Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновлённую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Недавно была разработана безхимическая антимикробная платформа на основе нанотехнологий с использованием искусственных водных наноструктур (EWNS). EWNS обладают высоким поверхностным зарядом и насыщены активными формами кислорода (ROS), которые могут взаимодействовать с рядом микроорганизмов и инактивировать их, включая патогены, передающиеся через пищу. В данной работе показано, что их свойства в процессе синтеза могут быть точно настроены и оптимизированы для дальнейшего повышения их антибактериального потенциала. Лабораторная платформа EWNS была разработана для точной настройки свойств EWNS путем изменения параметров синтеза. Характеризация свойств EWNS (заряд, размер и содержание ROS) проводилась с использованием современных аналитических методов. Кроме того, была оценена их способность инактивировать микроорганизмы, передающиеся через пищу, такие как Escherichia coli, Salmonella enterica, Listeria innocuous, Mycobacterium paraaccidentum и Saccharomyces cerevisiae. Представленные здесь результаты демонстрируют, что свойства EWNS могут быть точно настроены в процессе синтеза, что приводит к экспоненциальному увеличению эффективности инактивации. В частности, поверхностный заряд увеличился в четыре раза, а количество активных форм кислорода возросло. Скорость удаления микроорганизмов зависела от их количества и составляла от 1,0 до 3,8 log после 45-минутного воздействия аэрозольной дозы 40 000 #/см³ EWNS.
Микробное загрязнение является основной причиной пищевых отравлений, вызванных попаданием в организм патогенов или их токсинов. Только в Соединенных Штатах ежегодно от пищевых отравлений страдают около 76 миллионов человек, 325 000 госпитализаций и 5 000 смертей¹. Кроме того, по оценкам Министерства сельского хозяйства США (USDA), увеличение потребления свежих продуктов является причиной 48% всех зарегистрированных случаев пищевых отравлений в Соединенных Штатах². Стоимость заболеваний и смертей, вызванных пищевыми патогенами в Соединенных Штатах, очень высока и, по оценкам Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC), составляет более 15,6 миллиардов долларов США в год³.
В настоящее время химические4, радиационные5 и термические6 антимикробные меры для обеспечения безопасности пищевых продуктов в основном проводятся в ограниченном количестве критических контрольных точек (ККТ) вдоль производственной цепочки (обычно после сбора урожая и/или во время упаковки), а не непрерывно. Таким образом, они подвержены перекрестному загрязнению. 7. Для более эффективного контроля заболеваний, передающихся через пищу, и порчи продуктов необходимы антимикробные меры, которые потенциально могут применяться на всем протяжении от фермы до стола, одновременно снижая воздействие на окружающую среду и затраты.
Недавно была разработана безхимическая антимикробная платформа на основе нанотехнологий, способная инактивировать бактерии на поверхностях и в воздухе с помощью искусственных водных наноструктур (EWNS). EWNS были синтезированы с использованием двух параллельных процессов: электрораспыления и ионизации воды (рис. 1a). Предыдущие исследования показали, что EWNS обладают уникальным набором физических и биологических свойств8,9,10. EWNS содержат в среднем 10 электронов на структуру и имеют средний наноразмер 25 нм (рис. 1b,c)8,9,10. Кроме того, электронный спиновый резонанс (ЭСР) показал, что EWNS содержат большое количество активных форм кислорода (АФК), главным образом гидроксильных (OH•) и супероксидных (O2-) радикалов (рис. 1c)8. EVNS находятся в воздухе длительное время и могут сталкиваться с микроорганизмами, взвешенными в воздухе и присутствующими на поверхности, доставляя свой груз АФК и вызывая инактивацию микроорганизмов (рис. 1d). Эти ранние исследования также показали, что EWNS может взаимодействовать с различными грамотрицательными и грамположительными бактериями, включая микобактерии, и инактивировать их на поверхностях и в воздухе. Трансмиссионная электронная микроскопия показала, что инактивация вызвана нарушением клеточной мембраны. Кроме того, исследования острого ингаляционного воздействия показали, что высокие дозы EWNS не вызывают повреждения легких или воспаления⁸.
