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L'analisi di tracce di campioni liquidi ha un'ampia gamma di applicazioni nelle scienze biologiche e nel monitoraggio ambientale. In questo lavoro, abbiamo sviluppato un fotometro compatto ed economico basato su capillari a guida d'onda metallica (MCC) per la determinazione ultrasensibile dell'assorbimento. Il cammino ottico può essere notevolmente aumentato, raggiungendo una lunghezza molto maggiore della lunghezza fisica del capillare a guida d'onda metallica (MCC), poiché la luce diffusa dalle pareti metalliche lisce e ondulate può essere contenuta all'interno del capillare indipendentemente dall'angolo di incidenza. Concentrazioni fino a 5,12 nM possono essere raggiunte utilizzando comuni reagenti cromogenici grazie alla nuova amplificazione ottica non lineare e alla rapida commutazione del campione e alla rilevazione del glucosio.
La fotometria è ampiamente utilizzata per l'analisi di tracce di campioni liquidi grazie all'abbondanza di reagenti cromogeni e dispositivi optoelettronici a semiconduttore disponibili1,2,3,4,5. Rispetto alla tradizionale determinazione dell'assorbanza basata su cuvetta, i capillari a guida d'onda liquida (LWC) riflettono (TIR) ​​mantenendo la luce della sonda all'interno del capillare1,2,3,4,5. Tuttavia, senza ulteriori miglioramenti, il cammino ottico è solo vicino alla lunghezza fisica di LWC3,6, e un aumento della lunghezza di LWC oltre 1,0 m subirà una forte attenuazione della luce e un elevato rischio di bolle, ecc.3, 7. Per quanto riguarda la cella multiriflessione proposta per i miglioramenti del cammino ottico, il limite di rilevamento è migliorato solo di un fattore compreso tra 2,5 e 8,9.
Attualmente esistono due tipi principali di LWC, ovvero i capillari in Teflon AF (con un indice di rifrazione di solo ~1,3, inferiore a quello dell'acqua) e i capillari in silice rivestiti con Teflon AF o film metallici1,3,4. Per ottenere la TIR all'interfaccia tra materiali dielettrici, sono necessari materiali con un basso indice di rifrazione e angoli di incidenza della luce elevati3,6,10. Per quanto riguarda i capillari in Teflon AF, il Teflon AF è traspirante grazie alla sua struttura porosa3,11 e può assorbire piccole quantità di sostanze nei campioni d'acqua. Per i capillari in quarzo rivestiti esternamente con Teflon AF o metallo, l'indice di rifrazione del quarzo (1,45) è superiore a quello della maggior parte dei campioni liquidi (ad esempio 1,33 per l'acqua)3,6,12,13. Per i capillari rivestiti internamente con una pellicola metallica, sono state studiate le proprietà di trasporto14,15,16,17,18, ma il processo di rivestimento è complicato, la superficie della pellicola metallica ha una struttura ruvida e porosa4,19.
Inoltre, i LWC commerciali (capillari rivestiti in Teflon AF e capillari in silice rivestiti in Teflon AF, World Precision Instruments, Inc.) presentano altri svantaggi, come ad esempio: per guasti. L'ampio volume morto del TIR3,10, (2) Il connettore a T (per collegare capillari, fibre e tubi di ingresso/uscita) può intrappolare bolle d'aria10.
Allo stesso tempo, la determinazione dei livelli di glucosio è di grande importanza per la diagnosi di diabete, cirrosi epatica e malattie mentali20. Molti metodi di rilevamento sono disponibili, come la fotometria (inclusa la spettrofotometria 21, 22, 23, 24, 25 e la colorimetria su carta 26, 27, 28), la galvanometria 29, 30, 31, la fluorometria 32, 33, 34, 35, la polarimetria ottica 36, ​​la risonanza plasmonica di superficie 37, la cavità di Fabry-Perot 38, l'elettrochimica 39 e l'elettroforesi capillare 40, 41 e così via. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi richiede apparecchiature costose e il rilevamento del glucosio a concentrazioni nanomolari di diverse nanomolecole rimane una sfida (ad esempio, per le misurazioni fotometriche21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, la più bassa concentrazione di glucosio). il limite era di soli 30 nM quando venivano utilizzate nanoparticelle di blu di Prussia come imitatori della perossidasi). Le analisi del glucosio nanomolare sono spesso richieste per studi cellulari a livello molecolare come l'inibizione della crescita del cancro alla prostata nell'uomo42 e il comportamento di fissazione della CO2 del Prochlorococcus nell'oceano.
