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La corrosione microbica (MIC) è un problema serio in molti settori industriali in quanto può causare enormi perdite economiche. L'acciaio inossidabile super duplex 2707 (2707 HDSS) è stato utilizzato in ambienti marini grazie alla sua eccellente resistenza chimica. Tuttavia, la sua resistenza alla MIC non è stata dimostrata sperimentalmente. In questo studio, è stato investigato il comportamento alla MIC del 2707 HDSS causato dal batterio aerobico marino Pseudomonas aeruginosa. L'analisi elettrochimica ha mostrato che in presenza di biofilm di Pseudomonas aeruginosa nel mezzo 2216E, si è verificato un cambiamento positivo nel potenziale di corrosione e un aumento della densità di corrente di corrosione. L'analisi di spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) ha mostrato una diminuzione del contenuto di Cr sulla superficie del campione sotto il biofilm. L'analisi di imaging delle pitting ha mostrato che il biofilm di P. aeruginosa ha prodotto una profondità massima di pitting di 0,69 μm durante 14 giorni di incubazione. Sebbene questo sia piccolo, indica che il 2707 HDSS non è completamente immune alla MIC dei biofilm di P. aeruginosa.
Gli acciai inossidabili duplex (DSS) sono ampiamente utilizzati in vari settori industriali per la loro combinazione ideale di eccellenti proprietà meccaniche e resistenza alla corrosione1,2. Tuttavia, si verificano ancora vaiolature localizzate che compromettono l'integrità di questo acciaio3,4. I DSS non sono resistenti alla corrosione microbica (MIC)5,6. Nonostante l'ampia gamma di applicazioni dei DSS, esistono ancora ambienti in cui la resistenza alla corrosione dei DSS non è sufficiente per un utilizzo a lungo termine. Ciò significa che sono necessari materiali più costosi con una maggiore resistenza alla corrosione. Jeon et al7 hanno scoperto che anche gli acciai inossidabili super duplex (SDSS) presentano alcune limitazioni in termini di resistenza alla corrosione. Pertanto, in alcune applicazioni sono necessari acciai inossidabili super duplex (HDSS) con una maggiore resistenza alla corrosione. Ciò ha portato allo sviluppo di HDSS altamente legati.
La resistenza alla corrosione del DSS dipende dal rapporto tra le fasi alfa e gamma e dalle regioni impoverite di Cr, Mo e W 8, 9, 10 adiacenti alla seconda fase. L'HDSS contiene un alto contenuto di Cr, Mo e N11, quindi ha un'eccellente resistenza alla corrosione e un alto valore (45-50) del numero equivalente di resistenza alla vaiolatura (PREN), determinato da % in peso di Cr + 3,3 (% in peso di Mo + 0,5% in peso di W) + 16% in peso di N12. La sua eccellente resistenza alla corrosione si basa su una composizione bilanciata contenente circa il 50% di fasi di ferrite (α) e il 50% di fasi di austenite (γ), l'HDSS ha migliori proprietà meccaniche e una maggiore resistenza rispetto al DSS convenzionale13. Proprietà di corrosione da cloruri. La migliore resistenza alla corrosione amplia l'uso dell'HDSS in ambienti più corrosivi da cloruri, come gli ambienti marini.
La corrosione indotta da microrganismi (MIC) è un problema importante in molti settori industriali come quello petrolifero e del gas e quello delle aziende idriche14. La MIC rappresenta il 20% di tutti i danni da corrosione15. La MIC è una corrosione bioelettrochimica che può essere osservata in molti ambienti. I biofilm che si formano sulle superfici metalliche alterano le condizioni elettrochimiche, influenzando così il processo di corrosione. Si ritiene generalmente che la corrosione da MIC sia causata dai biofilm. I microrganismi elettrogeni corrodono i metalli per ottenere l'energia necessaria alla loro sopravvivenza17. Recenti studi sulla MIC hanno dimostrato che il trasferimento di elettroni extracellulari (EET) è il fattore limitante nella MIC indotta da microrganismi elettrogeni. Zhang et al. 18 hanno dimostrato che i mediatori di elettroni accelerano il trasferimento di elettroni tra le cellule di Desulfovibrio sessificans e l'acciaio inossidabile 304, portando a un attacco MIC più grave. Enning et al. 19 e Venzlaff et al. 20 hanno dimostrato che i biofilm di batteri solfato-riduttori (SRB) corrosivi possono assorbire direttamente elettroni dai substrati metallici, provocando una grave corrosione per vaiolatura.
