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L'analisi in tracce di campioni liquidi trova ampia applicazione nelle scienze biologiche e nel monitoraggio ambientale. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un fotometro compatto ed economico basato su capillari a guida d'onda metallica (MCC) per la determinazione ultrasensibile dell'assorbimento. Il percorso ottico può essere notevolmente aumentato, superando di gran lunga la lunghezza fisica del MWC, poiché la luce diffusa dalle pareti laterali metalliche lisce e ondulate può essere confinata all'interno del capillare indipendentemente dall'angolo di incidenza. Grazie alla nuova amplificazione ottica non lineare, alla rapida commutazione del campione e al rilevamento del glucosio, è possibile raggiungere concentrazioni fino a 5,12 nM utilizzando reagenti cromogenici comuni.
La fotometria è ampiamente utilizzata per l'analisi in tracce di campioni liquidi grazie all'abbondanza di reagenti cromogenici e dispositivi optoelettronici a semiconduttore disponibili1,2,3,4,5. Rispetto alla determinazione dell'assorbanza tradizionale basata su cuvette, i capillari a guida d'onda liquida (LWC) riflettono la luce (TIR) ​​mantenendo la luce della sonda all'interno del capillare1,2,3,4,5. Tuttavia, senza ulteriori miglioramenti, il percorso ottico è solo vicino alla lunghezza fisica dell'LWC3,6 e l'aumento della lunghezza dell'LWC oltre 1,0 m comporta una forte attenuazione della luce e un alto rischio di bolle, ecc.3, 7. Per quanto riguarda la cella a riflessione multipla proposta per migliorare il percorso ottico, il limite di rilevamento è migliorato solo di un fattore compreso tra 2,5 e 8,9.
Attualmente esistono due tipi principali di LWC, ovvero i capillari in Teflon AF (con un indice di rifrazione di soli ~1,3, inferiore a quello dell'acqua) e i capillari in silice rivestiti con Teflon AF o film metallici1,3,4. Per ottenere la riflessione interna totale (TIR) ​​all'interfaccia tra materiali dielettrici, sono necessari materiali con un basso indice di rifrazione e alti angoli di incidenza della luce3,6,10. Per quanto riguarda i capillari in Teflon AF, il Teflon AF è traspirante grazie alla sua struttura porosa3,11 e può assorbire piccole quantità di sostanze nei campioni d'acqua. Per i capillari in quarzo rivestiti esternamente con Teflon AF o metallo, l'indice di rifrazione del quarzo (1,45) è superiore a quello della maggior parte dei campioni liquidi (ad esempio 1,33 per l'acqua)3,6,12,13. Per i capillari rivestiti internamente con una pellicola metallica, sono state studiate le proprietà di trasporto14,15,16,17,18, ma il processo di rivestimento è complicato e la superficie della pellicola metallica ha una struttura ruvida e porosa4,19.
Inoltre, i LWC commerciali (capillari rivestiti in teflon AF e capillari in silice rivestiti in teflon AF, World Precision Instruments, Inc.) presentano alcuni altri svantaggi, come ad esempio: per i guasti. . L'ampio volume morto del TIR3,10, (2) connettore a T (per collegare capillari, fibre e tubi di ingresso/uscita) può intrappolare bolle d'aria10.
Allo stesso tempo, la determinazione dei livelli di glucosio è di grande importanza per la diagnosi di diabete, cirrosi epatica e malattie mentali20. Esistono molti metodi di rilevamento come la fotometria (inclusa la spettrofotometria 21, 22, 23, 24, 25 e la colorimetria su carta 26, 27, 28), la galvanometria 29, 30, 31, la fluorimetria 32, 33, 34, 35, la polarimetria ottica 36, ​​la risonanza plasmonica di superficie 37, la cavità Fabry-Perot 38, l'elettrochimica 39 e l'elettroforesi capillare 40,41 e così via. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi richiede apparecchiature costose e il rilevamento del glucosio a concentrazioni nanomolari rimane una sfida (ad esempio, per le misurazioni fotometriche21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, la concentrazione più bassa di glucosio). La limitazione era di soli 30 nM quando venivano utilizzate nanoparticelle di blu di Prussia come mimetici della perossidasi). Le analisi del glucosio a livello nanomolare sono spesso necessarie per studi cellulari a livello molecolare come l'inibizione della crescita del cancro alla prostata umano42 e il comportamento di fissazione della CO2 del Prochlorococcus nell'oceano.