In questo articolo, è stato sviluppato un fotometro compatto ed economico basato su un capillare a guida d'onda metallica (MWC), un capillare in acciaio inossidabile SUS316L con superficie interna elettrolucidata, per la determinazione dell'assorbimento ultrasensibile. Poiché la luce può essere intrappolata all'interno dei capillari metallici indipendentemente dall'angolo di incidenza, il cammino ottico può essere notevolmente aumentato dalla diffusione della luce su superfici metalliche ondulate e lisce, ed è molto più lungo della lunghezza fisica del MWC. Inoltre, è stato progettato un semplice connettore a T per la connessione ottica e l'ingresso/uscita del fluido per ridurre al minimo il volume morto ed evitare l'intrappolamento di bolle. Per il fotometro MWC da 7 cm, il limite di rilevabilità è migliorato di circa 3000 volte rispetto allo spettrofotometro commerciale con cuvetta da 1 cm grazie al nuovo miglioramento del cammino ottico non lineare e alla rapida commutazione del campione, e anche la concentrazione di rilevamento del glucosio può essere raggiunta a soli 5,12 nM utilizzando comuni reagenti cromogenici.
Come mostrato in Figura 1, il fotometro basato su MWC è costituito da un MWC lungo 7 cm con superficie interna elettrolucidata di grado EP, un LED da 505 nm con lente, un fotodiodo a guadagno regolabile e due per l'accoppiamento ottico e l'ingresso del liquido. Uscita. Una valvola a tre vie collegata al tubo di ingresso Pike viene utilizzata per commutare il campione in ingresso. Il tubo Peek si adatta perfettamente alla piastra di quarzo e al MWC, in modo che il volume morto nel connettore a T sia ridotto al minimo, impedendo efficacemente l'intrappolamento di bolle d'aria. Inoltre, il fascio collimato può essere introdotto facilmente ed efficacemente nel MWC attraverso la piastra di quarzo con raccordo a T.
Il fascio e il campione liquido vengono introdotti nell'MCC attraverso un raccordo a T e il fascio che attraversa l'MCC viene ricevuto da un fotorilevatore. Le soluzioni in ingresso dei campioni colorati o bianchi vengono introdotte alternativamente nell'ICC attraverso una valvola a tre vie. Secondo la legge di Beer, la densità ottica di un campione colorato può essere calcolata dall'equazione 1.10.
dove Vcolor e Vblank sono i segnali di uscita del fotorilevatore quando i campioni di colore e di bianco vengono introdotti rispettivamente nell'MCC, e Vdark è il segnale di fondo del fotorilevatore quando il LED è spento. La variazione del segnale di uscita ΔV = Vcolor–Vblank può essere misurata commutando i campioni. Secondo l'equazione. Come mostrato in Figura 1, se ΔV è molto inferiore a Vblank–Vdark, quando si utilizza uno schema di commutazione del campionamento, piccole variazioni di Vblank (ad esempio la deriva) possono avere un effetto minimo sul valore di AMWC.
Per confrontare le prestazioni del fotometro basato su MWC con lo spettrofotometro basato su cuvette, è stata utilizzata una soluzione di inchiostro rosso come campione di colore per la sua eccellente stabilità del colore e la buona linearità concentrazione-assorbanza, con acqua deionizzata come campione bianco. Come mostrato nella Tabella 1, una serie di soluzioni di inchiostro rosso è stata preparata con il metodo della diluizione seriale utilizzando acqua deionizzata come solvente. La concentrazione relativa del campione 1 (S1), vernice rossa originale non diluita, è stata determinata come 1,0. Nella Figura 2 sono mostrate fotografie ottiche di 11 campioni di inchiostro rosso (da S4 a S14) con concentrazioni relative (elencate nella Tabella 1) che vanno da 8,0 × 10–3 (sinistra) a 8,2 × 10–10 (destra).
I risultati delle misurazioni per il campione 6 sono mostrati nelle Fig. 3(a). I punti di commutazione tra campioni colorati e bianchi sono contrassegnati in figura da doppie frecce "↔". Si può osservare che la tensione di uscita aumenta rapidamente passando dai campioni colorati ai campioni bianchi e viceversa. Vcolor, Vblank e il corrispondente ΔV possono essere ottenuti come mostrato in figura.