È noto che il DSS è suscettibile alla MIC in ambienti contenenti SRB, batteri ferro-riduttori (IRB), ecc. 21. Questi batteri causano vaiolatura localizzata sulle superfici del DSS sotto i biofilm22,23. A differenza del DSS, la MIC dell'HDSS24 è poco conosciuta.
Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram-negativo mobile a forma di bastoncello ampiamente diffuso in natura25. Pseudomonas aeruginosa è anche un importante gruppo microbico nell'ambiente marino, causando corrosione indotta da microincrostazioni (MIC) sull'acciaio. Pseudomonas è strettamente coinvolto nei processi di corrosione ed è riconosciuto come un colonizzatore pioniere durante la formazione del biofilm. Mahat et al. 28 e Yuan et al. 29 hanno dimostrato che Pseudomonas aeruginosa ha la tendenza ad aumentare il tasso di corrosione dell'acciaio dolce e delle leghe in ambienti acquosi.
L'obiettivo principale di questo lavoro era quello di studiare le proprietà di corrosione indotta da microincrostazioni (MIC) dell'acciaio inossidabile ad alta densità 2707 causata dal batterio marino aerobico Pseudomonas aeruginosa, utilizzando metodi elettrochimici, tecniche di analisi superficiale e analisi dei prodotti di corrosione. Sono stati condotti studi elettrochimici, tra cui il potenziale a circuito aperto (OCP), la resistenza di polarizzazione lineare (LPR), la spettroscopia di impedenza elettrochimica (EIS) e la polarizzazione dinamica del potenziale, per studiare il comportamento MIC dell'acciaio inossidabile ad alta densità 2707. È stata eseguita un'analisi mediante spettrometro a dispersione di energia (EDS) per individuare gli elementi chimici presenti sulla superficie corrosa. Inoltre, è stata utilizzata l'analisi mediante spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) per determinare la stabilità della passivazione del film di ossido sotto l'influenza di un ambiente marino contenente Pseudomonas aeruginosa. La profondità delle pitting è stata misurata mediante microscopio confocale a scansione laser (CLSM).
La Tabella 1 elenca la composizione chimica dell'acciaio inossidabile HDSS 2707. La Tabella 2 mostra che l'acciaio inossidabile HDSS 2707 possiede eccellenti proprietà meccaniche con una resistenza allo snervamento di 650 MPa. La Figura 1 mostra la microstruttura ottica dell'acciaio inossidabile HDSS 2707 trattato termicamente in soluzione. Nella microstruttura, contenente circa il 50% di austenite e il 50% di ferrite, si possono osservare bande allungate di fasi di austenite e ferrite senza fasi secondarie.
La Figura 2a mostra i dati del potenziale a circuito aperto (Eocp) in funzione del tempo di esposizione per 2707 HDSS in terreno abiotico 2216E e brodo di P. aeruginosa per 14 giorni a 37 °C. Mostra che il cambiamento più grande e significativo di Eocp si verifica entro le prime 24 ore. I valori di Eocp in entrambi i casi hanno raggiunto il picco a -145 mV (vs. SCE) intorno alle 16 ore e poi sono diminuiti bruscamente, raggiungendo -477 mV (vs. SCE) e -236 mV (vs. SCE) rispettivamente per il campione abiotico e P. aeruginosa. rispettivamente, i campioni di Pseudomonas aeruginosa. Dopo 24 ore, il valore di Eocp di 2707 HDSS per P. aeruginosa era relativamente stabile a -228 mV (vs. SCE), mentre il valore corrispondente per i campioni non biologici era di circa -442 mV (vs. SCE). L'Eocp in presenza di P. aeruginosa era piuttosto basso.
Test elettrochimici di 2707 campioni di HDSS in terreno abiotico e brodo di Pseudomonas aeruginosa a 37 °C:
(a) Eocp in funzione del tempo di esposizione, (b) curve di polarizzazione al giorno 14, (c) Rp in funzione del tempo di esposizione e (d) icorr in funzione del tempo di esposizione.