(a) Электрораспыление происходит при подаче высокого напряжения между капиллярной трубкой, содержащей жидкость, и противоэлектродом. (b) Приложение высокого давления приводит к двум различным явлениям: (i) электрораспылению воды и (ii) образованию активных форм кислорода (ионов), захваченных в наночастицах электрораспыления. (c) Уникальная структура наночастиц электрораспыления. (d) Благодаря своей наноразмерной природе, наночастицы электрораспыления обладают высокой подвижностью и могут взаимодействовать с патогенами, переносимыми по воздуху.
Недавно также была продемонстрирована способность антимикробной платформы EWNS инактивировать пищевые микроорганизмы на поверхности свежих продуктов. Было также показано, что поверхностный заряд EWNS в сочетании с электрическим полем может быть использован для достижения целенаправленной доставки. Более того, предварительные результаты для органических томатов после 90-минутной экспозиции при дозе EWNS около 50 000 #/см³ были обнадеживающими, при этом были обнаружены различные пищевые микроорганизмы, такие как E. coli и Listeria 11. Кроме того, предварительные органолептические тесты не показали сенсорных эффектов по сравнению с контрольными томатами. Хотя эти первоначальные результаты инактивации обнадеживают с точки зрения безопасности пищевых продуктов даже при очень низких дозах EWNS (50 000 #/см³), очевидно, что более высокий потенциал инактивации был бы более полезен для дальнейшего снижения риска заражения и порчи.
В данном исследовании мы сосредоточимся на разработке платформы для генерации наночастиц EWN, позволяющей точно настраивать параметры синтеза и оптимизировать физико-химические свойства EWN для повышения их антибактериального потенциала. В частности, оптимизация была направлена ​​на увеличение поверхностного заряда (для улучшения адресной доставки) и содержания активных форм кислорода (для повышения эффективности инактивации). Оптимизированные физико-химические свойства (размер, заряд и содержание активных форм кислорода) будут охарактеризованы с использованием современных аналитических методов, а также с применением распространенных пищевых микроорганизмов, таких как E. coli.
Электрораспылитель EVNS был синтезирован путем одновременного электрораспыления и ионизации воды высокой чистоты (18 МΩ·см⁻¹). Электрораспылитель 12 обычно используется для распыления жидкостей и синтеза полимерных и керамических частиц 13 и волокон 14 контролируемого размера.
Как подробно описано в предыдущих публикациях 8, 9, 10, 11, в типичном эксперименте между металлическим капилляром и заземленным противоэлектродом прикладывалось высокое напряжение. В ходе этого процесса происходят два различных явления: i) электрораспыление и ii) ионизация воды. Сильное электрическое поле между двумя электродами вызывает накопление отрицательных зарядов на поверхности сконденсированной воды, что приводит к образованию конусов Тейлора. В результате образуются сильно заряженные капли воды, которые продолжают распадаться на более мелкие частицы, как в теории Рэлея16. В то же время сильные электрические поля вызывают расщепление некоторых молекул воды и отрыв от них электронов (ионизацию), что приводит к образованию большого количества активных форм кислорода (АФК)17. Одновременно генерируемые АФК18 были инкапсулированы в EWNS (рис. 1c).
На рис. 2а показана система генерации ЭУНС, разработанная и использованная в данном исследовании для синтеза ЭУНС. Очищенная вода, хранящаяся в закрытой бутылке, подавалась через тефлоновую трубку (внутренний диаметр 2 мм) в иглу из нержавеющей стали 30G (металлический капилляр). Поток воды контролировался давлением воздуха внутри бутылки, как показано на рис. 2б. Игла установлена ​​на тефлоновой консоли и может быть вручную отрегулирована на определенное расстояние от противоэлектрода. Противоэлектрод представляет собой полированный алюминиевый диск с отверстием в центре для отбора проб. Под противоэлектродом находится алюминиевая воронка для отбора проб, которая соединена с остальной частью экспериментальной установки через порт для отбора проб (рис. 2б). Чтобы избежать накопления заряда, которое могло бы нарушить работу пробоотборника, все компоненты пробоотборника электрически заземлены.