(a) Risultati delle misurazioni per il campione 6, (b) il campione 9, (c) il campione 13 e (d) il campione 14 utilizzando un fotometro basato su MWC.
I risultati delle misurazioni per i campioni 9, 13 e 14 sono mostrati rispettivamente nelle Figure 3(b)-(d). Come mostrato in Figura 3(d), il ΔV misurato è di soli 5 nV, ovvero quasi 3 volte il valore di rumore (2 nV). Un ΔV piccolo è difficile da distinguere dal rumore. Pertanto, il limite di rilevabilità ha raggiunto una concentrazione relativa di 8,2×10-10 (campione 14). Con l'aiuto delle equazioni: 1. L'assorbanza dell'AMWC può essere calcolata dai valori misurati di Vcolor, Vblank e Vdark. Per un fotorilevatore con un guadagno di 104, Vdark è -0,68 μV. I risultati delle misurazioni per tutti i campioni sono riassunti nella Tabella 1 e sono disponibili nel materiale supplementare. Come mostrato in Tabella 1, l'assorbanza rilevata ad alte concentrazioni satura, quindi un'assorbanza superiore a 3,7 non può essere misurata con spettrometri basati su MWC.
A titolo di confronto, è stato misurato anche un campione di inchiostro rosso con uno spettrofotometro e l'assorbanza misurata con l'Acuvette è mostrata in Figura 4. I valori dell'Acuvette a 505 nm (come mostrato in Tabella 1) sono stati ottenuti prendendo come riferimento le curve dei campioni 10, 11 o 12 (come mostrato nel riquadro in Fig. 4). Come mostrato, il limite di rilevabilità ha raggiunto una concentrazione relativa di 2,56 x 10-6 (campione 9) perché le curve di assorbimento dei campioni 10, 11 e 12 erano indistinguibili tra loro. Pertanto, utilizzando il fotometro basato su MWC, il limite di rilevabilità è stato migliorato di un fattore 3125 rispetto allo spettrofotometro basato su cuvette.
La dipendenza assorbimento-concentrazione è presentata in Figura 5. Per le misurazioni in cuvetta, l'assorbanza è proporzionale alla concentrazione di inchiostro a una lunghezza del cammino ottico di 1 cm. Mentre, per le misurazioni basate su MWC, è stato osservato un aumento non lineare dell'assorbanza a basse concentrazioni. Secondo la legge di Beer, l'assorbanza è proporzionale alla lunghezza del cammino ottico, quindi il guadagno di assorbimento AEF (definito come AEF = AMWC/Acuvetta alla stessa concentrazione di inchiostro) è il rapporto tra MWC e la lunghezza del cammino ottico della cuvetta. Come mostrato in Figura 5, ad alte concentrazioni, la costante AEF è intorno a 7,0, il che è ragionevole poiché la lunghezza della MWC è esattamente 7 volte la lunghezza di una cuvetta da 1 cm. Tuttavia, a basse concentrazioni (concentrazione correlata <1,28 × 10-5), l'AEF aumenta con la diminuzione della concentrazione e raggiungerebbe un valore di 803 a una concentrazione correlata di 8,2 × 10-10 estrapolando la curva della misurazione basata sulla cuvetta. Tuttavia, a basse concentrazioni (concentrazione correlata <1,28 × 10-5), l'AEF aumenta con la diminuzione della concentrazione e raggiungerebbe un valore di 803 a una concentrazione correlata di 8,2 × 10-10 estrapolando la curva della misurazione basata sulla cuvetta. Uno dei pochi concentrari (concentrazione <1,28 × 10–5) AEF viene visualizzato con l'aggiornamento concentrazione e possibilità di distribuzione dimensione 803 su un concentratore esterno 8,2 × 10–10 su un'area di osservazione separata sui tappetini aperti. Tuttavia, a basse concentrazioni (concentrazione relativa <1,28 × 10–5), l'AEF aumenta con la diminuzione della concentrazione e può raggiungere un valore di 803 a una concentrazione relativa di 8,2 × 10–10 quando estrapolato da una curva di misurazione basata su cuvetta.然而,在低浓度（相关浓度<1.28 × 10-5）下,AEF随着浓度的降低而增加 ，并且通过外推基于比色皿的测量曲线，在相关浓度为8.2 × 10-10时将达到803 的值.