La Tabella 3 elenca i valori dei parametri di corrosione elettrochimica di 2707 campioni HDSS esposti a mezzo abiotico e a mezzo inoculato con Pseudomonas aeruginosa per 14 giorni. Le tangenti delle curve anodica e catodica sono state estrapolate per arrivare alle intersezioni che forniscono la densità di corrente di corrosione (icorr), il potenziale di corrosione (Ecorr) e le pendenze di Tafel (βα e βc) secondo i metodi standard30,31.
Come mostrato nella Figura 2b, lo spostamento verso l'alto della curva di P. aeruginosa ha determinato un aumento di Ecorr rispetto alla curva abiotica. Il valore di icorr, che è proporzionale alla velocità di corrosione, è aumentato a 0,328 μA cm-2 nel campione di Pseudomonas aeruginosa, quattro volte quello del campione non biologico (0,087 μA cm-2).
LPR è un classico metodo elettrochimico non distruttivo per l'analisi rapida della corrosione. È stato utilizzato anche per studiare MIC32. La Figura 2c mostra la resistenza di polarizzazione (Rp) in funzione del tempo di esposizione. Un valore di Rp più elevato indica una minore corrosione. Entro le prime 24 ore, la Rp di 2707 HDSS ha raggiunto un valore massimo di 1955 kΩ cm2 per i campioni abiotici e 1429 kΩ cm2 per i campioni di Pseudomonas aeruginosa. La Figura 2c mostra anche che il valore di Rp è diminuito rapidamente dopo un giorno ed è poi rimasto relativamente invariato per i successivi 13 giorni. Il valore di Rp del campione di Pseudomonas aeruginosa è di circa 40 kΩ cm2, che è molto inferiore al valore di 450 kΩ cm2 del campione non biologico.
Il valore icorr è proporzionale al tasso di corrosione uniforme. Il suo valore può essere calcolato dalla seguente equazione di Stern-Geary,
Seguendo Zou et al. 33, in questo lavoro è stato assunto un valore tipico della pendenza di Tafel B pari a 26 mV/dec. La Figura 2d mostra che l'icorr del campione non biologico 2707 è rimasto relativamente stabile, mentre il campione di P. aeruginosa ha subito forti fluttuazioni dopo le prime 24 ore. I valori di icorr dei campioni di P. aeruginosa erano di un ordine di grandezza superiori rispetto ai controlli non biologici. Questa tendenza è coerente con i risultati della resistenza di polarizzazione.
L'EIS è un'altra tecnica non distruttiva utilizzata per caratterizzare le reazioni elettrochimiche alle interfacce corrose. Spettri di impedenza e valori di capacità calcolati di campioni esposti a mezzi abiotici e soluzione di Pseudomonas aeruginosa, resistenza Rb del film passivo/biofilm formatosi sulla superficie del campione, resistenza di trasferimento di carica Rct, capacità del doppio strato elettrico (EDL) Cdl e parametri dell'elemento a fase costante (CPE) QCPE. Questi parametri sono stati ulteriormente analizzati adattando i dati utilizzando un modello di circuito equivalente (EEC).
La Figura 3 mostra i tipici diagrammi di Nyquist (a e b) e i diagrammi di Bode (a' e b') di 2707 campioni HDSS in mezzo abiotico e brodo di P. aeruginosa per diversi tempi di incubazione. Il diametro dell'anello di Nyquist diminuisce in presenza di Pseudomonas aeruginosa. Il diagramma di Bode (Fig. 3b') mostra un aumento dell'ampiezza dell'impedenza totale. Le informazioni sulla costante di tempo di rilassamento possono essere fornite dai massimi di fase. La Figura 4 mostra le strutture fisiche basate su monostrato (a) e doppio strato (b) e i loro corrispondenti EEC. Il CPE è introdotto nel modello EEC. La sua ammettenza e impedenza sono espresse come segue:
Due modelli fisici e i corrispondenti circuiti equivalenti per l'adattamento dello spettro di impedenza del campione 2707 HDSS:
dove Y0 è l'ampiezza del CPE, j è il numero immaginario o (-1)1/2, ω è la frequenza angolare e n è l'indice di potenza del CPE inferiore all'unità35. L'inverso della resistenza al trasferimento di carica (ovvero 1/Rct) corrisponde alla velocità di corrosione. Un Rct minore significa una velocità di corrosione più rapida27. Dopo 14 giorni di incubazione, l'Rct dei campioni di Pseudomonas aeruginosa ha raggiunto 32 kΩ cm2, molto inferiore ai 489 kΩ cm2 dei campioni non biologici (Tabella 4).