In questo articolo, è stato sviluppato un fotometro compatto ed economico basato su un capillare a guida d'onda metallica (MWC), un capillare in acciaio inossidabile SUS316L con superficie interna elettrolucidata, per la determinazione dell'assorbimento ultrasensibile. Poiché la luce può essere intrappolata all'interno dei capillari metallici indipendentemente dall'angolo di incidenza, il percorso ottico può essere notevolmente aumentato dalla diffusione della luce su superfici metalliche ondulate e lisce, ed è molto più lungo della lunghezza fisica del MWC. Inoltre, è stato progettato un semplice connettore a T per la connessione ottica e l'ingresso/uscita del fluido per minimizzare il volume morto ed evitare l'intrappolamento di bolle. Per il fotometro MWC da 7 cm, il limite di rilevamento è migliorato di circa 3000 volte rispetto allo spettrofotometro commerciale con cuvetta da 1 cm grazie al nuovo miglioramento del percorso ottico non lineare e alla rapida commutazione del campione, e può anche raggiungere una concentrazione di rilevamento del glucosio di soli 5,12 nM utilizzando comuni reagenti cromogenici.
Come illustrato nella Figura 1, il fotometro basato su MWC è costituito da un MWC lungo 7 cm con superficie interna elettrolucidata di grado EP, un LED da 505 nm con lente, un fotorivelatore a guadagno regolabile e due uscite per l'accoppiamento ottico e l'ingresso del liquido. Una valvola a tre vie collegata al tubo di ingresso Pike viene utilizzata per commutare il campione in ingresso. Il tubo Peek si adatta perfettamente alla piastra di quarzo e all'MWC, in modo che il volume morto nel connettore a T sia ridotto al minimo, impedendo efficacemente l'intrappolamento di bolle d'aria. Inoltre, il fascio collimato può essere introdotto facilmente ed efficacemente nell'MWC attraverso la piastra di quarzo a T.
Il fascio e il campione liquido vengono introdotti nell'MCC attraverso un raccordo a T, e il fascio che attraversa l'MCC viene ricevuto da un fotorivelatore. Soluzioni in ingresso di campioni colorati o di controllo sono state introdotte alternativamente nell'ICC attraverso una valvola a tre vie. Secondo la legge di Beer, la densità ottica di un campione colorato può essere calcolata dall'equazione 1.10.
dove Vcolor e Vblank sono i segnali di uscita del fotorivelatore quando i campioni di colore e di bianco vengono introdotti nell'MCC, rispettivamente, e Vdark è il segnale di fondo del fotorivelatore quando il LED è spento. La variazione del segnale di uscita ΔV = Vcolor–Vblank può essere misurata commutando i campioni. Secondo l'equazione. Come mostrato in Figura 1, se ΔV è molto più piccolo di Vblank–Vdark, quando si utilizza uno schema di commutazione del campionamento, piccole variazioni in Vblank (ad esempio la deriva) possono avere un effetto minimo sul valore AMWC.
Per confrontare le prestazioni del fotometro basato su MWC con quelle dello spettrofotometro basato su cuvetta, è stata utilizzata una soluzione di inchiostro rosso come campione di colore, data la sua eccellente stabilità cromatica e la buona linearità concentrazione-assorbanza, e acqua deionizzata (DI H2O) come campione di riferimento. Come mostrato nella Tabella 1, sono state preparate diverse soluzioni di inchiostro rosso mediante il metodo di diluizione seriale, utilizzando acqua deionizzata come solvente. La concentrazione relativa del campione 1 (S1), vernice rossa originale non diluita, è stata determinata pari a 1,0. La Figura 2 mostra le fotografie ottiche di 11 campioni di inchiostro rosso (da S4 a S14) con concentrazioni relative (elencate nella Tabella 1) che vanno da 8,0 × 10–3 (a sinistra) a 8,2 × 10–10 (a destra).
I risultati delle misurazioni per il campione 6 sono mostrati nella Figura 3(a). I punti di commutazione tra campioni colorati e campioni bianchi sono indicati nella figura da doppie frecce “↔”. Si può notare che la tensione di uscita aumenta rapidamente quando si passa da campioni colorati a campioni bianchi e viceversa. Vcolor, Vblank e il corrispondente ΔV possono essere ottenuti come mostrato in figura.