然而, 在 低 浓度 （相关 浓度 <1.28 × 10-5）, ， AEF 随着 的 降低 而, 并且 通过 外推 基于比色皿 测量 曲线, 在 浓度 8.2 × 10-10 时 达到 达到 达到 达到 达到 803 值. Uno o più concentratori di piccole dimensioni (concentratori rilevanti < 1,28 × 10-5) АЭП viene visualizzato con l'impostazione concentrazione, e così via экстраполяции кривой имерения на основе кюветы она достигает значения относительной концентрации 8,2 × 10–10 803 . Tuttavia, a basse concentrazioni (concentrazioni rilevanti < 1,28 × 10-5) l'AED aumenta con la diminuzione della concentrazione e, quando estrapolato da una curva di misurazione basata su cuvetta, raggiunge un valore di concentrazione relativa di 8,2 × 10–10 803 .Ciò si traduce in un percorso ottico corrispondente di 803 cm (AEF × 1 cm), molto più lungo della lunghezza fisica del MWC e persino più lungo del più lungo LWC disponibile in commercio (500 cm di World Precision Instruments, Inc.). Doko Engineering LLC ha una lunghezza di 200 cm. Questo aumento non lineare dell'assorbimento nel LWC non era stato precedentemente segnalato.
Le figure 6(a)-(c) mostrano rispettivamente un'immagine ottica, un'immagine al microscopio e un'immagine di profilatura ottica della superficie interna della sezione MWC. Come mostrato in figura 6(a), la superficie interna è liscia e lucida, può riflettere la luce visibile ed è altamente riflettente. Come mostrato in figura 6(b), a causa della deformabilità e della natura cristallina del metallo, sulla superficie liscia compaiono piccole mesa e irregolarità. Considerata la piccola area (<5 μm×5 μm), la rugosità della maggior parte delle superfici è inferiore a 1,2 nm (Fig. 6(c)). Considerando una piccola area (<5 μm×5 μm), la rugosità della maggior parte della superficie è inferiore a 1,2 nm (Fig. 6(c)). La dimensione minima (<5 mm×5 mm) è di circa 1,2 miglia (ris. 6(в)). A causa della piccola area (<5 µm×5 µm), la rugosità della maggior parte della superficie è inferiore a 1,2 nm (Fig. 6(c)).考虑到小面积（<5 μm×5 μm）,大多数表面的粗糙度小于1.2 nm（图6（c））.考虑到小面积（<5 μm×5 μm）,大多数表面的粗糙度小于1.2 nm（图6（c））. Учитывая небольшую площадь (<5 мкм × 5 мкм), шероховатость большинства поверхностей составляет менее 1,2 nm (рис. 6(в)). Considerata la piccola area (<5 µm × 5 µm), la rugosità della maggior parte delle superfici è inferiore a 1,2 nm (Fig. 6(c)).
(a) Immagine ottica, (b) immagine al microscopio e (c) immagine ottica della superficie interna del taglio MWC.
Come mostrato in figura 7(a), il percorso ottico LOP nel capillare è determinato dall'angolo di incidenza θ (LOP = LC/sinθ, dove LC è la lunghezza fisica del capillare). Per i capillari in Teflon AF riempiti con H₂O disciolta, l'angolo di incidenza deve essere maggiore dell'angolo critico di 77,8°, quindi il LOP è inferiore a 1,02 × LC senza ulteriori miglioramenti3.6. Mentre, con la microcristallina (MWC), il confinamento della luce all'interno del capillare è indipendente dall'indice di rifrazione o dall'angolo di incidenza, quindi, al diminuire dell'angolo di incidenza, il percorso ottico può essere molto più lungo della lunghezza del capillare (LOP » LC). Come mostrato in figura 7(b), la superficie metallica ondulata può indurre dispersione della luce, che può aumentare notevolmente il percorso ottico.
Pertanto, esistono due percorsi luminosi per la MWC: luce diretta senza riflessione (LOP = LC) e luce a dente di sega con riflessioni multiple tra le pareti laterali (LOP » LC). Secondo la legge di Beer, l'intensità della luce diretta e a zigzag trasmessa può essere espressa rispettivamente come PS×exp(-α×LC) e PZ×exp(-α×LOP), dove la costante α è il coefficiente di assorbimento, che dipende interamente dalla concentrazione dell'inchiostro.