Le immagini CLSM e SEM nella Figura 5 mostrano chiaramente che la copertura del biofilm sulla superficie del campione 2707 HDSS dopo 7 giorni è densa. Tuttavia, dopo 14 giorni, la copertura del biofilm era rada e sono comparse alcune cellule morte. La Tabella 5 mostra lo spessore del biofilm sui campioni 2707 HDSS dopo l'esposizione a P. aeruginosa per 7 e 14 giorni. Lo spessore massimo del biofilm è passato da 23,4 μm dopo 7 giorni a 18,9 μm dopo 14 giorni. Anche lo spessore medio del biofilm ha confermato questa tendenza. È diminuito da 22,2 ± 0,7 μm dopo 7 giorni a 17,8 ± 1,0 μm dopo 14 giorni.
(a) Immagine CLSM 3D dopo 7 giorni, (b) Immagine CLSM 3D dopo 14 giorni, (c) Immagine SEM dopo 7 giorni e (d) Immagine SEM dopo 14 giorni.
L'analisi EDS ha rivelato elementi chimici nei biofilm e nei prodotti di corrosione su campioni esposti a P. aeruginosa per 14 giorni. La Figura 6 mostra che il contenuto di C, N, O e P nei biofilm e nei prodotti di corrosione è molto più elevato rispetto a quello nei metalli nudi, poiché questi elementi sono associati ai biofilm e ai loro metaboliti. I microbi necessitano solo di tracce di cromo e ferro. Gli alti livelli di Cr e Fe nei biofilm e nei prodotti di corrosione sulla superficie dei campioni indicano che la matrice metallica ha perso elementi a causa della corrosione.
Dopo 14 giorni, è stata osservata la formazione di pitting con e senza P. aeruginosa nel terreno 2216E. Prima dell'incubazione, la superficie del campione era liscia e priva di difetti (Fig. 7a). Dopo l'incubazione e la rimozione del biofilm e dei prodotti di corrosione, i pitting più profondi sulla superficie dei campioni sono stati esaminati al microscopio confocale a scansione laser (CLSM), come mostrato nelle Figure 7b e c. Non sono stati trovati pitting evidenti sulla superficie dei campioni di controllo non biologici (profondità massima del pitting 0,02 μm). La profondità massima del pitting causata da Pseudomonas aeruginosa è stata di 0,52 μm dopo 7 giorni e 0,69 μm dopo 14 giorni, sulla base della profondità massima media del pitting di 3 campioni (sono stati selezionati 10 valori di profondità massima del pitting per ciascun campione) ha raggiunto rispettivamente 0,42 ± 0,12 μm e 0,52 ± 0,15 μm (Tabella 5). Questi pitting I valori di profondità sono piccoli ma importanti.
(a) Prima dell'esposizione, (b) 14 giorni in mezzo abiotico e (c) 14 giorni in brodo di Pseudomonas aeruginosa.
La Figura 8 mostra gli spettri XPS di diverse superfici del campione e le composizioni chimiche analizzate per ciascuna superficie sono riassunte nella Tabella 6. Nella Tabella 6, le percentuali atomiche di Fe e Cr in presenza di P. aeruginosa (campioni A e B) erano molto inferiori a quelle dei campioni di controllo non biologici (campioni C e D). Per il campione di P. aeruginosa, la curva spettrale del livello di core Cr 2p è stata adattata a quattro componenti di picco con valori di energia di legame (BE) di 574,4, 576,6, 578,3 e 586,8 eV, che possono essere attribuiti rispettivamente a Cr, Cr2O3, CrO3 e Cr(OH)3 (Fig. 9a e b). Per i campioni non biologici, lo spettro del livello di core Cr 2p contiene due picchi principali per Cr (573,80 eV per BE) e Cr2O3 (575,90 eV per BE) nelle figure 9c e 9d, rispettivamente. La differenza più evidente tra i campioni abiotici e quelli di P. aeruginosa era la presenza di Cr6+ e una frazione relativa più elevata di Cr(OH)3 (BE di 586,8 eV) al di sotto del biofilm.
