5 mostra a espessura do biofilme nas amostras HDSS 2707 após exposição à P. aeruginosa por 7 e 14 dias. A espessura máxima do biofilme variou de 23,4 μm após 7 dias para 18,9 μm após 14 dias. A espessura média do biofilme também confirmou essa tendência, diminuindo de 22,2 ± 0,7 μm após 7 dias para 17,8 ± 1,0 μm após 14 dias.
(a) Imagem CLSM 3D após 7 dias, (b) Imagem CLSM 3D após 14 dias, (c) Imagem SEM após 7 dias e (d) Imagem SEM após 14 dias.
A análise EDS revelou elementos químicos em biofilmes e produtos de corrosão em amostras expostas a P. aeruginosa por 14 dias. A Figura 6 mostra que o teor de C, N, O e P em biofilmes e produtos de corrosão é muito maior do que em metais sem revestimento, pois esses elementos estão associados a biofilmes e seus metabólitos. Os microrganismos necessitam apenas de traços de cromo e ferro. Os altos níveis de Cr e Fe no biofilme e nos produtos de corrosão na superfície das amostras indicam que a matriz metálica perdeu elementos devido à corrosão.
Após 14 dias, observou-se a formação de cavidades com e sem P. aeruginosa no meio 2216E. Antes da incubação, a superfície da amostra era lisa e sem defeitos (Fig. 7a). Após a incubação e remoção do biofilme e dos produtos de corrosão, as cavidades mais profundas na superfície das amostras foram examinadas por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM), conforme mostrado nas Figuras 7b e c. Não foram encontradas cavidades evidentes na superfície das amostras de controle não biológicas (profundidade máxima da cavidade de 0,02 μm). A profundidade máxima da cavidade causada por Pseudomonas aeruginosa foi de 0,52 μm após 7 dias e 0,69 μm após 14 dias, com base na profundidade máxima média da cavidade de 3 amostras (10 valores de profundidade máxima da cavidade foram selecionados para cada amostra), que atingiu 0,42 ± 0,12 μm e 0,52 ± 0,15 μm, respectivamente (Tabela 5). Os valores são pequenos, mas importantes.
(a) Antes da exposição, (b) 14 dias em meio abiótico e (c) 14 dias em caldo de Pseudomonas aeruginosa.
A Figura 8 mostra os espectros XPS de diferentes superfícies de amostra, e as composições químicas analisadas para cada superfície estão resumidas na Tabela 6. Na Tabela 6, as porcentagens atômicas de Fe e Cr na presença de P. aeruginosa (amostras A e B) foram muito menores do que as das amostras de controle não biológicas (amostras C e D). Para a amostra de P. aeruginosa, a curva espectral do nível central Cr 2p foi ajustada a quatro componentes de pico com valores de energia de ligação (BE) de 574,4, 576,6, 578,3 e 586,8 eV, que podem ser atribuídos a Cr, Cr₂O₃, CrO₃ e Cr(OH)₃, respectivamente (Fig. 9a e b). Para as amostras não biológicas, o espectro do nível central Cr 2p contém dois picos principais para Cr (573,80 eV para BE) e Cr₂O₃ (575,90 eV para BE) na Fig. 9c e d, respectivamente.A diferença mais marcante entre as amostras abióticas e de P. aeruginosa foi a presença de Cr6+ e uma fração relativa maior de Cr(OH)3 (BE de 586,8 eV) abaixo do biofilme.
Os espectros XPS de ampla resolução da superfície da amostra 2707 HDSS nos dois meios são de 7 dias e 14 dias, respectivamente.
(a) 7 dias de exposição a P. aeruginosa, (b) 14 dias de exposição a P. aeruginosa, (c) 7 dias em meio abiótico e (d) 14 dias em meio abiótico.
O aço inoxidável duplex de alta resistência (HDSS) apresenta altos níveis de resistência à corrosão na maioria dos ambientes. Kim et al.² relataram que o HDSS UNS S32707 foi definido como um aço inoxidável duplex altamente ligado com um PREN superior a 45. O valor de PREN da amostra de HDSS 2707 neste trabalho foi de 49. Isso se deve ao seu alto teor de cromo e aos altos níveis de molibdênio e níquel, que são benéficos em ambientes ácidos e com alto teor de cloreto. Além disso, uma composição bem equilibrada e uma microestrutura livre de defeitos são úteis para a estabilidade estrutural e a resistência à corrosão. No entanto, apesar de sua excelente resistência química, os dados experimentais deste trabalho sugerem que o HDSS 2707 não é completamente imune à corrosão microbiológica (MIC) de biofilmes de P. aeruginosa.