Per inchiostri ad alta concentrazione (ad esempio, concentrazione correlata >1,28 × 10-5), la luce a zigzag è fortemente attenuata e la sua intensità è molto inferiore a quella della luce rettilinea, a causa dell'elevato coefficiente di assorbimento e del suo percorso ottico molto più lungo. Per inchiostri ad alta concentrazione (ad esempio, concentrazione correlata >1,28 × 10-5), la luce a zigzag è fortemente attenuata e la sua intensità è molto più bassa di quella della luce rettilinea, a causa dell'elevato coefficiente di assorbimento e del suo percorso ottico molto più lungo. Per il cerchio con un concentratore alto (esempio: concentratore esterno >1,28 × 10-5) colore beige si siede, e io l'intensità del nome non c'è, perché c'è un bel po' di amore, da una grande quantità di caffè e di cottura più grande ottico esclusione. Per inchiostri ad alta concentrazione (ad esempio concentrazione relativa >1,28×10-5), la luce a zigzag è fortemente attenuata e la sua intensità è molto inferiore a quella della luce diretta a causa dell'elevato coefficiente di assorbimento e dell'emissione ottica molto più lunga.traccia.对于高浓度墨水（例如,相关浓度>1.28×10-5）,Z字形光衰减很大,其强度远低于直光,这是由于吸收系数大,光学时间更长.对于 高浓度 墨水 （例如 ， 浓度 浓度> 1.28 × 10-5） ， z 字形 衰减 很 大 ， 强度 远 低于 直光,这 是 吸收 系数 大 光学 时间 更。。。 长 长 长 长 长 长 长 长 长 长 长 长 长Per il cerchio con un concentratore alto (esempio, concentratore rilevante >1,28×10-5) rosso satinato l'ossessione fondamentale e l'ego l'intensità non è buona, perché c'è un ottimo rapporto qualità-prezzo per una grande quantità di caffè e bevande tempo ottico prolungato. Per inchiostri ad alta concentrazione (ad esempio concentrazioni rilevanti >1,28×10-5), la luce a zigzag viene attenuata in modo significativo e la sua intensità è molto inferiore a quella della luce diretta a causa dell'elevato coefficiente di assorbimento e del tempo ottico più lungo.piccola strada.Pertanto, la luce diretta ha dominato la determinazione dell'assorbanza (LOP=LC) e l'AEF è stato mantenuto costante a ~7,0. Al contrario, quando il coefficiente di assorbimento diminuisce con la diminuzione della concentrazione dell'inchiostro (ad esempio, concentrazione correlata <1,28 × 10-5), l'intensità della luce a zigzag aumenta più rapidamente di quella della luce rettilinea e quindi la luce a zigzag inizia a svolgere un ruolo più importante. Al contrario, quando il coefficiente di assorbimento diminuisce con la diminuzione della concentrazione dell'inchiostro (ad esempio, concentrazione correlata <1,28 × 10-5), l'intensità della luce a zigzag aumenta più rapidamente di quella della luce rettilinea e quindi la luce a zigzag inizia a svolgere un ruolo più importante. In caso contrario, quando un preparato per la preparazione del caffè viene modificato con un concentratore di polvere (ad esempio, concentrazione ottimale <1,28 × 10-5), l'intensa attività di osservazione della luce si rivela molto intensa, come abbiamo fatto un gioco di bellezza, e ora stiamo giocando colore зигзагообразный. Al contrario, quando il coefficiente di assorbimento diminuisce con la diminuzione della concentrazione dell'inchiostro (ad esempio, la concentrazione relativa <1,28×10-5), l'intensità della luce a zigzag aumenta più velocemente di quella della luce diretta e quindi inizia a suonare la luce a zigzag.ruolo più importante.Traduzione ）,Z字形光的强度比直光增加得更快,然后Z字形光开始发挥作用一个更重要的角色.相反 ， 当 吸收 系数 随着 墨水 的 降低 而 降低 时 例如 例如 ， 相关 浓度 浓度 <1.28 × 10-5）,字形光 的 强度 比 增加 得 更 ， 然后 z 字形光 发挥 作用 一 个 重要 重要 重要 更 更 更 更更 更 更 更 HI的角色. E poi, quando un preparatore di caffè è in funzione con un concentratore di polvere (ad esempio, соответствующая концентрация < 1,28×10-5), l'intensificazione dell'immagine è molto intensa, ciò che è importante, e tuttora il tuo bellissimo gioco di carte è bello la tua palla. Al contrario, quando il coefficiente di assorbimento diminuisce con la diminuzione della concentrazione dell'inchiostro (ad esempio, la concentrazione corrispondente < 1,28×10-5), l'intensità della luce a zigzag aumenta più rapidamente della luce diretta e quindi la luce a zigzag inizia a svolgere un ruolo più importante.personaggio di ruolo.Pertanto, grazie al percorso ottico a dente di sega (LOP » LC), l'AEF può essere aumentato di molto oltre 7,0. Le precise caratteristiche di trasmissione della luce della MWC possono essere ottenute utilizzando la teoria dei modi in guida d'onda.