Gli spettri XPS ad ampio raggio della superficie del campione 2707 HDSS nei due mezzi sono rispettivamente di 7 e 14 giorni.
(a) 7 giorni di esposizione a P. aeruginosa, (b) 14 giorni di esposizione a P. aeruginosa, (c) 7 giorni in mezzo abiotico e (d) 14 giorni in mezzo abiotico.
L'HDSS presenta elevati livelli di resistenza alla corrosione nella maggior parte degli ambienti. Kim et al. 2 hanno riportato che l'HDSS UNS S32707 è stato definito come un DSS altamente legato con un PREN superiore a 45. Il valore PREN del campione di HDSS 2707 in questo lavoro era 49. Ciò è dovuto al suo elevato contenuto di cromo e agli alti livelli di molibdeno e nichel, che sono vantaggiosi in ambienti acidi e ad alto contenuto di cloruri. Inoltre, una composizione ben bilanciata e una microstruttura priva di difetti sono utili per la stabilità strutturale e la resistenza alla corrosione. Tuttavia, nonostante la sua eccellente resistenza chimica, i dati sperimentali in questo lavoro suggeriscono che l'HDSS 2707 non è completamente immune alla MIC dei biofilm di P. aeruginosa.
I risultati elettrochimici hanno mostrato che il tasso di corrosione dell'HDSS 2707 nel brodo di P. aeruginosa è aumentato significativamente dopo 14 giorni rispetto al mezzo non biologico. Nella Figura 2a, è stata osservata una riduzione dell'Eocp sia nel mezzo abiotico che nel brodo di P. aeruginosa durante le prime 24 ore. Successivamente, il biofilm ha completato la copertura della superficie del campione e l'Eocp diventa relativamente stabile36. Tuttavia, il livello di Eocp biologico era molto più alto di quello di Eocp non biologico. C'è motivo di credere che questa differenza sia dovuta alla formazione del biofilm di P. aeruginosa. Nella Fig. 2d, in presenza di P. aeruginosa, il valore icorr dell'HDSS 2707 ha raggiunto 0,627 μA cm-2, che era un ordine di grandezza superiore a quello del controllo abiotico (0,063 μA cm-2), che era coerente con il valore Rct misurato da EIS. Nei primi giorni, i valori di impedenza nel brodo di P. aeruginosa sono aumentati a causa dell'adesione delle cellule di P. aeruginosa e della formazione di biofilm. Tuttavia, quando il biofilm ricopre completamente la superficie del campione, l'impedenza diminuisce. Lo strato protettivo viene attaccato per primo a causa della formazione di biofilm e metaboliti del biofilm. Pertanto, la resistenza alla corrosione è diminuita nel tempo e l'adesione di P. aeruginosa ha causato corrosione localizzata. Le tendenze nei mezzi abiotici sono state diverse. La resistenza alla corrosione del controllo non biologico è stata molto più alta del valore corrispondente dei campioni esposti al brodo di P. aeruginosa. Inoltre, per i campioni abiotici, il valore Rct dell'HDSS 2707 ha raggiunto 489 kΩ cm2 al giorno 14, che era 15 volte il valore Rct (32 kΩ cm2) in presenza di P. aeruginosa. Pertanto, l'HDSS 2707 ha un'eccellente resistenza alla corrosione in un ambiente sterile, ma non è resistente all'attacco MIC da parte dei biofilm di P. aeruginosa.