(a) Risultati delle misurazioni per il campione 6, (b) campione 9, (c) campione 13 e (d) campione 14 utilizzando un fotometro basato su MWC.
I risultati delle misurazioni per i campioni 9, 13 e 14 sono mostrati rispettivamente nelle Fig. 3(b)-(d). Come mostrato nella Figura 3(d), il ΔV misurato è di soli 5 nV, che è quasi 3 volte il valore del rumore (2 nV). Un piccolo ΔV è difficile da distinguere dal rumore. Pertanto, il limite di rilevamento ha raggiunto una concentrazione relativa di 8,2×10⁻¹⁰ (campione 14). Con l'aiuto delle equazioni. 1. L'assorbanza AMWC può essere calcolata dai valori misurati di Vcolor, Vblank e Vdark. Per un fotorivelatore con un guadagno di 10⁴, Vdark è -0,68 μV. I risultati delle misurazioni per tutti i campioni sono riassunti nella Tabella 1 e possono essere trovati nel materiale supplementare. Come mostrato nella Tabella 1, l'assorbanza trovata ad alte concentrazioni si satura, quindi l'assorbanza superiore a 3,7 non può essere misurata con spettrometri basati su MWC.
Per confronto, è stato misurato anche un campione di inchiostro rosso con uno spettrofotometro e l'assorbanza misurata con Acuvette è mostrata nella Figura 4. I valori di Acuvette a 505 nm (come mostrato nella Tabella 1) sono stati ottenuti facendo riferimento alle curve dei campioni 10, 11 o 12 (come mostrato nell'inserto della Figura 4) come linea di base. Come mostrato, il limite di rilevamento ha raggiunto una concentrazione relativa di 2,56 x 10⁻⁶ (campione 9) poiché le curve di assorbimento dei campioni 10, 11 e 12 erano indistinguibili tra loro. Pertanto, utilizzando il fotometro basato su MWC, il limite di rilevamento è stato migliorato di un fattore 3125 rispetto allo spettrofotometro basato su cuvetta.
La dipendenza dell'assorbimento dalla concentrazione è presentata in Figura 5. Per le misurazioni in cuvetta, l'assorbanza è proporzionale alla concentrazione dell'inchiostro a una lunghezza del percorso di 1 cm. Al contrario, per le misurazioni basate su MWC, è stato osservato un aumento non lineare dell'assorbanza a basse concentrazioni. Secondo la legge di Beer, l'assorbanza è proporzionale alla lunghezza del percorso ottico, quindi il guadagno di assorbimento AEF (definito come AEF = AMWC/Acuvetta alla stessa concentrazione di inchiostro) è il rapporto tra MWC e la lunghezza del percorso ottico della cuvetta. Come mostrato in Figura 5, ad alte concentrazioni, la costante AEF è intorno a 7,0, il che è ragionevole poiché la lunghezza di MWC è esattamente 7 volte la lunghezza di una cuvetta da 1 cm. Tuttavia, a basse concentrazioni (concentrazione correlata <1,28 × 10⁻⁵), l'AEF aumenta con la diminuzione della concentrazione e raggiungerebbe un valore di 803 a una concentrazione correlata di 8,2 × 10⁻¹⁰ estrapolando la curva della misurazione basata sulla cuvetta. Tuttavia, a basse concentrazioni (concentrazione correlata <1,28 × 10⁻⁵), l'AEF aumenta con la diminuzione della concentrazione e raggiungerebbe un valore di 803 a una concentrazione correlata di 8,2 × 10⁻¹⁰ estrapolando la curva della misurazione basata sulla cuvetta. Uno dei pochi concentrari (concentrazione <1,28 × 10–5) AEF viene visualizzato con l'aggiornamento concentrazione e possibilità di distribuzione dimensione 803 su un concentratore esterno 8,2 × 10–10 su un'area di osservazione separata sui tappetini aperti. Tuttavia, a basse concentrazioni (concentrazione relativa <1,28 × 10–5), l'AEF aumenta con la diminuzione della concentrazione e può raggiungere un valore di 803 a una concentrazione relativa di 8,2 × 10–10 quando estrapolato da una curva di misurazione basata su cuvetta.然而,在低浓度（相关浓度<1.28 × 10-5）下,AEF随着浓度的降低而增加 ，并且通过外推基于比色皿的测量曲线，在相关浓度为8.2 × 10-10时将达到803 的值.