(a) Система генерации наноструктур из искусственной воды (EWNS). (b) Поперечное сечение пробоотборника и электрораспылителя, показывающее наиболее важные параметры. (c) Экспериментальная установка для инактивации бактерий.
Описанная выше система генерации ЭВНС позволяет изменять ключевые рабочие параметры для точной настройки свойств ЭВНС. Для точной настройки характеристик ЭВНС регулируют приложенное напряжение (В), расстояние между иглой и противоэлектродом (L) и поток воды (φ) через капилляр. Символы, используемые для обозначения различных комбинаций: [В (кВ), L (см)]. Регулируют поток воды для получения стабильного конуса Тейлора определенного набора [В, L]. Для целей данного исследования диаметр апертуры противоэлектрода (D) поддерживался на уровне 0,5 дюйма (1,29 см).
Из-за ограниченной геометрии и асимметрии напряженность электрического поля не может быть рассчитана из первых принципов. Вместо этого для расчета электрического поля использовалось программное обеспечение QuickField™ (Свендборг, Дания)19. Электрическое поле неоднородно, поэтому значение электрического поля на кончике капилляра использовалось в качестве эталонного значения для различных конфигураций.
В ходе исследования были оценены несколько комбинаций напряжения и расстояния между иглой и противоэлектродом с точки зрения формирования конуса Тейлора, стабильности конуса Тейлора, стабильности получения EWNS и воспроизводимости. Различные комбинации показаны в дополнительной таблице S1.
Выход системы генерации EWNS был напрямую подключен к сканирующему анализатору размера частиц (SMPS, модель 3936, TSI, Шоревилл, Миннесота) для измерения концентрации числа частиц, а также к аэрозольному электрометру Фарадея (TSI, модель 3068B, Шоревилл, Миннесота). Измерение тока аэрозоля проводилось, как описано в нашей предыдущей публикации. И SMPS, и аэрозольный электрометр отбирали пробы со скоростью потока 0,5 л/мин (общий поток пробы 1 л/мин). Концентрация числа частиц и поток аэрозоля измерялись в течение 120 секунд. Измерение повторялось 30 раз. На основе измерений тока рассчитывается общий заряд аэрозоля и оценивается средний заряд EWNS для заданного общего числа выбранных частиц EWNS. Средняя стоимость EWNS может быть рассчитана с использованием уравнения (1):
где IEl — измеренный ток, NSMPS — цифровая концентрация, измеренная с помощью SMPS, а φEl — расход на один электрометр.
Поскольку относительная влажность (ОВ) влияет на поверхностный заряд, температура и ОВ поддерживались постоянными в течение эксперимента на уровне 21 °C и 45 % соответственно.
Для измерения размера и времени жизни ЭВНС использовались атомно-силовая микроскопия (АСМ), прибор Asylum MFP-3D (Asylum Research, Санта-Барбара, Калифорния) и зонд AC260T (Olympus, Токио, Япония). Частота сканирования АСМ составляла 1 Гц, область сканирования — 5 мкм × 5 мкм, количество линий сканирования — 256. Все изображения были подвергнуты выравниванию изображений первого порядка с помощью программного обеспечения Asylum (диапазон маски 100 нм, пороговое значение 100 пм).