Os resultados eletroquímicos mostraram que a taxa de corrosão do HDSS 2707 em caldo de P. aeruginosa aumentou significativamente após 14 dias em comparação com o meio não biológico. Na Figura 2a, observou-se uma redução no Eocp tanto no meio abiótico quanto no caldo de P. aeruginosa durante as primeiras 24 horas. Posteriormente, o biofilme completou a cobertura da superfície da amostra e o Eocp tornou-se relativamente estável. No entanto, o nível de Eocp biológico foi muito maior do que o de Eocp não biológico. Há razões para acreditar que essa diferença se deve à formação do biofilme de P. aeruginosa. Na Figura 2d, na presença de P. aeruginosa, o valor de icorr do HDSS 2707 atingiu 0,627 μA cm-2, que foi uma ordem de magnitude maior do que o do controle abiótico (0,063 μA cm-2), o que foi consistente com o valor de Rct medido por EIS. Durante os primeiros dias, Os valores de impedância no caldo de P. aeruginosa aumentaram devido à adesão das células de P. aeruginosa e à formação de biofilmes. No entanto, quando o biofilme cobre completamente a superfície da amostra, a impedância diminui. A camada protetora é atacada primeiro devido à formação de biofilmes e metabólitos do biofilme. Portanto, a resistência à corrosão diminuiu ao longo do tempo e a adesão de P. aeruginosa causou corrosão localizada. As tendências em meios abióticos foram diferentes. A resistência à corrosão do controle não biológico foi muito maior do que o valor correspondente das amostras expostas ao caldo de P. aeruginosa. Além disso, para as amostras abióticas, o valor de Rct do HDSS 2707 atingiu 489 kΩ cm² no 14º dia, o que representa 15 vezes o valor de Rct (32 kΩ cm²) na presença de P. aeruginosa. Portanto, o HDSS 2707 apresenta excelente resistência à corrosão em ambiente estéril, mas não é resistente ao ataque MIC por P. aeruginosa. biofilmes de aeruginosa.
Esses resultados também podem ser observados nas curvas de polarização da Figura 2b. O ramificação anódica foi atribuída à formação de biofilme de Pseudomonas aeruginosa e às reações de oxidação do metal. Simultaneamente, a reação catódica é a redução do oxigênio. A presença de P. aeruginosa aumentou significativamente a densidade de corrente de corrosão, aproximadamente uma ordem de magnitude maior que o controle abiótico. Isso indica que o biofilme de P. aeruginosa aumenta a corrosão localizada do aço inoxidável duplex 2707. Yuan et al.²⁹ descobriram que a densidade de corrente de corrosão da liga Cu-Ni 70/30 aumentou sob a ação do biofilme de P. aeruginosa. Isso pode ser devido à biocatálise da redução de oxigênio pelos biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. Essa observação também pode explicar a corrosão microbiológica (MIC) do aço inoxidável duplex 2707 neste trabalho. Biofilmes aeróbicos também podem apresentar menor quantidade de oxigênio em sua superfície. Portanto, a falha na repassivação da superfície metálica pelo oxigênio pode ser um fator que contribui para a MIC neste trabalho.
Dickinson et al. 38 sugeriram que as taxas de reações químicas e eletroquímicas podem ser diretamente afetadas pela atividade metabólica de bactérias sésseis na superfície da amostra e pela natureza dos produtos de corrosão. Como mostrado na Figura 5 e na Tabela 5, tanto o número de células quanto a espessura do biofilme diminuíram após 14 dias. Isso pode ser razoavelmente explicado pelo fato de que, após 14 dias, a maioria das células sésseis na superfície do HDSS 2707 morreu devido ao esgotamento de nutrientes no meio 2216E ou à liberação de íons metálicos tóxicos da matriz do HDSS 2707. Esta é uma limitação dos experimentos em lote.
Neste trabalho, o biofilme de P. aeruginosa promoveu a depleção local de Cr e Fe sob o biofilme na superfície do aço inoxidável duplex 2707 (Figura 6). Na Tabela 6, a redução de Fe e Cr na amostra D em comparação com a amostra C indica que o Fe e o Cr dissolvidos pelo biofilme de P. aeruginosa persistiram além dos primeiros 7 dias. O meio 2216E é usado para simular ambientes marinhos. Ele contém 17.700 ppm de Cl-, valor comparável ao encontrado na água do mar natural. A presença de 17.700 ppm de Cl- foi a principal razão para a redução de Cr nas amostras abióticas de 7 e 14 dias analisadas por XPS. Comparada às amostras com P. aeruginosa, a dissolução de Cr nas amostras abióticas foi muito menor devido à forte resistência do aço inoxidável duplex 2707 ao Cl- em ambientes abióticos. A Figura 9 mostra a presença de Cr6+ no filme de passivação. Este íon pode estar envolvido na remoção de Cr do aço. superfícies por biofilmes de P. aeruginosa, conforme sugerido por Chen e Clayton.
