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A corrosão microbiana (MIC) é um problema sério em muitas indústrias, pois pode causar enormes perdas econômicas. O aço inoxidável super duplex 2707 (2707 HDSS) tem sido usado em ambientes marinhos devido à sua excelente resistência química. No entanto, sua resistência à MIC não foi demonstrada experimentalmente. Neste estudo, o comportamento da MIC do 2707 HDSS causado pela bactéria aeróbica marinha Pseudomonas aeruginosa foi investigado. A análise eletroquímica mostrou que, na presença de biofilme de Pseudomonas aeruginosa no meio 2216E, houve uma mudança positiva no potencial de corrosão e um aumento na densidade de corrente de corrosão. A análise de espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) mostrou uma diminuição no conteúdo de Cr na superfície da amostra abaixo do biofilme. A análise de imagem das cavidades mostrou que o biofilme de P. aeruginosa produziu uma profundidade máxima de cavidade de 0,69 μm durante 14 dias de incubação. Embora seja pequeno, indica que 2707 O HDSS não é totalmente imune ao MIC dos biofilmes de P. aeruginosa.
Aços inoxidáveis ​​duplex (DSS) são amplamente utilizados em vários setores por sua combinação ideal de excelentes propriedades mecânicas e resistência à corrosão1,2. No entanto, corrosão localizada ainda ocorre e afeta a integridade deste aço3,4. O DSS não é resistente à corrosão microbiana (MIC)5,6. Apesar da ampla gama de aplicações do DSS, ainda há ambientes onde a resistência à corrosão do DSS não é suficiente para uso a longo prazo. Isso significa que materiais mais caros com maior resistência à corrosão são necessários. Jeon et al7 descobriram que mesmo os aços inoxidáveis ​​super duplex (SDSS) têm algumas limitações em termos de resistência à corrosão. Portanto, aços inoxidáveis ​​super duplex (HDSS) com maior resistência à corrosão são necessários em algumas aplicações. Isso levou ao desenvolvimento de HDSS altamente ligados.
A resistência à corrosão do DSS depende da proporção das fases alfa e gama e das regiões 8, 9 e 10 empobrecidas de Cr, Mo e W adjacentes à segunda fase. O HDSS contém alto teor de Cr, Mo e N11, portanto, tem excelente resistência à corrosão e um alto valor (45-50) Número Equivalente de Resistência a Pite (PREN), determinado por % em peso de Cr + 3,3 (% em peso de Mo + 0,5% em peso de W) + 16% em peso de N12. Sua excelente resistência à corrosão depende de uma composição balanceada contendo aproximadamente 50% de fases de ferrita (α) e 50% de austenita (γ), o HDSS tem melhores propriedades mecânicas e maior resistência do que o DSS13 convencional. Propriedades de corrosão por cloreto. A resistência à corrosão aprimorada expande o uso do HDSS em ambientes de cloreto mais corrosivos, como ambientes marinhos.
MICs são um grande problema em muitas indústrias, como petróleo, gás e serviços públicos de água14. MIC é responsável por 20% de todos os danos por corrosão15. MIC é corrosão bioeletroquímica que pode ser observada em muitos ambientes. Biofilmes que se formam em superfícies metálicas alteram as condições eletroquímicas, afetando assim o processo de corrosão. Acredita-se amplamente que a corrosão MIC é causada por biofilmes. Microrganismos eletrogênicos corroem metais para obter energia de sustentação para sobreviver17. Estudos recentes de MIC mostraram que EET (transferência extracelular de elétrons) é o fator limitante da taxa de MIC induzida por microrganismos eletrogênicos. Zhang et al. 18 demonstraram que mediadores de elétrons aceleram a transferência de elétrons entre células Desulfovibrio sessificans e aço inoxidável 304, levando a um ataque de MIC mais severo. Enning et al. 19 e Venzlaff et al. 20 mostraram que biofilmes corrosivos de bactérias redutoras de sulfato (SRB) podem absorver elétrons diretamente de substratos metálicos, resultando em corrosão por pites severa.
Sabe-se que o DSS é suscetível ao MIC em ambientes que contêm SRB, bactérias redutoras de ferro (IRB), etc. 21. Essas bactérias causam corrosão localizada nas superfícies do DSS sob biofilmes22,23. Ao contrário do DSS, o MIC do HDSS24 é pouco conhecido.
Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa móvel em forma de bastonete amplamente distribuída na natureza25. Pseudomonas aeruginosa também é um importante grupo microbiano no ambiente marinho, causando MIC ao aço. Pseudomonas está intimamente envolvida em processos de corrosão e é reconhecida como uma colonizadora pioneira durante a formação de biofilmes. Mahat et al. 28 e Yuan et al. 29 demonstraram que Pseudomonas aeruginosa tem uma tendência a aumentar a taxa de corrosão de aço macio e ligas em ambientes aquosos.
O principal objetivo deste trabalho foi investigar as propriedades MIC do 2707 HDSS causadas pela bactéria aeróbica marinha Pseudomonas aeruginosa usando métodos eletroquímicos, técnicas analíticas de superfície e análise de produtos de corrosão. Estudos eletroquímicos incluindo Potencial de Circuito Aberto (OCP), Resistência de Polarização Linear (LPR), Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIS) e Polarização Dinâmica Potencial foram realizados para estudar o comportamento MIC do 2707 HDSS. A análise de espectrômetro de energia dispersiva (EDS) foi realizada para encontrar elementos químicos na superfície corroída. Além disso, a análise de espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) foi usada para determinar a estabilidade da passivação do filme de óxido sob a influência de um ambiente marinho contendo Pseudomonas aeruginosa. A profundidade do poço foi medida em um microscópio de varredura a laser confocal (CLSM).
A Tabela 1 lista a composição química do 2707 HDSS. A Tabela 2 mostra que o 2707 HDSS tem excelentes propriedades mecânicas com um limite de escoamento de 650 MPa. A Figura 1 mostra a microestrutura óptica do 2707 HDSS tratado termicamente em solução. Faixas alongadas de fases de austenita e ferrita sem fases secundárias podem ser vistas na microestrutura contendo cerca de 50% de fases de austenita e 50% de ferrita.
A Figura 2a mostra o potencial de circuito aberto (Eocp) versus dados de tempo de exposição para 2707 HDSS em meio abiótico 2216E e caldo de P. aeruginosa por 14 dias a 37 °C. Ela mostra que a maior e significativa mudança no Eocp ocorre nas primeiras 24 horas. Os valores de Eocp em ambos os casos atingiram o pico em -145 mV (vs. SCE) por volta de 16 h e então caíram bruscamente, atingindo -477 mV (vs. SCE) e -236 mV (vs. SCE) para a amostra abiótica e P, respectivamente). Cupons de Pseudomonas aeruginosa, respectivamente. Após 24 horas, o valor de Eocp de 2707 HDSS para P. aeruginosa foi relativamente estável em -228 mV (vs. SCE), enquanto o valor correspondente para amostras não biológicas foi de aproximadamente -442 mV (vs. SCE). O Eocp na presença de P. aeruginosa foi bastante baixo.
Teste eletroquímico de 2707 espécimes de HDSS em meio abiótico e caldo de Pseudomonas aeruginosa a 37 °C:
(a) Eocp em função do tempo de exposição, (b) curvas de polarização no dia 14, (c) Rp em função do tempo de exposição e (d) icorr em função do tempo de exposição.
A Tabela 3 lista os valores dos parâmetros de corrosão eletroquímica de 2707 amostras de HDSS expostas ao meio abiótico e ao meio inoculado com Pseudomonas aeruginosa por 14 dias. As tangentes das curvas anódica e catódica foram extrapoladas para chegar às interseções produzindo densidade de corrente de corrosão (icorr), potencial de corrosão (Ecorr) e inclinações de Tafel (βα e βc) de acordo com métodos padrão30,31.
Conforme mostrado na Figura 2b, o deslocamento para cima da curva de P. aeruginosa resultou em um aumento em Ecorr em comparação com a curva abiótica. O valor de icorr, que é proporcional à taxa de corrosão, aumentou para 0,328 μA cm-2 na amostra de Pseudomonas aeruginosa, quatro vezes maior que o da amostra não biológica (0,087 μA cm-2).