Тестовая воронка была удалена, и поверхность слюды была помещена на расстояние 2,0 см от противоэлектрода на время усреднения 120 с, чтобы избежать агломерации частиц и образования нерегулярных капель на поверхности слюды. EWNS распыляли непосредственно на поверхность свежесрезанной слюды (Ted Pella, Redding, CA). Изображение поверхности слюды сразу после распыления АСМ. Угол смачивания поверхности свежесрезанной немодифицированной слюды близок к 0°, поэтому EVNS распределяется по поверхности слюды в виде купола. Диаметр (a) и высота (h) диффундирующих капель были измерены непосредственно по топографии АСМ и использованы для расчета объема диффузии купола EWNS с использованием нашего ранее проверенного метода. Предполагая, что встроенные EWNS имеют одинаковый объем, эквивалентный диаметр можно рассчитать с помощью уравнения (2):
На основе разработанного нами ранее метода для обнаружения присутствия короткоживущих радикальных промежуточных продуктов в EWNS использовалась спиновая ловушка электронного спинового резонанса (ЭСР). Аэрозоли пропускали через мини-барботер Midget (Ace Glass, Vineland, NJ) с диаметром пор 650 мкм, содержащий 235 мМ раствор DEPMPO (5-(диэтоксифосфорил)-5-метил-1-пирролин-N-оксид) (Oxis International Inc., Портленд, Орегон). Все измерения ЭСР проводились с использованием спектрометра Bruker EMX (Bruker Instruments Inc., Биллерика, Массачусетс, США) и плоскопанельной ячейки. Для сбора и анализа данных использовалось программное обеспечение Acquisit (Bruker Instruments Inc., Биллерика, Массачусетс, США). Определение характеристик АФК проводилось только для набора рабочих условий [-6,5 кВ, 4,0 см]. Концентрации EWNS измерялись с помощью SMPS с учетом потерь EWNS в импакторе.
Уровень озона контролировался с помощью двухлучевого озонатора 205 Dual Beam Ozone Monitor™ (2B Technologies, Боулдер, Колорадо)8,9,10.
Для всех свойств EWNS в качестве измеренного значения используется среднее значение, а в качестве погрешности измерения — стандартное отклонение. Для сравнения значений оптимизированных атрибутов EWNS с соответствующими значениями базового EWNS были проведены t-тесты.
На рисунке 2c показана ранее разработанная и охарактеризованная система электростатического осаждения (ЭПС) типа «притяжения», которая может использоваться для целенаправленной доставки ЭВНС на поверхность. В ЭПС используются заряды ЭВНС, которые могут быть «направлены» непосредственно к поверхности цели под воздействием сильного электрического поля. Подробности системы ЭПС представлены в недавней публикации Пиргиотакиса и др.¹¹. Таким образом, ЭПС состоит из напечатанной на 3D-принтере ПВХ-камеры с коническими концами и содержит две параллельные металлические пластины из нержавеющей стали (304, зеркальное покрытие) в центре на расстоянии 15,24 см друг от друга. Пластины были подключены к внешнему источнику высокого напряжения (Bertran 205B-10R, Spellman, Hauppauge, NY), нижняя пластина всегда была подключена к положительному напряжению, а верхняя пластина всегда была подключена к заземлению (плавающее заземление). Стенки камеры покрыты алюминиевой фольгой, которая электрически заземлена для предотвращения потери частиц. Камера имеет герметичную переднюю загрузочную дверцу, которая позволяет размещать тестируемые поверхности на пластиковых подставках, приподнимающих их над нижней металлической пластиной, чтобы избежать помех от высокого напряжения.
Эффективность осаждения EWNS в EPES рассчитывалась в соответствии с ранее разработанным протоколом, подробно описанным на дополнительном рисунке S111.
В качестве контрольной камеры к системе EPES последовательно была подключена вторая цилиндрическая проточная камера, в которой для удаления EWNS использовался промежуточный HEPA-фильтр. Как показано на рисунке 2c, аэрозоль EWNS прокачивался через две встроенные камеры. Фильтр между контрольной комнатой и системой EPES удаляет любые оставшиеся частицы EWNS, что приводит к сохранению одинаковой температуры (T), относительной влажности (RH) и уровня озона.