Questi risultati possono essere osservati anche dalle curve di polarizzazione in Fig. 2b. La ramificazione anodica è stata attribuita alla formazione del biofilm di Pseudomonas aeruginosa e alle reazioni di ossidazione del metallo. Allo stesso tempo, la reazione catodica è la riduzione dell'ossigeno. La presenza di P. aeruginosa ha aumentato notevolmente la densità di corrente di corrosione, circa un ordine di grandezza superiore al controllo abiotico. Ciò indica che il biofilm di P. aeruginosa aumenta la corrosione localizzata dell'HDSS 2707. Yuan et al.29 hanno scoperto che la densità di corrente di corrosione della lega Cu-Ni 70/30 aumentava sotto la sfida del biofilm di P. aeruginosa. Ciò potrebbe essere dovuto alla biocatalisi della riduzione dell'ossigeno da parte dei biofilm di Pseudomonas aeruginosa. Questa osservazione potrebbe anche spiegare il MIC dell'HDSS 2707 in questo lavoro. I biofilm aerobici potrebbero anche avere meno ossigeno al di sotto di essi. Pertanto, il mancato ripristino della passivazione della superficie metallica da parte dell'ossigeno potrebbe essere un fattore che contribuisce al MIC in questo lavoro.
Dickinson et al. 38 hanno suggerito che i tassi delle reazioni chimiche ed elettrochimiche possono essere influenzati direttamente dall'attività metabolica dei batteri sessili sulla superficie del campione e dalla natura dei prodotti di corrosione. Come mostrato nella Figura 5 e nella Tabella 5, sia il numero di cellule che lo spessore del biofilm sono diminuiti dopo 14 giorni. Ciò può essere ragionevolmente spiegato dal fatto che dopo 14 giorni, la maggior parte delle cellule sessili sulla superficie dell'HDSS 2707 è morta a causa dell'esaurimento dei nutrienti nel mezzo 2216E o del rilascio di ioni metallici tossici dalla matrice HDSS 2707. Questa è una limitazione degli esperimenti in batch.
In questo lavoro, il biofilm di P. aeruginosa ha promosso l'esaurimento locale di Cr e Fe sotto il biofilm sulla superficie 2707 HDSS (Fig. 6). Nella Tabella 6, la riduzione di Fe e Cr nel campione D rispetto al campione C, indica che Fe e Cr disciolti causati dal biofilm di P. aeruginosa sono persistiti oltre i primi 7 giorni. Il mezzo 2216E viene utilizzato per simulare ambienti marini. Contiene 17700 ppm di Cl-, che è paragonabile a quello trovato nell'acqua di mare naturale. La presenza di 17700 ppm di Cl- è stata la ragione principale della riduzione di Cr nei campioni abiotici di 7 e 14 giorni analizzati mediante XPS. Rispetto ai campioni di P. aeruginosa, la dissoluzione di Cr nei campioni abiotici è stata molto minore a causa della forte resistenza al Cl− del 2707 HDSS in ambienti abiotici. La Figura 9 mostra la presenza di Cr6+ nel film di passivazione. Può essere coinvolti nella rimozione del Cr dalle superfici in acciaio da parte dei biofilm di P. aeruginosa, come suggerito da Chen e Clayton.
A causa della crescita batterica, i valori di pH del terreno prima e dopo la coltivazione erano rispettivamente 7,4 e 8,2. Pertanto, al di sotto del biofilm di P. aeruginosa, è improbabile che la corrosione da acidi organici sia un fattore determinante in questo lavoro, a causa del pH relativamente elevato nel terreno di coltura. Il pH del terreno di controllo non biologico non è cambiato in modo significativo (da un valore iniziale di 7,4 a un valore finale di 7,5) durante il periodo di prova di 14 giorni. L'aumento del pH nel terreno di inoculazione dopo l'incubazione è stato dovuto all'attività metabolica di P. aeruginosa e si è riscontrato che ha lo stesso effetto sul pH anche in assenza di strisce reattive.
Come mostrato nella Figura 7, la profondità massima delle cavità causate dal biofilm di P. aeruginosa era di 0,69 μm, molto maggiore di quella del mezzo abiotico (0,02 μm). Ciò è coerente con i dati elettrochimici descritti in precedenza. La profondità delle cavità di 0,69 μm è più di dieci volte inferiore al valore di 9,5 μm riportato per il 2205 DSS nelle stesse condizioni. Questi dati dimostrano che il 2707 HDSS presenta una migliore resistenza al MIC rispetto al 2205 DSS. Ciò non dovrebbe sorprendere, poiché il 2707 HDSS ha un contenuto di cromo più elevato, che fornisce una passivazione più duratura, grazie alla struttura di fase bilanciata senza precipitati secondari dannosi, rendendo più difficile per P. aeruginosa la depassivazione e l'inizio dell'eclissi dei punti.