LPR é um método eletroquímico não destrutivo clássico para análise rápida de corrosão. Também foi usado para estudar MIC32. A Figura 2c mostra a resistência à polarização (Rp) como uma função do tempo de exposição. Um valor de Rp mais alto significa menos corrosão. Nas primeiras 24 horas, o Rp de 2707 HDSS atingiu um valor máximo de 1955 kΩ cm2 para amostras abióticas e 1429 kΩ cm2 para amostras de Pseudomonas aeruginosa. A Figura 2c também mostra que o valor de Rp diminuiu rapidamente após um dia e permaneceu relativamente inalterado pelos próximos 13 dias. O valor de Rp da amostra de Pseudomonas aeruginosa é de cerca de 40 kΩ cm2, o que é muito menor do que o valor de 450 kΩ cm2 da amostra não biológica.
O valor icorr é proporcional à taxa de corrosão uniforme. Seu valor pode ser calculado a partir da seguinte equação de Stern-Geary,
Seguindo Zou et al. 33, um valor típico da inclinação Tafel B neste trabalho foi assumido como sendo 26 mV/dec. A Figura 2d mostra que o icorr da amostra não biológica 2707 permaneceu relativamente estável, enquanto a amostra de P. aeruginosa flutuou muito após as primeiras 24 horas. Os valores de icorr das amostras de P. aeruginosa foram uma ordem de magnitude maiores do que os controles não biológicos. Essa tendência é consistente com os resultados da resistência à polarização.
EIS é outra técnica não destrutiva usada para caracterizar reações eletroquímicas em interfaces corroídas. Espectros de impedância e valores de capacitância calculados de espécimes expostos a meios abióticos e solução de Pseudomonas aeruginosa, resistência Rb do filme passivo/biofilme formado na superfície do espécime, resistência de transferência de carga Rct, capacitância de camada dupla elétrica Cdl (EDL) e parâmetros do elemento de fase constante (CPE) do QCPE. Esses parâmetros foram analisados ​​posteriormente ajustando os dados usando um modelo de circuito equivalente (EEC).
A Figura 3 mostra os diagramas de Nyquist típicos (a e b) e diagramas de Bode (a' e b') de 2707 amostras de HDSS em meio abiótico e caldo de P. aeruginosa para diferentes tempos de incubação. O diâmetro do anel de Nyquist diminui na presença de Pseudomonas aeruginosa. O diagrama de Bode (Fig. 3b') mostra um aumento na magnitude da impedância total. Informações sobre a constante de tempo de relaxamento podem ser fornecidas pelos máximos de fase. A Figura 4 mostra as estruturas físicas baseadas em monocamada (a) e bicamada (b) e seus EECs correspondentes. O CPE é introduzido no modelo EEC. Sua admitância e impedância são expressas da seguinte forma:
Dois modelos físicos e circuitos equivalentes correspondentes para ajustar o espectro de impedância do espécime 2707 HDSS:
onde Y0 é a magnitude do CPE, j é o número imaginário ou (-1)1/2, ω é a frequência angular e n é o índice de potência do CPE menor que a unidade35. O inverso da resistência de transferência de carga (ou seja, 1/Rct) corresponde à taxa de corrosão. Rct menor significa taxa de corrosão mais rápida27. Após 14 dias de incubação, o Rct das amostras de Pseudomonas aeruginosa atingiu 32 kΩ cm2, muito menor que os 489 kΩ cm2 das amostras não biológicas (Tabela 4).
As imagens CLSM e SEM na Figura 5 mostram claramente que a cobertura de biofilme na superfície do espécime 2707 HDSS após 7 dias é densa. No entanto, após 14 dias, a cobertura de biofilme era esparsa e algumas células mortas apareceram. A Tabela 5 mostra a espessura do biofilme em espécimes 2707 HDSS após exposição a P. aeruginosa por 7 e 14 dias. A espessura máxima do biofilme mudou de 23,4 μm após 7 dias para 18,9 μm após 14 dias. A espessura média do biofilme também confirmou essa tendência. Ela diminuiu de 22,2 ± 0,7 μm após 7 dias para 17,8 ± 1,0 μm após 14 dias.
(a) Imagem CLSM 3D após 7 dias, (b) Imagem CLSM 3D após 14 dias, (c) Imagem SEM após 7 dias e (d) Imagem SEM após 14 dias.