Было обнаружено, что свежие продукты загрязняются важными микроорганизмами, передающимися через пищу, такими как кишечная палочка (E. coli, ATCC #27325), фекальный индикатор сальмонелла энтерика (Salmonella enterica, ATCC #53647), пищевой патоген листерия безвредная (Listeria harmless, ATCC #33090), заменитель патогенной листерии моноцитогенной (Listeria monocytogenes), полученный из ATCC (Манассас, Вирджиния) Saccharomyces cerevisiae (ATCC #4098), заменитель дрожжей, вызывающих порчу продуктов, и более устойчивая инактивированная бактерия Mycobacterium paralucky (ATCC #19686).
Купите на местном рынке случайные коробки органических помидоров черри и храните в холодильнике при температуре 4°C до использования (до 3 дней). Экспериментальные помидоры были одинакового размера, около 1/2 дюйма в диаметре.
Протоколы культивирования, инокуляции, воздействия и подсчета колоний подробно описаны в нашей предыдущей публикации и в дополнительных данных. Эффективность EWNS оценивали путем воздействия на инокулированные томаты дозой 40 000 #/см³ в течение 45 минут. Для оценки количества выживших микроорганизмов в момент времени t = 0 мин использовали три томата. Три томата помещали в EPES и подвергали воздействию EWNS при дозе 40 000 #/см³ (томаты, подвергнутые воздействию EWNS), а оставшиеся три помещали в контрольную камеру (контрольные томаты). Дополнительная обработка томатов в обеих группах не проводилась. Томаты, подвергнутые воздействию EWNS, и контрольные томаты удаляли через 45 минут для оценки эффекта EWNS.
Каждый эксперимент проводился в трех повторениях. Анализ данных выполнялся в соответствии с протоколом, описанным в дополнительных материалах.
Механизмы инактивации оценивали путем седиментации образцов, подвергнутых воздействию EWNS (45 мин при концентрации аэрозоля EWNS 40 000 #/см3), и необлученных образцов безвредных бактерий E. coli, Salmonella enterica и Lactobacillus. Частицы фиксировали в 2,5% глутаральдегиде, 1,25% параформальдегиде и 0,03% пикриновой кислоте в 0,1 М какодилатном буфере натрия (pH 7,4) в течение 2 часов при комнатной температуре. После промывки проводили постфиксацию 1% тетраоксидом осмия (OsO4)/1,5% ферроцианидом калия (KFeCN6) в течение 2 часов, промывали 3 раза водой и инкубировали в 1% ацетате уранила в течение 1 часа, затем промывали дважды водой и обезвоживали в течение 10 минут в 50%, 70%, 90%, 100% спирте. Затем образцы помещали в оксид пропилена на 1 час и пропитывали смесью оксида пропилена и эпоксидной смолы TAAP в соотношении 1:1 (Marivac Canada Inc., Сент-Лоран, Калифорния). Образцы заливали эпоксидной смолой TAAB и полимеризовали при 60°C в течение 48 часов. Затвердевшую гранулированную смолу разрезали и визуализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) на обычном просвечивающем электронном микроскопе JEOL 1200EX (JEOL, Токио, Япония), оснащенном ПЗС-камерой AMT 2k (Advanced Microscopy Techniques, Corp., Вобурн, Массачусетс, США).
Все эксперименты проводились в трех повторениях. Для каждой временной точки бактериальные смывы засевали в трех повторениях, в результате чего получалось девять точек данных для каждой точки, среднее значение которых использовалось в качестве концентрации бактерий для данного микроорганизма. В качестве погрешности измерения использовалось стандартное отклонение. Учитываются все точки.
Логарифм уменьшения концентрации бактерий по сравнению с моментом времени t = 0 мин был рассчитан по следующей формуле:
где C0 — концентрация бактерий в контрольном образце в момент времени 0 (т.е. после высыхания поверхности, но до помещения образца в камеру), а Cn — концентрация бактерий на поверхности после n минут воздействия.
Для учета естественного разложения бактерий в течение 45-минутного воздействия, логарифмическое снижение по сравнению с контролем через 45 минут также рассчитывалось следующим образом:
где Cn — концентрация бактерий в контрольном образце в момент времени n, а Cn-Control — концентрация контрольных бактерий в момент времени n. Данные представлены в виде логарифмического снижения по сравнению с контролем (без воздействия EWNS).