In conclusione, è stata riscontrata la presenza di vaiolatura da MIC sulla superficie dell'acciaio inossidabile ad alta densità 2707 in brodo di coltura di P. aeruginosa, a differenza della vaiolatura trascurabile osservata in ambiente abiotico. Questo studio dimostra che l'acciaio inossidabile ad alta densità 2707 presenta una migliore resistenza alla MIC rispetto all'acciaio inossidabile duplex 2205, ma non è completamente immune alla MIC dovuta al biofilm di P. aeruginosa. Questi risultati sono utili per la selezione di acciai inossidabili idonei e per la stima della durata di servizio in ambiente marino.
Il campione di acciaio inossidabile ad alta densità 2707 è fornito dalla Facoltà di Metallurgia della Northeastern University (NEU) di Shenyang, Cina. La composizione elementare dell'acciaio inossidabile ad alta densità 2707 è riportata nella Tabella 1, analizzata dal Dipartimento di Analisi e Test dei Materiali della NEU. Tutti i campioni sono stati sottoposti a trattamento termico di solubilizzazione a 1180 °C per 1 ora. Prima del test di corrosione, i campioni di acciaio inossidabile ad alta densità 2707 a forma di moneta, con una superficie superiore esposta di 1 cm², sono stati lucidati con carta abrasiva al carburo di silicio fino a grana 2000 e ulteriormente lucidati con una sospensione di polvere di Al₂O₃ da 0,05 μm. I lati e il fondo sono protetti da vernice inerte. Dopo l'asciugatura, i campioni sono stati risciacquati con acqua deionizzata sterile e sterilizzati con etanolo al 75% (v/v) per 0,5 ore. Sono stati quindi asciugati all'aria sotto luce ultravioletta (UV) per 0,5 ore prima dell'uso.
Il ceppo marino di Pseudomonas aeruginosa MCCC 1A00099 è stato acquistato dal Centro di raccolta di colture marine di Xiamen (MCCC), Cina. Pseudomonas aeruginosa è stato coltivato in condizioni aerobiche a 37 °C in fiasche da 250 ml e celle di vetro elettrochimiche da 500 ml utilizzando il terreno liquido Marine 2216E (Qingdao Hope Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, Cina). Terreno (g/L): 19,45 NaCl, 5,98 MgCl2, 3,24 Na2SO4, 1,8 CaCl2, 0,55 KCl, 0,16 Na2CO3, 0,08 KBr, 0,034 SrCl2, 0,08 SrBr2, 0,022 H3BO3, 0,004 NaSiO3, 0,016 NH3, 0,016 NH3, 0,016 NaH2PO4, 5,0 peptone, 1,0 estratto di lievito e 0,1 citrato ferrico. Autoclavare a 121 °C per 20 minuti prima dell'inoculazione. Contare le cellule sessili e planctoniche utilizzando un emocitometro al microscopio ottico con ingrandimento 400X. La concentrazione cellulare iniziale di Pseudomonas aeruginosa planctonica immediatamente dopo l'inoculazione era di circa 10⁶ cellule/ml.
Test elettrochimici sono stati eseguiti in una classica cella di vetro a tre elettrodi con un volume medio di 500 ml. Una lamina di platino e un elettrodo a calomelano saturo (SCE) sono stati collegati al reattore tramite capillari di Luggin riempiti con ponti salini, fungendo rispettivamente da controelettrodo e elettrodo di riferimento. Per realizzare gli elettrodi di lavoro, un filo di rame rivestito di gomma è stato fissato a ciascun campione e ricoperto con resina epossidica, lasciando circa 1 cm2 di superficie esposta su un solo lato per l'elettrodo di lavoro. Durante le misurazioni elettrochimiche, i campioni sono stati posti in mezzo 2216E e mantenuti a una temperatura di incubazione costante (37 °C) in un bagno d'acqua. I dati OCP, LPR, EIS e di polarizzazione dinamica del potenziale sono stati misurati utilizzando un potenziostato Autolab (Reference 600TM, Gamry Instruments, Inc., USA). I ​​test LPR sono stati registrati a una velocità di scansione di 0,125 mV s-1 nell'intervallo tra -5 e 5 mV con Eocp e una frequenza di campionamento di 1 Hz. L'EIS è stato eseguito con un onda sinusoidale nell'intervallo di frequenza da 0,01 a 10.000 Hz utilizzando una tensione applicata di 5 mV allo stato stazionario Eocp. Prima della scansione del potenziale, gli elettrodi erano in modalità a circuito aperto fino al raggiungimento di un valore stabile del potenziale di corrosione libera. Le curve di polarizzazione sono state quindi eseguite da -0,2 a 1,5 V rispetto a Eocp con una velocità di scansione di 0,166 mV/s. Ogni test è stato ripetuto 3 volte con e senza P. aeruginosa.