A EDS revelou elementos químicos em biofilmes e produtos de corrosão em amostras expostas a P. aeruginosa por 14 dias. A Figura 6 mostra que o conteúdo de C, N, O e P em biofilmes e produtos de corrosão é muito maior do que em metais puros, porque esses elementos estão associados a biofilmes e seus metabólitos. Os micróbios precisam apenas de traços de cromo e ferro. Altos níveis de Cr e Fe no biofilme e produtos de corrosão na superfície dos espécimes indicam que a matriz metálica perdeu elementos devido à corrosão.
Após 14 dias, a formação de cavidades com e sem P. aeruginosa foi observada no meio 2216E. Antes da incubação, a superfície da amostra era lisa e sem defeitos (Fig. 7a). Após a incubação e remoção do biofilme e dos produtos de corrosão, as cavidades mais profundas na superfície das amostras foram examinadas sob CLSM, conforme mostrado nas Figuras 7b e c. Nenhuma cavidade óbvia foi encontrada na superfície das amostras de controle não biológico (profundidade máxima da cavidade 0,02 μm). A profundidade máxima da cavidade causada por Pseudomonas aeruginosa foi de 0,52 μm após 7 dias e 0,69 μm após 14 dias, com base na profundidade máxima média da cavidade de 3 amostras (10 valores de profundidade máxima da cavidade foram selecionados para cada amostra) atingiu 0,42 ± 0,12 μm e 0,52 ± 0,15 μm, respectivamente (Tabela 5). Esses valores de profundidade do poço são pequenos, mas importantes.
(a) Antes da exposição, (b) 14 dias em meio abiótico e (c) 14 dias em caldo de Pseudomonas aeruginosa.
A Figura 8 mostra os espectros XPS de diferentes superfícies de amostra, e as composições químicas analisadas para cada superfície estão resumidas na Tabela 6. Na Tabela 6, as porcentagens atômicas de Fe e Cr na presença de P. aeruginosa (amostras A e B) foram muito menores do que as das amostras de controle não biológico (amostras C e D). Para a amostra de P. aeruginosa, a curva espectral de nível de núcleo de Cr 2p foi ajustada a quatro componentes de pico com valores de energia de ligação (BE) de 574,4, 576,6, 578,3 e 586,8 eV, que podem ser atribuídos a Cr, Cr2O3, CrO3 e Cr(OH)3, respectivamente (Fig. 9a e b). Para espécimes não biológicos, o espectro de nível de núcleo de Cr 2p contém dois picos principais para Cr (573,80 eV para BE) e Cr2O3 (575,90 eV para BE) na Fig. 9c e d, respectivamente. A diferença mais marcante entre as amostras abióticas e de P. aeruginosa foi a presença de Cr6+ e uma fração relativa maior de Cr(OH)3 (BE de 586,8 eV) abaixo do biofilme.
Os amplos espectros XPS da superfície do espécime 2707 HDSS nos dois meios são de 7 dias e 14 dias, respectivamente.
(a) 7 dias de exposição a P. aeruginosa, (b) 14 dias de exposição a P. aeruginosa, (c) 7 dias em meio abiótico e (d) 14 dias em meio abiótico.
O HDSS exibe altos níveis de resistência à corrosão na maioria dos ambientes. Kim et al. 2 relataram que o UNS S32707 HDSS foi definido como um DSS altamente ligado com um PREN de mais de 45. O valor de PREN do espécime 2707 HDSS neste trabalho foi 49. Isso se deve ao seu alto teor de cromo e altos níveis de molibdênio e Ni, que são benéficos em ambientes ácidos e com alto teor de cloreto. Além disso, uma composição bem balanceada e uma microestrutura livre de defeitos são úteis para a estabilidade estrutural e resistência à corrosão. No entanto, apesar de sua excelente resistência química, os dados experimentais neste trabalho sugerem que o 2707 HDSS não é completamente imune ao MIC de biofilmes de P. aeruginosa.