Devido ao crescimento bacteriano, os valores de pH do meio antes e depois do cultivo foram de 7,4 e 8,2, respectivamente. Portanto, abaixo do biofilme de P. aeruginosa, é improvável que a corrosão por ácido orgânico seja um fator contribuinte neste trabalho, devido ao pH relativamente alto no meio em geral. O pH do meio de controle não biológico não apresentou alterações significativas (de 7,4 inicial para 7,5 final) durante o período de teste de 14 dias. O aumento do pH no meio de inoculação após a incubação deveu-se à atividade metabólica de P. aeruginosa e apresentou o mesmo efeito sobre o pH na ausência das tiras de teste.
Como mostrado na Figura 7, a profundidade máxima de corrosão causada pelo biofilme de P. aeruginosa foi de 0,69 μm, muito maior do que a do meio abiótico (0,02 μm). Isso está de acordo com os dados eletroquímicos descritos anteriormente. A profundidade de corrosão de 0,69 μm é mais de dez vezes menor do que o valor de 9,5 μm relatado para o aço inoxidável duplex 2205 nas mesmas condições. Esses dados demonstram que o aço inoxidável duplex 2707 apresenta melhor resistência à corrosão microbiológica (MIC) em comparação com o aço inoxidável duplex 2205. Isso não deve ser uma surpresa, visto que o aço inoxidável duplex 2707 possui um teor de cromo mais elevado, proporcionando uma passivação mais duradoura, devido à estrutura de fase balanceada sem precipitados secundários prejudiciais, dificultando a despassivação e o início da formação de pontos de eclipse por P. aeruginosa.
Em conclusão, observou-se corrosão por microrganismos induzidos por corrosão (MIC) na superfície do aço inoxidável duplex 2707 em caldo de *P. aeruginosa*, em comparação com a corrosão insignificante em meio abiótico. Este trabalho demonstra que o aço inoxidável duplex 2707 apresenta melhor resistência à corrosão por microrganismos induzidos por corrosão do que o aço inoxidável duplex 2205, porém não é totalmente imune à corrosão por microrganismos induzidos por corrosão devido ao biofilme de *P. aeruginosa*. Esses resultados auxiliam na seleção de aços inoxidáveis ​​adequados e na estimativa da vida útil em ambientes marinhos.
O cupom para o aço inoxidável duplex 2707 foi fornecido pela Escola de Metalurgia da Universidade do Nordeste (NEU) em Shenyang, China. A composição elementar do aço inoxidável duplex 2707 é mostrada na Tabela 1, tendo sido analisada pelo Departamento de Análise e Teste de Materiais da NEU. Todas as amostras foram submetidas a tratamento térmico de solubilização a 1180 °C por 1 hora. Antes do teste de corrosão, amostras de aço inoxidável duplex 2707 em formato de moeda, com uma área de superfície exposta de 1 cm², foram polidas com lixa de carbeto de silício de granulação 2000 e posteriormente polidas com uma suspensão de pó de Al₂O₃ de 0,05 μm. As laterais e a base foram protegidas com tinta inerte. Após a secagem, os corpos de prova foram enxaguados com água deionizada estéril e esterilizados com etanol 75% (v/v) por 0,5 h. Em seguida, foram secos ao ar sob luz ultravioleta (UV) por 0,5 h antes do uso.
A cepa marinha Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099 foi adquirida do Centro de Coleção de Culturas Marinhas de Xiamen (MCCC), China. Pseudomonas aeruginosa foi cultivada aerobicamente a 37 °C em frascos de 250 ml e células de vidro eletroquímicas de 500 ml, utilizando o meio líquido Marine 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China). Composição do meio (g/L): 19,45 NaCl, 5,98 MgCl2, 3,24 Na2SO4, 1,8 CaCl2, 0,55 KCl, 0,16 Na2CO3, 0,08 KBr, 0,034 SrCl2, 0,08 SrBr2, 0,022 H3BO3, 0,004 NaSiO3, 0,0016 NH3, 0,0016 NH3, 0,0016 NaH2PO4, 5,0 de peptona, 1,0 de extrato de levedura e 0,1 de citrato férrico. Autoclavar a 121 °C por 20 minutos antes da inoculação. Contar as células sésseis e planctônicas usando uma câmara de Neubauer sob um microscópio óptico com aumento de 400x. A concentração celular inicial de Pseudomonas aeruginosa planctônica imediatamente após a inoculação foi de aproximadamente 10⁶ células/ml.