В ходе исследования были оценены несколько комбинаций напряжения и расстояния между иглой и противоэлектродом с точки зрения формирования конуса Тейлора, стабильности конуса Тейлора, стабильности образования EWNS и воспроизводимости. Различные комбинации показаны в дополнительной таблице S1. Для всестороннего изучения были выбраны два случая, демонстрирующие стабильные и воспроизводимые свойства (конус Тейлора, образование EWNS и стабильность во времени). На рисунке 3 показаны результаты для заряда, размера и содержания ROS в обоих случаях. Результаты также суммированы в таблице 1. Для сравнения, как рисунок 3, так и таблица 1 содержат свойства ранее синтезированных неоптимизированных EWNS8, 9, 10, 11 (базовые EWNS). Расчеты статистической значимости с использованием двухстороннего t-критерия приведены в дополнительной таблице S2. Кроме того, дополнительные данные включают исследования влияния диаметра отверстия для отбора проб противоэлектрода (D) и расстояния между заземляющим электродом и его наконечником (L) (дополнительные рисунки S2 и S3).
(ac) Распределение размеров, измеренное с помощью АСМ. (df) Характеристика поверхностного заряда. (g) Характеристика ЭПР с помощью АФК.
Важно также отметить, что при всех вышеперечисленных условиях измеренный ток ионизации составлял от 2 до 6 мкА, а напряжение — от -3,8 до -6,5 кВ, что приводило к энергопотреблению менее 50 мВт для этого единственного контактного модуля генерации EWNS. Несмотря на то, что синтез EWNS проводился под высоким давлением, уровень озона был очень низким, никогда не превышая 60 ppb.
На дополнительном рисунке S4 показаны смоделированные электрические поля для сценариев [-6,5 кВ, 4,0 см] и [-3,8 кВ, 0,5 см] соответственно. Для сценариев [-6,5 кВ, 4,0 см] и [-3,8 кВ, 0,5 см] расчетные значения поля составляют 2 × 10⁵ В/м и 4,7 × 10⁵ В/м соответственно. Это ожидаемо, поскольку во втором случае отношение напряжения к расстоянию значительно выше.
На рис. 3a,b показан диаметр EWNS, измеренный с помощью AFM8. Рассчитанные средние диаметры EWNS составили 27 нм и 19 нм для схем [-6,5 кВ, 4,0 см] и [-3,8 кВ, 0,5 см] соответственно. Для сценариев [-6,5 кВ, 4,0 см] и [-3,8 кВ, 0,5 см] геометрические стандартные отклонения распределений составляют 1,41 и 1,45 соответственно, что указывает на узкое распределение по размерам. Как средний размер, так и геометрическое стандартное отклонение очень близки к базовому значению EWNS, составляя 25 нм и 1,41 соответственно. На рис. 3c показано распределение размеров базового значения EWNS, измеренное тем же методом в тех же условиях.
На рис. 3d,e показаны результаты характеризации заряда. Данные представляют собой средние значения 30 одновременных измерений концентрации (#/см³) и тока (I). Анализ показывает, что средний заряд на EWNS составляет 22 ± 6 e- и 44 ± 6 e- для [-6,5 кВ, 4,0 см] и [-3,8 кВ, 0,5 см] соответственно. Они имеют значительно более высокие поверхностные заряды по сравнению с базовым EWNS (10 ± 2 e-), в два раза больше, чем в сценарии [-6,5 кВ, 4,0 см], и в четыре раза больше, чем в сценарии [-3,8 кВ, 0,5 см]. На рис. 3f показаны данные о заряде для базового EWNS.