然而, 在 低 浓度 （相关 浓度 <1.28 × 10-5）, ， AEF 随着 的 降低 而, 并且 通过 外推 基于比色皿 测量 曲线, 在 浓度 8.2 × 10-10 时 达到 达到 达到 达到 达到 803 值. Uno o più concentratori di piccole dimensioni (concentratori rilevanti < 1,28 × 10-5) АЭП viene visualizzato con l'impostazione concentrazione e altre parti superiori osservazione di piccole dimensioni su un tavolo di legno distribuito su un contenitore esterno 8,2 × 10–10 803 . Tuttavia, a basse concentrazioni (concentrazioni rilevanti < 1,28 × 10⁻⁵) l'AED aumenta con la diminuzione della concentrazione e, se estrapolato da una curva di misurazione basata su cuvetta, raggiunge un valore di concentrazione relativa di 8,2 × 10⁻¹⁰ 803.Ciò si traduce in un percorso ottico corrispondente di 803 cm (AEF × 1 cm), che è molto più lungo della lunghezza fisica del MWC e persino più lungo del più lungo LWC disponibile in commercio (500 cm di World Precision Instruments, Inc.). Doko Engineering LLC ne ha uno lungo 200 cm. Questo aumento non lineare dell'assorbimento nel LWC non era stato precedentemente segnalato.
Le figure 6(a)-(c) mostrano rispettivamente un'immagine ottica, un'immagine al microscopio e un'immagine ottenuta con un profilometro ottico della superficie interna della sezione MWC. Come mostrato in figura 6(a), la superficie interna è liscia e lucida, riflette la luce visibile ed è altamente riflettente. Come mostrato in figura 6(b), a causa della deformabilità e della natura cristallina del metallo, sulla superficie liscia compaiono piccole mesostrutture e irregolarità. Considerata la piccola area (<5 μm×5 μm), la rugosità della maggior parte della superficie è inferiore a 1,2 nm (Fig. 6(c)). Considerata la piccola area (<5 μm×5 μm), la rugosità della maggior parte della superficie è inferiore a 1,2 nm (Fig. 6(c)). La dimensione minima (<5 mm×5 mm) è di circa 1,2 miglia (ris. 6(в)). A causa della piccola area (<5 µm×5 µm), la rugosità della maggior parte della superficie è inferiore a 1,2 nm (Fig. 6(c)).考虑到小面积（<5 μm×5 μm）,大多数表面的粗糙度小于1.2 nm（图6（c））.考虑到小面积（<5 μm×5 μm）,大多数表面的粗糙度小于1.2 nm（图6（c））. Учитывая небольшую площадь (<5 мкм × 5 мкм), шероховатость большинства поверхностей составляет менее 1,2 nm (рис. 6(в)). Considerando la piccola area (<5 µm × 5 µm), la rugosità della maggior parte delle superfici è inferiore a 1,2 nm (Fig. 6(c)).
(a) Immagine ottica, (b) immagine al microscopio e (c) immagine ottica della superficie interna del taglio MWC.
Come mostrato in fig. 7(a), il percorso ottico LOP nel capillare è determinato dall'angolo di incidenza θ (LOP = LC/sinθ, dove LC è la lunghezza fisica del capillare). Per i capillari AF in Teflon riempiti con H2O DI, l'angolo di incidenza deve essere maggiore dell'angolo critico di 77,8°, quindi il LOP è inferiore a 1,02 × LC senza ulteriori miglioramenti3,6. Mentre, con MWC, il confinamento della luce all'interno del capillare è indipendente dall'indice di rifrazione o dall'angolo di incidenza, quindi al diminuire dell'angolo di incidenza, il percorso della luce può essere molto più lungo della lunghezza del capillare (LOP » LC). Come mostrato in fig. 7(b), la superficie metallica corrugata può indurre la diffusione della luce, che può aumentare notevolmente il percorso ottico.
Pertanto, per MWC esistono due percorsi luminosi: la luce diretta senza riflessione (LOP = LC) e la luce a dente di sega con riflessioni multiple tra le pareti laterali (LOP » LC). Secondo la legge di Beer, l'intensità della luce trasmessa diretta e a zigzag può essere espressa rispettivamente come PS×exp(-α×LC) e PZ×exp(-α×LOP), dove la costante α è il coefficiente di assorbimento, che dipende interamente dalla concentrazione dell'inchiostro.