Oltre a migliorare il percorso ottico, la rapida commutazione del campione contribuisce anche a limiti di rilevabilità estremamente bassi. Grazie al volume ridotto di MCC (0,16 ml), il tempo necessario per commutare e cambiare soluzione in MCC può essere inferiore a 20 secondi. Come mostrato in Figura 5, il valore minimo rilevabile di AMWC (2,5 × 10–4) è 4 volte inferiore a quello di Acuvette (1,0 × 10–3). La rapida commutazione della soluzione in flusso nel capillare riduce l'effetto del rumore di sistema (ad esempio, deriva) sull'accuratezza della differenza di assorbanza rispetto alla soluzione di ritenzione nella cuvetta. Ad esempio, come mostrato in Fig. 3(b)-(d), ΔV può essere facilmente distinto da un segnale di deriva grazie alla rapida commutazione del campione nel capillare di piccolo volume.
Come mostrato nella Tabella 2, sono state preparate diverse soluzioni di glucosio a diverse concentrazioni utilizzando H₂O deionizzata come solvente. I campioni colorati o bianchi sono stati preparati miscelando una soluzione di glucosio o acqua deionizzata con soluzioni cromogeniche di glucosio ossidasi (GOD) e perossidasi (POD) 37 in un rapporto volumetrico fisso di 3:1, rispettivamente. La figura 8 mostra fotografie ottiche di nove campioni colorati (S2-S10) con concentrazioni di glucosio comprese tra 2,0 mM (sinistra) e 5,12 nM (destra). Il rossore diminuisce con la diminuzione della concentrazione di glucosio.
I risultati delle misurazioni dei campioni 4, 9 e 10 con un fotometro basato su MWC sono mostrati rispettivamente nelle Figure 9(a)-(c). Come mostrato in Figura 9(c), il ΔV misurato diventa meno stabile e aumenta lentamente durante la misurazione, man mano che il colore del reagente GOD-POD stesso (anche senza aggiunta di glucosio) cambia lentamente alla luce. Pertanto, successive misurazioni del ΔV non possono essere ripetute per campioni con una concentrazione di glucosio inferiore a 5,12 nM (campione 10), poiché quando il ΔV è sufficientemente piccolo, l'instabilità del reagente GOD-POD non può più essere trascurata. Pertanto, il limite di rilevabilità per la soluzione di glucosio è di 5,12 nM, sebbene il valore di ΔV corrispondente (0,52 µV) sia molto maggiore del valore di rumore (0,03 µV), a indicare che è ancora possibile rilevare un piccolo ΔV. Questo limite di rilevabilità può essere ulteriormente migliorato utilizzando reagenti cromogenici più stabili.
(a) Risultati delle misurazioni per il campione 4, (b) il campione 9 e (c) il campione 10 utilizzando un fotometro basato su MWC.
L'assorbanza dell'AMWC può essere calcolata utilizzando i valori misurati di Vcolor, Vblank e Vdark. Per un fotorilevatore con un guadagno di 105, Vdark è pari a -0,068 μV. Le misurazioni per tutti i campioni possono essere impostate nel materiale supplementare. A titolo di confronto, anche i campioni di glucosio sono stati misurati con uno spettrofotometro e l'assorbanza misurata di Acuvette ha raggiunto un limite di rilevabilità di 0,64 µM (campione 7), come mostrato in Figura 10.
La relazione tra assorbanza e concentrazione è presentata in Figura 11. Con il fotometro basato su MWC, è stato ottenuto un miglioramento di 125 volte del limite di rilevabilità rispetto allo spettrofotometro basato su cuvetta. Questo miglioramento è inferiore rispetto al test con inchiostro rosso a causa della scarsa stabilità del reagente GOD-POD. È stato inoltre osservato un aumento non lineare dell'assorbanza a basse concentrazioni.