Resultados eletroquímicos mostraram que a taxa de corrosão de 2707 HDSS no caldo de P. aeruginosa aumentou significativamente após 14 dias em comparação ao meio não biológico. Na Figura 2a, uma redução no Eocp foi observada tanto no meio abiótico quanto no caldo de P. aeruginosa durante as primeiras 24 horas. Depois, o biofilme cobriu completamente a superfície da amostra e o Eocp se tornou relativamente estável36. No entanto, o nível de Eocp biológico foi muito maior do que o de Eocp não biológico. Há razões para acreditar que essa diferença se deve à formação de biofilme de P. aeruginosa. Na Figura 2d, na presença de P. aeruginosa, o valor de icorr de 2707 HDSS atingiu 0,627 μA cm-2, que foi uma ordem de magnitude maior do que a do controle abiótico (0,063 μA cm-2), o que foi consistente com o valor de Rct medido por EIS. Durante os primeiros dias, os valores de impedância no caldo de P. aeruginosa aumentaram devido à fixação de células de P. aeruginosa e à formação de biofilmes. No entanto, quando o biofilme cobre completamente a superfície da amostra, a impedância diminui. A camada protetora é atacada primeiro devido à formação de biofilmes e metabólitos de biofilme. Portanto, a resistência à corrosão diminuiu com o tempo, e a fixação de P. aeruginosa causou corrosão localizada. As tendências em meios abióticos foram diferentes. A resistência à corrosão do controle não biológico foi muito maior do que o valor correspondente das amostras expostas ao caldo de P. aeruginosa. Além disso, para amostras abióticas, o valor de Rct de 2707 HDSS atingiu 489 kΩ cm2 no dia 14, que foi 15 vezes o valor de Rct (32 kΩ cm2) na presença de P. aeruginosa. Portanto, 2707 HDSS tem excelente resistência à corrosão em um ambiente estéril, mas não é resistente ao ataque de MIC por P. biofilmes de aeruginosa.
Esses resultados também podem ser observados nas curvas de polarização da Fig. 2b. A ramificação anódica foi atribuída à formação do biofilme de Pseudomonas aeruginosa e às reações de oxidação do metal. Ao mesmo tempo, a reação catódica é a redução do oxigênio. A presença de P. aeruginosa aumentou muito a densidade da corrente de corrosão, aproximadamente uma ordem de magnitude maior do que o controle abiótico. Isso indica que o biofilme de P. aeruginosa aumenta a corrosão localizada do 2707 HDSS. Yuan et al. 29 descobriram que a densidade da corrente de corrosão da liga Cu-Ni 70/30 aumentou sob desafio do biofilme de P. aeruginosa. Isso pode ser devido à biocatálise da redução de oxigênio pelos biofilmes de Pseudomonas aeruginosa. Essa observação também pode explicar o MIC do 2707 HDSS neste trabalho. Biofilmes aeróbicos também podem ter menos oxigênio abaixo deles. Portanto, a falha em repassivar a superfície do metal pelo oxigênio pode ser um fator que contribui para o MIC em este trabalho.
Dickinson et al. 38 sugeriram que as taxas de reações químicas e eletroquímicas podem ser diretamente afetadas pela atividade metabólica de bactérias sésseis na superfície da amostra e pela natureza dos produtos de corrosão. Conforme mostrado na Figura 5 e na Tabela 5, tanto o número de células quanto a espessura do biofilme diminuíram após 14 dias. Isso pode ser razoavelmente explicado pelo fato de que, após 14 dias, a maioria das células sésseis na superfície do 2707 HDSS morreu devido à depleção de nutrientes no meio 2216E ou à liberação de íons metálicos tóxicos da matriz do 2707 HDSS. Essa é uma limitação dos experimentos em lote.
Neste trabalho, o biofilme de P. aeruginosa promoveu a depleção local de Cr e Fe abaixo do biofilme na superfície do 2707 HDSS (Fig. 6). Na Tabela 6, a redução de Fe e Cr na amostra D em comparação com a amostra C, indicando que o Fe e o Cr dissolvidos causados ​​pelo biofilme de P. aeruginosa persistiram além dos primeiros 7 dias. O meio 2216E é usado para simular ambientes marinhos. Ele contém 17.700 ppm de Cl-, que é comparável ao encontrado na água do mar natural. A presença de 17.700 ppm de Cl- foi a principal razão para a redução de Cr nas amostras abióticas de 7 e 14 dias analisadas por XPS. Em comparação com as amostras de P. aeruginosa, a dissolução de Cr em amostras abióticas foi muito menor devido à forte resistência ao Cl− do 2707 HDSS em ambientes abióticos. A Figura 9 mostra a presença de Cr6+ no filme de passivação. Pode estar envolvido na remoção de Cr de superfícies de aço por biofilmes de P. aeruginosa, conforme sugerido por Chen e Clayton.