Per inchiostri ad alta concentrazione (ad esempio, concentrazione relativa >1,28 × 10⁻⁵), la luce a zigzag è fortemente attenuata e la sua intensità è molto inferiore a quella della luce rettilinea, a causa dell'elevato coefficiente di assorbimento e del suo percorso ottico molto più lungo. Per inchiostri ad alta concentrazione (ad esempio, concentrazione relativa >1,28 × 10⁻⁵), la luce a zigzag è fortemente attenuata e la sua intensità è molto inferiore a quella della luce rettilinea, a causa dell'elevato coefficiente di assorbimento e del suo percorso ottico molto più lungo. Per il cerchio con un concentratore alto (esempio: concentratore esterno >1,28 × 10-5) colore beige si siede, e io l'intensità del nome non c'è, perché c'è un bel po' di amore, è una grande quantità di caffè e di cottura più grande ottico излучения. Per inchiostri ad alta concentrazione (ad esempio, concentrazione relativa >1,28×10⁻⁵), la luce a zigzag viene fortemente attenuata e la sua intensità è molto inferiore a quella della luce diretta a causa dell'elevato coefficiente di assorbimento e della maggiore emissione ottica.traccia.对于高浓度墨水（例如,相关浓度>1.28×10-5）,Z字形光衰减很大,其强度远低于直光,这是由于吸收系数大,光学时间更长.对于 高浓度 墨水 （例如 ， 浓度 浓度> 1.28 × 10-5） ， z 字形 衰减 很 大 ， 强度 远 低于 直光,这 是 吸收 系数 大 光学 时间 更。。。 长 长 长 长 长 长 长 长 长 长 长 长 长Per il cerchio con un concentratore alto (esempio, concentratore rilevante >1,28×10-5) rosso satinato l'ossessione fondamentale e l'ego l'intensità non è buona, perché c'è un ottimo rapporto qualità-prezzo per una grande quantità di caffè e bevande tempo ottico prolungato. Per inchiostri ad alta concentrazione (ad esempio, concentrazioni rilevanti >1,28×10⁻⁵), la luce a zigzag viene notevolmente attenuata e la sua intensità è molto inferiore a quella della luce diretta a causa dell'elevato coefficiente di assorbimento e del tempo ottico più lungo.stradina.Pertanto, la luce diretta ha dominato la determinazione dell'assorbanza (LOP=LC) e l'AEF è stato mantenuto costante a ~7,0. Al contrario, quando il coefficiente di assorbimento diminuisce con la diminuzione della concentrazione dell'inchiostro (ad esempio, concentrazione correlata <1,28 × 10⁻⁵), l'intensità della luce a zigzag aumenta più rapidamente di quella della luce diritta e quindi la luce a zigzag inizia a svolgere un ruolo più importante. Al contrario, quando il coefficiente di assorbimento diminuisce con la diminuzione della concentrazione dell'inchiostro (ad esempio, concentrazione correlata <1,28 × 10⁻⁵), l'intensità della luce a zigzag aumenta più rapidamente di quella della luce diritta e quindi la luce a zigzag inizia a svolgere un ruolo più importante. In caso contrario, quando un preparato per la preparazione del caffè viene modificato con un concentratore di polvere (ad esempio, concentrazione ottimale <1,28 × 10-5), l'intensa attività di osservazione della luce si rivela molto intensa, come abbiamo fatto un gioco di bellezza, e ora stiamo giocando colore зигзагообразный. Al contrario, quando il coefficiente di assorbimento diminuisce con la diminuzione della concentrazione dell'inchiostro (ad esempio, la concentrazione relativa <1,28×10⁻⁵), l'intensità della luce a zigzag aumenta più rapidamente di quella della luce diretta, e quindi inizia a suonare la luce a zigzag.ruolo più importante.Traduzione ）,Z字形光的强度比直光增加得更快,然后Z字形光开始发挥作用一个更重要的角色.相反 ， 当 吸收 系数 随着 墨水 的 降低 而 降低 时 例如 例如 ， 相关 浓度 浓度 <1.28 × 10-5）,字形光 的 强度 比 增加 得 更 ， 然后 z 字形光 发挥 作用 一 个 重要 重要 重要 更 更 更 更更 更 更 更 HI的角色. E poi, quando un preparatore di caffè è in grado di gestire un ambiente di concentrazione (come esempio, соответствующая концентрация < 1,28×10-5), l'intensificazione dell'immagine è molto intensa, ciò che è importante, e tuttora il tuo bellissimo gioco di carte è bello важную роль. Al contrario, quando il coefficiente di assorbimento diminuisce con la diminuzione della concentrazione dell'inchiostro (ad esempio, la concentrazione corrispondente < 1,28×10⁻⁵), l'intensità della luce a zigzag aumenta più rapidamente della luce diretta, e quindi la luce a zigzag inizia a svolgere un ruolo più importante.personaggio di ruolo.Pertanto, grazie al percorso ottico a dente di sega (LOP » LC), l'AEF può essere aumentato ben oltre 7,0. Le caratteristiche precise di trasmissione della luce del MWC possono essere ottenute utilizzando la teoria dei modi di guida d'onda.