Il fotometro basato su MWC è stato sviluppato per la rilevazione ultrasensibile di campioni liquidi. Il cammino ottico può essere notevolmente aumentato, raggiungendo una lunghezza ben superiore a quella fisica del MWC, poiché la luce diffusa dalle pareti metalliche lisce e ondulate può essere contenuta all'interno del capillare indipendentemente dall'angolo di incidenza. Concentrazioni fino a 5,12 nM possono essere ottenute utilizzando i reagenti GOD-POD convenzionali grazie alla nuova amplificazione ottica non lineare e alla rapida commutazione del campione e alla rilevazione del glucosio. Questo fotometro compatto ed economico sarà ampiamente utilizzato nelle scienze biologiche e nel monitoraggio ambientale per l'analisi di tracce.
Come mostrato in Figura 1, il fotometro basato su MWC è costituito da un MWC lungo 7 cm (diametro interno 1,7 mm, diametro esterno 3,18 mm, superficie interna elettrolucidata di classe EP, capillare in acciaio inossidabile SUS316L), un LED a lunghezza d'onda di 505 nm (Thorlabs M505F1) e lenti (apertura del fascio di circa 6,6 gradi), un fotodiodo a guadagno variabile (Thorlabs PDB450C) e due connettori a T per la comunicazione ottica e l'ingresso/uscita del liquido. Il connettore a T è realizzato incollando una lastra di quarzo trasparente a un tubo in PMMA in cui sono inseriti e incollati saldamente i tubi MWC e Peek (0,72 mm di diametro interno, 1,6 mm di diametro esterno, Vici Valco Corp.). Una valvola a tre vie collegata al tubo di ingresso Pike viene utilizzata per commutare il campione in ingresso. Il fotodiodo può convertire la potenza ottica ricevuta P in un segnale di tensione amplificato N×V (dove V/P = 1,0 V/W a 1550 nm, il guadagno N può essere regolato manualmente nell'intervallo 103-107). Per brevità, V viene utilizzato al posto di N×V come segnale di uscita.
A titolo di confronto, è stato utilizzato anche uno spettrofotometro commerciale (Agilent Technologies Cary 300 series con fotomoltiplicatore ad alta efficienza R928) con una cella a cuvetta da 1,0 cm per misurare l'assorbanza dei campioni liquidi.
La superficie interna del taglio MWC è stata esaminata utilizzando un profilatore ottico di superficie (ZYGO New View 5022) con una risoluzione verticale e laterale rispettivamente di 0,1 nm e 0,11 µm.
Tutti i prodotti chimici (di grado analitico, senza ulteriore purificazione) sono stati acquistati da Sichuan Chuangke Biotechnology Co., Ltd. I kit per il test del glucosio includono glucosio ossidasi (GOD), perossidasi (POD), 4-amminoantipirina e fenolo, ecc. La soluzione cromogenica è stata preparata con il consueto metodo GOD-POD 37.
Come mostrato nella Tabella 2, sono state preparate diverse soluzioni di glucosio a diverse concentrazioni utilizzando H₂O DI come diluente, utilizzando un metodo di diluizione seriale (vedere Materiali supplementari per i dettagli). Preparare i campioni colorati o bianchi mescolando una soluzione di glucosio o acqua deionizzata con una soluzione cromogenica in un rapporto di volume fisso di 3:1, rispettivamente. Tutti i campioni sono stati conservati a 37 °C al riparo dalla luce per 10 minuti prima della misurazione. Con il metodo GOD-POD, i campioni colorati virano al rosso con un massimo di assorbimento a 505 nm, e l'assorbimento è pressoché proporzionale alla concentrazione di glucosio.
Come mostrato nella Tabella 1, una serie di soluzioni di inchiostro rosso (Ostrich Ink Co., Ltd., Tianjin, Cina) sono state preparate mediante il metodo di diluizione seriale utilizzando DI H2O come solvente.
Come citare questo articolo: Bai, M. et al. Fotometro compatto basato su capillari a guida d'onda metallica: per la determinazione di concentrazioni nanomolari di glucosio. the science. 5, 10476. doi: 10.1038/srep10476 (2015).
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