Os testes eletroquímicos foram realizados em uma célula de vidro clássica de três eletrodos com um volume médio de 500 ml. Uma lâmina de platina e um eletrodo de calomelano saturado (ECS) foram conectados ao reator por meio de capilares de Luggin preenchidos com pontes salinas, servindo como contraeletrodo e eletrodo de referência, respectivamente. Para a confecção dos eletrodos de trabalho, um fio de cobre revestido de borracha foi fixado a cada amostra e coberto com epóxi, deixando cerca de 1 cm² de área superficial exposta em um dos lados para o eletrodo de trabalho. Durante as medições eletroquímicas, as amostras foram imersas em meio 2216E e mantidas a uma temperatura constante de incubação (37 °C) em banho-maria. Os dados de potencial de circuito aberto (OCP), potencial de polarização linear (LPR), espectroscopia de impedância eletroquímica (EIS) e polarização dinâmica de potencial foram medidos utilizando um potenciostato Autolab (Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., EUA). Os testes de LPR foram registrados a uma taxa de varredura de 0,125 mV s⁻¹ na faixa de -5 a 5 mV com potencial de circuito aberto (Eocp) e uma frequência de amostragem de 1 Hz. O teste foi realizado com uma onda senoidal na faixa de frequência de 0,01 a 10.000 Hz, utilizando uma tensão aplicada de 5 mV em potencial de corrosão em estado estacionário (Eocp). Antes da varredura de potencial, os eletrodos permaneceram em circuito aberto até que um valor estável de potencial de corrosão livre fosse atingido. As curvas de polarização foram então obtidas de -0,2 a 1,5 V vs. Eocp a uma taxa de varredura de 0,166 mV/s. Cada teste foi repetido 3 vezes, com e sem P. aeruginosa.
As amostras para análise metalográfica foram polidas mecanicamente com lixa de SiC úmida de grão 2000 e, em seguida, polidas com suspensão de pó de Al2O3 de 0,05 μm para observação óptica. A análise metalográfica foi realizada utilizando um microscópio óptico. As amostras foram atacadas com solução de hidróxido de potássio a 10% em peso.
Após a incubação, as amostras foram lavadas 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) e fixadas com glutaraldeído a 2,5% (v/v) por 10 horas para fixação dos biofilmes. Em seguida, foram desidratadas com uma série gradual de etanol (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100% v/v) antes da secagem ao ar. Finalmente, a superfície da amostra foi revestida com uma camada de ouro por pulverização catódica para proporcionar condutividade para observação em microscopia eletrônica de varredura (MEV). As imagens de MEV foram focadas nos pontos com maior concentração de células de *P. aeruginosa* sésseis na superfície de cada amostra. Foi realizada análise EDS para identificação dos elementos químicos. Um microscópio confocal de varredura a laser (CLSM) Zeiss (LSM 710, Zeiss, Alemanha) foi utilizado para medir a profundidade das cavidades de corrosão. Para observar as cavidades de corrosão sob o biofilme, a amostra foi preparada. Primeiramente, a peça de teste foi limpa de acordo com a Norma Nacional Chinesa (CNS) GB/T4334.4-2000 para remover os produtos de corrosão e o biofilme da superfície.
A análise por espectroscopia fotoeletrônica de raios X (XPS, sistema de análise de superfície ESCALAB250, Thermo VG, EUA) foi realizada utilizando uma fonte de raios X monocromática (linha Kα do alumínio com energia de 1500 eV e potência de 150 W) em uma ampla faixa de energia de ligação, de 0 a 1350 eV em condições padrão. Espectros de alta resolução foram registrados utilizando energia de passagem de 50 eV e passo de 0,2 eV.
As amostras incubadas foram removidas e lavadas delicadamente com PBS (pH 7,4 ± 0,2) por 15 segundos. Para observar a viabilidade bacteriana dos biofilmes nas amostras, os biofilmes foram corados utilizando o kit de viabilidade bacteriana LIVE/DEAD BacLight (Invitrogen, Eugene, OR, EUA). O kit possui dois corantes fluorescentes: um corante verde fluorescente SYTO-9 e um corante vermelho fluorescente iodeto de propídio (PI). Em microscopia confocal de varredura a laser (CLSM), pontos com fluorescência verde e vermelha representam células vivas e mortas, respectivamente. Para a coloração, uma mistura de 1 ml contendo 3 μl de solução de SYTO-9 e 3 μl de solução de PI foi incubada por 20 minutos à temperatura ambiente (23 °C) no escuro. Posteriormente, as amostras coradas foram observadas em dois comprimentos de onda (488 nm para células vivas e 559 nm para células mortas) utilizando um microscópio confocal de varredura a laser Nikon (C2 Plus, Nikon, Japão). Espessura do biofilme foi medida no modo de digitalização 3D.
Como citar este artigo: Li, H. et al. Corrosão microbiana do aço inoxidável super duplex 2707 por biofilme de Pseudomonas aeruginosa marinha. Science. Rep. 6, 20190; doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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