Oltre a migliorare il percorso ottico, la rapida commutazione del campione contribuisce anche a limiti di rilevamento estremamente bassi. Grazie al piccolo volume della MCC (0,16 ml), il tempo necessario per commutare e cambiare le soluzioni nella MCC può essere inferiore a 20 secondi. Come mostrato in Figura 5, il valore minimo rilevabile di AMWC (2,5 × 10–4) è 4 volte inferiore a quello di Acuvette (1,0 × 10–3). La rapida commutazione della soluzione in flusso nel capillare riduce l'effetto del rumore di sistema (ad esempio, deriva) sull'accuratezza della differenza di assorbanza rispetto alla soluzione di ritenzione nella cuvetta. Ad esempio, come mostrato in Fig. 3(b)-(d), ΔV può essere facilmente distinto da un segnale di deriva grazie alla rapida commutazione del campione nel capillare di piccolo volume.
Come mostrato nella Tabella 2, sono state preparate diverse soluzioni di glucosio a varie concentrazioni utilizzando H2O DI come solvente. Campioni colorati o di controllo sono stati preparati miscelando la soluzione di glucosio o acqua deionizzata con soluzioni cromogeniche di glucosio ossidasi (GOD) e perossidasi (POD) 37 in un rapporto di volume fisso di 3:1, rispettivamente. La Figura 8 mostra le fotografie ottiche di nove campioni colorati (S2-S10) con concentrazioni di glucosio che vanno da 2,0 mM (a sinistra) a 5,12 nM (a destra). Il rossore diminuisce con la diminuzione della concentrazione di glucosio.
I risultati delle misurazioni dei campioni 4, 9 e 10 con un fotometro basato su MWC sono mostrati rispettivamente nelle Fig. 9(a)-(c). Come mostrato in Fig. 9(c), il ΔV misurato diventa meno stabile e aumenta lentamente durante la misurazione, poiché il colore del reagente GOD-POD stesso (anche senza aggiunta di glucosio) cambia lentamente alla luce. Pertanto, le misurazioni successive del ΔV non possono essere ripetute per campioni con una concentrazione di glucosio inferiore a 5,12 nM (campione 10), perché quando il ΔV è sufficientemente piccolo, l'instabilità del reagente GOD-POD non può più essere trascurata. Di conseguenza, il limite di rilevamento per la soluzione di glucosio è di 5,12 nM, sebbene il corrispondente valore di ΔV (0,52 µV) sia molto maggiore del valore di rumore (0,03 µV), il che indica che un piccolo ΔV può ancora essere rilevato. Questo limite di rilevamento può essere ulteriormente migliorato utilizzando reagenti cromogenici più stabili.
(a) Risultati delle misurazioni per il campione 4, (b) il campione 9 e (c) il campione 10 utilizzando un fotometro basato su MWC.
L'assorbanza AMWC può essere calcolata utilizzando i valori misurati di Vcolor, Vblank e Vdark. Per un fotorivelatore con un guadagno di 105, Vdark è pari a -0,068 μV. Le misurazioni per tutti i campioni possono essere impostate nel materiale supplementare. Per confronto, sono stati misurati anche campioni di glucosio con uno spettrofotometro e l'assorbanza misurata di Acuvette ha raggiunto un limite di rilevamento di 0,64 µM (campione 7), come mostrato in Figura 10.
La relazione tra assorbanza e concentrazione è presentata nella Figura 11. Con il fotometro basato su MWC, è stato ottenuto un miglioramento di 125 volte del limite di rilevamento rispetto allo spettrofotometro basato su cuvetta. Questo miglioramento è inferiore a quello del test con inchiostro rosso a causa della scarsa stabilità del reagente GOD-POD. È stato inoltre osservato un aumento non lineare dell'assorbanza a basse concentrazioni.