I campioni per l'analisi metallografica sono stati lucidati meccanicamente con carta abrasiva al SiC a grana 2000 bagnata e successivamente ulteriormente lucidati con sospensione di polvere di Al2O3 da 0,05 μm per l'osservazione ottica. L'analisi metallografica è stata eseguita utilizzando un microscopio ottico. I campioni sono stati incisi con una soluzione di idrossido di potassio al 10% in peso 43.
Dopo l'incubazione, i campioni sono stati lavati 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,4 ± 0,2) e quindi fissati con glutaraldeide al 2,5% (v/v) per 10 ore per fissare i biofilm. Successivamente sono stati disidratati con una serie graduata (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100% v/v) di etanolo prima dell'asciugatura all'aria. Infine, la superficie del campione è stata ricoperta con un film d'oro per fornire conduttività per l'osservazione SEM. Le immagini SEM sono state focalizzate sui punti con le cellule di P. aeruginosa più sessili sulla superficie di ciascun campione. Eseguire un'analisi EDS per trovare gli elementi chimici. Un microscopio confocale a scansione laser Zeiss (CLSM) (LSM 710, Zeiss, Germania) è stato utilizzato per misurare la profondità delle fosse. Al fine di osservare le fosse di corrosione sotto il biofilm, il test Il campione è stato innanzitutto pulito secondo lo standard nazionale cinese (CNS) GB/T4334.4-2000 per rimuovere i prodotti di corrosione e il biofilm presenti sulla sua superficie.
L'analisi mediante spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS, sistema di analisi di superficie ESCALAB250, Thermo VG, USA) è stata eseguita utilizzando una sorgente di raggi X monocromatica (linea Kα dell'alluminio a 1500 eV di energia e 150 W di potenza) su un ampio intervallo di energia di legame da 0 a 1350 eV in condizioni standard. Gli spettri ad alta risoluzione sono stati registrati utilizzando un'energia di passaggio di 50 eV e un passo di 0,2 eV.
I campioni incubati sono stati rimossi e risciacquati delicatamente con PBS (pH 7,4 ± 0,2) per 15 s45. Per osservare la vitalità batterica dei biofilm sui campioni, i biofilm sono stati colorati utilizzando il kit LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Invitrogen, Eugene, OR, USA). Il kit contiene due coloranti fluorescenti: un colorante fluorescente verde SYTO-9 e un colorante fluorescente rosso ioduro di propidio (PI). Al microscopio confocale a scansione laser (CLSM), i punti fluorescenti verdi e rossi rappresentano rispettivamente le cellule vive e morte. Per la colorazione, una miscela di 1 ml contenente 3 μl di soluzione di SYTO-9 e 3 μl di soluzione di PI è stata incubata per 20 minuti a temperatura ambiente (23 °C) al buio. Successivamente, i campioni colorati sono stati osservati a due lunghezze d'onda (488 nm per le cellule vive e 559 nm per le cellule morte) utilizzando un microscopio confocale a scansione laser Nikon (C2 Plus, Nikon, Giappone). Spessore del biofilm è stata misurata in modalità di scansione 3D.
Come citare questo articolo: Li, H. et al. Corrosione microbica dell'acciaio inossidabile super duplex 2707 da parte del biofilm marino di Pseudomonas aeruginosa. science.Rep. 6, 20190; doi: 10.1038/srep20190 (2016).
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