Из карт концентрации числа ЭВНС (дополнительные рисунки S5 и S6) видно, что в сценарии [-6,5 кВ, 4,0 см] частиц значительно больше, чем в сценарии [-3,8 кВ, 0,5 см]. Также стоит отметить, что концентрация числа ЭВНС отслеживалась в течение 4 часов (дополнительные рисунки S5 и S6), при этом стабильность генерации ЭВНС показала одинаковый уровень концентрации числа частиц в обоих случаях.
На рис. 3g показан спектр ЭПР после вычитания оптимизированного контрольного образца EWNS (фон) при [-6,5 кВ, 4,0 см]. Спектры АФК также сравнивались со сценарием базового EWNS в ранее опубликованной работе. Количество EWNS, реагирующих со спиновыми ловушками, было рассчитано как 7,5 × 10⁴ EWNS/с, что аналогично ранее опубликованному сценарию базового EWNS⁸. Спектры ЭПР четко показали наличие двух типов АФК, причем O₂⁻ является преобладающим видом, а OH• — менее распространенным. Кроме того, прямое сравнение интенсивностей пиков показало, что оптимизированный EWNS имел значительно более высокое содержание АФК по сравнению с базовым EWNS.
На рис. 4 показана эффективность осаждения EWNS в EPES. Данные также суммированы в таблице I и сопоставлены с исходными данными по EWNS. В обоих случаях осаждение EWNS близко к 100% даже при низком напряжении 3,0 кВ. Как правило, 3,0 кВ достаточно для 100% осаждения, независимо от изменения поверхностного заряда. В тех же условиях эффективность осаждения базовых EWNS составляла всего 56% из-за их меньшего заряда (в среднем 10 электронов на один EWNS).
На рис. 5 и в таблице 2 приведены значения инактивации микроорганизмов, инокулированных на поверхность томатов после воздействия электромагнитного излучения мощностью около 40 000 л/см³ в течение 45 минут в оптимальном режиме [-6,5 кВ, 4,0 см]. Инокулированные E. coli и Lactobacillus innocuous показали значительное снижение на 3,8 логарифма за 45 минут воздействия. В тех же условиях S. enterica показала снижение на 2,2 логарифма, а S. cerevisiae и M. parafortutum — на 1,0 логарифм.
Электронные микроснимки (рисунок 6) демонстрируют физические изменения, вызванные EWNS в безвредных клетках Escherichia coli, Streptococcus и Lactobacillus, приводящие к их инактивации. У контрольных бактерий клеточные мембраны были неповрежденными, тогда как у бактерий, подвергшихся воздействию, внешние мембраны были повреждены.
Электронно-микроскопическое исследование контрольных и экспериментальных бактерий выявило повреждение мембраны.
Данные о физико-химических свойствах оптимизированных EWNS в совокупности показывают, что свойства (поверхностный заряд и содержание ROS) EWNS значительно улучшились по сравнению с ранее опубликованными базовыми данными EWNS8,9,10,11. С другой стороны, их размер оставался в нанометровом диапазоне, что очень похоже на ранее полученные результаты, позволяя им оставаться на воздухе в течение длительного времени. Наблюдаемая полидисперсность может быть объяснена изменениями поверхностного заряда, определяющими размер EWNS, случайностью эффекта Рэлея и потенциальной коалесценцией. Однако, как подробно описано Нильсеном и др. 22, высокий поверхностный заряд снижает испарение за счет эффективного увеличения поверхностной энергии/натяжения капли воды. В нашей предыдущей публикации8 эта теория была экспериментально подтверждена для микрокапель 22 и EWNS. Потеря заряда с течением времени также может влиять на размер и способствовать наблюдаемому распределению размеров.
Кроме того, заряд на структуру составляет примерно 22-44 электрона в зависимости от ситуации, что значительно выше по сравнению с базовыми EWNS, средний заряд которых составляет 10 ± 2 электрона на структуру. Однако следует отметить, что это средний заряд EWNS. Сето и др. показали, что заряд неоднороден и подчиняется логарифмически нормальному распределению21. По сравнению с нашей предыдущей работой, удвоение поверхностного заряда удваивает эффективность осаждения в системе EPES почти до 100%11.