Il fotometro basato su MWC è stato sviluppato per il rilevamento ultrasensibile di campioni liquidi. Il percorso ottico può essere notevolmente aumentato, superando di gran lunga la lunghezza fisica del MWC, poiché la luce diffusa dalle pareti laterali metalliche lisce e ondulate può essere contenuta all'interno del capillare indipendentemente dall'angolo di incidenza. Grazie alla nuova amplificazione ottica non lineare, alla rapida commutazione del campione e al rilevamento del glucosio, è possibile raggiungere concentrazioni fino a 5,12 nM utilizzando i reagenti GOD-POD convenzionali. Questo fotometro compatto ed economico troverà ampio impiego nelle scienze biologiche e nel monitoraggio ambientale per l'analisi di tracce.
Come illustrato nella Figura 1, il fotometro basato su MWC è costituito da un MWC lungo 7 cm (diametro interno 1,7 mm, diametro esterno 3,18 mm, superficie interna elettrolucidata di classe EP, capillare in acciaio inossidabile SUS316L), un LED con lunghezza d'onda di 505 nm (Thorlabs M505F1), lenti (diffusione del fascio di circa 6,6 gradi), un fotorivelatore a guadagno variabile (Thorlabs PDB450C) e due connettori a T per la comunicazione ottica e l'ingresso/uscita del liquido. Il connettore a T è realizzato incollando una piastra di quarzo trasparente a un tubo in PMMA in cui sono inseriti e incollati saldamente i tubi MWC e Peek (0,72 mm di diametro interno, 1,6 mm di diametro esterno, Vici Valco Corp.). Una valvola a tre vie collegata al tubo di ingresso Pike viene utilizzata per commutare il campione in ingresso. Il fotorivelatore può convertire la potenza ottica ricevuta P in un segnale di tensione amplificato N×V (dove V/P = 1,0 V/W a 1550 nm, il guadagno N può essere regolato manualmente nell'intervallo 10³-10⁷). Per brevità, si utilizza V al posto di N×V come segnale di uscita.
In confronto, per misurare l'assorbanza dei campioni liquidi è stato utilizzato anche uno spettrofotometro commerciale (serie Agilent Technologies Cary 300 con fotomoltiplicatore ad alta efficienza R928) con una cella a cuvetta da 1,0 cm.
La superficie interna del campione tagliato in MWC è stata esaminata utilizzando un profilometro ottico di superficie (ZYGO New View 5022) con una risoluzione verticale e laterale rispettivamente di 0,1 nm e 0,11 µm.
Tutti i reagenti chimici (di grado analitico, senza ulteriore purificazione) sono stati acquistati da Sichuan Chuangke Biotechnology Co., Ltd. I kit per il test del glucosio includono glucosio ossidasi (GOD), perossidasi (POD), 4-amminoantipirina e fenolo, ecc. La soluzione cromogenica è stata preparata con il metodo GOD-POD 37 standard.
Come mostrato nella Tabella 2, sono state preparate diverse soluzioni di glucosio a varie concentrazioni utilizzando acqua deionizzata come diluente, mediante un metodo di diluizione seriale (vedere Materiali supplementari per i dettagli). I campioni colorati o di controllo sono stati preparati miscelando la soluzione di glucosio o l'acqua deionizzata con la soluzione cromogenica in un rapporto di volume fisso di 3:1, rispettivamente. Tutti i campioni sono stati conservati a 37 °C al riparo dalla luce per 10 minuti prima della misurazione. Nel metodo GOD-POD, i campioni colorati assumono una colorazione rossa con un massimo di assorbimento a 505 nm, e l'assorbimento è quasi proporzionale alla concentrazione di glucosio.
Come illustrato nella Tabella 1, una serie di soluzioni di inchiostro rosso (Ostrich Ink Co., Ltd., Tianjin, Cina) sono state preparate mediante il metodo di diluizione seriale utilizzando acqua deionizzata come solvente.
Come citare questo articolo: Bai, M. et al. Fotometro compatto basato su capillari a guida d'onda metallica: per la determinazione di concentrazioni nanomolari di glucosio. the science. 5, 10476. doi: 10.1038/srep10476 (2015).
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