Devido ao crescimento bacteriano, os valores de pH do meio antes e depois do cultivo foram 7,4 e 8,2, respectivamente. Portanto, abaixo do biofilme de P. aeruginosa, é improvável que a corrosão por ácido orgânico seja um fator contribuinte para este trabalho devido ao pH relativamente alto no meio em massa. O pH do meio de controle não biológico não mudou significativamente (de 7,4 inicial para 7,5 final) durante o período de teste de 14 dias. O aumento do pH no meio de inoculação após a incubação foi devido à atividade metabólica de P. aeruginosa e descobriu-se que teve o mesmo efeito no pH na ausência de tiras de teste.
Conforme mostrado na Figura 7, a profundidade máxima do poço causada pelo biofilme de P. aeruginosa foi de 0,69 μm, que foi muito maior do que a do meio abiótico (0,02 μm). Isso é consistente com os dados eletroquímicos descritos acima. A profundidade do poço de 0,69 μm é mais de dez vezes menor do que o valor de 9,5 μm relatado para o 2205 DSS sob as mesmas condições. Esses dados demonstram que o 2707 HDSS exibe melhor resistência à MIC em comparação ao 2205 DSS. Isso não deve ser nenhuma surpresa, pois o 2707 HDSS tem um maior teor de cromo, proporcionando passivação mais duradoura, devido à estrutura de fase balanceada sem precipitados secundários prejudiciais, tornando mais difícil para P. aeruginosa despassivar e iniciar o eclipse dos pontos.
Em conclusão, foi encontrada corrosão por MIC na superfície do 2707 HDSS em caldo de P. aeruginosa, em comparação à corrosão por MIC insignificante em meios abióticos. Este trabalho mostra que o 2707 HDSS tem melhor resistência à MIC do que o 2205 DSS, mas não é totalmente imune à MIC devido ao biofilme de P. aeruginosa. Essas descobertas auxiliam na seleção de aços inoxidáveis ​​adequados e na estimativa da vida útil para o ambiente marinho.
O cupom para 2707 HDSS é fornecido pela Escola de Metalurgia da Universidade Northeastern (NEU) em Shenyang, China. A composição elementar do 2707 HDSS é mostrada na Tabela 1, que foi analisada pelo Departamento de Análise e Teste de Materiais da NEU. Todas as amostras foram tratadas com solução a 1180 °C por 1 hora. Antes do teste de corrosão, o 2707 HDSS em forma de moeda com uma área de superfície exposta superior de 1 cm2 foi polido até 2000 grãos com lixa de carboneto de silício e posteriormente polido com uma suspensão de pó de Al2O3 de 0,05 μm. As laterais e o fundo são protegidos por tinta inerte. Após a secagem, os espécimes foram enxaguados com água deionizada estéril e esterilizados com etanol 75% (v/v) por 0,5 h. Eles foram então secos ao ar sob luz ultravioleta (UV) por 0,5 horas antes do uso.
A cepa Marine Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099 foi adquirida do Xiamen Marine Culture Collection Center (MCCC), China. A Pseudomonas aeruginosa foi cultivada aerobicamente a 37 °C em frascos de 250 ml e células de vidro eletroquímicas de 500 ml usando meio líquido Marine 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China). Meio (g/L): 19,45 NaCl, 5,98 MgCl2, 3,24 Na2SO4, 1,8 CaCl2, 0,55 KCl, 0,16 Na2CO3, 0,08 KBr, 0,034 SrCl2, 0,08 SrBr2, 0,022 H3BO3, 0,004 NaSiO3, 0,016 NH3, 0,016 NH3, 0016 NaH2PO4, 5,0 peptona, 1,0 extrato de levedura e 0,1 citrato férrico. Autoclave a 121°C por 20 minutos antes da inoculação. Conte as células sésseis e planctônicas usando um hemocitômetro sob um microscópio de luz com ampliação de 400X. A concentração inicial de células planctônicas de Pseudomonas aeruginosa imediatamente após a inoculação foi de aproximadamente 106 células/ml.
Testes eletroquímicos foram realizados em uma célula de vidro clássica de três eletrodos com um volume médio de 500 ml. Uma folha de platina e um eletrodo de calomelano saturado (SCE) foram conectados ao reator por meio de capilares de Luggin preenchidos com pontes salinas, servindo como eletrodos de contra e referência, respectivamente. Para fazer os eletrodos de trabalho, um fio de cobre revestido de borracha foi conectado a cada amostra e coberto com epóxi, deixando cerca de 1 cm2 de área de superfície exposta de um lado para o eletrodo de trabalho. Durante as medições eletroquímicas, as amostras foram colocadas em meio 2216E e mantidas a uma temperatura de incubação constante (37 °C) em um banho-maria. Os dados de OCP, LPR, EIS e polarização dinâmica potencial foram medidos usando um potenciostato Autolab (Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., EUA). Os testes de LPR foram registrados a uma taxa de varredura de 0,125 mV s-1 na faixa de -5 e 5 mV com Eocp e uma frequência de amostragem de 1 Hz.EIS foi realizado com uma onda senoidal na faixa de frequência de 0,01 a 10.000 Hz usando uma tensão aplicada de 5 mV em estado estável Eocp. Antes da varredura de potencial, os eletrodos estavam em modo de circuito aberto até que um valor de potencial de corrosão livre estável fosse atingido. As curvas de polarização foram então executadas de -0,2 a 1,5 V vs. Eocp a uma taxa de varredura de 0,166 mV/s. Cada teste foi repetido 3 vezes com e sem P. aeruginosa.
As amostras para análise metalográfica foram polidas mecanicamente com lixa de SiC úmida de granulação 2000 e depois polidas novamente com suspensão de pó de Al2O3 de 0,05 μm para observação óptica. A análise metalográfica foi realizada usando um microscópio óptico. As amostras foram atacadas com solução de hidróxido de potássio a 10% em peso 43.
Após a incubação, as amostras foram lavadas 3 vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) e então fixadas com glutaraldeído 2,5% (v/v) por 10 horas para fixar os biofilmes. Posteriormente, foram desidratadas com uma série graduada (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100% v/v) de etanol antes da secagem ao ar. Finalmente, a superfície da amostra é pulverizada com um filme de ouro para fornecer condutividade para observação SEM. As imagens SEM foram focadas nos pontos com as células de P. aeruginosa mais sésseis na superfície de cada espécime. Realize a análise EDS para encontrar elementos químicos. Um microscópio de varredura a laser confocal Zeiss (CLSM) (LSM 710, Zeiss, Alemanha) foi usado para medir a profundidade do poço. Para observar os poços de corrosão sob o biofilme, a peça de teste foi primeiramente limpa de acordo com a Norma Nacional Chinesa (CNS) GB/T4334.4-2000 para remover os produtos de corrosão e biofilme na superfície da peça de teste.
A análise por espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS, sistema de análise de superfície ESCALAB250, Thermo VG, EUA) foi realizada usando uma fonte de raios X monocromática (linha Kα de alumínio com energia de 1500 eV e potência de 150 W) em uma ampla faixa de energia de ligação de 0 a 1350 eV sob condições padrão. Espectros de alta resolução foram registrados usando energia de passagem de 50 eV e tamanho de passo de 0,2 eV.
Os espécimes incubados foram removidos e enxaguados suavemente com PBS (pH 7,4 ± 0,2) por 15 s45. Para observar a viabilidade bacteriana dos biofilmes nas amostras, os biofilmes foram corados usando o kit LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability (Invitrogen, Eugene, OR, EUA). O kit tem dois corantes fluorescentes, um corante SYTO-9 fluorescente verde e um corante iodeto de propídio (PI) fluorescente vermelho. Sob CLSM, os pontos com verde e vermelho fluorescentes representam células vivas e mortas, respectivamente. Para a coloração, uma mistura de 1 ml contendo 3 μl de SYTO-9 e 3 μl de solução de PI foi incubada por 20 minutos à temperatura ambiente (23 oC) no escuro. Depois, as amostras coradas foram observadas em dois comprimentos de onda (488 nm para células vivas e 559 nm para células mortas) usando uma máquina Nikon CLSM (C2 Plus, Nikon, Japão). A espessura do biofilme foi medida no modo de escaneamento 3D.
Como citar este artigo: Li, H. et al. Corrosão microbiana do aço inoxidável super duplex 2707 por biofilme marinho de Pseudomonas aeruginosa. Science. Rep. 6, 20190; doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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